Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy | Protocol (Translated to Spanish)\nVisualizar el lazo intracelular del tráfico de por vida de fluorescencia microscopía de imágenes\nAnálisis de la fusión de la membrana SNAREediada usando un ensayo de fusión celular enzimática…\nNanogold Etiquetado del Sistema Endosomal Levadura de análisis ultraestructurales…\nEste protocolo describe un nuevo método que permite la visualización cuantitativa de la formación de complejos de proteínas SNARE, basado en la transferencia de energía de resonancia Förster y toda la vida de la fluorescencia microscopía de imágenes.\nSoluble N- etilmaleimida sensible proteína (NSF) accesorio proteína del receptor (trampa) proteínas de fusión son clave para el tráfico de la membrana, ya que catalizan la fusión de la membrana en las células eucariotas. La familia de proteínas SNARE consiste en alrededor de 36 miembros. Rutas de transporte intracelulares específicos son catalizadas por conjuntos específicos de 3 o 4 proteínas SNARE que contribuyan a la especificidad y fidelidad de la membrana trata. Sin embargo, estudiar la función precisa de proteínas SNARE es técnicamente difícil, porque trampas son muy abundantes y funcionalmente redundante, con más trampas que múltiples y superposición de funciones. En este protocolo, se describe un nuevo método para la visualización de la formación de complejos de trampa en células vivas. Este método se basa en la expresión de proteínas SNARE C-terminal Unidas a proteínas fluorescentes y medir su interacción por energía de resonancia Förster transferencia (traste) empleando vida de fluorescencia microscopía (FLIM) la proyección de imagen. Encajando los histogramas de por vida de fluorescencia con un modelo de decaimiento multicomponente, FRET-FLIM permite (semi-) estimación cuantitativa de la fracción de la formación del complejo SNARE en diferentes vesículas. Este protocolo se ha aplicado con éxito para visualizar la formación compleja de la trampa en la membrana plasmática y en compartimientos endosomal en células mamíferas y las células inmunes primarias y puede ser fácilmente extendido para estudiar funciones de trampa en otros organelos en animal, vegetal y células fúngicas.\nTrata de la membrana es una característica central de las células eucariotas, donde vesículas de membrana bud apagado de un orgánulo de donantes hacia y del fusible con un organelo blanco1,2. Excepción de las mitocondrias, todos estos pasos de la fusión de la membrana son catalizados por miembros de la proteína SNARE familia1,2. La familia de proteínas SNARE consiste en alrededor de 36 miembros en células de mamíferos y cerca de 20 miembros en levadura2. Proteínas SNARE contienen uno o dos ~ 52 residuos de largo, nativamente regiones, denominadas SNARE-motivos. Proteínas SNARE son atadas a menudo a las membranas por una hélice transmembrana c-terminal1,2. Trampas pueden ser categorizados basado en los residuos central contribuyen a la trampa compleja en arginina (R) y glutamina (Q) trampas1,2. Fusión de membrana está impulsada por la interacción de 3 o 4 trampas cognadas que juntos contribuyen 4 trampa-motivos y se distribuyen sobre el donante y aceptor de1,de membrana2. Un complejo de la trampa consiste en un adorno de lazo R y tres motivos Q-SNARE (llamados Qa, Qb y Qc). Formación de complejos se inicia en el termini N de los motivos de lazo, formando una llamada trans-trampa-complejo y continúa hacia C-termini, formando un apretado haz de en espiral-arrolle α-helicoidal llamado un cis-trampa-complejo. La formación de complejos de incluso una sola trampa compleja arrastra a las membranas del donante y del aceptador y supera la barrera de energía para la fusión de la membrana3.\nA menudo técnicamente es difícil asignar distintos complejos SNARE a rutas de transporte específicas dentro de las células. Aunque trampas contribuyen claramente a la especificidad de tráfico de la membrana, son promiscuos, funcionalmente redundante, y sus funciones superponen1,2. Debido a esto, experimentos de perturbación a trampas, como por knockout de genes, RNA de interferencia, la introducción de anticuerpos de bloqueo o con fragmentos SNARE soluble actúa como negativos dominantes, con frecuencia no resultan en fenotipos claros como otro Trampas compensarán2,4. Por otra parte, es difícil de distinguir pasos de fusión de membrana específico de eventos de tráfico por aguas arriba, porque de trampas se pueden participar en varias rutas de transporte2. Estudios de localización de trampas por microscopia enfoques, mediante inmunomarcación o genética fusión a proteínas fluorescentes reportero, sufren de los problemas que: (i) trampas localizar varios orgánulos como ellos a menudo median varios pasos la trata de personas y (ii) sus localizaciones no significan automáticamente que funcionalmente se dedican a formación complejo SNARE. Finalmente, complejos SNARE pueden identificarse mediante experimentos de inmunoprecipitación utilizando una de las trampas como cebo y las otras trampas como blancos, pero esto no permite la asignación de estos complejos organelos específicos o las rutas de tráfico. Así, actualmente, no hay ninguna técnica alternativa para visualizar complejos SNARE con resolución organellar. Inmunofluorescencia no es capaz de demostrar las interacciones de la trampa pero puede mostrar sólo la presencia o ausencia de co-localización, mientras inmunoprecipitación sólo puede mostrar interacciones trampa en toda la población de la célula pero no asignan los organelos donde estas las interacciones ocurren.\nPara superar estas limitaciones, un nuevo método que permite la visualización cuantitativa de complejos SNARE dentro de células vivas con resolución organellar fue desarrollado recientemente por Verboogen et al. 5 este método se basa en la expresión de pares de trampas con proteínas fluorescentes espectralmente desplazadas fusionados con el C-terminal a sus hélices transmembranales. Después de la terminación de la fusión de la membrana y la formación de un cis-encadenar complejo, estos fluoróforos en el termini de C de las hélices transmembranales inmediatamente se yuxtaponen entre sí. Los fluoróforos son entonces dentro de la distancia de Förster (típicamente < 5 nm), resultando en traste de fluoróforo donantes verde-cambiado de puesto al fluoróforo aceptor rojo-cambiado de puesto5,6. FRET resultados en Temple de fluoróforo donador y una mayor emisión del fluoróforo aceptor que puede ser medida de la proporción de la emisión del donador y aceptor (radiométrica traste). Sin embargo, radiométrica traste entre dos moléculas diferentes es un reto, debido a niveles de diafonía y diferente fluorescencia del donador y aceptor trampas en distintos orgánulos y células7,8. TRASTE se puede medir también de la vida de la fluorescencia, que es el tiempo entre la excitación y la emisión de un fotón. Si el fluoróforo donador puede liberar su energía por nerviosismo, esta competencia resultado de proceso en un aparente acortamiento de la vida de la fluorescencia. Esto se puede medir por el FLIM7,8. Vida traste es mucho más sólido que radiométrica traste para medir interacciones entre dos moléculas diferentes, como la vida de la fluorescencia es una propiedad intrínseca de un fluoróforo y es insensible a su concentración. Por otra parte, FRET es aproximación cuantitativa, porque la eficacia de traste es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia entre el donador y aceptor fluoróforos (esencialmente una función escalón). Por lo tanto, ajustando los histogramas de por vida de fluorescencia registrados por FLIM con un modelo de decaimiento de doble componente, FRET-FLIM permite la (semi-) estimación cuantitativa de la fracción de moléculas de trampa en trampa formación compleja5.\nRecientemente, este método de FRET-FLIM fue utilizada por Verboogen et al. para visualizar la formación de complejos SNARE en primarias células dendríticas del sistema inmune5. Se ha demostrado que al encontrarse un estímulo patógeno, las células dendríticas redireccionar su tráfico de membrana acompañado por una mayor formación de complejos de la proteína de membrana asociada a vesículas R-SNARE (VAMP) 3 con el Qa-SNARE sintaxina 4 específicamente en el membrana del plasma. Este aumento de la formación complejo trampa es probablemente necesaria para satisfacer el aumento de la capacidad secretora de la secreción de citoquinas proinflamatorias como la interleucina-65. Este protocolo describe los pasos experimentales necesarios para la adquisición de datos de FRET-FLIM para la visualización y (semi-) para la medición cuantitativa de complejos SNARE.Se explica cómo ajustar los histogramas de toda la vida de la fluorescencia de células completas con mono y bi-exponencial decaimiento de funciones, dando por resultado la duración aparente de la fluorescencia como una estimación cuantitativa a las interacciones de la trampa. En este protocolo, se utiliza la línea celular HeLa ampliamente utilizado como un ejemplo, pero el método puede ampliarse fácilmente para estudiar complejos SNARE en otras células eucarióticas.\n1. preparación de las muestras del microscopio\nExpresión de Qa-SNARE sintaxina 4 fundido a mCitrine (sintaxina 4-mCitrine; fluoróforo donador) y el VAMP3 R-caja fundida a mCherry (VAMP3 mCherry)\nNota: Otras trampas con proteínas fluorescentes fusionados con sus hélices transmembranales c-terminal pueden también utilizarse. En lugar de mCitrine-mCherry, otros pares donador aceptor de fluoróforos espectralmente separado también pueden ser utilizado (e.g., CFP-YFP).\nCrecen las células HeLa y dividir células HeLa 900.000 sobre platos de fondo de cristal tres 35 mm de diámetro adecuados para microscopía.\nNota: En principio, este protocolo puede ser adaptado para otros tipos de células eucariotas y platos de microscopía.\nMantener cultivos de células HeLa en T75 frascos con 10 mL de glucosa alta de Dulbecco suplementado modificado Eagle (DMEM), con 10% de suero fetal de ternero (FCS) y 1% antibiótico-antimicótico (conteniendo anfotericina B, penicilina y estreptomicina) a 37 ° C y 5% CO 2 en una incubadora de cultivo celular.\nReponer el medio dos veces una semana y dividir las células 1:10 una vez por semana o cuando las células alcanzan a 85-90% confluency a los nuevos frascos T75 (500.000 células/frasco, en promedio).\nQuitar el DMEM y lavar las monocapas de HeLa dos veces con 8 mL de tampón fosfato salina (PBS) durante 3 minutos.\nRetirar el PBS y añadir 2 mL de PBS con el ácido de 2 mM etilendiaminotetracético (EDTA).\nIncubar las células durante 5 minutos a 37 ° C y 5% de CO2 en incubadora de cultivo celular y posteriormente ligeramente agite el frasco para separar las células HeLa de la parte inferior del matraz.\nEliminar las células con 10 mL de medio, transfiera la suspensión a un tubo de 15 mL y sacar una alícuota de 10 μL para contar.\nDiluir la alícuota 1:1 con tinción de azul de tripano 0.4% y contar las células con un hemocitómetro de Bürker9.\nNota: Cuenta 4 x 4 de dos plazas y múltiples el número de células por 10.000 el número de células/mL.\nDespués de que célula contando, tomar 900.000 células del tubo de 15 mL, dividirlos en los platos de fondo de 3 cristal (vea el paso 1.1.1) y prepararse para la transfección.\nTransfectar las células por electroporación10 (véase Tabla de materiales) con la sintaxina 4 mCitrine construcción (donante, muestra #1), sintaxina 4-mCitrine junto con VAMP3-mCherry (muestra #2) y la sintaxina 3 fundido a (mCitrine y mCherry Muestra #3).\nNota: Otros métodos de transfección celular también pueden ser usado11. La construcción de tándem en la muestra #3 es un control positivo para la estimación del más corto tiempo de vida esperable (es decir, máxima esperable traste).\nCultura de que las células durante la noche en alta glucosa DMEM suministrado con 10% FCS y 1% antibiótico-antimicótico a 37 ° C con 5% CO2 en una incubadora de cultivo celular.\nDMEM de aspirar y lavar las células una vez con el celular en medio de la proyección de imagen (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH = 7.4, mOsm = 300; véase Tabla de materiales) por 2 min y posteriormente colocar las células en la proyección de imagen fresca medio.\n2. registro de los datos FLIM\nLugar muestra #2 debajo de un microscopio confocal de dominio de tiempo FLIM con una fuente de excitación pulsada para el fluoróforo donador (es decir, mCitrine) y adquisición de datos de tiempo resuelto. Mantener las células a 37 ° C con una platina calefactada.\nNota: El microscopio confocal utilizado este protocolo está equipado con un objetivo de inmersión agua de 63 X 1.20 NA, un láser pulsado de luz blanco (80 MHz pulso, < duración de pulso de 100 ps), un tubo multiplicador de fotón (PMT) y un Time-Correlated único fotón contando (TCSPC ) sistema (véase Tabla de materiales para la configuración específica utilizada). Otros microscopios FLIM también pueden ser utilizado (por ejemplo, diodos de avalancha del solo-fotón (SPAD) en lugar de PMT, sola longitud de onda láser pulsada en lugar de un láser pulsado de luz blanca).\nSeleccione una celda con la expresión visible de la mCitrine y proteínas SNARE mCherry etiquetados y grabar una imagen confocal de 256 × 256 píxeles con excitación simultánea de ambos fluoróforos antes de cada medición del FLIM. Un paso de píxel de aproximadamente 2 más pequeño que la difracción limita la resolución espacial del microscopio (~ 200 nm) debe ser utilizado. Para mCitrine, excitar en 516 nm y cobrar emisión de 521-565 nm; para mCherry, excitar a 610 nm y recoger la emisión de 613-668 nm.\nNota: No no la posición del plano imagen demasiado cerca de la parte inferior del plato (dentro de ~ 2 μm de distancia), ya que esto resultará en un pico de reflexión en el histograma de toda la vida de la fluorescencia. Excitación simultánea de los fluoróforos donador y aceptor se prefiere, como esto permite superar el problema del movimiento de la muestra. Sin embargo, excitación secuencial puede ser utilizada así.\nDisco una imagen FLIM haciendo clic en Ejecutar el FLIM con la imagen FLIM se registran con las mismas dimensiones y resolución espacial como la imagen confocal grabada en el paso 2.2. Registrar los fotones de la imagen por lo menos 50.000 para el análisis FLIM de celulares, o por lo menos 400 fotones/pixel. Sólo excitar el fluoróforo donador de mCitrine y no mCherry aceptador fluoróforo y excitar así en 516 nm y recoger la emisión de 521-565 nm.\nRepita los pasos 2.1-2.3 para varias celdas y para los demás muestra #1 (sólo donante) y la muestra #3 (la construcción del tándem de mCitrine mCherry).\nRegistrar una función de la respuesta del instrumento (IRF). Sintonice el monocromador del detector de emisión de la longitud de onda de excitación (p. ej., emisión récord de 510-550 nm) y luego grabar una imagen FLIM con la dispersión hacia atrás de un cubreobjetos de vidrio limpio haciendo clic en el botón Ejecutar FLIM. Usar la misma longitud de onda de excitación (516 nm) y energía utilizada para registrar los datos del celular a pasos 2.1-2.4.\nNota: Si varios picos son visibles en el IRF o si no pueden ajustarse la emisión monocromadores, la Fig también se puede medir con una solución de colorante fluorescente con ultrarrápida de vida, por ejemplo de amortiguamiento de la fluorescencia de un colorante orgánico en una saturada acuoso solución de yoduro de potasio. Por otra parte, no es estrictamente necesaria para registrar un IRF, porque la pendiente de decaimiento de los histogramas de fluorescencia se puede también caber sin deconvolución de la IRF. Sin embargo, un IRF permite para corregir las características de la temporización del detector del fotón utilizadas y lo hace más exacto los ajustes de los histogramas de por vida.\n3.Conversión de las grabaciones del fotón a las imágenes FLIM\nDescargar e instalar el PT32ICS conversión software5.\nNota: Los datos de toda la vida también pueden ser analizados por otro software, incluyendo software de varios proveedores de microscopio.\nConfigurar el software de PT32ICS.\nEstablecer el tamaño de 256 × 256 píxeles de tamaño de imagen via configuración | Tamaño.\nLa posición del canal 2 través de la configuración de | Tamaño.\nNota: El canal de la emisión de mCitrine es exclusivamente dependiente de la configuración del microscopio. Un canal mal dará como resultado una imagen FLIM con no fotones (es decir, negro la imagen) y como consecuencia un vacío 'LifetimeTable.txt'-archivo. El canal correcto puede ser identificado por ensayo y error.\nAjustar salida en ImageJ (xyz) (o TRI2 (xyt)) para generar imágenes FLIM (paso 3.4).\nPresiona convertir y cargar uno o más rastros del fotón (archivos .pt3). Para seleccionar múltiples rastros de fotón, mantenga pulsada la tecla Ctrl .\nNota: El formato de .ptu de 64 bits más reciente también se puede convertir.\nAsegurar que el software de PT32ICS genera los siguientes archivos en la misma carpeta donde se guardan los archivos de pt3: un montón de fotones por .pt3 rastro de fotón en formato estándar de citometría de imagen (.ics), un mapa de bits archivo por .pt3 rastro de fotón (.bmp), un archivo de texto por conversión (_Report.txt) que contiene información sobre las estadísticas del fotón (es decir, el número total de fotones en cada rastro de .pt3 del fotón, el tiempo de resolución del detector) y un segundo archivo de texto por conversión (_LifetimeTable.txt) que contiene el total histogramas de por vida de la fluorescencia en formato delimitado por tabulaciones para cada rastro del fotón de .pt3.\nNota: El archivo .ics puede utilizarse para píxel apropiado para generar imágenes FLIM, por ejemplo con TRI2 software12,13 o la curva delgada montaje biblioteca en ImageJ FIJI14,15. Este archivo puede también usarse para análisis de fasores16, por ejemplo con el plugin de momento cerrada fasor de FIJI de Spechron. El archivo de mapa de bits no contiene ninguna información de toda la vida. El segundo archivo de texto se utiliza para el análisis FLIM de celulares en el paso 4.\n4. instalación de histogramas de por vida de la fluorescencia para el análisis de células completas FLIM\nNota: Este paso (instalación de deconvoluted de la fig) requiere software capaz de conexión deconvoluted. Montaje de las pistas de los histogramas de fluorescencia sin deconvolución de la Fig se puede hacer con otros programas así.\nAbrir el programa de software de análisis de datos capaz de caber con deconvolución (Tabla de materiales) e importar el archivo de texto que contiene el histograma de cada huella de fotones (_LifetimeTable.txt) via archivo | Importación | Solo ASCII.\nReorganizar la tabla que el IRF es en la segunda columna de la tabla (mediante copiar y pegar). Lugar de la Fig en la segunda columna B junto a los valores de tiempo en la primera columna A.\nDeterminar la calidad de las huellas registradas del fotón por seleccionar todas las columnas pulsando Ctrl + A y seleccionando parcela | Varios paneles | panel de 9. No analizar rastros de fotón con un pico de alta reflexión (figura 4F).\nSeleccione todas las columnas que contienen los histogramas de control de calidad de vida que se instalarán así como de la Fig en la columna B usando Ctrl clave y la conexión no lineal a través de análisis de la carga | Montaje | Ajuste no lineal de la curva | Abrir cuadro de diálogo.\nLa función de ajuste deconvoluted (disponible en la archivo adicional 1) la carga añadiendo esta función en el software de análisis (a través de categoría | Definidos por el usuario | Función | Añadir). Seleccione el archivo de ajuste de la función 'FLIM_convoluted_IRF.fdf'. Esta función se adapta los histogramas de toda la vida de la fluorescencia con una función del decaimiento exponencial mono deconvoluted con la IRF (es decir, la segunda columna B en la tabla) (ecuación 1):\ncon t el tiempo, τ la fluorescencia evidente toda la vida, A la amplitud y y0 el desplazamiento.\nNota: Otra opción es para ajustar los histogramas de por vida con una función de forma bi-exponencial (ecuación 2):\nMediante la fijación de la duración del componente lento (τ1) a la condición de donante único (paso 1.1.2: ejemplo #1) y que el componente rápido (τ2) para la construcción del tándem (muestra #3), esto permite la estimación de la fracción de Proteínas SNARE en complejo (F) de las amplitudes de los componentes rápidos (A2; ver discusión; y lento (A1) La ecuación 3):\nEl archivo de función de ajuste para el ajuste exponencial bi deconvoluted 'FLIM_convoluted_IRF_biexp.fdf' está disponible en el archivo adicional 2.\nSeleccione equipado curvas | X tipo de datos como mismo como datos de entrada.\nNota: Esto tendrá como resultado el adecuado x-eje escalado de las curvas de cabida.\nAjuste las curvas pulsando el botón ajuste.\nNota: Esto convertirá el ajuste y generar una 'hoja de informe' en el array con una tabla que contiene los cursos de la vida de la fluorescencia, compensaciones y amplitudes. También generará una hoja de datos con las curvas equipadas y los residuos del ajuste.\nEl fundamento del ensayo para la medición de las interacciones de la trampa por traste-FLIM se muestra en la figura 1. El C-termini de las hélices transmembranales de cognado proteínas SNARE se fusionan a un par de proteínas fluorescentes espectralmente cambiada de puesto (p. ej., mCitrine y mCherry). La formación de un cis-encadenar complejo sobre resultados de fusión de la membrana en estas proteínas fluorescentes inmediatamente ser yuxtapuestas uno al otro y preocuparse. La figura 2 muestra imágenes representativas confocales de células HeLa expresando proteínas SNARE marcada con fluorescencia. Se muestra una célula expresan sintaxina 4-mCitrine (donante fluoróforo) con VAMP3-mCherry (fluoróforo aceptor), así como las condiciones de control de las células que expresan sólo la sintaxina 4 mCitrine construir (donante sólo, sin traste) y sintaxina 3 fusionado a ambos mCitrine y mCherry en tándem (máxima esperable traste). La figura 3 muestra las imágenes FLIM generadas colocando los histogramas de la vida de cada píxel con funciones del decaimiento exponencial mono (Figura 3A–B) y (de las funciones del decaimiento exponencial bi y acompaña toda la vida de la fluorescencia Figura 3 - D). la Figura 4A muestra la Fig de nuestra configuración medido por dispersión detrás de un vidrio de cubierta de microscopio. En la Figura 4B–E, histogramas de vida representativos de la fluorescencia de la célula todo análisis FLIM con acompañamiento de ajuste se muestran curvas para las funciones del decaimiento exponencial de mono. Figura 4F muestra un histograma de vida fluorescente de un experimento que se desliza demasiado cerca de la superficie del vidrio de cubierta de microscopio, lo que resulta en un pico prominente de la reflexión. Figura 4 muestra un histograma de toda la vida con representante de ajuste con una función del decaimiento exponencial bi.\nFigura 1: esquema de la lógica para la visualización de complejos SNARE por traste. (A) modelo estructural de la proteína neuronal de trampas (proteína base de datos 3HD717) membrana asociada a vesículas (VAMP) 2 (azul; R), sintaxina 1 (rojo; Qa-SNARE) y SNAP25 (verde; contiene tanto un adorno lazo Qb y Qc). El C-terminal de la hélice transmembrana de sintaxina-1 es conjugada con mCitrine (fluoróforo donador; proteína base de datos 3DQ118). El C-terminal de la hélice transmembrana de VAMP2 es conjugado a mCherry (fluoróforo aceptor; proteína base de datos 2H5Q19). (B) esquema de la trampa mediada por fusión de la membrana resultando en traste. Después de la fusión de la membrana por la formación de un cis-complejo de la trampa, las trampas inmediatamente se yuxtaponen entre sí resultando en traste. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nFigura 2: expresión de proteínas SNARE fusionados a proteínas fluorescentes. Primera columna: donantes fluoróforo, emocionado al 516 nm. Segunda columna: fluoróforo aceptor, emocionado a 610 nm. (A) donante sólo la condición. Imagen confocal representativa de una célula HeLa expresando sintaxina 4-mCitrine (fluoróforo donador; verde en combinación). El canal del aceptador (segunda columna) muestra la fluorescencia de la diafonía. (B) control negativo (sin trastes). Imagen confocal representativa de una célula HeLa expresando ambos sintaxina 4-mCitrine con VAMP3 mCherry (fluoróforo aceptor; magenta en combinación). (C) control positivo (máxima esperable traste). La construcción de imagen confocal representativa de una célula HeLa expresando la sintaxina 3-mCitrine-mCherry tándem. Tenga en cuenta que la señal de fluorescencia de la mCitrine y mCherry señales hace no totalmente traslapo, probablemente debido a una menor resistencia de mCitrine a la degradación lisosomal comparada mCherry (véase la sección discusión). BF: campo brillante. Escala de barras, 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nFigura 3: imágenes FLIM de formación compleja caja. (A) representante de la fluorescencia de por vida las imágenes de las celdas que se muestra en la figura 2. Las imágenes fueron generadas por la primera conversión de los rastros de fotones por un sistema TCSPC (.pt3) para el estándar de citometría de imagen (.ics) utilizando el software PT32ICS. Píxel dispone de toda la vida de la fluorescencia imágenes luego fueron generadas con el TRI2 software12,13 de umbralización de 15-100% de intensidad, 7 pixel binning circular y monoexponential algoritmo de ajuste (Marquardt). El color indica la vida fluorescente aparente promedio. (B) FLIM imágenes donde las imágenes de vida de fluorescencia (se muestra en panel A) fueron enrevesadas con las intensidades de fluorescencia de un fluoróforo donador mCitrine (se muestra en la figura 2). La convolución se realizó con ImageJ de FIJI con una macro por encargo (véase Tabla de materiales). (C) vida de fluorescencia e imágenes FLIM de la célula HeLa expresando sintaxina 4-mCitrine y VAMP3 mCherry de paneles A-B, pero ahora con ajuste con las curvas de decaimiento exponencial bi (con cursos de la vida fijados en las condiciones de control; ver paso en 4,4 Protocolo). Los colores de píxel indican las fracciones estimadas F de sintaxina 4 en complejo con VAMP3 (ecuación 3). (D) igual que el panel B, pero para el bi-exponencial ajuste. La convolución se realizó con ImageJ de FIJI con una macro por encargo (véase Tabla de materiales). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nFigura 4: celda todo análisis FLIM. (A) la función de la respuesta del instrumento (IRF) de la instalación. La IRF se midió usando la dispersión hacia atrás en la interfaz de agua de cristal (con un plato de microscopio limpio de vidrio que contiene agua).(B–E) Toda célula histogramas de vida útil de las celdas que se muestra en la figura 2 y figura 3. Se agruparon todos los fotones presentes en las imágenes. Las curvas se deconvoluted con la IRF y equipadas con funciones del decaimiento exponencial mono (ecuación 1). Para estas células, los cursos de la vida de la fluorescencia se obtuvieron de 2.82 ns (células expresando sólo sintaxina 4-mCitrine; donante sólo panel B), 2.09 ns (las células que expresan Co sintaxina 4-mCitrine con VAMP3 mCherry, panel C) y 2.08 ns (las células que expresan la sintaxina 3 - tándem mCitrine-mCherry construir; máximo control de traste esperable; panel D). Las incrustaciones muestran los gráficos mismo, pero ahora con escala logarítmica del eje y. El panel E muestra una superposición de las curvas de decaimiento de paneles B-D. (F) ejemplo de un histograma de toda la vida fluorescente grabado demasiado cerca a la superficie de la hoja de cubierta de microscopio. Esto resulta en un pico de gran reflexión (representado por el área sombreada de amarillo). (G) mismo grupo C, pero ahora se ajuste con una curva de decaimiento exponencial bi con cursos de la vida fija las condiciones de control (ver paso 4.4 en protocolo). Las amplitudes de la rápida (A1) y lento (A2) componentes fueron 14.42 y 0,01, respectivamente, dando por resultado una fracción estimada de trampas en el complejo F de 0.99 (ecuación 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.\nArchivo complementario 1. Archivo de función FLIM_convoluted_IRF haga clic aquí para descargar este archivo.\nArchivo complementario 2. Archivo de función FLIM_convoluted_IRF_biexp haga clic aquí para descargar este archivo.\nEste protocolo muestra el uso del traste-FLIM para visualización de interacción SNARE sintaxina 4 VAMP3 en vivo células HeLa. Sintaxina 4 es una proteína de Qa-SNARE predominante localización en la membrana plasmática donde media exocitosis1,2,20,21. VAMP3 es una trampa de R que se describe principalmente para localizar en reciclaje compartimientos endosomal y media trata a otros endosomas, así como a la membrana plasmática1,2,20. Sin embargo, el ensayo de FLIM traste puede ser fácilmente adaptado para el estudio de otras proteínas SNARE. La única condición es que estas trampas contienen una hélice transmembrana c-terminal, que es el caso de la mayoría de las proteínas SNARE por lejos1,2. Además, el protocolo descrito aquí puede ser adaptado para la visualización de complejos SNARE en cualquier tipo de células eucariotas, incluyendo plantas y levaduras. En este protocolo, hemos utilizado el acortamiento de la vida de la fluorescencia del fluoróforo donador como una medida de traste. Como un enfoque complementario, la vida útil del fluoróforo aceptor podría ser examinada, debido a que la emisión sensibilizada provoca una fase de subida distinta que proporciona prueba inequívoca transferencia de energía de resonancia se produce.\nActualmente, la técnica FRET-FLIM no puede visualizar complejos SNARE en compartimientos lysosomal. Para la construcción de 3-mCitrine-mCherry tándem sintaxina, la fluorescencia mCherry puede normalmente encontrarse más acumulada en una zona de juxtanuclear, que probablemente corresponde a compartimentos lysosomal, mientras que la señal mCitrine es más abundante en el celular 5de la periferia. Se observó una acumulación similar de juxtanuclear de mCherry comparado con mCitrine, cuando el mismo proteínas SNARE Unidas a estas proteínas fluorescentes se expresa Co5. Lisosomas se caracterizan por un pH extremadamente bajo (< 4) y una alta actividad de enzimas proteolíticas. La acumulación de juxtanuclear de mCherry probablemente es causada por una mayor resistencia del fluoróforo mCherry lysosomal degradación en comparación con el fluoróforo mCitrine. No es debido al amortiguamiento de pH de mCitrine, ya juxtanuclear acumulación de mCherry también ocurre en la fijación de las células5. Así, la técnica FRET-FLIM subestima la cantidad de trastes en las regiones de juxtanuclear (lisosomal) y esto va a requerir otras proteínas fluorescentes reportero que sobreviven a las duras condiciones dentro de los lúmenes de lisosomas.\nEl FLIM-FRET en principio permite para obtener una estimación cuantitativa de (semi-) de la fracción de trampas en el complejo5. Como explicamos en este protocolo, esto requiere la instalación de los histogramas de por vida de la fluorescencia con funciones del decaimiento exponencial doble (ecuación 2), donde la amplitud de la componente rápida es proporcional a la fracción de trampas en complejo ( La ecuación 3). Sin embargo, tal conexión con un modelo de dos componentes es un desafío técnico. Conexión con múltiples parámetros de ajuste libres (dos cursos de la vida de la fluorescencia y dos amplitudes) requiere un número muy grande de fotones, especialmente puesto que los parámetros influyen entre sí y pequeños errores en la vida afectarán las amplitudes y vice versa. Para superar estos problemas de conexión, la vida de la fluorescencia de la componente lenta puede ser fijada a la duración de la condición de donante único (es decir, sin traste; sólo mCitrine actual) y que el componente rápido de la vida útil del tándem construir) máxima esperable traste). Sin embargo, esto debe también interpretarse con cuidado, porque la vida de la fluorescencia puede no ser la misma que en estos Estados de control y puede desviarse debido a múltiples razones (apagando el auto, orientación del dipolo, las variaciones en el microambiente). Múltiples complejos de trampa en las inmediaciones (< 10 nm) puede resultado en traste dependiente de la distancia, el mismo principio que permite el traste ser utilizado como una "regla molecular", pero en este caso, oscurece la cuantificación de complejos SNARE. Por otra parte, una estimación cuantitativa no siempre es significativa, porque las trampas etiquetadas compiten con trampas (sin etiqueta) endógenas. Como consecuencia, el nivel de expresión de etiquetado mCherry trampa es un determinante principal para el porcentaje del traste5. Debido a todas estas advertencias, se recomienda a los histogramas de vida fluorescente con una función del decaimiento exponencial mono (ecuación 1). Esto tiene la ventaja que no requiere ningún conocimiento a priori de la vida y la vida fluorescente media aparente resultante proporciona una medida sólida para trampa secuestrantes5.\nSin embargo, se espera que cuantitativa traste-FLIM la proyección de imagen de modelos apropiados de dos componentes tendrá potentes aplicaciones futuras. Codificación de caja genes dentro del cromosoma se pueden fusionar con proteínas fluorescentes reportero, por ejemplo por CRISPR/CAS9. Esto resulta en el etiquetado fluorescente de proteínas endógenas de la trampa, con niveles de proteína endógena y no fondo de trampas sin etiqueta y así permite una estimación cuantitativa significativa de la fracción de complejos SNARE por traste-FLIM. Mientras que los niveles de expresión de trampas endógenos podrían ser bastante bajo y dan relativamente bajo señales fluorescentes, se espera que se puede obtener un número suficiente de fotones, especialmente para las células enteras FLIM (que requiere sólo unos pocos 1,000s de fotones). Además, estas mediciones de FRET-FLIM se pueden realizar con más sensibles detectores de fotodiodo de avalancha que también resultará en mayores señales de fluorescencia y mejores estadísticas de fotón.\nEste trabajo fue financiado por una beca de Hypatia de la Radboud University Medical Center, un premio de desarrollo de carrera del programa de Ciencias humanas de frontera, la gravitación programa 2013 de la organización de países bajos para la investigación científica (NWO; ICI-024.002.009), un VIDI conceder de nuevo orden mundial (ALW VIDI 864.14.001) y una beca Starting Grant del Consejo Europeo de investigación (ERC) de la Unión Europea en el séptimo programa marco (contrato de concesión número 336479).


El clima en la Isla de Pascua • ¿Qué ropa llevar?\nInicio » Guía de viaje » Clima\nEl clima en la Isla de Pascua\nPodemos garantizarte que el clima en la Isla de Pascua no te va a suponer ninguna preocupación. La isla tiene un clima subtropical con temperaturas suaves durante todo el año. Tanto en invierno como en verano, la variación térmica anual es de apenas 5ºC. Las temperaturas máximas pueden ser de 28º, mientras que las mínimas son de 15º. La elevada humedad de la isla hace que la sensación térmica sea elevada.\nLa lluvia suele darse en forma de chaparrones y lloviznas a lo largo de todo el año. Aunque es abril, mayo y junio son los meses más lluviosos. Por contra, septiembre, octubre y noviembre son los meses más secos. Por otra parte, el viento es habitual en la Isla de Pascua. De septiembre a mayo, sopla viento desde el este y el sureste; el resto del año, del norte y el noroeste. El viento se deja notar, sobre todo, en los terrenos más elevados. Por ejemplo, en la cima del Terevaka o el cráter del Rano Kau.\nEso sí, el tiempo en la Isla de Pascua es cambiante. En un mismo día puede hacer sol, refrescar y terminar lloviendo. Más adelante, en este mismo artículo, te recomendamos qué tipo de ropa deberías llevar en tu visita a Rapa Nui.\nLa temperatura promedio anual es de 20,5º, siendo febrero el mes más cálido (23,7º de media) y agosto el más frío (18º). Te hemos preparado un climograma para que puedas consultar el clima de la Isla de Pascua de un vistazo.\nTemperatura media (ºC) 23,3 23,7 23,1 21,8 20,3 18,8 18,2 18,0 18,4 19,2 20,4 21,8 20,5\nPrecipitación (mm) 92,2 86,9 86,4 117,5 127,9 102,3 93,9 85,8 84,3 73,1 80,0 92,4 1124,7\n¿Qué ropa llevar a la Isla de Pascua?\nEn líneas generales, la ropa debe ser cómoda y ligera. Es importante traer también un cortavientos o un impermeable, debido al viento y a la posible lluvia. En abril y mayo, por ejemplo, puede llover varios días seguidos.\nAdemás, el calzado ha de ser cómodo, preferiblemente de suela gruesa y resistente al agua. El estilo de vestimenta de la Isla de Pascua es informal, por lo que te recomendamos ropa desenfadada para disfrutar de tus vacaciones.\nPor otra parte, conviene traer gafas de sol, gorra o sombrero y protector solar para defenderse del sol. Es recomendable llevar sandalias y traje de baño para disfrutar de las playas de la isla. El verano tiene lugar de diciembre a marzo, y la elevada humedad contribuye a crear una sensación térmica un poco sofocante. Por contra, de junio a septiembre la temperatura media de la isla es de unos 18ºC y los días tienden a ser ventosos y húmedos.


Cortasetos site:leroymerlin.es - Cortasetos Eléctrico\nComo ya comentamos, el cortasetos site:leroymerlin.es ayuda a sostener tus arbustos y setos con la manera deseada y el tamaño adecuado, procurando que estén lo más sano posible.\nLa elección del cortasetos depende de la área del jardín, de la vegetación a recortar y de la altura a la que debamos realizar nuestro trabajo.\nSelección de los mejores cortasetos site:leroymerlin.es\nDependiendo de sus plantas y su moda estética, querrá recortar las plantas perennes hasta sus coronas en otoño o bien a inicios de la primavera. Dado que estos cortes tienen la posibilidad de hacerse de forma imprecisa y sólo requieren cortar un montón de tejido del tallo sentimental y muerto al unísono, las tijeras son buenas para esto.\nAl utilizar los cortasetos se aconseja como medida de seguridad utilizar guantes, gafas y zapato de seguridad . Son utensilios de jardinería que se utilizan con el objetivo de embellecer los espacios ajardinados, dar forma a los arbustos y podar los árboles para repercutir además en su desarrollo y floración posterior.


Francisco Santos archivos | Saúl Hernández [web/blog]\nSiempre he tenido la certeza de que Francisco Santos tendría mayores opciones de ganarle la contienda por la Presidencia a su primo hermano doble, don Juan Manuel. Pero, al mismo tiempo, que Óscar Iván Zuluaga está mejor preparado. Francisco es...\nSaúl Hernández / 2013/11/04\nNadie duda de las capacidades de Óscar Iván Zuluaga, un hombre serio, inteligente y capacitado como el que más para llevar las riendas del país. Pero, tal vez viéndose un tanto arrinconado en las encuestas, quiso generar un hecho político...\nSaúl Hernández / 2013/10/08\nSi se hace el paseo de olla propuesto por Chávez, el fin del fin será otro día. Sancocho, según el Drae: «Dícese de ‘alimento a medio cocer’; ‘revoltijo (conjunto de cosas sin orden)’; ‘resto de comida que se utiliza como...\nSaúl Hernández / 2007/09/18


El HTC One ya se puede reservar con Vodafone\nIván Martín Publicado el 14 de abril, 2013 • 15:00\nDesde el mismo día que se dio a conocer, el HTC One ha sido uno de los terminales más atractivos que se esperaban en el mercado. Después de diferentes comentarios e informaciones, parece que su desembarco es una realidad y, una muestra de ello, es que Vodafone ya ofrece la posibilidad de reservarlo.\nPara hacer esto se ha publicado una página, a la que puedes acceder en este enlace, en la que es posible realizar todo el proceso de reserva. Para ello, sólo es necesario indicar el perfil de cliente (particular, autónomo, etc.), si ya se es cliente de Vodafone y la información de contacto (nombre, correo y teléfono móvil). De esta forma, se puede conocer cuándo está disponible el terminal antes que el resto.\nDe esta forma tan sencilla es como se hace todo… que, en realidad, se puede decir que es una prereserva, ya que no se puede apartar un HTC One, sino que se es avisado de su disponibilidad para decidir si se desea comprar uno o no.\nHTC One, un terminal de gama alta\nSi no conocer en profundidad cómo este teléfono de la compañía taiwanesa, es importante conocer que se trata de un modelo con una pantalla de 4,7 pulgadas Full HD con 469 ppp, 2 GB de RAM y un procesador Qualcomm Snapdragon 600 de cuatro núcleos a 1,7 GHz.\nAdicionalmente, tiene otras características interesantes, como su cámara de Ultrapíxeles, una batería de 2.300 mAh, Sistema operativo Android Jelly Bean (con interfaz Sense 5) y un grosor de 9,3 milímetros. Como se puede ver, un modelo destinado a la gama alta de producto. Su capacidad de almacenamiento es de 32 o 64 GB.\nSin duda un terminal muy atractivo que, si viene acompañado de una oferta interesante, será un modelo que puede tener muy buenas posibilidades en el mercado ya que su rendimiento está fuera de toda duda y, además, tiene un diseño de lo más atractivo ya que dispone de un acabado muy cuidado. Además, no hya que olvidar que la reserva esta disponible con otras compañías.


Un Lector Indiscreto: abril 2015\nNota aclaratoria sobre la II edición del Reto de Novela Histórica\nPido a quienes participan en esta II edición del Reto de Novela Histórica lean atentamente lo que a continuación expongo:\nQuienes organizan eventos literarios en sus blogs les gusta que los que participan cumplan las normas que se piden para poder tomar parte en él y facilitar en lo máximo la labor al organizador/a del mismo. Pues eso mismo pido yo con el Reto de Novela Histórica que se organizo ya en su segunda edición: el cumplimiento de las bases.\nY digo esto porque veo que no se tienen en cuenta las pautas que marqué en su día para que se diera una novela por válida. En el este enlace os recuerdo los requisitos que había que cumplir. Ya en la primera edición pude haber decidido el no organizar el sorteo pues quienes participaron en ella solo se limitaron a direccionar las reseñas y no añadir los datos que pedía.\nEn esta segunda edición tenía ya la idea de admitir solo novelas de ficción histórica o histórica pura. Pero decidí mantener las que se conocen como guerreras, landscape, de aventuras, thrillers y novela negra con un claro trasfondo histórico pero que, además, se cumpliera el requisito de que si tenían esa catalogación se cumpliera el hecho de que la fecha límite era finales de la Segunda Guerra Mundial (1945). Hay algunas editoriales que solo catalogan como históricas aquellas en las que el argumento se desarrolla, como mucho, hasta finales del siglo XVIII.\nLos participantes en esta segunda edición verán a continuación las novelas que considero no pueden ser incluidas en el reto. Y, en base a que cada uno interpreta su participación en el reto sin tener muy claro los límites del mismo, me veo obligado, a partir de ahora, a admitir solo novelas de ficción histórica manteniendo la misma fecha límite: finales de la Segunda Guerra Mundial. Quedan derogadas las bases publicadas inicialmente, salvo en lo relativo a acompañar a la reseña direccionada, la editorial que publica la novela, el año de publicación y si el autor es español o extranjero. No se admiten, por supuesto, novelas reseñadas en otro idioma que no sea el castellano.\nSolo pido que se tenga en cuenta que esto es un entretenimiento y no una competición por ver quién reseña más novelas. Solo pido que se ayude un poco al organizador de un evento como este porque lleva mucho trabajo organizarlo y comprobar que se cumpla lo exigido. No tengo porque estar avisando a los participantes en el mismo sobre cada duda que tengan e insistir en que se cumplan los requisitos exigidos para el buen funcionamiento del mismo.\nA partir de la fecha de la publicación de esta entrada no volveré a realizar actualizaciones hasta un mes antes del cierre del reto. Lo que no quiere decir que esté en retaguardia comprobando cómo va el discurrir del mismo e incluso publicar alguna actualización de forma imprevista.\nEspero que entiendan mi postura quienes participan en el mismo y pido la máxima colaboración a la hora de que esto vaya por el buen camino. De seguir así a finales de esta edición tengo la intención de renunciar a la organización de la que sería ya la tercera edición del mismo.\nQuienes no estén de acuerdo con estas apreciaciones que hago pueden desistir de su participación en esta segunda edición. Si se cumple el reto, pues felicito a quien lo logró, si no se cumple, no hay por qué lamentarse. Solo es, repito, un entretenimiento y no una competición.\nA continuación paso a detallar como queda el listado de participantes y las causas de las reseñas admitidas y rechazadas.\nVamos a leer: las dos son correctas (novelas de ficción histórica)\nLibros, exposiciones y excursiones.....\nPolvo de libros: 4 (como no está direccionada En el país de la nube blanca, ya no la doy por buena, ni El Plan Bérkowitz, pues son dos líneas temporales y no se tiene en cuenta la fecha tope que pongo en el reto)\nEl universo de los libros: es correcta El dios del desierto, catalogada como narrativa histórica\nLa casa de San Jamás: no se puede tener en cuenta Claroscuro, porque narra la relación de dos mujeres de color en el Nueva York de los años 20 (lo dice la sinopsis). Como mucho sería costumbrista. Se mantiene Matar a Leonardo da Vinci, novela de ficción histórica.\nMis lecturas de retos: 4 válidas. No se puede aceptar El tren de los huérfanos (narrativa), Las lágrimas de la diosa maorí, al no estar direccionada ya no la tengo en cuenta; La puerta pintada: la primera línea temporal es un claro thriller y en la segunda es una novela costumbrista que retrata la cerrada sociedad de la posguerra.\nEl despertar de un libro: las tres son correctas, son novelas de ficción histórica\nBourbon Street: son correctas las once novelas\nSueños Prohibidos: es correcta Las tres bodas de Manolita\nLibros en el petate: son correctas las cuatro, al estar ya direccionadas las dos de Sarah Lark\nPedacitos de mi mundo: solo se admite la primera. Las sombras de África no es novela histórica porque hay dos líneas temporales y la primera transcurre a finales del siglo XX. Se ve en la sinopsis claramente. No puede tomarse como landscape. Como mucho, exótica pero, ojo, la autora parte de la base de la esclavitud lo que no quiere decir que por este hecho tenga que considerarse como de ficción histórica.\nJuntando más letras: Un millón de gotas, de Víctor del Árbol, no es novela de ficción histórica porque, como leí en alguna reseña, la parte actual transcurre en el año 2002. Recuerdo que la fecha tope para considerar válida una novela es finales de la Segunda Guerra Mundial (1945)\nSin libros no soy nada: Memorias de África no es novela de ficción histórica. Está catalogada como romántica, que es la base principal de la novela. Como mucho sería costumbrista. La isla prometida: no es novela de ficción histórica. En la sinopsis dice que es una novela landscape que tiene como elementos clave el romance, aventuras, viaje, saga familar, riesgo y exotismo. Está catalogada como narrativa extranjera. Son válidas cuatro de las seis novelas contabilizadas.\nNo solo leo: se mantienen las siete. Dos de ellas son catalogadas como romántica histórica\nEn busca de mr. Darcy: se mantiene El testigo invisible, novela de ficción histórica.\nAll the year round: se admiten las cuatro que tiene contabilizadas.\nBooks & Co.:\nMis lecturas y más cositas: Las sombras de África no es novela de ficción histórica. Ya está explicado el motivo porque figura en otro blog como tal. La sangre de los crucificados la mantengo porque es novela negra con un claro transfondo histórico.\nYerathel Books: la novela Juliet no está direccionada. La dejo con interrogante.\nLo que leo y punto:\nBibliobulimica´s blog: se admiten las tres novelas direccionadas. Pero faltan datos a añadir.\nUn Lector Indiscreto: se mantienen las cuatro contabilizadas hasta la última actualización y no es, precisamente, porque sea mi blog.\nEl lado frío de mi almohada: se mantiene la única que tiene direccionada. Es novela de ficción histórica.\nLecturas y Lectoras: A la sombra del árbol kaurí no es novela histórica. Es una landscape que, como mucho, tiene un trasfondo costumbrista, que no es lo mismo. Que el tiempo nos encuentre no es novela de ficción histórica, es costumbrista. En ella, Teresa Viejo nos descubre en esta obra de la narrativa española u na época y un país fascinantes: el México de los años cuarenta. Un país exótico, de bailes, fiestas y glamour; la magia de sus platós y sus grandes orquestas (lo extraje de la sinopsis de la novela).\nEl templo de la lectura:\nTardes de sofá, manta y libro: se mantiene la que tiene direccionada\nLeyendo con mar: se mantienen las tres.\nLoca por incordiaR: Cuaderno de Sarajevo no puedo admitirla como novela histórica. Sobrepasa con creces la fecha tope para considerarla como tal.\nEl búho entre libros: El tren de los huérfanos y Las sombras de África no pueden considerarse novela de ficción histórica como más arriba lo aclaro en algún blog. Hay que tener en cuenta también que hay, en cada una de ellas, dos líneas temporales ambientadas en años muy recientes. En ambos casos las autoras parten de una mínima base histórica para crear la trama de sus respectivas novelas. Las otras cinco son correctas.\nLa historia en mis libros: se admiten las dos que tiene direccionadas hasta la fecha.\nLibros que hay que leer: A la sombra del árbol kaurí (como mucho es costumbrista), El tren de los huérfanos, Las sombras de África (como mucho es exótica) y La reina de azúcar no se pueden admitir como novelas de ficción histórica. La reina del azúcar está catalogada por la editorial como narrativa.\nEl misterio de las letras: El tren de los huérfanos no es novela de ficción histórica.\nPublicado por Francisco en 9:31 22 comentarios:\n1890. Bastian y Hugo Fortuny parten a Tahití en busca de una oportunidad después de perder su trabajo como sopladores de vidrio en su Mallorca natal. Durante la travesía conocen a Laia Kane, la hija de un cónsul inglés corrupto en Menorca al que han desterrado a la isla de la Polinesia. Este encuentro marcará la vida de los hermanos Fortuni y de Laia para siempre.\nEva García Sáenz nos ofrece en Pasaje a Tahití una novela que nos atrapa desde las primeras páginas hasta el desenlace. Bien se nota que la autora sabe cómo conquistar a quienes se interesan por su trabajo literario. Lo demostró con creces con la autopublicación en Amazon de su ópera prima La saga de los longevos, un fenómeno de ventas y crítica convirtiéndose en uno de los libros digitales más vendidos por una autora española, siendo traducido al inglés y publicado en Estados Unidos, Gran Bretaña y Australia, con un gran éxito de ventas en estos países.\nLa escritora afincada en Alicante, en esta ocasión, sorprende a sus seguidores con una novela de ficción histórica en la que trata una temática creo que original, pues somos testigos de los orígenes de la industria de las perlas cultivadas, en Tahití y Japón, y de imitación, en Manacor (Mallorca) con el atractivo añadido de que tenemos ante nosotros un magnífico viaje literario que nos llevará de isla en isla, sin olvidarnos de la Exposición Universal de París, en el año 1889, en donde comenzarán las peripecias de dos de los personajes principales de esta novela: Bastian y Hugo Fortuny, cuyo destino se encontrará con el de Laia Kane, hija del cónsul inglés en Menorca, que verá cómo su vida tomará un rumbo distinto a causa del exilio al que será enviado su padre al ser tachado de corrupto. Los hermanos Fortuny emprenderán ese viaje por un motivo completamente distinto: el hecho de quedarse sin trabajo como sopladores de vidrio en su tierra natal. Pese a desarrollarse la historia durante la última década del siglo XIX y los años 30 del XX, después de la Gran Depresión, vemos cómo el punto de partida al que se enfrentan unos y otros es muy de nuestros días. Está claro que los hermanos Fortuny eran unos emprendedores que pasaron de la nada a constituir un negocio boyante en el campo de las perlas de cultivo y de imitación. Creo que a muy pocos les resultará indiferente el nombre de las perlas Majorica, en Manacor precisamente, en donde se inventó la producción de estas preciadas joyas orgánicas hechas por el hombre. Eva García Sáenz nos ofrece la historia novelada del nacimiento de estas industrias, partiendo de un trabajo exhaustivo de documentación.\n(Perleras de Manacor)\nEn la familia Fortuny Kane primará el interés por la herencia que queda tras el fallecimiento de su padre, Hugo Fortuny. Esta herencia pasa a manos de su hijo Denis Fortuny que se encuentra con la encerrona que le tienen preparados sus hermanos al dudar de la legitimidad de sus lazos familiares, por lo que se desplazará a Tahití para enfrentarse a su verdadera historia y así desdecir las dudas que se vertían sobre sus orígenes. Denis Fortuny conocerá de esta forma cómo fueron sus primeros años de vida pero también descubrirá secretos familiares que se guardaron durante años. Allí conocerá su historia a través de su tío Bastián. Seremos testigos de estos roces familiares, no solo en esta generación, sino los también de los que se originan entre los dos hermanos que emigraron a tierras tahitianas en busca de un futuro mejor. Unos roces que chocaban por la forma de ser de ambos así como por su visión de afrontar la vida pero, sobre todo, por la presencia de Laia en sus vidas.\n(Playa de Arue en Tahití)\nCreo que también podemos incluir Pasaje a Tahití en lo que conocemos como novelas landscape o de viaje. Los personajes se moverán por unos paisajes exóticos descritos magníficamente por la autora. El exotismo que contiene sus páginas junto con el romance, la aventura y un claro componente histórico forman un perfecto engranaje. En este caso hay que sumarle también un plus policíaco que añadirá más interés al desarrollo de la misma. Sin olvidarnos de que en ella nos encontramos con la historia de una saga familiar.\nEva García Sáenz nos ofrece una trama hábilmente trabajada con la que consigue que nos sumerjamos en el desarrollo de la misma al saber mantener nuestra atención con la distribución de los misterios y secretos que envuelven a los personajes a través de las dos líneas temporales que se van alternando a lo largo de los 64 capítulos más el epílogo final en la que está estructurada la novela. Son capítulos de corta extensión lo que hace que el ritmo de la novela sea ágil, sin darnos así cuenta de que estamos enfrascados en la lectura de una historia contada en 480 páginas.\nMe sorprendió gratamente la narrativa de Eva García Sáenz, utilizando un lenguaje sencillo pero muy cuidado, diría incluso que elegante, con el que dota a la novela de una gran belleza literaria. Sin duda, no tiene nada que envidiarle a las autoras ya consagradas de la narrativa española. Una belleza literaria que se traslada a la forma en la que nos presenta la historia alternando ambas líneas temporales sin perder el interés por una y otra y en las distintas voces narradoras que emplea para darnos a conocer las historias que conforman la novela. Bastián y Laia lo que les sucedió en el pasado en primera persona y un narrador omnisciente será quien nos ponga al día de lo que ocurre en la primera línea temporal.\nOtro fuerte de Pasaje a Tahití son sus personajes. Unos personajes trazados perfectamente por la autora, que parecen cobrar vida propia. A través de ellos nos ofrece un gran fresco que es un fiel reflejo de la sociedad de aquella época: una España afectada por los efectos de la Gran Depresión y el apogeo de países como Francia, que extiende sus dominios en los territorios que ahora se conocen como la Polinesia Francesa. Personajes históricos como los gobernadores de Tahití Lacascade y Pierre Papinaud, el abogado Auguste Gaupil, Kokichi Mikimoto o el mismísimo Paul Gaugin comparten escenarios con otros creados por la imaginación de la autora.\nPero también nos encontramos con hechos que tienen lugar en Tahítí en los que somos testigos de la supremacía de los colonos sobre los nativos, que no admiten el que su territorio sea colonia francesa, lo que provoca la revuelta de Raiatea o presenciaremos el ciclón que arrasó las islas de los Mares del Sur en el año 1903, año que coincidiría también con el fallecimiento del gran pintor francés.\nComo ya nos adelanta la sinopsis, Pasaje a Tahití es una historia épica de amor, superación, lazos familiares y secretos con el telón de fondo del Tahití colonial y el fascinante origen de las perlas cultivadas. Creo que merece la pena adentrarse en la lectura de esta novela que dejará con un buen sabor de boca a quienes decidan darle una oportunidad.\nNota: datos técnicos, sinopsis y biografía de la autora tomada de la web de Planetadelibros; imágenes de Papeete en 1930, perleras de Manacor, playa de Arue y de Kokichi Mikimoto tomadas de google imágenes.\nPublicado por Francisco en 8:16 19 comentarios:\nSorteo un ejemplar de La Pintora de Estrellas, de Amelia Noguera: lista provisional participantes\nEsta es la lista provisional de participantes en el sorteo de un ejemplar de La Pintora de Estrellas, de Amelia Noguera:\nJéssica Rodrigo 15\nLoli elmisteriodelasletras 7\nFul Navalón 7\nÁngeles Arca Bustelo 7\nLo infinito 15\nLibros Eris 17\nMª Ángeles bookeandoconmangeles 7\n* virmaen virginia olivencia no puede ser admitida en el concurso porque No serán admitidos quienes solo se inscriben en cualquier tipo de sorteos. Solo admito a quienes tienen blogs literarios o comentan en páginas como Ciao.\n* Lo infinito tiene que facilitarme el enlace correcto de haber dado publicidad al sorteo en el blog. El que me pasó no vale.\nEn la convocatoria del sorteo advierto:\n* Para facilitar la labor de comprobación de los datos procurad que coincida vuestro nick que utilizáis en los comentarios del blog, así como el avatar correspondiente, con el que figuráis como seguidor del mismo. (En su día publiqué un tutorial sobre cambio de nick en blogger y también el avatar). Este apartado afecta a Lunilla, Ful Navalón y Ángeles Arca Bustelo (en este último caso, además, no coincide el nombre con el que comenta en la entrada del sorteo con el nick con el que figura como seguidora). De no arreglarse esta anomalía, en vez de los 3 puntos como seguidor antiguo los contabilizaré como un punto.\nFinalmente, será el lunes, día 4 de mayo, cuando publique la lista definitiva de participantes y los números asignados a cada uno. Ya que está cercano el puente del 1º de mayo, atraso la fecha de la publicación definitiva hasta el día 4 del mes entrante. En esta fecha, posiblemente por la tarde, daré a conocer el ganador del sorteo, que tendrá que remitirme sus datos postales y un teléfono de contacto al correo electrónico franciscoj.portela@telefonica.net, para enviárselos a la editorial que será la encarcada de remitir el ejemplar correspondiente al ganador. El sorteo se realizará mediante Random.org. ¡Suete a tod@!\nPublicado por Francisco en 9:03 15 comentarios:\nII actualización de la II Edición del Reto de Novela Histórica\n1. Quilu (Bibi)\nPolvo de libos\n5. José Hervás\n7. Lourdes ILGR\n13 Lidia Casado\n15. Nosolo leo\nNosolo leo...también sueño\n17. Raquel Campos\n18. Minea Halcombe\n19. Marisa G.\nMis libros y más cositas\n22. Zeno Martín\n26. Raquel Alonso\n33. Eva Mª Martín Martín\n* Quienes tienen un interrogante al lado del número de novelas reseñadas y direccionadas es que no especifican los datos que se requiere para este apartado. En las bases lo explico claramente.\n* Quienes vean que tienen menos reseñas de las que figuran en sus entradas respectivas es que no tuve en cuenta las que no están direccionadas.\n* La próxima actualización será el último viernes del mes de junio. En ese momento es cuando pondré al día las indicaciones que se me hagan al comprobar sus datos en la entrada que hoy publico, salvo que el error sea claramente mío, por lo que será rectificado una vez que lo compruebe.\nPublicado por Francisco en 9:04 19 comentarios:\nSorteo en Blogs El búho entre libros y Leyendo en el bus: un pack de dos libros de David J. Skinner\nLos blogs El Búho entre libros y Leyendo en el bus nos traen un sorteo interesante: un pack de dos novelas de David J. Skinner. Los títulos son:\nLos crímenes del ajedrez:\nCuatro terribles crímenes, sin relación aparente entre ellos excepto las piezas de ajedrez encontradas en todos los escenarios, harán que tres personas completamente distintas, cada una con su propia motivación, se vean inmersas en una trama más retorcida de lo que podrían haber imaginado. (Ed. Tagus. Long. Impresión: 92 pág. aprox. Libro digital)\nUna herencia problemática:\nAntonio Cerezo es un investigador privado que se gana la vida resolviendo sobre todo casos de infidelidad. Sin embargo, cuando una joven heredera se pone en contacto con él para investigar la veracidad de un testamento hológrafo, Cerezo se verá inmerso en una espiral de violencia, relaciones ocultas y muerte que no será fácil de resolver.\nLa herencia Cortés no será el único quebradero de cabeza del investigador. Un antiguo compañero suyo, ahora comisario en la Brigada Central de Estupefacientes, está convencido de su implicación en un caso de tráfico de drogas que causó, años antes, la muerte de una policía. El comisario usará todos los medios a su alcance para demostrar la culpabilidad de Cerezo.\nUna historia con dos tramas muy diferentes que el autor entremezcla con maestría durante toda la novela, consiguiendo que el lector se sumerja en ella desde las primeras páginas. (208 pág. Editorial Libros Mablaz)\nEste es un sorteo de carácter nacional. Los nacionales de otros países podrán participar si facilitan una dirección postal en España.\nEl sorteo se realizará mediante random.org y el resultado será publicado en torno al 13 de mayo.\nEl sorteo finaliza el día 10 de mayo.\nSerá el propio autor el encargado de enviar los ejemplares a los ganadores.\nSer seguidor de los blogs El Búho entre libros y Leyendo en el bus.\nDejar un enlace en cualquiera de los blogs diciendo que se quiere participar en el sorteo así como los enlaces que se aporten de los requisitos exigidos.\nPor todo ello ya se tienen 5 puntos.\nPuntos extras opcionales:\n+ 3 por ser seguidor antiguo de Leyendo en el bus (hasta Laurita R) (Adjuntar perfil de blogger)\n+ 1 por sumar los puntos y poner el resultado, (si hay algo que sumar)\nPublicado por Francisco en 8:53 10 comentarios:\nPuede decirse que Pablo Carnicero es de esos autores que, sin más pretensiones que las de entretener al público con sus novelas, como él bien lo advierte, entra sin hacer ruido en el mundo literario y logra, con sus títulos publicados hasta la fecha, ganarse a los lectores que apuestan por sus obras. No son títulos que aspiran a ser grandes best-sellers del género de turno ni a que el márketing haga que sus novelas copen los mejores puestos en las listas de los más vendidos. Lo que sí está claro es que, quienes hemos leído algunas de sus publicaciones que autoedita en la plataforma digital Amazon, repetimos y es que sabe cómo ganarse al lector utilizando los ingredientes necesarios para ello. Los buenos comentarios que se leen en las redes sociales sobre su buen hacer literario son la mejor baza que tiene este autor madrileño para ganarse más adeptos. Y es que no hay mejor publicidad que el boca a boca, o boca-oído, como mejor prefieran.\nEn su primera novela que escribe dentro del género noir me dejó un buen sabor de boca por las buenas maneras que mostraba en ella, dominada por toques de humor y fina ironía así como un ritmo trepidante que nos invitaba a seguir leyendo hasta el desenlace de la trama. En ella nos presenta al peculiar investigador que tendrá que resolver el caso que le encargan a cambio de pingües beneficios. Con él formará tandem el no menos peculiar hacker Oli que aprovecha todos los trucos que un personaje como él sabe de informática para hacer las averiguaciones oportunas que le encarguen.\n(C.P. Madrid II, Hombres)\nYa en esta nueva entrega la cosa se pone más seria y el humor y la ironía quedan un tanto relegados porque en esta ocasión Miguel Herrero ve cómo su amigo Jano puede ser asesinado nada más salir de la cárcel en la que cumplió diez años de condena por un asesinato en el que su participación no está muy clara. Y es que el investigador no las tiene todas consigo porque hay un francotirador justiciero asesinando con un tiro en la cabeza a los criminales que son puestos en libertad, gracias a los beneficios que el sistema penitenciario español pone a su alcance, pese a los crímenes execrables cometidos por los condenados. A favor suyo está el beneplácito de las familias de los asesinados. Está claro que en esta novela el autor nos invita a la reflexión sobre esos beneficios penitenciarios, tan cuestionados por la sociedad, de los que se favorecen criminales que no muestran una clara predisposición a la reinserción social.\nSi en la primera entrega en la que aparece este investigador, lo llamativo de la misma es el título, en su segunda aparición lo primero que nos llama la atención es la portada. Está claro que una imagen vale más que mil palabras y en este caso este dicho muy nuestro se puede aplicar en esta novela.\nMiguel Herrero y su buen amigo Oli tendrán que actuar en esta ocasión contra el reloj. Empezarán a atar cabos para demostrar la inocencia de Jano condenado por el asesinato de la que fuera su novia Laura. Una serie de indagaciones les llevan hasta descubrir quién da la orden de apretar realmente el gatillo.\nDecisión Encadenada sigue el mismo ritmo trepidante que nos mantiene enfrascados en la lectura al igual que ocurrió con la primera entrega de esta saga. Pese a que en cierto modo el desenlace se hace un tanto previsible, pues a mitad de la novela ya sabemos quién es el que ordena apretar el gatillo, hay una serie de descubrimientos a lo largo de la investigación que sacan a la luz nuevos datos con los que demostrar la inocencia de quien fue condenado injustamente por el asesinato de su novia y mantienen nuestro interés por llegar al desenlace de este caso. Vemos cómo detrás de todo ello hay una trama en la que el tráfico de influencias, estupefacientes, chantaje y secuestro hacen muy difícil el lograr que una nueva víctima sea abatida por el francotirador.\n(Parque de la Concordia-Guadalajara)\nEstá claro que en esta segunda entrega de la saga nos encontramos con un salto de calidad del autor. Se nota en ella que hay más rasgos de novela negra que en la anterior. Pablo Carnicero nos presenta a unos personajes ya más asentados tras los soberbios beneficios conseguidos al resolver su primer caso y nos encontraremos con otros nuevos que les ayudarán en esta compleja misión. También vemos cómo Guadalajara estará más presente en el desarrollo de la trama pues, aunque en la otra también se menciona a la ciudad, es más bien con carácter testimonial, por lo que los hechos bien pudieran ocurrir en cualquier otra.\nPablo Carnicero nos ofrece una trama en la que, como podemos comprobar a lo largo de los trece capítulos en los que está estructurada la novela, se vuelve a recalcar la influencia en ella de películas de acción como Jungla de Cristal, pues Miguel Herrero sigue emulando en algunas de sus acciones a Bruce Willis y también se hace referencia a la novela de Ágatha Christie Asesinato en el Orient Express, ya que al investigador lo que estaba ocurriendo en esta ocasión le parecía una burda copia de ella, en donde había una conspiración de víctimas se alían para asesinar a las personas que les han ocasionado gran dolor.\nEstá claro que ambas novelas cumplen con creces el propósito de su autor. Pese a que forman parte de una saga, pueden leerse perfectamente de forma independiente, porque en esta segunda entrega el lector recibe información de lo ocurrido en la anterior. Pablo Carnicero nos ofrece unas novelas de ritmo trepidante, lectura fluida y mucha dosis de acción. Creo que, como ya dije, el entretenimiento está asegurado.\nSe inicia como autor con El Mundo de las Sombras, un marco en el que se ambientan sus cuatro primeras novelas publicadas: Inmortal, El Filo de la Espada, Tiempos Aciagos y Sangre Inmortal. Sin embargo, no es hasta diciembre de 2013 cuando publica su primera novela negra, Un tipo casi normal en una situación casi anormal, donde se aprecian influencias de Andrea Camirelli, Eduardo Mendoza e incluso algun trazo de Conan Doyle.\nMás adelante continuó con la novela negra Decisión Encadenada, para proseguir con la ficción histórica con El secreto de los Dedos de Aignes y Operación: La sangre del diablo, en una literatura muy alejada de la fantasía, pero que le cautiva de igual manera, no buscando otra cosa más que entretener al lector con una lectura rápida, fresca y apta para cualquier edad, sin más pretensiones.\nTítulo: Decisión Encadenada\nVendido por: Amazon Media EU S.á.r.l.\nNota: sinopsis y datos técnicos, tomados de Amazon. Fotografía de C.P. II Hombres tomada de la web http://www.afaprema.com/, y del Parque de la Concordia de Guadalajara, de http://comeryandarporlaalcarria.blogspot.com.es/.\nFotografía de Pablo Carnicero de solonovelanegra.wordpress.com\nPublicado por Francisco en 18:42 13 comentarios:\nEtiquetas: autoeditado, novela negra, resenas\nDecisión Encadenada, de Pablo Carnicero de la Cáma...


✅ Pico Curavacas - Montaña Palentina\n¿Eres aficionado a las excursiones y a las escaladas de montañas? Entonces no te puedes perder este destino turístico llamado Pico Curavacas Montaña Palentina.\nEste es uno de los destinos más emocionantes y bonitos que te podrás encontrar en el Parque Natural Montaña Palentina en la localidad de Vidrieros, en España.\nEste parque es de los destinos turísticos más visitados por deportistas que buscan una buena experiencia en la montaña.\nSi quieres saber más sobre él, en este artículo vamos a hablarte un poco acerca de este lugar para que puedas planear tus próximas vacaciones y así visitarlo con tu familia y amigos.\n¿Qué es el Pico Curavacas Montaña Palentina?\nPrincipales puntos turísticos del Pico Curavacas Montaña Palentina\nPrecauciones a considerar antes de escalar o caminar el Pico Curavacas Montaña Palentina\nVídeo Pico Curavacas con NIÑOS en la Montaña Palentina\nRuta MAPA Wikiloc Pico Curavacas – Montaña Palentina\nEstamos todos en el Pico Curavacas\nDatos útiles para la ruta al Pico Curavacas en la Montaña Palentina\nWebcam Pico Curavacas:\nAntes de contarte un poco de las paradas turísticas más importantes de este parque, es bueno hablarte del pico en sí.\nAsí, podrás tener toda la información necesaria para tus vacaciones y disfrutar del recorrido que te espera.\nEl Pico Curavacas Montaña Palentina NO es el pico más elevado de la montaña Palentina, con unos 2.524 metros sobre el nivel del mar. Está situado en el Macizo de Fuentes Carrionas de la cordillera Cantábrica. Decimos que no es el más alto pues lleva a error con diversas afirmaciones. La montaña mas alta de la Montaña Palentina y por consiguiente de la provincia de Palencia, es el Pico del Infierno con 2.537 mts. este pico es la cumbre secundaria de Peña Prieta\nEsto hace que sea muy atractiva de escalar y, por tanto, la más atrayente para los turistas y deportistas.\nUn dato curioso de la poca vegetación del área es que es escasa debido a las duras condiciones climáticas del pico.\nLlegan a ser destacables las especies de plantas y animales autóctonos de la zona que no se llegan a encontrar en ninguna otra parte del parque, como la Sempervivum, la Tormentilla, Brezo de Turbera o el Pericularis.\nEl primer punto turístico del recorrido es, sin duda, el pueblo de Vidrieros, que está situado a 126 km de la capital palentina y su aspecto antiguo le da un aire de misterio y belleza que te enamorará.\nEn esta parada podrás probar la gastronomía local mientras te preparas para la escalada.\nEl segundo punto turístico de la ruta es el Arroyo de Cabriles. Esta es la primera parte del recorrido que cuenta con paisajes muy bonitos de la montaña y con abundante vegetación que podrás disfrutar y te preparará para lo que viene.\nSeguimos ascendiendo, después de haber atravesado todo el terreno de bosque y pradera llegamos a la zona de pedrera y el conocido Callejo Grande zona rocosa de la subida, llegarás a una trepada y cambio de vertiente cubriendo la última parte de la arista llegaremos al pico en sí, que es la parte final del recorrido y donde podrás disfrutar de todo el esplendor de la montaña con unas vistas que nunca podrás olvidar, dando por terminada la ascensión… sin olvidar la bajada.\nEs importante que seas consciente de ciertas precauciones que debes tener en cuenta antes de subir el Pico Curavacas Montaña Palentina, para que no tengas ningún problema en el tramo.\nPrincipalmente debes llevar ropa adecuada y suministros vitales, como ir bien desayunados y llevar abundante agua, ya que te esperan duras horas de actividad en el ascenso. (La época será determinante para la equipación y preparación de la ruta)\nTambién es importante llevar protector solar, además de buen calzado que te protejan del terreno abrupto que te espera en la subida.\nAlgo recomendable es llevar casco para la última parte de la subida, donde el terreno se vuelve aún más rocoso y empinado.\nSi tienes algún problema médico que pueda darte problemas a la hora de subir, es recomendable hacer los preparativos previos, como poder contar con un botiquín de esta forma no tener problemas.\nPor último, lleva una buena cámara para captar los momentos únicos que te esperan en este recorrido tan emocionante y que seguro no podrás olvidar nunca.\nDe esta forma concluimos este artículo, esperamos que te haya brindado la información necesaria para tu próxima aventura.\nPara saber mejor sobre nuestra experiencia no dejes de ver el vídeo que hemos realizado de la ruta y esperamos que los datos de interés, track y demás detalles sean útiles.\nComo veréis en le vídeo tuvimos la suerte de conocer a Luis una persona que ha cumplido el reto de subir al Pico Curavacas en muchas ocasiones a consecuencia de una promesa por la situación que tuvo que vivir en primera persona al perder a sus dos hijos en esta montaña.\nNos conto su historia y pudimos apreciar su sentir, y entrega. Con mucho cariño y afecto le mandamos un respetuoso saludo deseando lo mejor para el y los suyos, agradecerle su interés por nuestra actividad y contarnos su historia la cual escuchamos con atención e inculcamos a nuestros hijos haciendo ver el gran respeto que se debe tener a la montaña y los grandes valores que se esconden tras de cada paso que damos en ellas.\nSi queréis saber más sobre este asunto os dejamos enlace a FOROPICOS donde se ha hablado intensamente de este asunto.\nEnlace Wikilock: Pico Curavacas desde Vidrieros\nKilómetros: 11,16 km\nDesnivel: 1.183 metros de subida\nLugar de comienzo: Vidrieros – Palencia – Catilla y León – España\nPunto más bajo: 1.326 metros / Punto más alto: 2.524 metros\nTiempo con niños y comiendo en el camino: 7 horas y 39 minutos Paradas a descansar, comer, cambiarse de ropa todo el tiempo.\nDejamos una imagen del Pico Curavacas desde Triollo con la webcam de www.curavacas.es que nos autoriza su uso.\nDistancia total: 10.57 Km mi / ft ?\nDistancia analizada: 10.57 Km\nDesn. de subida acumulado: 1143.7 m info Lista de puntos\nDesn. de bajada acumulado: 1136.8 m\nAltura máxima : 2463 m\nAltura mínima : 1326.4 m\nAltura en inicio: 1328.5 m\nAltura en final: 1334.9 m\nRatio de subida: 22.64 %\nRatio de bajada : 22.48 %\nDesnivel positivo por Km: 108.2 m\nDesnivel negativo por Km: 107.55 m\nNúmero de puntos: 933 (cad. 11.33 m)\nPuntos significativos : 303 (cad. 35.01 m / 32.48 %)\nCambios dirección por Km: 16.27\nCambios dirección > 5º por Km: 13.06\nTramos rectos acumulados : 1.315 Km\nTramos rectos por Km: 124.41 m\nCambios de pendiente penalizables por Km: 0.473\nTiempo total : 7:39:24 h\nTiempo en movimiento: 4:42:21 h\nTiempo parado : 2:57:03 h\n2250 1.255 11.87 0:33:34 2.24 1:46:29 2:20:03 0.54\n2000 1.202 11.37 0:47:56 1.5 0:37:45 1:25:41 0.84\n1750 1.424 13.47 0:59:12 1.44 0:14:41 1:13:53 1.16\n1500 2.598 24.58 1:06:45 2.34 0:06:20 1:13:05 2.13\nTotal: 6.479 Km 61.28 % 3:27:27 h 1.87 Km/h 2:45:15 h 6:12:42 h 1.04 Km/h


¿Quién es Lili Love? – Titulares 24hrs\n8 febrero, 2019 19 diciembre, 2019 joveneshacerpolitica\n¿Quién es Lili Love?\nMexicana de nacimiento (Jalisciense), se dedica a hacer performance en centros nocturnos y recientemente se incorporó a la empresa de cine para adultos Sexmex, posicionándose rápidamente como una de las preferidas por hombres y mujeres, pues en sus redes sociales tiene poco más de medio millón de seguidores.\nSe hace llamar Lili Love (Lili Amor), se caracteriza por ser divertida, buena onda, siempre honesta y directa.\nRecientemente el portal El Gráfico la entrevistó y recopilamos lo más importante de sus picantes y hot declaraciones.\nMe inicié alrededor de los 15 años, era una niña calenturienta y precoz.\nEs algo muy rico siempre y cuando tengas una buena manera de llevar tu sexualidad, es decir, que te cuides, sexo seguro ante todo porque ahorita está muy expandido lo de las ETS.\nComo actriz porno invito a todos mis seguidores a que se cuiden, se protejan y usen preservativo.\nEs primordial, deben tener sexo, es importante. Todo influye, espirituales, emocionales, físicas, etc., más que nada es como el cuerpo lo pide.\nEn un trío. Conocer a una pareja y la chava se puso celosa y me jaló los cabellos. Cuando estábamos haciendo el trío se empezó a portar súper mal.\nPara mí es lujuria y pasión.\nMe encantan los hombres, son algo rico. No sé qué haría yo sin hombres. Aunque también, debo reconocer, hay mujeres bellas.\nLa anterior fue una recopilación de la entrevista El Gráfico, aquí te dejamos sus redes sociales para que puedas seguir conociéndola un poco más.\nLili Love estará este 1, 2 y 3 de marzo en la Expo Sexo y Erotismo 2019 en el Palacio de los Deportes y promete a sus seguidores que esta vez se va a poner “muy bueno”.\nAnterior Músico colombiano Fabio Legarda muere por una bala perdida\nSiguiente 29 aplicaciones que debes eliminar porque te espían\nActriz xxx te invita a su cumpleaños – Titulares 24hrs dice:\n2 abril, 2019 a las 9:33 pm\n[…] Unique, la famosa actriz porno que se desnudó en una taquería de Puebla. Lanzó una convocatoria para todos los que aquella […]\nLiLi Love dice:\nToda una diosa, la sigo desde mucho antes, y ahora surgiendo en grandes productoras como sexmex.\nEs toda una diosa, la sigo desde hace mucho y ahora feliz porque sale en grandes productoras como sexmex.


Comunicado al Partido de los Trabajadores de la República Popular Democrática de Corea\nEstimados camaradas: El Comité Central del Partido Comunista Obrero Español (PCOE) se une al dolor del Partido de los Trabajadores de la República Popular Democrática de Corea, así como al dolor del Pueblo norcoreano, tras el fallecimiento de Kim Jong Il. Kim Jong Il y el Partido han sabido dirigir con gran acierto el proceso revolucionario coreano en unas condiciones internacionales hostiles. Ha…\nSaludos del PCOE al Congreso del Frente Polisario\nEstimados camaradas saharauis: Desde el Comité Central del Partido Comunista Obrero Español (PCOE) queremos transmitir nuestro más sincero reconocimiento y admiración hacia el Pueblo saharaui y su organización el Frente Polisario. Nuestros pueblos están hermanados por vínculos indestructibles, vínculos que son incapaces de sucumbir a las maniobras de los estados que practican el pillaje, el saqueo, el asesinato, la colonización,…\nEl pasado viernes día 7 de octubre fue liberado de la cárcel de Marianna (Florida), René González, uno de los Cinco Héroes cubanos detenidos por el gobierno de los EEUU en mil novecientos noventa y ocho. René, junto a Gerardo Hernández, Ramón Labañino, Antonio Guerrero y Fernando González fueron juzgados en 2001 siendo acusados de espionaje, en un juicio lleno…\n11 de septiembre de 2011 Hoy se cumplen 38 años del bombardeo del Palacio de la Moneda en la ciudad de Santiago de Chile. El ejército chileno y imperialismo norteamericano en la sombra conspiraron para derrocar al gobierno del Poder Popular presidido por Salvador Allende. El presidente, con un reducido número de compañeros, resistieron los bombardeos aéreos, el fuego de…\nDeclaración del Ministerio de Exteriores de Cuba\nEl 18 de agosto, el Departamento de Estado incluyó a Cuba, por trigésima ocasión, en la espuria lista de "Estados patrocinadores del terrorismo internacional", con el único propósito de desacreditar a nuestro país y continuar justificando la política cruel y repudiada de bloqueo contra Cuba. El gobierno de Estados Unidos, que ha practicado históricamente el terrorismo de Estado, las ejecuciones…


Rigging - Wikipedia, la enciclopedia libre\nSe ha sugerido que este artículo o sección sea fusionado en Skeletal animation (véase discusión).\nEl rigging es el proceso de crear un sistema de controles digitales y agregárselos a un modelo 3D para que así pueda ser animado fácilmente y eficientemente. Este es un paso crucial dentro del proceso de la creación de una animación 3D. Como dijo Johan Arzuza "Un Rigger es como un creador de marionetas, pero en este caso como son modelos digitales, podríamos decir entonces marionetas digitales" \nDentro del pipeline de animación, existe el departamento de Rigging. Este departamento suele ser muy olvidado ya que es un trabajo muy tedioso que pocos quieren hacer. A pesar de ser un proceso tedioso, es fundamental para la creación de muchísimo contenido 3D. El Rigger, término que se le da a alguien que hace el rigging, debe ser alguien con conocimientos de programación, scripting, rigging, skinning y debe desarrollar sistemas procedurales que faciliten una movilidad que sea lógica y correcta.\nPara que un rigging pueda ser eficiente, debe ser lo suficientemente intuitivo para que el operador no tenga problemas tales como la falta de movilidad o movimientos antinaturales. Este proceso, está en constante cambio dentro de la industria puesto que cada vez se necesitan nuevos tipos de riggs, por ejemplo; riggs para simular músculos, piel, cabello, etc. Lo riggs más comunes están credos por deformadores de uniones. "Los deformadores son herramientas de alto nivel que se pueden utilizar para manipular (durante el modelado) o unidad (al animar) los componentes de bajo nivel de una geometría de destino." \nEn la animación de personajes se deben crear un sistema esquelético que vaya de acuerdo con la forma básica del personaje. Un manera simple es mediante esferas de estructura alámbrica digitales para así crear uniones que puedan moverse fácilmente. Estas uniones están representadas por una pirámide de estructura alámbrica y se conectan así con los huesos virtuales. Cuando ya se tiene la estructura básica, el modelo 3D se acopla al esqueleto alámbrico para así poder darle movilidad creíble y natural , como a una marioneta.\nPlugins y controladores virtuales[editar]\nYa todo en su lugar, existe un proceso donde, por medio de plugins, se puede poner un peso al modelo, haciendo su movimiento aún más realista. Un libro lo describe de la siguiente manera. "Each joint in a hierarchy exerts influence over each vertex of the geometry, pushing or pulling it in one direction or another. The amount of influence exerted on a vertex by a joint is controlled through weighting." \nEl último trabajo del rigger es crear un sistema de controles virtuales para que el animador pueda controlar el modelo 3D sin ningún problema. Estos controles pueden ser algo sencillo, como un nodo en el esqueleto virtual, curvas en una gráfica, o pueden ser complicados al grado de ser manipulados por código.\nTodd Palamar nos dice en su libro (Mastering Autodesk Maya 2016) que la meta de un rigger es crear uniones que imiten la funcionalidad de un esqueleto real. No es necesario replicar cada hueso de un esqueleto real, la mayoría de las veces, puedes obtener un efecto realista utilizando un número reducido de uniones. Algunos casos requieren uniones que no existen en la vida real para así lograr el movimiento deseado. Sea cual sea el caso, es importante recordar que la meta del esqueleto es proveer la estructura correcta para el movimiento realista y adecuado del personaje, todo esto de una manera eficiente.\n¿Por qué es tan importante ?[editar]\nTomemos como ejemplo del proceso de Rigging al primer largometraje completamente creado en 3D, Toy Story del estudio Pixar. Para que cualquiera de los personajes de esa película pudiera cobrar vida, primero debieron crear un modelo 3D. En este punto de la producción, el modelo 3D es una masa gris, de baja resolución que no se puede mover. Aquí es cuando entra en juego el Rigger. El Rigger toma el modelo 3D sin movilidad y sin texturas y comienza a crear un sistema de huesos y de "hilos" virtuales con los cuales un animador podrá mover ese modelo 3D para que cobre vida y pueda ser utilizado en la producción del largometraje.\nNo todo el contenido 3D utiliza rigging, sólo lo utilizan los personajes que deben moverse. Si no existiera la especialidad de rigging, no podrían darle "vida" a los personajes y simplemente no se podría realizar una gran cantidad de contenido 3D perdiendo así un importante porcentaje de contenido audiovisual del cual depende tanto nuestra sociedad actual.\n↑ «¿ Qué es Rigging ?». www.artzuza.com. Consultado el 17 de abril de 2017.\n↑ Maya,Autodesk. C.A., E.U.: Mill Valley. 2012. |fechaacceso= requiere |url= (ayuda)\n↑ Palamar Todd. «Mastering Autodesk Maya2016». Autodesk Official Press. Archivado desde el original el 21 de abril de 2017. Consultado el 15 de marzo de 2017.\nObtenido de «https://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Rigging&oldid=126288929»


Pla de la Casa (desde el puerto de Confrides)\nSubida por la pista del puerto de Confrides al Pla de la Casa y al Recingle Alt\nRecorrido por la Serrella, en su mayoría por pistas. Encontramos señalización en los tramos que coinciden con los PR-CV 23 y 24.\nEmpezamos la ruta en el puerto de Confrides, a donde llegamos por la CV-70 desde Confrides o desde Benasau. En el mismo puerto hay una explanada donde se puede aparcar.\nPuerto de Confrides - Pla de la Casa (3 horas)\nDesde el puerto de Confrides, cruzamos la carretera y subimos por la pista de tierra. Aunque ya no queda demasiada nieve, es suficiente para poder subir con los esquís puestos. La pista serpentea por la sierra y sube por el barranc de les Cremades hasta el depósito de agua. En este punto se separan las rutas hacia el Pla de la Casa y el Recingle Alt. Seguimos por la pista principal hasta llegar al collado de Borrell. Desde esta zona subimos por la ruta del sendero habitual, ahora tapado por la nieve, hasta la parte alta del Pla de la Casa. Una vez arriba, continuamos hasta el pozo nevero y desde allí, subida final hasta la cima. Desde la cima hay una espléndida vista de la umbría de Aitana, cargada de nieve, y del resto de las montañas de los alrededores.\nPla de la Casa - Recingle Alt (2 horas y media)\nVolvemos por la misma ruta hasta el depósito, y desde allí, subimos por la pista que conduce al Recingle Alt de la Serrella. Los últimos metros de subida tienen un pasamanos que termina junto al vértice y la caseta forestal.\nRegresamos por la misma pista hasta el puerto de Confrides. No todos los años se puede disfrutar de jornadas de esquí de travesía en Alicante, así que había que aprovecharla.\nMallada del Llop (desde Famorca)\nTravesía Aixortà - Serrella (por el bco. del Negre)


La burla de Elisa Carrió a los trabajadores de C5N | Perfil\nPOLITICA / Instituto Hannah Arendt\nLa legisladora le envió un fuerte mensaje a Cristobal López y se refirió a la situación laboral de sus empleados. Mirá el video.\nElisa Carrió en el Instituto Hannah Arendt. Foto: Captura de Pantalla\nLa diputada oficialista Elisa Carrió fue a dar una charla este martes al Instituto Hannah Arendt junto a sus compañeras de la Coalición Cívica Mariana Zuvic, Paula Oliveto, Mónica Frade y Mariana Stilman. En ese marco es que cuando supo que había un periodista de C5N en el evento tuvo un fuerte mensaje frente a sus cámaras y a la salida terminó ironizando a un cronista de dicho canal con la crisis que viven sus trabajadores por el cobro en cuotas de los sueldos, luego de que fuera bloqueada la cuenta destinada al pago de salarios.\n"¿Dónde están los delincuentes de C5N?", preguntó Carrió al mismo momento que el cronista Lautaro Maislin llegaba a la sala donde brindaba su discurso. Y volvió a preguntar: "¿Dónde están los delincuentes de C5N? parte de la delincuencia argentina".\nEn ese momento es donde las imágenes mostraron como el periodista exhibe donde estaba y la legisladora dijo: "Los trabajadores no tienen la culpa. Le digo a C5N que ustedes son unos delincuentes. Que forman parte de una asociación ilícita".\nEn diálogo con PERFIL, el cronista Maislin detalló que si bien Carrió "tuvo un reparo después de ese comentario y dijo que los trabajadores no tienen la culpa, luego nos acusó a C5N de ser delincuentes y nos hizo sentir en un clima hostil en medio del evento".\nNo obstante, el momento en donde el periodista describe su mayor indignación es a la salida del evento, cuando la funcionaria parlamentaria ironiza con su situación laboral: "El prensa nos dijo a mí y a un colega de La Nación que Carrió no iba a dar entrevistas, pero nosotros la esperamos afuera y si no quería responder podía hacerlo igual. Ahí es cuando le pregunto por las declaraciones que tuvo con el ministro Garavano, a lo que no responde. El colega le pregunta por el caso D'Alessio y ella no responde tampoco. Luego yo le pregunté cómo estaba su relación con D'Alessio y ahí es cuando me responde". En el video, se observa y entiende que Carrió le repregunta al joven "¿Y la ustedes con Cristobal López como anda?", entre risas. Y agregó: "¿Les paga o no les paga Cristóbal López?".\nLa Justicia bloqueó la cuenta inembargable para pagar sueldos a los empleados de C5N\nBloqueo a la cuenta sueldo. Actualmente y desde hace un año, los empleados del canal están cobrando los salarios en cuotas a través del cambio de cheques de publicidad de financieras. “Cuando estaba todo dispuesto para la apertura de dicha cuenta, que significaría que quienes pertenecemos a C5N podamos empezar a percibir nuestros salarios de una manera más normal, la AFIP presentó una apelación ante la Cámara Nacional en lo Comercial para que esa cuenta no pueda abrirse o, caso contrario, sea embargada”, explicó la comisión gremial.\nEl 6 de febrero de este 2019, la Sala D de la Cámara Nacional de Apelaciones en lo Comercial integrada por los jueces Gerardo Vassallo, Pablo Heredia y Juan Garibotto decidieron bloquear la cuenta que el magistrado de primera instancia Javier Cosentino había ordenado crear bajo el carácter de "inembargable" para pagar los sueldos de los medios del ex Grupo Indalo (el canal C5N, el portal Minuto Uno y las radios 10 y FM Pop).\nEs que en medio de la causa por el concurso de los medios de Cristobal López, la Administración Federal de Ingresos Públicos (AFIP) apeló a la decisión de Cosentino para que en medio de los embargos de todas las cuentas del holding del empresario kirchnerista -procesado por evadir desde la empresa Oil Combustibles el pago de $7600 millones en concepto de impuestos- se pudiera continuar con el pago de los trabajadores de los medios. Y la Cámara le dio la derecha al organismo recaudador del Estado.


Restaurantes cerca de Houghton House\nTodo los panoramas en Ampthill\nCosas que hacer cerca de Houghton House\nPortal de viajes: Ampthill\nN.º 1 de 13 cosas que hacer en Ampthill\nAtracciones y lugares de interés, Edificios con valor arquitectónico, Monumentos y lugares de interés, Lugares históricos, Ruinas antiguas Más\nBedford Road | B530 north of Ampthill, Ampthill MK45 2EZ, Inglaterra\nUna casa del siglo xvii temprano en ruinas en 1800, ya sobre como se puede ver en las fotos. Todavía hay ruinas sustancial que puede pasearse por la vista es impresionante y lo que es aún mejor es que es gratis para visitar. Lugar para...picnic. 🙂goodMás\nAtmosférico arruinar de una casa de campo con vistas preciosas\nSe dice que esta era la hermosa Casa descrito en progreso de John Bunyan peregrinos. Había conexiones reales con casa muy bien situado que domina la cresta de Manganesio Greensand mirando hacia Bedford. Construido en el siglo 17, con detalles de Inigo Jones, posiblemente la...casa está ahora en el cuidado de patrimonio inglés. Se puede aparcar bastante cerca y hay la oportunidad de caminar alrededor de la casa en un entorno tranquilo.Más\nVale la pena una visita escondido al final de un camino, algunos espacios para aparcar un coche. Excelentes vistas en un día claro de la campiña y Bedfordshire\nLas vistas preciosas, no grandes y turísticos, hermoso y sencillo, fue capaz de llevar el perro, gratis, bueno para un picnic.\nLas Ruinas bien cuidadas con fácil acceso\nLas señales son claras para esta ubicación. La entrada está un poco escondido en la esquina de la calle, así que ten cuidado. El estacionamiento es amplio y gratuito. Está a unos 500 metros a pie de la web. La puerta principal está cerrada. La...puerta lateral a la derecha de la puerta principal y está siempre abierto. Zapatos de dios poca son necesarios. Hay un árbol de hermosos árboles de la carretera que conduce a las ruinas. El edificio está bien cuidado y bien señalizado indicando la historia y propietarios. Las vistas son increíbles desde todos los ángulos. Graffiti antiguos pueden verse en las paredes, que me parece muy interesante.Más\nMi esposa y yo visitamos la casa de Houghton en mayo de 2016, y estamos de vuelta otra vez Mayo 2017. Es una gran sensación pararse aquí y sentir la historia de este gran casa antigua. Prueba a ver si puedes. .\nBonito, pero necesita algunas reparaciones\nPrecioso edificio, pequeño parking. Muchos jóvenes de estar y vaguear que estropeó un poco. Los jardines necesitaba un poco de limpieza y borrado también, un montón de basura, cristales, agujas, botellas. . Quizás algunos bancos. etc. sería bueno para fomentar las visitas más? Quizás el...área de picnic? Vistas impresionantes desde aquí!Más\nCasa de houghton\nPreciosos jardines pero viaje podría haber sido mejor. Estaba decepcionado por un grupo de unos 15 adolescentes posiblemente borrachos escandalosos escalada sobre las ruinas. Los niños disfrutaron de lo que vimos y a tratar de coger otro día donde no hay tantas personas.\nFotógrafos de ensueño!\nMaravillosamente evocador. Aquí sólo pasó una hora caminando, tomando fotos y sólo imaginando lo que era como volver en el día.\nHistoria interesante. Se dice que la hermosa casa. Muy tranquila con aparcamiento limitado, pero normalmente no supone un problema.\nObtén respuestas rápidas del personal y los visitantes anteriores de Houghton House.