Producción de biobutanol a partir de subproductos\nde industria agroalimentaria. Análisis de estrategias\nen operación en continuo\nPablos de la Fuente, Cristian\nSe ha estudiado la viabilidad de la operación en continuo de la fermentación ABE utilizando sacarosa como sustrato. Se han empleado dos biorreactores colocados en serie, tratando así de imitar las fases de crecimiento en discontinuo llevadas a cabo por la bacteria Clostridium\nbeijerinckii DSM 6422. Para ello primeramente se han llevado a cabo una serie de experimentos en discontinuo a partir de los cuales se ha encontrado la concentración de sustrato más conveniente, y los parámetros necesarios para un posterior dimensionado de la planta piloto en continuo. En dicha planta finalmente se han efectuado varios experimentos empleando diversas estrategias de arranque hasta alcanzar la que se ha considerado como más conveniente. Como resultados se ha obtenido una concentración final de butanol en régimen estacionario de 1,01 g/l, y de 0,35 g/l de acetona utilizando una concentración de sacarosa de 30 g/l tras 250 horas de experimentación.\nPalabras clave: fermentación ABE, sacarosa, butanol, Clostridium\nThe viability of continuous ABE fermentation by Clostridium beijerinckii DSM 6422 is described. Two bioreactors in series have been used in order to simulate the two phases of batch culture growth using sucrose as substrate. Firstly some batch experiments have been carried on to look for the best substrate concentration and the necessary parameters for the purpose of designing a continuous pilot plant. Then some continuous experiments were carried on using a few start strategies to try to come across the best one. As a result a final concentration of 1,01 g/l of butanol and 0,35 g/l of acetone has been found using a 30 g/l concentration of sucrose as substrate for a period of continuous operation of 250 hours. A growth rate close to its maximal value has been use in the first reactor where acidogenesis were developed.\n1.6.1 Fermentación en batch ... 16\n1.6.2 Fermentación en fed-batch ... 16\n1.6.3 Fermentación en continuo ... 17\n1.7 Separación de los Productos ... 19\n1.7.1 Destilación ... 19\n1.7.7 Destilación en membrana ... 23\n1.7.8 Pervaporación ... 24\n2. Objetivos ... 26\n3. Materiales y métodos ... 30\n3.1 Microorganismo utilizado y condiciones de cultivo ... 32\n3.1.1 Microorganismo ... 32\n3.1.2 Mantenimiento y formación del inóculo ... 32\n3.1.3 Medio de fermentación ... 33\n3.2 Sustrato ... 34\n3.3.1 Experimentación en batch ... 34\n3.3.2 Experimentación con 2 biorreactores en continuo ... 35\n3.4 Métodos analíticos ... 36\n3.4.1 Determinación de azúcares, ácidos y solventes ... 36\n3.4.2 Medida de la biomasa ... 36\n3.4.3 Observación microscópica de los cultivos ... 36\n4.1 Experimentación en discontinuo... 39\n4.1.1 Concentración de sustrato de 60 g/L ... 39\n4.1.2 Concentración de sustrato de 30 g/L ... 44\n4.1.3 Comparación en función de la concentración de sustrato ... 46\n4.1.4 Determinación de parámetros biológicos y cinéticos ... 47\n4.1.5 Velocidad de crecimiento máxima ... 48\n4.2 Operación en continuo ... 51\n4.2.1 Dimensionado de los biorreactores ... 51\n4.2.2 Construcción y puesta a punto de la planta ... 52\n4.2.3 Modo de operación ... 53\n2. Experimentación en continuo ... 99\nExperimento 2.1 ... 99\nExperimento 2.2 ... 101\nExperimento 2.3 ... 103\nLa fermentación ABE (Acetona-Butanol-Etanol) es una de las fermentaciones industriales de las que más antiguamente se tienen conocimientos, ya que fue descubierta en 1861 por Louis Pasteur. No obstante Pasteur únicamente detectó la presencia de butanol tras la fermentación, y no fue hasta años más tarde, concretamente en 1905 cuando Schardinger dio cuenta de la presencia de acetona (1).\nEntre 1912 y 1914 Chaim Weizmann consiguió aislar cepas de Clostridium acetobutylicum, las cuales tenían la habilidad de fermentar sustratos de almidón y conseguir unos rendimientos de butanol superiores a lo anteriormente existente (1).\nYa en la Primera y Segunda Guerra Mundial se produce un gran crecimiento de la industria de la fermentación ABE tanto en Estados Unidos como en Europa, debido a la aplicación de los productos mayoritarios de la misma para fines bélicos. A partir del año 1945 se comienza la implantación de este tipo de industria en países como China, Japón, Sudáfrica o la antigua unión soviética (1).\nSin embargo, al finalizar la Segunda Guerra Mundial comienza a florecer la industria petroquímica a una velocidad sin precedentes, este hecho hace que se abandonara el proceso de fermentación ABE, debido a que butanol y acetona son dos productos que se pueden obtener en grandes cantidades de una manera mucho más barata mediante síntesis química (1).\nDe esta manera en 1960 prácticamente todas las industrias que utilizaban la fermentación ABE para obtener acetona y butanol se encuentran cerradas, y únicamente en pises como China Sudáfrica o Rusia se continua realizando este tipo de fermentaciones debido a la abundancia y bajo precio de melazas como sustrato (1).\nHoy en día sin embargo, debido principalmente a la cada vez menor cantidad de combustibles fósiles, su alto precio y a la preocupación creciente por el calentamiento global, la industria de la fermentación ABE está volviendo a imponerse con fuerza como posible sustitución a largo plazo de la industria petroquímica para la obtención de butanol y acetona, impulsada además por los nuevos conocimientos que se poseen sobre ingeniería genética y que permiten la modificación de cepas de microorganismos de manera que se consigue obtener una mayor cantidad de producto a un precio muy inferior al de otras épocas (2).\n5 encima de la que posee el etanol (16 MJ/L) (3), es un compuesto menos volátil, menos higroscópico, y menos corrosivo que este último, de tal manera que lo hace mucho más interesante a la hora de utilizarlo como combustible en los motores existentes (4).\nLa producción de acetona, butanol y etanol es llevada a cabo principalmente por bacterias, concretamente por aquellas que pertenecen al género Clostridium (1). Existe un elevado número de especies diferentes dentro del género Clostridium que son capaces de realizar la fermentación ABE, y que se pueden diferenciar según el ratio de disolventes producidos (1).\nLa bacteria Clostridium acetibutylicum, es la más usada para realizar este tipo de fermentaciones (5) (1) (6); la mayor parte del conocimiento obtenido de este tipo de fermentación ha sido recogido utilizando esta bacteria, y si bien esto ha permitido avanzar relativamente rápido en su estudio, también ha provocado que los resultados obtenidos se extrapolen para otras especies cuando eso no es del todo correcto. El ratio (A:B:E) de disolventes obtenidos por esta especie es de 75:10:15 (6).\nOtra especie capaz de llevar a cabo este tipo de fermentación es Clostridium beijerinckii. Esta especie destaca por tener diferentes variantes. Dependiendo de la especie concreta de C. beijerinckii que se esté utilizando se pueden obtener diversos productos y ratios de los mismos. Por ejemplo, como productos se pueden obtener butanol, etanol y en lugar de acetona, esta se transforma en ispropanol (5). Esto es especialmente interesante para la producción de biodiesel, ya que la acetona no puede ser utilizada como combustible, pero el isopropanol sí. Otra variante existente es aquella que no produce isopropanol (5), dando ratios muy similares a aquellos obtenidos por C. acetibutylicum (1). Por último existe una última variante de esta especie que es capaz de producir butanol, etanol y una mezcla de acetona e isopropanol (5).\nTambién dentro del género Clostridium, Clostridium tentanomorphum es capaz de producir únicamente butanol y etanol en ratios 1:1 (5), y Clostridium thermosaccharolyticum, es caracterizada por ser termófila y porque también produce etanol y butanol en ratios aproximadamente iguales (5).\n6 patatas, raíces de legumbres fijadoras de nitrógeno y otras raíces de cultivos (1), además de cereales, frutas como las grosellas o suelo agrícola.\nPor otro lado algunas especies del género Bacillus también pueden utilizarse para la formación de acetona y alcoholes mediante fermentación, destacando Baciillus saccharobutylicum, o Bacillus butacone, todos ellos formadores de esporas (6).\nComo conclusión debe destacarse que la elección de una u otra especie para uso industrial, dependerá de la naturaleza del sustrato a utilizar, del ratio de productos requerido, así como de la necesidad de nutrientes adicionales y que sea resistente al fago (1).\n1.3 Materia Prima\nEl género Clostridia es capaz de utilizar un gran número de azúcares y carbohidratos para realizar la fermentación ABE (7) (4), el coste de la materia prima a emplear en la fermentación ABE, o sustrato, es muchas veces uno de los factores más importantes a la hora de decidir si el proceso es rentable o no (7), por eso el hecho de poder utilizar una amplia gama de sustratos hace tan interesante a esta clase.\nA lo largo de los años se han investigado sustratos tales como la glucosa, xilosa, maíz, almidones, melazas, pulpa de manzana, biomasa algal, suero de queso… (4) (1) con diferentes resultados. Sin embargo hoy en día cada vez se investigan más otras materias primas o fuentes de carbohidratos que no son utilizadas como posibles alimentos, sino que se trata de material lignocelulósico procedente de residuos de labores agrícolas en su amplia mayoría (4), con alto contenido en sustratos fermentables, tales como bagazo procedente de la caña de azúcar, paja de trigo, o paja de cebada (7).\nDe esta manera se pretende abaratar el coste de los sustratos haciendo más rentable la fermentación y además dando la posibilidad de purificar aguas residuales.\n7 sustrato se deberán realizar una serie de operaciones de pretratamiento diferentes para cada caso antes de realizarse la fermentación.\nLa principal diferencia entre los procesos es la necesidad o no de una hidrólisis previa a la fermentación, necesaria en el caso de que se parta de almidón o material lignocelulósico, no siendo así cuando se parte de materias primas como la caña de azúcar cuyos carbohidratos ya son fácilmente fermentables por los microorganismos.\nEn el caso del almidón además de una sacarificación, es necesaria en algunas ocasiones una etapa de desgerminación o incluso de separación de las proteínas presentes en el material almidonado.\nRespecto al material lignocelulósico habrá que tener en cuenta que en muchas ocasiones la hidrólisis puede generar una importante cantidad de componentes inhibitorios para la fermentación, por lo que deberán de ser retirados del proceso (7).\nDe lo expuesto se deduce que a la hora de seleccionar el sustrato adecuado para realizar la fermentación ABE se debe tener en cuenta tanto el origen como la composición del mismo a la hora de determinar si es rentable o no su utilización. No obstante, una vez tenido en cuenta esto, la utilización de los microorganismos para obtener un producto de valor añadido a partir de residuos parece una elección muy acertada desde todos los puntos de vista.\n1.4 Ruta metabólica\nLa fermentación ABE consta de dos fases diferenciadas la acidogénesis y la solventogénesis (5).\nLa acidogénesis ocurre en la fase de crecimiento celular. Durante esta etapa los microorganismos generan y expulsan al medio ácido acético y ácido butírico, además de hidrógeno y dióxido de carbono como principales productos. El incremento en la concentración de ácidos en el medio provoca un descenso importante del pH respecto al inicial (1).\n8 En la figura 1 se muestra la ruta metabólica de la bacteria Clostridium beijerinckii, uno de los microorganismos más utilizados para la fermentación ABE (1):\nFigura 1. Ruta metabólica de Clostridium Beijerinckii\n9 Además de hexosas, el género clostridia puede metabolizar también pentosas por la ruta metabólica pentosa fosfato. Como resultado de esta ruta se obtienen por cada 3 moles de pentosa 5 moles de ATP y 5 moles de NADH (1). A continuación se explican más detalladamente las dos etapas que se dan en la fermentación ABE, centrándose especialmente en la solventogénesis, ya que es donde se obtienen los productos deseados de fermentación y una buena comprensión de esta etapa es crucial para obtener los mayores rendimientos de producto posibles.\nEn esta primera fase, el flujo de carbono está destinado a la producción de diferentes tipos de ácidos. Por un lado está el ácido butírico y el ácido acético, y por otro lado cabe la posibilidad de que Clostridium Beijerinckii pueda convertir el piruvato en lugar de Acetil-Coa en lactato (1), pero esta ruta metabólica solamente es empleada por la bacteria cuando se encuentra ante condiciones muy desfavorables (1), como puede ser la presencia de monóxido de carbono (8), o el agotamiento del hierro presente en las células (9), y es empleada como una alternativa menos eficiente para la generación de energía y la oxidación del NADH (1).\nCentrándose en el butirato y el acetato, ambos ácidos son generados mediante dos etapas a partir de sus predecesores, butiril – CoA y acetil – CoA respectivamente como se puede observar en la figura 1. Las enzimas encargadas de esta transformación son en el caso del ácido butírico la fosfato butiltransferasa (M) y la butirato kinasa posteriormente (N). En el caso del ácido acético son la fosfato acetil transferasa (G) y la acetato kinasa (H) (9). Sendas rutas están destinadas a la producción de ATP, y es la ruta en la que el acetil - CoA es transformado al butiril – CoA donde se produce la regeneración del NADH. Estos pasos son llevados a cabo mediante cuatro enzimas: thiolasa (I), β-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa (J), crotonasa (K) y butiril-CoA (L) deshidrogenasa (9).\n10 En un comienzo se sugirió que este cambio en el que los ácidos producidos en la primera etapa son reasimilados, podía ocurrir debido a un proceso de detoxificación iniciado por la acumulación de ácidos que resultan ser desfavorables para el crecimiento celular (10).\nEstudios realizados posteriormente dieron a conocer que con la adición de ácido acético o ácido butírico se lograban mayores rendimientos en cuanto a la producción de acetona y butanol (9) (11) (12). Además se propuso que durante la producción de disolventes se podía estar dando la ruta metabólica de producción de ácido acético y ácido butírico a la inversa (13).\nFinalmente otra serie de estudios ha demostrado que la asimilación de los ácidos producidos durante la primera etapa está directamente relacionado con la producción de acetona por la vía acetoacetyl-CoA: acetato/butirato: CoA transferasa (9). Se ha observado que la Acetoacetyl-CoA transferasa es capaz de utilizar tanto acetato como butirato como aceptores de CoA durante la conversión del acetoacetil-CoA a acetoacetato (14).En este proceso el acetoacetato producido es entonces descarboxilado en una etapa irreversible para formar acetona y CO2. Además se ha demostrado (14) que la asimilación de los ácidos se da solamente después de que la acetoacetyl descarboxilasa es inducida, y se ha encontrado que el pH óptimo para esta enzima está alrededor de 5,0, lo que hace que sea posible la producción de acetona con un pH ácido.\nPara C. acetobutylicum la acetona es un producto final, sin embargo para C. beijerinckii en una de sus variantes la acetona es reducida a isopropanol por la acción de la enzima isopropanol deshidrogenasa (9).\nEstudios posteriores demostraron que la actividad de las enzimas fosfato butyryl-transferasa (M), fosfato acetiltransferasa (G) y acetato kinasa, rápidamente disminuía una vez que la etapa de solventogénesis había comenzado, por lo tanto este descubrimiento demostró la no validez de las teorías sobre una vía metabólica reversible para la creación de ácidos (10). El 97 % de los moles de ácidos utilizados estaban destinados a la producción de acetona con una desviación estándar de 11, lo que sugiere que el mecanismo de asimilación de ácidos tiene como objetivo la producción de cantidades equimolares de acetoacetato (10).\n11 Resultados obtenidos por otra serie de estudios (15) demostraron que el ácido butírico rápidamente es reducido a butanol durante la solventogénesis, y que además más del 55% de ácido acético es también convertido a butanol, mientras que la mayor parte restante es utilizada para la formación de acetona y dióxido de carbono, y solo una pequeña parte es destinada a la producción de etanol (9) (15).\nEn otros experimentos realizados se comprobó que si se adicionaba únicamente ácido acético al medio de fermentación a cultivos en los que existía limitación por glucosa, se mejoraba la producción de disolventes, pero sin embargo no se alteraba la relación acetona/butanol (9). Sin embargo cuando el ácido acético era añadido a cultivos en los que no existía limitación por glucosa, la concentración de acetona incrementaba quedándose inalterada la concentración de butanol (16). El incremento en la concentración de acetona demostró que la acetoacetato descarboxilasa no era un factor limitante en la producción de acetona. Además se observó que bajo condiciones de glucosa ilimitada el exceso de acetil-CoA generado por el consumo de acetato era desviado a la producción de acetona en lugar de butanol (1). Esto es debido a que el acetil-CoA generado por el consumo del ácido añadido no está relacionado con la formación de NADH como lo está el generado por la glucólisis. Por lo tanto bajo estas condiciones el exceso de acetil-CoA es metabolizado para producir un producto oxidado como es la acetona en lugar de reducirse a butanol (1).\nDel resultado de estos experimentos se deduce por lo tanto que la formación de acetona no está relacionada necesariamente con la formación de butanol (1).\n12 1.5.1 Acetona\nLa acetona, también conocida como dimetilcetona o 2-propanona, se trata de un compuesto orgánico muy inflamable de la familia de las cetonas que se presenta en condiciones normales como un líquido incoloro de olor característico (18). Se trata de un compuesto químico ampliamente utilizado en la sociedad gracias a sus propiedades como disolvente, siendo también utilizado en la industria ya que es capaz de disolver una gran cantidad de plásticos, pegamentos, así como otros compuestos químicos (19). Es miscible en agua, lo que le hace especialmente útil en tareas de secado ya que posee una alta volatilidad.\nSu fórmula química es C3H6O, y su estructura es la indicada en la figura 2:\nFigura 2. Estructura de la acetona\nComo formas de obtención tradicionales encontramos como principal vía la hidrólisis en medio ácido del hidroperóxido de cumeno, y en segundo lugar la deshidrogenación catalítica del alcohol isopropílico (20).\nA continuación se muestran algunas de las propiedades físicas más importantes de la acetona (21):\n• Punto de ebullición: 56°C\n• Punto de fusión: -95°C\n• Densidad relativa (agua = 1): 0,8\n• Solubilidad en agua: miscible.\n• Presión de vapor, kPa a 20°C: 24\n• Densidad relativa de vapor (aire = 1): 2,0\n• Densidad relativa de la mezcla vapor/aire a 20°C (aire = 1): 1,2\n• Punto de inflamación: -18°C c.c.\n• Temperatura de autoignición: 465°C\n• Límites de explosividad, % en volumen en el aire: 2,2-13\n• Coeficiente de reparto octanol/agua como log Pow: -0,24\n13 En la vida cotidiana la acetona es utilizada principalmente como quitaesmaltes gracias a sus propiedades disolventes de compuestos orgánicos, destacando también por la capacidad de eliminar restos de pegamentos y epóxidos (19).\nEn el laboratorio es muy comúnmente utilizada para la limpieza de utensilios ya que es capaz de eliminar restos grasientos y además acelera el proceso de secado de los instrumentos gracias a su alta volatilidad (18).\nEn la industria, la acetona se utiliza principalmente para la obtención de metil metacrilato (MMA) (22). Este se trata de un líquido claro con olor frutal, utilizado principalmente para la obtención de polimetil metacrilato (PMMA), un laminado utilizado normalmente como sustituto de cristales de seguridad o paneles (23).\nOtro uso importante a nivel industrial es la obtención de Bisfenol A (22). Este se trata de un sólido incoloro soluble en disolventes orgánicos, y utilizado principalmente para fabricar plásticos y resinas (24).\nAdemás hay que destacar que se trata de un disolvente ampliamente utilizado en la industria (22), y un aditivo en las gasolinas, ya que gracias al poder disolvente de la misma posibilita la limpieza del motor (19).\nEl butanol se trata de un alcohol primario que se presenta como cuatro posibles isómeros estructurales: n-butanol, isobutanol, 2-butanol y el tert-butanol (25). En la experimentación que nos ocupa, el isómero más abundante es el n-butanol, cuya obtención se trata del objetivo principal del estudio como se comentará en sucesivos apartados. Se trata de un líquido claro, con olor característico, soluble en disolventes orgánicos y algo soluble en agua, obtenido tradicionalmente en la industria a partir del propileno (25). Su fórmula química es C4H9OH, y su estructura es la indicada en la figura 3:\n14 De entre las propiedades físicas del n-butanol, destacan las siguientes (26):\n• Punto de ebullición: 117°C\n• Punto de fusión: -90°C\n• Densidad relativa (agua = 1): 0,81\n• Solubilidad en agua, g/100 ml a 20°C: 7,7\n• Presión de vapor, kPa a 20°C: 0,58\n• Densidad relativa de vapor (aire = 1): 2,6\n• Densidad relativa de la mezcla vapor/aire a 20°C (aire = 1): 1,01\n• Punto de inflamación: 29°C (c.c.) Temperatura de autoignición: 345°C\n• Límites de explosividad, % en volumen en el aire: 1,4-11,3\n• Coeficiente de reparto octanol/agua como log Pow: 0,9\nTradicionalmente en la industria el butanol es utilizado principalmente como intermediario, como por ejemplo para la obtención de butil acrilato, un líquido incoloro con fuerte olor afrutado que se utiliza principalmente en la obtención de fibras sintéticas y en dispersiones de polímeros para fabricar telas, etc… (27)\nTambién se utiliza como producto intermedio para la obtención del butil acetato, dibutil ftalato, así como otros ésteres butílicos, éteres butílicos como el etilenglicol y los correspondientes acetatos de butil éter (25).\nUn uso muy importante del butanol es su utilización como disolvente para la obtención de lacas, resinas o barnices además de otros productos como perfumes (25).\n15 1.5.3 Etanol\nSe trata de un alcohol primario, el cual en condiciones normales se encuentra en estado líquido. Se trata de un compuesto muy volátil, incoloro e inodoro miscible con el agua en cualquier proporción formando una mezcla azeotrópica al 95% de concentración (28).\nSu fórmula química es C2H5OH, y su estructura es la indicada en la figura 4:\nFigura 4. Estructura del etanol\nTradicionalmente ha sido obtenido mediante fermentación anaeróbica gracias a la acción de la levadura Saccharomyces Cerevisae sobre los azúcares, de manera que se puede encontrar en muchas bebidas alcohólicas tales como el vino, la cerveza o el aguardiente acompañado de otros compuestos químicos que proporcionan el olor o sabor característico de los mismos. Industrialmente sin embargo el etanol se obtiene principalmente por la hidratación del etileno a etanol (28).\nComo propiedades físicas importantes del etanol se pueden destacar las siguientes: (29)\n• Densidad relativa de vapor (aire = 1): 1,6_\n• Densidad relativa de la mezcla vapor/aire a 20°C (aire = 1): 1,03\n• Punto de inflamación: 13°C c.c.\n• Temperatura de autoignición: 363°C\n• Límites de explosividad, % en volumen en el aire: 3,3-19\n• Coeficiente de reparto octanol/agua como log Pow: -0,32\n16 trata de un potente bactericida, siendo especialmente eficaz en mezclas con el agua entorno al 70% (30).\nEn la industria química es utilizado para la síntesis de productos como el acetato de etilo que se trata de un líquido sin color, inflamable y miscible en agua que se utiliza principalmente como disolvente universal (31), o el éter dietílico, otro disolvente en este caso de compuestos orgánicos, que destaca por ser el primer anestésico que se utilizó en la historia. Se trata de un líquido incoloro con olor característico que es insoluble en agua (32).\nAl igual que el butanol, el etanol puede ser utilizado como un combustible alternativo a los tradicionales fósiles. Sin embargo como ya se ha mencionado el etanol es un combustible menos interesante (33) (3).\n1.6 Modos de operación\nBuena parte del rendimiento de una fermentación ABE reside en la elección del modo de operación mediante el cual se va a llevar a cabo la fermentación. Principalmente existen tres modos de operación, aunque luego se puedan dar diversas variantes dentro de los mismos: batch, fed-batch y continuo. A continuación se analiza cada una de las operaciones presentando además las ventajas e inconvenientes de cada una de ellas.\n1.6.1 Fermentación en batch\nEste modo de operación se caracteriza por la ausencia de entradas y salidas del fermentador. Se carga la alimentación junto con el medio de fermentación y se inocula el microorganismo encargado de llevar a cabo la fermentación. Este modo de operación se caracteriza por su alta eficacia, así como por su facilidad de control (17), estás características son las que hacen que pese a que la productividad no sea especialmente elevada sea el modo de operación más empleado en la industria de la fermentación (17).\nSin embargo se encuentra el hecho de que la productividad no sea elevada debido principalmente a los altos tiempos de carga y descarga del reactor, así como a labores de mantenimiento, limpieza y esterilización. Esto hace que se considere una alternativa en procesos en los que el producto tiene un alto valor añadido como por ejemplo la industria farmacéutica (17).\n1.6.2 Fermentación en fed-batch\n17 Este tipo de técnica de fermentación es empleada sobretodo en casos en los que existe inhibición por sustrato, o se busca la represión catabólica (17) en la que se debe mantener una determinada cantidad de sustrato para impedir la expresión de genes que expresan las proteínas necesarias para la fermentación de otros sustratos y así impedir un gasto energético innecesario (34).\nPara el caso de la fermentación ABE esta técnica puede resultar interesante desde el punto de vista de la inhibición por producto, ya que el butanol en altas concentraciones en el caldo de fermentación actúa como bactericida impidiendo un crecimiento celular adecuado, y por lo tanto provocando que la fermentación pueda durar un número de horas más elevado. De esta manera se consigue diluir cada cierto tiempo la concentración de butanol, consiguiendo que se pueda seguir llevando a cabo la fermentación, a expensas por supuesto de diluir la concentración de producto.\nSi-Yu Li et al. (17) comprobaron como para la fermentación ABE con control de pH igual a 4,5 y glucosa como sustrato se conseguía sin embargo un mayor rendimiento de producción de disolventes así como una mayor productividad en el caso de fermentación en batch. Diversas posibles causas han sido aportadas por Qureshi et al (35), como pueden ser la presencia de células inactivas o muertas, la acumulación de macromoléculas inhibitorias, y la deficiencia de nutrientes.\n1.6.3 Fermentación en continuo\nEste tipo de fermentación puede llevarse a cabo utilizando uno o varios reactores colocados en serie (normalmente 2).\nSi únicamente se utiliza un fermentador, este modo de operación se caracteriza por operar en un principio de manera discontinua, comenzando posteriormente a alimentar el biorreactor con una determinada velocidad de dilución, sacando además producto de manera que el volumen permanezca constante.\nOperando de esta manera se ha encontrado que el rendimiento de producción de disolventes es inferior a la operación en batch, mientras que el rendimiento de producción de butanol es más o menos parejo (17). Respecto a la productividad este modo de operación se presenta como el más atractivo, ya que se evitan los largos periodos de mantenimiento del biorreactor entre carga y carga, y además se reducen los tiempos de esterilización y el tiempo perdido debido a la fase lag en la que las bacterias se acostumbran al medio (17).\n18 un único fermentador, esto es debido a un problema denominado degeneración del disolvente, en el que las bacterias pierden la capacidad de producir los disolventes tras ese periodo de tiempo (17), (36), (37).\nEs por ello que una alternativa al uso de un único fermentador es la utilización de 2 fermentadores, de esta manera se ha comprobado que se puede operar durante mucho más tiempo (38), obteniendo un rendimiento de butanol similar al obtenido en una única etapa y una productividad algo menor, pero que puede ser mantenida durante mucho más tiempo (17), y que siempre es superior a la productividad obtenida en el caso de operar en batch o en fed- batch.\nAunque las maneras de realizar la inoculación pueden ser variadas, cuando se opera con dos biorreactores lo que se trata es de simular en el primero de ellos la etapa de acidogénesis y en el segundo la etapa de solventogénesis, de manera que no se pierda la actividad celular consiguiendo que las células puedan seguir produciendo disolventes tras un largo periodo de tiempo de operación (17).\nDentro de los diferentes modos de operación comentados existen multitud de variantes de los mismos en lo que a condiciones de operación se refiere, como puede ser la limitación de algún nutriente, diversas estrategias de alimentación u operar con un pH constante o no entre otras muchas.\nRespecto a operar con un pH constante se ha demostrado que el pH óptimo de operación es 4,5 (17) y que los rendimientos son superiores a cuando no se opera controlando el mismo (17). Sin embargo habrá que tener en cuenta desde un punto de vista industrial que si se pretende controlar el pH habrá principio una mayor productividad operando en continuo en dos etapas salvo que se supere la velocidad a la que se produce el lavado del reactor.\n1.7 Separación de los Productos\nEl caldo obtenido tras el proceso de fermentación ABE contiene normalmente, como ya se ha indicado, un ratio de acetona:butanol:etanol de 3:6:1, con un contenido de butanol de entre 1 y 2% en masa (39), lo que supone una concentración muy pequeña de los principales productos de la fermentación y delimita en muchas ocasiones la viabilidad económica del proceso. Además de los productos anteriormente mencionados, el caldo obtenido de la fermentación contiene ácido acético, ácido butírico, células, nutrientes, agua y sustrato que no haya reaccionado en diferentes concentraciones.\nLas diferentes técnicas de separación existentes hasta la fecha se centran en dos maneras de separar los productos obtenidos, ya que por un lado se puede decidir separar los productos obtenidos después del proceso, o separarlos durante el proceso (recuperación in situ) (40) (39). Estas últimas, la mayoría aún en estudio, aportan una serie de ventajas respecto a las primeras en lo que a disminución de la intoxicación de los microorganismos presentes en el caldo de fermentación se refiere, ya que no se permite que la concentración de butanol supere nunca un determinado valor, además de un consecuente aumento en la productividad. Sin embargo hay que tener presente que puede provocar, dependiendo la técnica utilizada, otros tipos de problemas, como puede ser la contaminación del caldo si no se lleva a cabo en las condiciones óptimas (39).\nA continuación se repasan los fundamentos de las técnicas más empleadas en la actualidad, describiendo las principales ventajas e inconvenientes de las mismas:\nTradicionalmente la destilación ha sido la principal operación de separación empleada para separar los productos del caldo de la fermentación ABE (40). Existen diferentes maneras de llevar a cabo la separación mediante la destilación, como son: destilación flash en continuo, destilación batch, destilación fraccional y destilación con vapor (40).\n20 Como ventaja de esta operación de separación destacar que se obtienen concentraciones de butanol en torno al 98% en masa y que está ampliamente estudiada.\nSe trata de una técnica de recuperación in situ en la que se burbujean gases como nitrógeno libre de oxígeno, o incluso los propios gases creados durante la fermentación para separar la acetona, el butanol y el etanol (39). El gas que sale del fermentador con los productos es posteriormente condensado parcialmente de manera que los gases utilizados para recuperar el producto son recirculados al interior del reactor, mientras que los productos son llevados a otras operaciones de separación posteriores.\nEsta técnica presenta como ventajas un aumento en el rendimiento y la productividad global de la fermentación debido a la disminución de la concentración de butanol en el caldo, además de que es barata y simple a la hora de llevarla a cabo, pudiendo utilizar los propios gases generados durante la fermentación. Además únicamente se separan los compuestos más volátiles, lo que permite mantener en el caldo metabolitos primarios imprescindibles para la fermentación como son el ácido acético y butírico, y no afecta para nada a los microorganismos (39) (40).\nPor otro lado como desventajas se encuentra el hecho de que cuando se utilizan grandes flujos de gas para optimizar la operación, se forman grandes cantidades de espuma, lo que exige el uso de antiespumantes, que pueden afectar el rendimiento de la fermentación siendo tóxico para la bacteria (40). 1.7.3 Adsorción\nLa adsorción es una operación de separación interesante sobre todo desde el punto de vista económico (40). Para este proceso se utilizan una serie de partículas denominadas adsorbentes para las que se busca que el producto deseado de una mezcla se quede ligado a ellas.\n21 pueden ser utilizados son carbono activo, resinas poliméricas o zeolitas, cada uno de ellos con sus respectivas ventajas e inconvenientes (39).\nAunque se han encontrado buenos resultados en cuanto a la selectividad del butanol (40), es cierto que existen problemas con esta técnica aún, como son dificultades obtenidas en la operación de desorción que se debe llevar a cabo posteriormente, o la posibilidad de que las células se queden adheridas al adsorbente, lo que supone una pérdida en la efectividad del mismo, o incluso de la fermentación, ya que en algunas ocasiones el caldo es recirculado después de la adsorción (40).\n1.7.4 Extracción líquido-líquido\nEn esta técnica el caldo de fermentación se pone en contacto con un disolvente que contiene agua y compuestos orgánicos de tal manera que el butanol es selectivamente eliminado del caldo ya que éste es más soluble en el disolvente que en el caldo de fermentación (39). El disolvente y el caldo de fermentación son normalmente insolubles por lo que su posterior separación se puede realizar de una manera sencilla.\nSe debe tratar de encontrar un disolvente que sea lo menos tóxico posible para las células y que tenga una alta selectividad por el producto deseado, lo cual en el caso de la separación del butanol a menudo es un problema, ya de disolvente, intoxicación de microorganismos, formación de emulsiones, e incluso acumulación de microorganismos en el disolvente utilizado para efectuar la separación (39).\n22 descritas se debe antes utilizar algún método de retención de los microorganismos vía inmovilización o ultrafiltración (39).\nLa pertracción puede utilizarse para solucionar alguno de los problemas más importantes de la extracción líquido-líquido. En esta operación se utiliza una membrana que está en contacto por un lado con el caldo de fermentación, y por el otro con el disolvente utilizado para realizar la extracción. De esta manera ambas mezclas no están en contacto directo, y por lo tanto se pueden evitar así algunos problemas, como la formación de emulsiones o la intoxicación de microorganismos (39).\nEl éxito de esta técnica depende de una buena selección no solo del disolvente como ocurría en el caso de la extracción líquido-líquido, sino también de la membrana, la cual debe presentar una alta selectividad hacia el butanol (39).\nAlgunos de los disolventes más utilizados para esta operación de separación son: propilenglicol, tributirina, 1-ocatnol, 1-dodecanol y 2-etil-1hexanol (39). Como ventajas de esta operación se encuentra la capacidad de poder unir la efectividad del disolvente con la selectividad de las membranas empleadas (41) (40), además de que gracias a la membrana se evita el paso del disolvente al caldo con la intoxicación de microorganismos que esto conlleva (42) (40).\nComo limitaciones a este proceso se encuentra una disminución de los coeficientes de transferencia de materia respecto a la extracción líquido-líquido (43) (40), y ya a escala industrial pueden surgir problemas debido a la relativamente alta viscosidad de los disolventes empleados, resultando en pérdidas de presión y limitaciones de la transferencia de materia en la fase de la disolución (41) (40). Otro de los inconvenientes es el alto coste de las membranas, así como su alta tendencia a obstruirse (39).\n1.7.6 Ósmosis inversa\nLa ósmosis inversa puede ser utilizada de dos maneras, por un lado se puede tratar de deshidratar el caldo obtenido tras la fermentación, o por el contrario se puede intentar eliminar el producto deseado si se encuentra una membrana que tenga la selectividad adecuada para ello (39).\n23 La deshidratación del caldo puede estar unida a una posterior destilación, ya que de esta manera se consigue aumentar mucho la concentración de producto y así la destilación puede resultar más rentable desde un punto de vista económico (39).\nEstudios (44), han demostrado que el uso de la ultrafiltración para eliminar las células antes de la ósmosis inversa lleva a mejores resultados, ya que se evita la obstrucción de las membranas. Sin embargo el módulo empleado para llevar a cabo la ultrafiltración se ha comprobado que también se obstaculiza con relativa facilidad, lo que provoca que se deba sustituir en muy poco tiempo (39).\n1.7.7 Destilación en membrana\nLa destilación en membrana es una técnica en la que se utiliza una membrana microporosa e hidrofóbica para separar mecánicamente dos líquidos a temperaturas diferentes y soportar la interfase líquido vapor (45). En esta operación primeramente se calienta la alimentación hasta que se le suministra el calor latente de vaporización. Debido a que existe una diferencia de temperatura entre ambos lados de la membrana se creará una diferencia en las presiones de vapor a ambos lados, lo que provocará que el vapor generado atraviese la membrana (40) (45). Una vez que el vapor se encuentra en el otro lado de la membrana se debe condensar, y esto se puede hacer dentro o fuera de la célula, lo que dará lugar a diferentes tipos de destilación en membrana (45).\nFigura 5. Tipos de destilación en membrana\n24 que se pueden utilizar temperaturas más bajas que en la destilación convencional y que el colmatado de los poros se produce con menor frecuencia que en otras operaciones de membrana gracias a que los poros tienen un tamaño mayor (45).\nComo mayor desventaja se encuentra la necesidad de impedir que el líquido penetre en los poros de la membrana, cosa que ocurre cuando el líquido tiene la presión suficiente. Esta presión dependerá de la membrana, del tipo de líquidos difícilmente separables a través de la destilación convencional (45). En esta ocasión la alimentación está en contacto directo con un lado de la membrana, mientras que el permeado es eliminado como vapor al otro lado de la misma aplicando una presión parcial reducida (39) (45).\nLa diferencia con la destilación en membranas reside en que en esta únicamente se da un transporte a través de la membrana del permeado en estado vapor, no interviniendo directamente en la separación (función mecánica), mientras que en la pervaporación se da un transporte selectivo por fenómenos de solubilidad y difusión a través de la membrana que marcarán la selectividad de la misma (45).\nFigura 6. Esquema de la pervaporación.\n25 Como desventajas destacar que el flujo de permeado suele ser bajo, lo que lleva a tener que emplear grandes áreas superficiales (39).\n28 El objetivo del presente Trabajo Fin de Grado es el estudio de un proceso de fermentación en continuo para la obtención de butanol, utilizando sacarosa como sustrato mediante el microorganismo Clostridium beijerinckii.\nPara lograr este objetivo final, se han establecido los siguientes objetivos parciales:\n• Realización de ensayos en discontinuo con diferentes concentraciones de sustrato, para establecer las condiciones de operación más adecuadas.\n• Obtención a partir de los datos anteriores de las etapas implicadas en la fermentación, así como de los parámetros cinéticos y biológicos del proceso.\n• Diseño de una planta piloto-laboratorio que comprenda el dimensionado de los biorreactores y del equipo auxiliar necesario.\n• Arranque de la planta y planteamiento de estrategias de operación de forma que en los biorreactores se simulen las fases acidogénica y solventogénica y demuestren la viabilidad del proceso.\n3.1 Microorganismo utilizado y condiciones de cultivo\nEl microorganismo utilizado en este estudio fue Clostridium Beijerinckii DSM 6422, adquirido en la Colección Alemana de Microorganismos y cultivos (DSMZ).\nFigura 7. Clostridium Beijerinckii (x20).\n3.1.2 Mantenimiento y formación del inóculo\nLa cepa se conservó en Reinforced Clostridial Medium, RCM, (Fluka, Sigma-Aldrich, España) en tubos Hungate (18x150 mm), en forma de esporas y conservada a -20°C en condiciones anaerobias.\nPara preparar el medio de crecimiento se utilizaron penicilin flasks de 150 ml. El medio de crecimiento se compuso de una disolución que contenía el sustrato fermentable(I): 30 g/l de sacarosa, 1 g/l de extracto de levadura; una disolución de buffer(II): 0,5 g/l de KH2PO4, 0,5 g/l de K2HPO4, 2,2 g/l de acetato de amonio; una disolución de sales (III): 0,2 g/l de MgSO4·7H2O, 0,01 g/l de MnSO4·H2O, 0,01 g/l de NaCl, 0,01 g/l de FeSO4·7H2O; y una disolución de vitaminas (IV): 0,001 g/l de PABA, 0,001 g/l de Tiamina, y 0,00001 g/l de Biotina.\nEl procedimiento establecido para la preparación del medio de crecimiento fue el siguiente:\n33 Figura 8 Método utilizado para extraer el oxígeno.\nPosteriormente se autoclavó la disolución de azúcares para esterilizar el medio a 121 °C durante 20 minutos. A continuación se añadieron las disoluciones restantes a la disolución de azúcares en una cámara de flujo laminar utilizando filtros esterilizados (0,22 µm), finalizando así la preparación del medio de crecimiento.\nPreviamente a la inoculación del microorganismo dentro del medio preparado se realizó un choque térmico al mismo, introduciendo el tubo hungate donde se encontraba la cepa dentro de un baño de agua a 80 °C nada más sacarla del congelador durante 3,5 minutos, estimulando la germinación de esporas. Posteriormente se enfrió de nuevo durante 1 minuto con agua a temperatura ambiente. concentraciones fueron semejantes a los utilizados para la obtención del medio de crecimiento, residiendo la diferencia principal en la cantidad preparada.\nPara la operación en discontinuo se prepararon 900 ml de medio de fermentación y 100 ml de inóculo.\n34 Después, cuando se enfrió el reactor hasta la temperatura de fermentación, las disoluciones restantes fueron añadidas para evitar así la pérdida de propiedades de los diferentes compuestos añadidos al medio.\nFinalmente se inoculó el microorganismo en el reactor y comenzó la operación en batch. conservaran las mismas concentraciones presentes en el medio de crecimiento, obteniéndose así 696,5 ml de alimentación para recargar la alimentación de la planta.\nFinalmente, se procedió a la inoculación de los microrganismos en los biorreactores, siempre respetando que la concentración de los mismos fuera de un 10% v/v. En el apartado 4 se habla más en detalle sobre este aspecto en la sección 4.2.4 arranque.\nComo sustrato se utilizó sacarosa comercial para todos los experimentos realizados. existentes dentro del mismo. Además posee un agitador de palas acoplado a la tapa superior, un difusor que permite la dispersión de gases, un orificio para toma de muestras y un condensador.\n35 de un encamisado alrededor del mismo utilizando agua como fluido refrigerante, controlar el pH mediante la adición de algún ácido o base previamente provisto utilizando una o varias de las cuatro bombas peristálticas con las que viene equipado, o incluso controlar el nivel de líquido presente en el reactor introduciendo o extrayendo líquido del mismo, así como el caudal de gas a introducir comparando el flujo existente con una referencia dada.\nFigura 9. Reactor BIOSTAT BPlus\n3.3.2 Experimentación con 2 biorreactores en continuo\nPara la operación en continuo se diseñó una planta experimental compuesta por dos biorreactores encamisados de 0,5 L (R1) y 1 L (R2) de volumen útil respectivamente, de tal manera que era posible el mantenimiento de la temperatura en el interior de los mismos. Para poder llevar a cabo el experimento, se utilizaron tres bombas peristálticas que permitían mantener los flujos de operación constantes, y por tanto el estado estacionario.\nPara la agitación se utilizaron agitadores magnéticos con imanes de diferentes tamaños para cada reactor. Para el correcto suministro de la alimentación al conjunto de la planta se dispuso de un tanque de alimentación (T1), de manera que se pudiese asegurar unas condiciones anaerobias y estériles lo más estrictas posibles.\nFigura 10. Planta piloto para operación en continuo\n3.4.1 Determinación de azúcares, ácidos y solventes\nLa sacarosa, así como los productos de la fermentación, fueron analizados por HPLC utilizando una columna Aminex HPX-87H junto con un detector de medida del índice de refracción. Como fase móvil se utilizó una disolución 0,01 N de H2SO4 con un flujo de 0,6 ml/min, y se operó con una temperatura en la columna de 30°C. Previamente todas las muestras se diluyeron para poder ser correctamente analizadas (1:5), y se centrifugaron a 13400 rpm durante 10 min para separar los sólidos presentes en las mismas. Además una vez centrifugadas se filtraron utilizando filtros de nylon con 0,2 µm de porosidad.\n3.4.2 Medida de la biomasa\nLa cantidad de biomasa se determinó a través de la densidad óptica (OD) de las muestras recogidas, medida con una absorbancia de 600 nm en un espectrofotómetro HITACHI U200 UC/visible (Hitachi Ltd, Tokyo, Japón).\n3.4.3 Observación microscópica de los cultivos\nLa observación se realizó utilizando un microscopio (LEICA DM 400B) provisto de una lámpara de mercurio y otra halógena, además de cuatro lentes (5x, 10x, 20x y 100x). Para la visualización a través de un ordenador, y para la obtención de fotografías, se empleó el software LEICA APPLICATION SUITE.\n4.1 Experimentación en discontinuo\nSe llevó a cabo experimentación en discontinuo con una doble finalidad; por una parte, establecer los periodos de las fases acidogénica y solventogénica implicadas en la fermentación, y por otra, determinar los parámetros cinéticos y biológicos del proceso. En este sentido se dispusieron de datos de la evolución temporal de las concentraciones de sustrato, disolventes generados y biomasa producida.\nLos experimentos en discontinuo se llevaron a cabo en un reactor de 2 litros de volumen útil (BiostatBplus) equipado con un sensor de temperatura, nivel y pH. Este último fue controlado con un valor de 4,5, la temperatura en el interior del reactor se mantuvo en 35°C utilizando agua como fluido refrigerante, y la agitación se mantuvo a 175 rpm. Se plantearon dos ensayos utilizando concentraciones iniciales de sacarosa de 60 g/L y 30 g/L.\n4.1.1 Concentración de sustrato de 60 g/L\nEn este experimento se utilizó una concentración inicial de sacarosa de 60 g/l. La duración del mismo fue de 120 horas. Se han obtenido datos de la concentración de sustrato en todo momento, así como de todos los ácidos y disolventes generados, y de la biomasa presente en el bioreactor.\n40 Evolución de los disolventes\nSe muestra en la figura 11 la evolución de cada uno de los disolventes (acetona, butanol y etanol) durante todo el experimento.\nFigura 11. Evolución de los disolventes\nEn la figura anterior se observa como la evolución de la concentración de acetona y butanol sigue un patrón muy parecido, siendo siempre superior la de butanol y llegando a un máximo a las 96 horas de 7,67 g/l, frente a 4,56 g/l de acetona.\nCabe destacar que cuando la concentración de butanol llega a un valor en torno a 7.60 g/l la concentración del mismo se mantiene, y la concentración de biomasa disminuye de manera importante tal y como se puede comprobar en la figura 12. Esto sugiere que se produce una cierta inhibición a causa del mismo.\n41 Evolución del sustrato y microrganismos\nEn la figura 12 se observa cual fue la concentración de la sacarosa y de los microrganismos a lo largo de todo el experimento.\nFigura 12. Evolución del sustrato y microrganismos\n42 Evolución de sustrato, ácidos y disolventes\nEn la figura 13 se indica cuál ha sido la concentración total de la suma de ácidos y disolventes presentes en el biorreactor, y se muestra a su vez la relación de los mismos con la concentración de sustrato.\nFigura 13. Evolución de sustrato, ácidos y disolventes.\nSegún se puede comprobar en la figura 13, la concentración de disolventes es siempre superior a la de ácidos excepto durante las primeras horas de experimentación en las cuales los microorganismos se hallan en fase acidogénica. Después la concentración de disolventes es siempre muy superior a la de ácidos, llegando a ser al final de la experimentación de 12,56 g/l.\nLa concentración de ácidos por su parte alcanza un máximo en torno a las 70 horas con un valor de 3,90 g/l.\n43 Evolución de los ácidos\nEn la figura 14 se muestra cual ha sido la evolución de la concentración tanto del ácido acético como del ácido butírico a lo largo de todo el experimento.\nFigura 14. Evolución de los ácidos.\nEn la figura 14 se observa como la concentración del ácido acético se mantiene más o menos constante durante las 120 horas situándose en un valor en torno a 1,25 g/l. La concentración del mismo únicamente es superior a la de butírico durante las primeras 20 horas, momento tras el cual la concentración de butírico sufre un aumento importante dando lugar a un máximo en torno a 2,50 g/l que se mantiene más o menos constante hasta las 80 horas.\n4.1.2 Concentración de sustrato de 30 g/L\nEn este segundo experimento en discontinuo se utilizó una concentración de sacarosa de 30 g/l. En esta ocasión se midió la cantidad de sustrato presente en el bioreactor, los disolventes y la cantidad de microrganismos a cada instante. La duración del experimento fue de nuevo de 120 horas.\nLos resultados de este experimento pueden encontrarse en el anexo I en el apartado 1.2, en la tabla 10.\nA continuación se comentan los resultados obtenidos al igual que se hizo con el primer experimento.\nEvolución de los disolventes\nEn la figura 15 se muestra la evolución de la concentración de cada uno de los disolventes presentes en el medio de fermentación a lo largo del periodo de experimentación.\nFigura 15. Evolución de los disolventes\nTal y como se puede observar en la figura 15, la concentración de butanol y la de acetona siguen un comportamiento muy similar, estando presente el butanol con una mayor concentración a lo largo de las 120 horas, tal y como es característico en la fermentación ABE.\n45 Por último comentar que la concentración de etanol es de 0 g/l durante las primeras 40 horas para posteriormente subir y estabilizarse en torno a 0,25 g/l, presentando un máximo de 0,3 g/l a las 66 horas de experimentación. Evolución de sustrato y microrganismos\nEn la figura 16 se representa la evolución de la concentración de los microrganismos frente al consumo de sacarosa.\nFigura 16. Evolución de sustrato y microrganismos.\nEn esta figura se observa un descenso de sustrato muy pronunciado en las primeras 40 horas de experimentación, para luego establecerse en torno a 2,5 g/l durante unas 30 horas. Finalmente se puede comprobar como cerca de a las 100 horas la concentración de sacarosa es de 0 g/l en el interior del reactor, por lo que la utilización del sustrato es completa.\n4.1.3 Comparación en función de la concentración de sustrato\nPara la elección de la concentración de sustrato a utilizar durante la operación en continuo, se van a emplear una serie de datos obtenidos a partir de los dos experimentos anteriores de modo que sea más fácil realizar la elección. Estos datos se muestran en las tablas 1 y 2.\nEn la tabla 1 que se muestra a continuación, aparecen las concentraciones máximas de cada uno de los disolventes presentes en el biorreactor, así como la concentración final de sustrato. Destacar que el número entre paréntesis representa la hora a la que se alcanzó dicho valor.\nTabla 1. Resumen de resultados en discontinuo\nEn vista de estos datos, se observa como en el primer experimento en el que la concentración de sustrato es del doble que en el segundo, la concentración de todos y cada uno de los disolventes es mayor, siendo esta en torno al doble respecto al segundo experimento.\nDestacar por otro lado como la utilización de sacarosa es completa en el caso de la operación en discontinuo con 30 g/l de concentración inicial de sustrato, mientras que con 60 g/l es aproximadamente del 89%.\n4.1.4 Determinación de parámetros biológicos y cinéticos\nA partir de los resultados obtenidos anteriormente, se procedió al cálculo de los coeficientes de rendimiento y los ratios entre los disolventes producidos y biomasa generada, respecto del consumo de sustrato.\nLos rendimientos mostrados en la tabla 2 son los máximos obtenidos, y el ratio resultante es una media de los correspondientes a distintos tiempos de experimentación.\nY / =x − xs − s\nRatio butanol =butanol + acetona + etanolbutanol\nRatio acetona =butanol + acetona + etanolacetona\nRatio etanol =butanol + acetona + etanoletanol\n48 Una vez comparados ambos experimentos se ha decidido emplear una concentración de 30 g/l para realizar la operación en continuo debido a que si bien las concentraciones de producto son mucho mayores en el caso en el que la concentración de sacarosa inicial es de 60 g/l, se observa también como la utilización de sustrato no es completa por lo que se estaría desperdiciando parte del mismo.\nAdemás pese a que las concentraciones son mucho más elevadas, a la hora de evaluar los rendimientos, si bien son iguales o superiores en el caso en el que se emplea una mayor concentración inicial, no lo son por mucho margen, y el tiempo que se tardan en conseguir es mucho más elevado, lo que puede afectar gravemente al dimensionado de los biorreactores, necesitando volúmenes mucho mayores o flujos muy pequeños.\n4.1.5 Velocidad de crecimiento máxima\nUna vez elegida la concentración de sustrato inicial a emplear (30 g/l), se procede al cálculo de la velocidad de crecimiento máxima de los microrganismos (µmax), que nos permitirá posteriormente dimensionar correctamente los biorreactores en la operación en continuo.\nPara ello se va a utilizar la siguiente expresión con los datos experimentales obtenidos y mostrados anteriormente:\nμ, =1xdxdt → μ, =dlnxdt\nPara obtener la velocidad máxima de crecimiento se necesitan los datos del logaritmo neperiano de la concentración de microrganismos frente al tiempo, los cuales se muestran a continuación en la tabla 3.\nTiempo(h) X (g/l) ln X\n49 A continuación se procede a representar los datos de manera que se pueda extraer a partir de la pendiente correspondiente a la fase de crecimiento exponencial el valor deseado.\nFigura 17. Ln de la biomasa frente al tiempo\nEl ajuste de los datos se ha realizado empleando el método de los mínimos cuadrados, con una R2=0,9994.\ny = 0,0594 − 0,348\nμ, 0,06 h :\nEn la bibliografía se reseña un valor de velocidad de crecimiento μ,\nDe los experimentos realizados en discontinuo se ha comprobado cómo resulta más eficaz la utilización de 30 g/l de sacarosa en lugar de 60 g/l, ya que como se ha comentado pese a que la concentración de productos sea superior, a la hora de analizar los rendimientos los resultados son muy similares.\n4.2 Operación en continuo\nPara operar en continuo se seleccionó la estrategia de utilizar dos biorreactores en serie, estableciendo como criterio de diseño el que tuvieran lugar las fases implicadas en la fermentación en cada uno ellos. De esta manera, en el primero de ellos se produciría la fase acidogénica, en la que se pretende que los microorganismos crezcan rápidamente, y en el segundo de ellos la solventogénica, donde se espera obtener los productos principales. 4.2.1 Dimensionado de los biorreactores\nEl primer paso en el diseño de la planta consistió en obtener la velocidad de dilución del primer biorreactor, en el que se llevaría a cabo la fase acidogénica. La velocidad máxima de dilución corresponde con la velocidad máxima de crecimiento tal y como se demuestra a partir de un balance de materia a los microrganismos del primer reactor (1):\nV= · ?x − x @ V · r (1)\nSe analiza ahora el término de reacción:\nr = μ · x (2)\nSustituyendo la ecuación 2 en la ecuación 1, y teniendo en cuenta que la velocidad de dilución (D) se define como el caudal dividido entre el volumen, se obtiene:\nD =V=V (3@\nD · ?x − x @ μ · x (4@\nPor último se debe tener en cuenta que la alimentación entra en condiciones estériles (x 0). Finalmente resulta la siguiente expresión:\nD = μ (5)\nPor lo tanto si se conoce la velocidad de crecimiento de los microorganismos, se conocerá la velocidad de dilución.\n52 Para el segundo reactor (R2) se estableció un valor de la velocidad de dilución cinco veces menor, de tal manera que se completara la fase solventogénica y pudiera agotarse además completamente el sustrato.\nLos volúmenes útiles que se fijaron, para llevar a cabo la fermentación, fueron de 150 mL para el primer reactor y de 750 mL para el segundo reactor. Los volúmenes finales fueron sobredimensionados para asegura una correcta operación que pudiera derivarse de la formación de espumas, arrastre por gases, etc.\nUna vez fijado el volumen y también la velocidad de dilución, según la ecuación 3, es posible calcular el flujo que las bombas deben aportar, para poder operar en estado estacionario..\n4.2.2 Construcción y puesta a punto de la planta\nDebido al pequeño caudal con el que se debía trabajar, se encontraron problemas a la hora de bombear el líquido, por lo que se realizaron múltiples pruebas con tubos de diferentes diámetros hasta que se comprobó que los tubos de 4cm de diámetro eran los mejores.\nUna vez escogido el tamaño de los tubos a utilizar se realizó el calibrado de las bombas de manera automática (con el software instalado en la bomba), y de manera manual (medida volumen / tiempo, hasta conseguir los flujos deseados.\nUna vez que las bombas funcionaban se realizaron pruebas hidráulicas para comprobar que el nivel se mantenía constante dentro de los reactores. Para ello antes de montarlos se comprobó con probetas durante varios días que el nivel de las mismas no experimentaba cambios bruscos, consiguiendo finalmente variaciones de nivel al cabo de 2 días de operación en torno a 7 ml en el primer reactor y 20 ml en el segundo utilizando agua para realizar las pruebas, por lo que se consideró que el nivel se mantenía lo suficientemente constante.\n53 4.2.3 Modo de operación\nEn la figura 18 se puede observar un esquema de la planta que se ha empleado para operar en continuo. La planta consta de dos reactores encamisados R1 y R2 con 0,5 L y 1 L de volumen útil respectivamente. Los volúmenes utilizados para realizar los experimentos, han sido 150ml y 750 ml. Además se utilizaron tres bombas peristálticas que proporcionaban el caudal necesario para mantener constante el nivel de los tanques.\nFigura 18. Esquema de la planta piloto\nSe disponía además de dos depósitos adicionales: en el tanque T1 es donde se almacenó la alimentación que pasaría posteriormente al reactor 1, y el tanque T2 se utilizó para recoger el producto.\nPara mantener la temperatura constante a 35 °C se utilizó un termostato que vehiculaba agua como fluido de intercambio a través de la camisa de ambos reactores. Para efectuar una correcta agitación, se emplearon agitadores magnéticos tanto en ambos reactores, como en el Tanque T1 de alimentación, manteniendo así la homogeneidad de la mezcla.\n54 contaminación del experimento en la medida de lo posible. Las válvulas V1 y V2 se utilizaron para permitir o no el suministro de nitrógeno a todos los tanques, pudiendo así burbujear únicamente uno de ellos si era necesario sin tener que hacerlo en el resto.\nSe tomaron muestras cada 24 horas aproximadamente de ambos reactores, para medir las concentraciones de sacarosa, ácido butírico, ácido acético, acetona, butanol y etanol presentes en los mismos. La toma de las mismas se realizó a través de las válvulas de tres vías V3 y V4.\nDestacar que durante la experimentación se realizaron modificaciones en diversas partes de la planta hasta que se llegó al esquema final mostrado en la figura 18. Los motivos de estos cambios fueron dirigidos a encontrar las máximas condiciones de esterilidad en la instalación.\nLa estrategia de arranque varió en cada uno de los experimentos, y estuvo muy condicionada por el problema de intoxicación ácida comentado en el apartado 1.2. Debido a este problema se decidió que el tiempo de operación en batch del primer reactor donde se simuló la fase acidogénica, no podía superar nunca las 24 horas de operación, para obtener así células que no estuvieran afectadas por la ruptura provocada por esta intoxicación.\nLas estrategias de arranque utilizadas para cada uno de los experimentos han sido las siguientes:\n• En el experimento 1, primeramente se inoculó R1 (10% v/v), y 2 horas después se inoculó R2 (10% v/v). Una vez inoculados ambos reactores se dejó que la planta operara en batch durante 20 horas, periodo tras el cual se activaron las bombas y se comenzó la operación en continuo.\n• En el experimento 2 se inocularon ambos reactores a la vez, y 24 horas después se comenzó la operación en continuo.\n• En el experimento 3 se inoculó primeramente R2, y 8 horas después se inoculó R1. Una vez inoculados ambos reactores se mantuvieron operando en batch durante 19 horas, y posteriormente se comenzó la operación en continuo.\nAprovechamiento de subproductos de la industria extractora de aceite de palma africana para la obtención de un alimento balanceado para animales\n5 Universidad de Guayaquil Facultad de ingenier?a qu?mica Tesis de grado Previa a la obtenci?n del titulo de Ingeniero qu?mico Tema APROVECHAMIENTO DE SUBPRODUCTOS DE LA INDUSTRIA


Científicos: «En el espacio abundan planetas como la Tierra que podrían albergar vida» | CODIGO OCULTO\nCientíficos: «En el espacio abundan planetas como la Tierra que podrían albergar vida»\nCientíficos polacos del observatorio astronómico de la Universidad de Varsovia han descubierto que entre los cuerpos espaciales conocidos como planetas vagabundos, errantes o huérfanos ―que se mueven independientemente por el espacio sin estar sujetos a una estrella― son más abundantes aquellos similares a la Tierra. Algunos especialistas especulan que los mismos podrían ser apropiados para albergar vida, reporta The Daily Mail.\nLos investigadores analizaron una protuberancia central en la Vía Láctea para llegar a las conclusiones publicadas en la revista Nature. Según el estudio, los planetas vagabundos del tipo de Júpiter son al menos 10 veces menos comunes de lo que se creía anteriormente. El equipo señala que los astros rocosos del tamaño de la Tierra son más difíciles de detectar, pero que podrían ser más abundantes que planetas como Júpiter.\n«Hemos detectado algunos posibles eventos de duración ultracorta ―menos de medio día― lo que podría indicar la existencia de planetas de libre flotación de masa de Tierra o de masa de supertierra, como lo predijeron las teorías de formación de los planetas», comentó el investigador Przemek Mroz. Sin embargo, el especialista añadió que tales eventos «no están bien cubiertos por las observaciones y es difícil, si no imposible, probar o refutar su naturaleza como planetas flotantes».\nLa conclusiones del estudio han sido publicadas en la revista Nature.\nArtículo anteriorRobot submarino realiza un gran descubrimiento en la central nuclear de Fukushima (Vídeo)\nArtículo siguienteCientífico afirma haber resuelto el misterio del Triángulo de las Bermudas\nEXTRANGE 25 julio, 2017 En 12:35\nEs imprescindible la presencia de una estrella, una atmósfera y un campo magnético que retenga la atmósfera y desvíe las radiaciones cósmicas, para que un astro frío, o planeta pueda albergar vida.\n¿Está Snowden a punto de revelar documentos sobre extraterrestres y proyectos...\nRedacción CODIGO OCULTO - 30 septiembre, 2015 0


Educación Integral, Arte y Ciudadanía: Congreso FRACTAL 09. Medellín. 3 al 6 de Marzo de 2009\nCongreso FRACTAL 09. Medellín. 3 al 6 de Marzo de 2009\nFRACTAL 09 es un congreso que se celebrará en Medellín del 3 al 6 de Marzo del 2009. Tiene por temática y por nombre: Ciencia ficción, nuevas tecnologías y literatura fantástica..\nEl congreso contará con la participación de expertos de Estados Unidos, España, Argentina, Chile y Colombia, además de ochocientos asistentes: estudiantes universitarios, profesionales, docentes, investigadores y jóvenes empresarios del país y Latinoamérica.\nDurante los días del congreso se realizarán eventos culturales en diferentes escenarios de la ciudad: conciertos, exposiciones de arte, cine y lecturas públicas.\nEl organizador del congreso PROYECTO LIQUIDO, pretende crear experiencias a partir de historias que exploran el impacto de la ciencia y la tecnología en el ser humano, además de promover la intersección de prácticas artísticas y experimentaciones sensoriales a través de la experiencia de la lectura.\nAlgunos Invitados a FRACTAL09:\nBruce Sterling (Browsville, Texas, EEUU, 4 de abril de 1954): es uno de los más importantes escritores de ciencia ficción actual. Conocido en Latinoamérica por el libro “Mirrorshades: Una Antología Ciberpunk” y el libro de no-ficción “La Caza de Hackers”, Bruce Sterling fue uno de los fundadores y el principal promulgador ideológico del movimiento Ciberpunk.\nLucius Shepard (Lynchburg, Virginia, 1947): es uno de los más importantes escritores norteamericanos vivos, tanto en ciencia ficción, como en fantasía y mainstream, aunque su trabajo trasciende cualquier categorización. Ha viajado por todo el mundo y ha encontrado en Latinoamérica un paisaje encantador que lo ha inspirado en muchas de sus historias, tanto en ciencia ficción –con elementos tecnológicos de un futuro próximo–, como en una fantasía muy cercana al realismo mágico, y recientemente, en no ficción.\nJames Patrick Kelly (Mineola, New York, 1951): escritor de ciencia ficción ganador de dos Premios Hugo y un Premio Nébula. Enseña y participa frecuentemente en talleres de ciencia ficción como el aclamado Clarion y el Taller de Escritores Sycamore Hill. Ha sido miembro del New Hampshire State Council on the Arts desde 1998 y presidente del consejo en 2004. Sus cuentos han sido traducidos a dieciséis idiomas y ha coeditado con el escritor John Kessel dos antologías importantes para entender dos nuevos subgéneros que surgen en la literatura: "Feeling Very Strange: The Slipstream Anthology" y “Rewired: The Post-Cyberpunk Anthology”.\nJohn Kessel (Buffalo, New York, 1950): escritor de ciencia ficción ganador de los premios Nébula, Theodore Sturgeon Memorial, James Tiptree y Locus. Luego de obtener un PhD en Inglés de la Universidad de Kansas, ha sido organizador del taller de escritores Sycamore Hill, y ha dado clases de literatura norteamericana, ciencia ficción y literatura fantástica en la universidad North Carolina State desde 1982, institución donde se le reconoce como el primer director del programa MFA de Escritura Creativa.\nPublicado por Ciberculturas-Colombia en 13:54\nEtiquetas: ciencia ficcion, Colombia, cultura política, literatura fantastica, medellin, nuevas tecnologias


Micropigmentacion Centro Armonia Área Empresas\nEl Campello, 2 03205 Elx/elche (Alicante) Ver mapa\nInformación sobre Micropigmentacion Centro Armonia\n¿Te gustaría lucir un maquillaje duradero y personalizado? En Micropigmentación Centro Armonía cuenta con la última tecnología para este tipo de tratamiento permanentes para cejas, ojos y labios. De esta manera, conseguirás lucir espléndida sin tener que preocuparte de nada en un día tan importante. En función de tus necesidades, podrás elegir aquella zona que prefieras consiguiendo así realzar tu belleza natural.\nCuentan con una amplia experiencia en el sector, asegurando así su profesionalidad en este campo. Su especialidad, es la micropigmentación de labios, cejas y ojos, con el objetivo de mejorar el contorno, corregir asimetrías, dar más volumen, realzar o potenciar la mirada.\nEsta empresa de belleza te brindará un servicio único y cuidado al más mínimo detalle. Os ofrecerán un servicio de micropigmentación basado en la implementación de pigmentos en la epidermis, a fin de resaltar rasgos faciales. Utilizando las mejores tecnologías y las últimas técnicas en el sector os aseguraréis de obtener un resultado espectacular.\nDesde 160€ hasta 519€\nTratamientos y programas de belleza, dietética y nutrición, asesoría de imagen, Tratamiento estético,…Ver más rejuvenecimiento facial y corporal con tecnología y cosmética, ciencia ageloc\nBono de 6 sesiones de tratamiento estético, rejuvenecimiento facial y corporal con tecnología y…Ver más cosmética, ciencia ageloc + 1 micropigmentación a elegir en cejas, ojos o labios\nMás información sobre Micropigmentacion Centro Armonia\nEn efectivo al realizar el trabajo\nGlitter Wedding Belleza Novias, Alacant/alicante\nSi tú lo sueñas, ellos pueden hacerlo realidad. Glitter Wedding es una empresa que se encargará de materializar tu idea...\nClínica Sergio Piñol Belleza Novias, Elx/elche\nDurante la boda todas las miradas están puestas en ti, serás el centro de todos los comentarios. En un día en el que tú...\nPrincipal micro boda\nMicropigmentación piel morena\nNovia micropigmentación diseño\nNovia micropigmenos tonos\nPromociones de Micropigmentacion Centro Armonia\nMapa de localización Micropigmentacion Centro Armonia


Duro combate a la MS en frontera mexicana / 20 de Noviembre / 2003\nEN EL MUNDO Autoridades detienen pandilleros todos los días\nLos mareros que cometen delitos graves son puestos a la orden de jueces antes de ser repatriados a sus países de origen.\nnacional@elsalvador.com Agentes de la Policía Sectorial de Chiapas custodian a salvadoreños que delinquían en la zona. Foto: EDH\nEl procurador de Justicia del Estado mexicano de Chiapas, Mariano Herrán Salvatti, dio a conocer que ayer fueron puestos a disposición del juez del Ramo Penal a 31 miembros de la Mara Salvatrucha que acaban de cumplir su mayoría de edad.\nPor haber tenido menos de 18 años al momento de su captura, los pandilleros habían permanecido en el Centro tutelar para Menores Infractores Villacrisol.\nEl gobierno de Chiapas tomó la decisión de consignar a los 31 mareros, porque los delitos que cometieron son graves y el tiempo que deben pasar en prisión es largo. Tienen que tener un castigo, un reproche social a la conducta que ellos hicieron, manifestó Salvatti.\nPor otro lado, en el caso de 20 pandilleros de la misma Mara Salvatrucha que continúan siendo menores de edad, hicieron una negociación con el Instituto Nacional de Migración para repatriarlos directamente a El Salvador. Esto por instrucciones del gobernador del Estado, Pablo Salazar Mendiguchía.\nPrecisó que la mayoría de estos mareros fueron quienes provocaron enfrentamientos, disturbios internos y motines en Villacrisol, donde estaban recluidos. Por lo que decidimos que no tenían por qué estar allí y que se fueran a su país de origen, para que allá sean reprimidos como debe ser, dijo.\nAdemás, Salvatti señaló que, antes, los dejaban ir en la línea fronteriza. Sin embargo, más tardaban en dejarlos que ellos en regresar. Devolviéndolos a su lugar de origen tenemos un doble objetivo. Primero hacerles más difícil el regreso y, segundo, en El Salvador existe un combate muy fuerte con estas manifestaciones de violencia juvenil a través de una ley especial que están aplicando, lo que les permite combatirlos con mayor eficacia, afirmó.\nPara Salvatti, este es un fenómeno que solamente se está presentando en la costa de Chiapas, debido a que vienen huyendo de su país o van de paso a Estados Unidos.\nLos efectivos que patrullan la zona fronteriza de Chiapas tienen múltiples denuncias de delitos cometidos por pandilleros.\n31 mareros que ya tienen la edad para responder por sus actos, comparecieron ante la justicia mexicana debido a graves delitos.\n20 menores siempre de la MS fueron repatriados a El Salvador después de amotinarse en el centro donde estaban recluidos.


Un niño se chupa un dedo: cómo destetar, mejores maneras y causas / WebInfantil\nArtículo anterior Heces normales en un bebé y su frecuencia Próximo artículo ¿Cómo debe ser la apariencia de un recién nacido?\nCuando se les amamanta\nEfecto en el crecimiento de los dientes\n¿Cómo puedes destetar?\n¿Por qué es imposible conectarse?\nEncontramos una alternativa\n¿A qué edad se convierte en un problema?\nChuparse los dedos para un niño pequeño puede convertirse en un problema grave. Si antes dicho comportamiento se consideraba simplemente como un mal hábito, tratando de evitar que el bebé chupara su dedo con todas sus fuerzas, ahora la actitud hacia este problema ha cambiado. ¿Por qué el niño comienza a chuparse un dedo y cómo desacostumbrarlo de tal acción?\nLa razón principal para chuparse un dedo es el deseo del niño de satisfacer el instinto de chupar. Se observa que los niños que tienen una frecuencia de alimentación más a menudo se chupan los dedos con menos frecuencia. Además, los bebés que chupan la leche más rápidamente recurren a chuparse el dedo con más frecuencia que los bebés que succionan la leche durante mucho tiempo.\nEl niño puede chuparse un dedo porque:\nÉl está hambriento o todavía quiere chupar su tetero.\nSus dientes están cortados y quiere rascarse la encía.\nEl niño no tiene suficiente atención y amor de sus padres.\nEsta acción lo tranquiliza y lo mantiene calmado.\nFue demasiado temprano o muy severamente excomulgado.\nLa mayoría de las veces, chuparse un dedo se puede ver en los bebés, y el tipo de alimentación afecta el desarrollo de este hábito.\nLos bebés que reciben leche materna chupan dedo con poca frecuencia, especialmente si la madre le da pecho al bebé cuando lo ha pedido y no interfiere con la succión. Mami no ve si hay leche en su pecho, por lo que le da al bebé la oportunidad de chupar más que cuando se alimenta de un biberón.\nA menudo, los bebés con alimentación artificial comienzan a chuparse un dedo si beben una porción de la mezcla demasiado rápido. Normalmente, el bebé debe succionar la leche del biberón durante 20 minutos (esta vez solo está chupando, sin contar los intervalos de descanso), y los orificios del pezón deben dimensionarse para garantizar que la leche se succione con precisión durante dicho período de tiempo.\nUn niño muy rara vez comienza a chuparse un dedo a esta edad, por lo general se le veía antes en esta acción. Los niños mayores de 12 meses chupan los dedos por comodidad, cuando están aburridos, tristes, cansados o quieren quedarse dormidos. Por lo tanto, para deshacerse de este hábito, necesitan medidas completamente diferentes a las del primer año de vida.\nEn la mayoría de los casos, los niños chupan los pulgares. Si tal hábito se arraiga y el niño sigue chupando el pulgar por encima de los 4 años, existe un alto riesgo de maloclusión, así como del habla. El problema es que al succionar, la piel del dedo se engrosa y puede incluso inflamarse. La succión prolongada también puede conducir a la deformación del dedo.\nA menudo en los niños pequeños que se chupan un dedo, los dientes superiores de leche en el frente sobresalen ligeramente hacia adelante, mientras que los dientes inferiores están ligeramente inclinados hacia atrás. Cuanto más tiempo un niño se chupa un dedo, más pronunciado será el desplazamiento de los dientes. En muchos aspectos, la posición de los dientes estará determinada por la posición del dedo en la boca durante la succión. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que esta acción no afecta los dientes permanentes, si el niño dejó de chuparse un dedo antes de los seis años.\nEn los métodos de destete para chuparse los dedos, los padres muestran un ingenio considerable, sin embargo, no se recomienda hacer con el bebé lo siguiente:\nUntar el dedo con jugo de aloe, mostaza, laca amarga u otra cosa con un sabor muy desagradable.\nVende sus dedos y átale las manos.\nUse mitones densos o cóselos a la camisa.\nHaga un llamado de atención al niño, obligándolo a sacar su dedo.\nAmenazan o castigan.\nVincular las manos del bebé y otras medidas restrictivas hacen que el bebé sufra. Además, tales acciones no salvarán al bebé de chuparse un dedo. Tan pronto como la madre deje de atarle las manos o untarle el dedo con algo desagradable, el niño volverá a su hábito y chupará aún más intensamente que antes de atarlo, ya que necesitará calmarse.\nTome medidas para chuparse el dedo inmediatamente, tan pronto como los padres noten tales acciones del bebé. Especialmente si necesita chupar el dedo el bebé durante los primeros tres a cuatro meses de vida, y después de seis meses en la mayoría de los niños, el instinto de succión comienza a disminuir. Y entonces, los primeros intentos de chupar los dedos de los niños comprometen hasta 3 meses. Un poco más tarde, todos los niños comienzan a chupar y mordisquear los dedos debido a los dientes. Este comportamiento debe delinearse con chuparse un dedo.\nSi el bebé es amamantado, la duración de la lactancia materna debe aumentarse a 30-40 minutos. En los casos en que la madre para una alimentación le da al bebé de inmediato ambos senos, debe mantener al bebé durante más tiempo en el primer seno. Un niño con alimentación artificial necesita seleccionar el pezón correcto para un biberón para que el bebé succione la mezcla lo suficiente.\nNo se recomienda reducir el número de alimentaciones para un bebé chupando un dedo. Por el contrario, a veces es necesario agregar una alimentación, que a su debido tiempo puede cancelarse.\nLos niños mayores de un año deben descubrir la razón de este comportamiento. Quizás, el niño carece de una sociedad de pares, juguetes o comunicación con su madre. Trate de proteger al bebé de diversas tensiones y también aumente el contacto físico de la madre con el bebé.\nSi un niño de 3 a 6 años sigue chupando un dedo, hable con él, como con un interlocutor igualitario. Vaya al dentista con el niño, deje que le diga por qué es dañino chuparte el dedo. También dígale al bebé que este hábito es adecuado solo para niños pequeños, enfatizando que el niño que deja de mamar se vuelve completamente adulto.\nEnseñar a un niño a calmarse de otra manera, por ejemplo, expresando sus propios sentimientos con palabras, leyendo un libro, sentándose en los brazos de una madre.\nDele al niño un juguete que pueda digirir con los dedos, por ejemplo, una pequeña pelota de goma.\nHaz que una pequeña fashionista sea una bonita manicura, similar a la de una madre, que no quiere estropearse.\nA los bebés se les puede ofrecer un abstemio, que se convertirá en una alternativa para chuparse los dedos.\nEl dedo succionador no causa ansiedad en adultos. Si el niño ya cumplió un año y sigue chupando un dedo, los padres comienzan a preocuparse, pero realmente no necesitan preocuparse. A menudo, esta succión sigue siendo un reflejo y el hábito indeseable desaparece rápidamente, si los adultos entienden su causa y ayudan al bebé.\nLa situación se agrava si el niño de 3-4 años chupa su dedo. En primer lugar, debe evaluar el estado psicológico del bebé, porque este comportamiento puede tener motivos muy serios. Y deshacerse de la adicción de chuparse un dedo más de la edad de 3 años ya es más difícil, y aumenta el riesgo de un efecto negativo sobre los dientes y el habla.\nEl secreto principal: si la madre ya está desesperada en su deseo de destetar al bebé, un hábito tan dañino en su opinión, debería detenerse. Chupar un dedo es realmente una señal de alarma, a lo que debes responder. Pero no lo tome como una catástrofe, que debe tratarse con urgencia.\nSé paciente y actúa de manera consistente. Intente crear las condiciones más favorables para que el bebé se desarrolle y viva. Solo los padres dependen del bienestar de los bebés. Y si la madre entiende esto, las posibilidades de despedirse con éxito del hábito de chuparse un dedo aumentarán.\nSi el niño está chupando solo el pulgar, puede ofrecerle que no le quite los otros dedos y que los chupe también. Muchos bebés, tratando de cumplir un recado, están tan cansados de chuparse los dedos que dejan de hacerlo.\nUn pediatra reconocido, como otros médicos, considera que la satisfacción instintiva del reflejo de succión es la razón por la que se chupa un dedo. Sugiere cambiar la atención del niño a un maniquí, experimentando con sus diferentes tipos. Komarovsky está seguro de que es inútil luchar contra los instintos. Si los padres "toman" el dedo del niño, sin duda deben ofrecerle algo. No erradique este fenómeno, sino cree una alternativa a él.\nPara que el niño no comience a chuparse los dedos, tales acciones son adecuadas:\nAl bebé se le debe dar un seno por un tiempo prolongado.\nSi el bebé tiene un fuerte reflejo de succión, acostumbrar a un niños a un chupete.\nDurante el período de la dentición, dele al bebé "roedores".\nMás para comunicarse con el bebé, jugar, mostrar el mundo que te rodea.\nComprometerse constantemente con lo que mejora las habilidades motrices y tomarse de las manos: modelar, jugar con arena, rompecabezas plegables, un diseñador, mosaico y similares.