Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer | Protocol (Translated to Spanish)\nLas interacciones entre las proteínas son fundamentales para todos los procesos celulares. El uso de bioluminiscencia de transferencia de energía de resonancia, la interacción entre un par de proteínas se puede controlar en células vivas y en tiempo real. Además, los efectos de las mutaciones potencialmente patógenos pueden ser evaluados.\nLos ensayos basados en la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) proporcionan un medio sensible y confiable para monitorear las interacciones proteína-proteína en las células vivas. BRET es la transferencia no radiativa de energía a partir de un "donante" de la enzima luciferasa a una proteína fluorescente aceptora. En la configuración más común de este ensayo, el donante es de la luciferasa de Renilla reniformis y el aceptor es proteína amarilla fluorescente (YFP). Debido a que la eficiencia de la transferencia de energía es fuertemente dependiente de la distancia, la observación del fenómeno BRET requiere que el donante y aceptor de estar en estrecha proximidad. Para la prueba de una interacción entre dos proteínas de interés en células de mamífero en cultivo, una proteína se expresa como una fusión con la luciferasa y la segunda como una fusión con YFP. Una interacción entre las dos proteínas de interés puede llevar el donador y el aceptor suficientemente cerca para que se produzca la transferencia de energía. En comparación con otras técnicas para la investigación de la proteína-proteína eninteracciones, el ensayo BRET es sensible, requiere poca práctica en el tiempo y unos reactivos, y es capaz de detectar interacciones que son débiles, transitorio o dependiente del entorno bioquímico encontrado dentro de una célula viva. Por lo tanto, es un enfoque ideal para la confirmación de las interacciones putativas sugeridas por estudios de proteómica de levadura de dos híbridos o espectrometría de masas, y además es muy adecuado para cartografiar regiones interactuar, evaluar el efecto de las modificaciones post-traduccionales en las interacciones proteína-proteína, y evaluar el impacto de las mutaciones identificadas en el ADN del paciente.\nTanto vinculación clásica y de próxima generación análisis de secuenciación de trastornos humanos están revelando la relevancia clínica de las proteínas que participan en una variedad de procesos biológicos. A menudo es el caso que, antes de su identificación en tales estudios, ha habido poca o ninguna investigación del papel biológico de estas proteínas. Una vía fructífera para comenzar a explorar la función biológica de una proteína de interés es identificar qué otras proteínas interactúa con en su contexto fisiológico. Caracterización de las redes moleculares de esta manera proporciona información detallada sobre los procesos biológicos que subyacen al fenotipo humano.\nLa proyección a gran escala de uso más frecuente se acerca para la identificación de los compañeros de interacción candidatos para las proteínas de interés son la levadura de dos híbridos de 1 y proteómica basada en la espectrometría de masas 2. Estos métodos pueden ser muy exitosos en lo que sugiere que interactúan las proteínas potenciales, pero are vulnerable a resultados positivos falsos. Por lo tanto, la confirmación de una interacción identificado por levadura de la espectrometría de masas de dos híbridos o requiere la validación de la interacción utilizando una segunda técnica. Normalmente, un co-inmunoprecipitación o ensayo de pull-down se utiliza para este fin 3. Una desventaja del uso de tales técnicas para la validación es el requisito para la lisis celular, que destruye las condiciones intracelulares que pueden ser esenciales para el mantenimiento de ciertas interacciones proteína. Una segunda desventaja es que las interacciones débiles o transitorios de proteína pueden ser interrumpidos durante los pasos de lavado. Además, estos ensayos exigen práctica en tiempo significativos, están limitados en el número de muestras que se pueden procesar de forma simultánea, y a menudo requieren la optimización de tiempo de los reactivos y protocolos.\nPara superar algunos de los problemas asociados con experimentos de co-inmunoprecipitación, varios ensayos se han desarrollado sobre la base de fluorescente y bioluminescent proteínas que se pueden utilizar en células vivas. El primero de estos ensayos se basan en la fluorescencia (o Förster) Transferencia de energía de resonancia (FRET), la transferencia no radiante de energía entre dos proteínas fluorescentes con la superposición de espectros de emisión y de excitación 4. La eficiencia de la transferencia de energía es fuertemente dependiente de la distancia, por lo tanto, la observación del fenómeno de FRET requiere que los fluoróforos donador y aceptor estar en estrecha proximidad. Para la prueba de una interacción entre dos proteínas de interés, una proteína se expresa como una fusión con el fluoróforo donante (proteína fluorescente cian comúnmente; PPC) y el segundo como una fusión con el fluoróforo aceptor (proteína fluorescente amarilla comúnmente; YFP). Una interacción entre las dos proteínas de interés puede llevar a los donantes y aceptor fluoróforos suficientemente próximos para que se produzca la transferencia de energía, lo que resultará en un aumento mensurable en la emisión de luz desde el aceptor YFP en relación con el donante de la PPC. FRET ha tenido éxito en la detección de interacciones proteína-proteína en células vivas 4. El principal inconveniente del uso de FRET para la detección de interacciones proteína-proteína es el requisito para la iluminación externa para la excitación del fluoróforo donante. Resultados de la iluminación interior en gran fondo en la señal de emisión, excitación no deseada del aceptante, y fotoblanqueo del donante y aceptor fluoróforos. Estos efectos reducen la sensibilidad del ensayo para la detección de interacciones proteína-proteína.\nUna modificación del ensayo de FRET, que supera el problema de alto fondo de la iluminación externa es la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) 5,6 ensayo. En el sistema de BRET el fluoróforo donante se sustituye por una enzima luciferasa. Así, la energía para la excitación del fluoróforo aceptor se genera dentro del sistema por la oxidación de un sustrato de luciferasa, lo que hace innecesaria la iluminación externa. En el másconfiguración común de este ensayo, el donante es luciferasa de Renilla reniformis y el aceptor es YFP (para una discusión de la alternativa de donantes y aceptores de proteínas ver Pfleger et al. 5). De acuerdo con ello, en este sistema, una proteína de interés se fusiona con una proteína luciferasa y potencialmente interactuar a YFP, o viceversa. El ensayo BRET requiere la adición de coelenterazina como sustrato para la luciferasa. Debido a que la coelenterazina es permeable a las células, es posible llevar a cabo ensayos de BRET en células vivas. Sin embargo, coelenterazina nativa es inestable en solución acuosa, y el desglose-enzima independiente de coelenterazina tanto reduce la concentración de sustrato disponible para el ensayo y genera autoluminiscencia, lo que reduce la sensibilidad de las mediciones de la actividad de luciferasa. El uso de BRET en células vivas ha sido facilitado por el desarrollo de coelenterazines protegidas, que son estables en solución acuosa, pero se escinden por esterasas citosólicass después de la difusión a través de la membrana de la célula para generar coelenterazina activo dentro de la célula 7.\nDespués de la adición de sustrato a las células que expresan luciferasa y las proteínas de fusión-YFP, la transferencia de energía resultante de las interacciones proteína-proteína se cuantificó mediante el control de la emisión de la luciferasa y YFP. Debido a las interacciones de proteínas se pueden monitorizar directamente en células vivas en placas de múltiples pocillos, el ensayo BRET constituye un método simple y escalable para la validación de las interacciones putativo que es el costo y eficiente en el tiempo.\nAdemás de validar interactores putativos identificados en estudios de cribado proteómicos, el sistema de BRET también se puede utilizar para candidatos a elementos interactuantes prueba de derivados de estudios bioquímicos y estructurales previas sobre la proteína de interés. Una vez que la existencia de una interacción proteína-proteína se ha establecido (ya sea usando el ensayo BRET o por otras técnicas), existe un potencial para el ensayo BRET para ser EMPLoyed más para caracterizar la interacción. Por ejemplo, las regiones que interactúan se pueden asignar mediante la generación de versiones truncadas de las proteínas, y la participación de residuos específicos en la interacción se puede demostrar mediante la creación de mutaciones puntuales. Además, el efecto modulador de modificaciones postraduccionales o pequeñas moléculas (tales como fármacos o ligandos) sobre las interacciones proteína-proteína puede ser investigado 8-10.\nEl ensayo BRET también tiene un gran potencial para la investigación de mutaciones identificadas en el ADN del paciente. En los casos en que se ha establecido un papel causal para una mutación, estudiar el efecto de la mutación en las interacciones proteína-proteína utilizando BRET puede revelar más acerca de la etiología molecular de la fenotipo 11. Desde el advenimiento de las metodologías de secuenciación de próxima generación, cada vez es más común para varias mutaciones potencialmente dañinos que se identifiquen dentro de un individuo, en cuyo caso no está claro cuáles son releVant para el fenotipo 12. En esta situación el ensayo BRET puede ser valiosa en la evaluación del impacto de las mutaciones en la función de las proteínas y, por tanto, su importancia para el trastorno.\n1. Creación de plásmidos\nSubclonar el ADNc para cada proteína de interés en ambos los vectores pluc y pYFP, utilizando técnicas estándar de biología molecular (Figura 1). Para ver protocolos detallados Green et al 13.\nSecuencia de todos los constructos para verificar que las proteínas de interés están en marco con la secuencia de Luc / YFP sin codones de parada intermedios.\nRealizar ensayos funcionales como se desee para confirmar que las proteínas de fusión conservan su actividad biológica. En el caso que aquí se presenta la localización subcelular de las proteínas de fusión YFP se determinó por microscopía de fluorescencia.\nHacer plásmidos de expresión de las proteínas de control apropiadas Luc y YFP mediante el diseño de las señales de orientación pertinentes en los vectores de expresión pLUC y pYFP. En el caso que aquí se presenta, generar constructos Luc y YFP-nucleares dirigida por la inserción de una señal de localización nuclear en los vectores pLUC y pYFP.\nHaceruna construcción de control positivo en el que Luc y YFP se funden en un único polipéptido. En el caso que aquí se presenta, generar un control positivo en el que se inserta la secuencia de codificación de YFP en el vector pLuc.\nSeleccionar un plásmido de relleno neutro para ser utilizado para igualar la masa de ADN en las mezclas de transfección. Utilice un plásmido que no tiene promotor eucariota y por lo tanto será transcripcionalmente inactivo en células de mamífero, tales como un vector de clonación bacteriana.\n2. Preparación de ADN Mezclas\nEstimar la concentración de todos los plásmidos descritos en la Sección 1 basado en la absorbancia a 260 nm (1 unidad de absorbancia es equivalente a 50 g / ml de ADN). Determinar la masa molecular de cada plásmido de multiplicar el número de pares de bases por 650 Da. Utilice la concentración y masa molecular para calcular la concentración molar de cada preparación de plásmido. Diluir las preparaciones de ADN de plásmido a una concentración de 36 nM. Estas serán las reservas de trabajoque se usan para preparar las mezclas de ADN para la transfección.\nPreparar una mezcla de ADN de control que contiene 1.800 ng de plásmido de relleno en un volumen final de 20 l de agua.\nPrepare una mezcla de ADN de control que contiene 5 l de la construcción-el control pLuc. Añadir plásmido de relleno para aumentar el peso total de ADN a 1800 ng. Añadir agua para llevar el volumen final a 20 l.\nPreparar una mezcla de ADN de control que contiene 5 l de constructo de control de pLuc y 5 l de constructo de control de pYFP. Añadir plásmido de relleno para aumentar el peso total de ADN a 1800 ng. Añadir agua para llevar el volumen final a 20 l.\nPrepare una mezcla de ADN de control que contiene 5 l de construcción de control positivo. Añadir plásmido de relleno para aumentar el peso total de ADN a 1800 ng. Añadir agua para llevar el volumen final a 20 l.\nPrepare el siguiente ADN se mezcla para la prueba de homodimerización de una proteína de interés, X. Para cada mezcla de ADN combinar 5 l de la pLuc relevante construir y 5 l de la pYFP construir. Añadir plásmido de relleno para aumentar el peso total de ADN a 1800 ng. Añadir agua para llevar el volumen final a 20 l.\nA)-Control pLuc y pYFP-X\nB) pLuc-X y control pYFP\nC) pLuc-X y X-pYFP\nPrepare el siguiente ADN se mezcla para la prueba de una interacción entre un par de proteínas de interés, X e Y. Para cada mezcla de ADN se combinan 5 l de la pLuc relevante construir y 5 l de la pYFP construyen. Añadir plásmido de relleno para aumentar el peso total de ADN a 1800 ng. Añadir agua para llevar el volumen final a 20 l.\nC) de control de pLuc y pYFP-Y\nD) pLuc-Y y-control de pYFP\nE) pLuc-X e-Y pYFP\nF) pLuc-Y y pYFP-X\nHarvest Subconfluent células HEK293 de un frasco de 75 cm2. Diluir 10% del total de células en 13 ml de medio de cultivo. Dispensar 130 l de suspensión celular en cada pocillo de un blancofondo transparente de 96 pocillos placa de cultivo de tejidos. Cultivar las células durante 24 horas.\nCalcular el número de pozos a ser transfectadas multiplicando el número de mezclas de ADN por 3. Traer medio de cultivo libre de suero a temperatura ambiente. Preparar una mezcla maestra que contiene 6,3 l de medio libre de suero y 0,18 l de reactivo de transfección por pocillo. Mezclar por agitación e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.\nPreparar las mezclas de transfección mediante la adición de 2 l de mezcla de ADN a 20 l de medio / transfección mezcla maestra reactivo libre de suero. No vórtice. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.\nTransfectar tres pozos con cada mezcla de transfección dispensar 6,5 l de mezcla de transfección por pocillo. Cultivar las células de un 36 a 48 horas más.\n4. Medición de la señal BRET\nDisolver sustrato de luciferasa de células vivas a 34 mg / ml en DMSO por vórtex.\nDiluir sustrato de luciferasa de células vivas reconstituido a 1:1.000 en sustrato dilución medio pre-calentado a 37 ° C. Permitir 50 l de medio de dilución de sustrato por pocillo. Vortex para mezclar. Puede formarse un precipitado, pero no va a interferir con el ensayo.\nAspirar el medio de cultivo de la placa de 96 pocillos. Dispensar 50 l de sustrato de luciferasa de células vivas diluido en cada pocillo. Células de cultivo durante al menos 2 horas (hasta 24 horas).\nRetire la tapa de la placa de 96 pocillos y se incuba la placa durante 10 minutos a temperatura ambiente en el interior del luminómetro.\nMedida de emisión de Luc y YFP un pozo a la vez. Medida de emisión de Luc usando un filtro de bloqueo de longitudes de onda más larga que 470 nm. Medida de emisión de YFP utilizando un filtro de paso de banda de 500-600 nm. Integrar las señales de emisión durante 10 s.\nPromedio de las lecturas de emisión Luc de los 3 pocillos que recibieron sólo el plásmido de relleno. Reste este valor de todas las otras lecturas de emisiones Luc para producir los valores de emisión de Luc fondo-resta.\nPromedio de las lecturas de emisión de YFP de los 3 pocillos que recibieron sólo el plásmido de relleno. Reste este valor de todas las otras lecturas de emisiones YFP para producir los valores YFP emisión de fondo-resta.\nPara cada pocillo, se divide el YFP valor de fondo-resta la emisión por el valor Luc fondo-resta de emisión para dar la relación de BRET sin corregir.\nLa media de los coeficientes de BRET no corregidas de los tres pozos que fueron transfectadas con sólo el plásmido de control pLuc. Restar este valor de todas las otras relaciones de BRET no corregidos para dar las proporciones de BRET corregidos.\nPara cada uno de los restantes conjuntos de relaciones de BRET corregidos, el promedio de los valores de los tres pozos transfectadas para obtener una relación BRET final.\nEl principio del ensayo BRET se ilustra en la Figura 2. La configuración de ensayo utilizado a través de los experimentos presentados aquí se representa en la figura 3. La detección de una señal BRET fuerte a partir de células transfectadas con una proteína de fusión luciferasa-YFP confirmó que la transferencia de energía era observable en este montaje experimental (Figura 4).\nNuestra investigación se centra en el papel de la familia FOXP de represores transcripcionales en el desarrollo del cerebro. Mutaciones heterocigotas afectan plomo FOXP2 a una rara forma de expresión y el trastorno del lenguaje, de las cuales el elemento más destacado es la dispraxia verbal-la dificultad del desarrollo con la producción de las complejas secuencias de movimientos musculares necesarios para el habla orofocial 14-16. FOXP1 mutaciones se han reportado en pacientes con trastornos del espectro del autismo y discapacidad intelectual acompañados de problemas de lenguaje 17-20 voz grave y. La interacción de FOXPs con otras proteínas se está investigando para obtener información sobre los mecanismos moleculares relacionados con el papel de estas proteínas en el desarrollo del cerebro.\nFOXP2 se conoce para formar homo-o heterodímeros con otros miembros de la familia FOXP 21, por lo tanto, se utilizó el FOXP2 homodimerización para validar el ensayo BRET (Figura 4). Para excluir la posibilidad de que la interacción de proteínas de fusión FOXP2 en este ensayo era debido simplemente a la sobreexpresión de la proteína, la especificidad de la interacción se demostró mediante la introducción de una mutación en el dominio de dimerización de cremallera de leucina de FOXP2 (deleción en marco de residuo E400), el cual se conoce para interrumpir homo-y heterodimerización 21 (Figura 5A). Cuando las proteínas de fusión Luc-FOXP2.DE400 y YFP-FOXP2 se co-expresaron, se observó una reducción en la señal de BRET en comparación a cuando Luc-FOXP2 y YFP-FOXP2 se co-expresaron (Figura 5B). Esto sireducción gnal no era debido a una alteración en la localización subcelular de la proteína mutante (Figura 5C) o a una diferencia en los niveles de expresión tal como se evaluó por el Western Blot (datos no mostrados). También se observó la reducción de la señal cuando Luc-FOXP2 se expresó con YFP-FOXP2.DE400 (datos no mostrados). Por lo tanto BRET es eficaz en la detección de la homodimerización de proteínas, y la interacción de proteínas sigue siendo específico cuando estas proteínas se sobreexpresa como YFP-fusiones de la luciferasa-y. Además, el uso de BRET en combinación con mutación dirigida de proteínas tiene el potencial de identificar los residuos individuales involucrados en interacciones proteína-proteína.\nPara evaluar la eficacia del ensayo BRET en la detección de interacciones heterotípicas, la interacción de FOXP2 con FOXP1 fue probado (Figura 6). Se observó una señal de BRET en ambas configuraciones posibles del ensayo (es decir, con el FOXP2 como el donante o aceptor como la fusioN proteína). Por lo tanto el ensayo BRET es capaz de detectar tanto homo-y las interacciones heterotípicas. Además, la idoneidad del ensayo BRET para detectar la interacción de FOXP2 con proteínas no-FOXP se puso a prueba mediante el examen de la interacción con CtBP1, un co-represor transcripcional y conocida pareja de interacción FOXP2 21. La interacción entre CtBP1 y FOXP2 se sugirió originalmente por una pantalla de dos híbridos de levadura y posteriormente fue validada por experimentos de co-inmunoprecipitación 21. La interacción FOXP2-CtBP1 se detectó mediante el ensayo BRET cuando FOXP2 era la proteína de fusión donante y CtBP1 era el aceptor, pero no en la configuración inversa (Figura 7A). Estos resultados son de esperar con el sistema BRET (ver sección de debate). Se observó la interacción entre el FOXP2 y CtBP1 a pesar de que solamente una proporción menor de CtBP1 se localizó en el núcleo (Figura 7B), destacando la sensibilidad de este ensayo. Así, la BRETensayo es útil para la validación de putativo interacciones identificadas a través de dos híbridos de levadura.\nPor último, se empleó el ensayo BRET para examinar los efectos de las mutaciones patógenas en el gen FOXP2 en las interacciones proteína-proteína. Se han reportado dos mutaciones puntuales en el gen FOXP2 para causar un trastorno autosómico dominante poco frecuente que afecta el habla y el lenguaje (Figura 8A). La mutación missense R553H fue descubierto a través de un estudio de ligamiento en una familia numerosa en la que la mitad de los miembros se vieron afectados por el trastorno 14. La mutación sin sentido R328X fue descubierto a través de la secuencia específica del locus FOXP2 en probandos con un diagnóstico de dispraxia verbal del desarrollo 22. La capacidad de las proteínas mutantes para dimerizar con el tipo salvaje FOXP2 se evaluó mediante el ensayo BRET. Los resultados utilizando de tipo salvaje FOXP2 como un donante y el FOXP2 mutante como el aceptor se muestran en la Figura 8B. Los mismos resultados se observaron utilizando mFOXP2 utant como el donante y de tipo salvaje como el aceptor (datos no mostrados). La mutación R553H, que está dentro del dominio de unión a ADN de FOXP2, no afectó a la capacidad de la proteína mutante para dimerizar con la de tipo salvaje. Por consiguiente, el mecanismo patogénico de esta mutación puede incluir un efecto negativo dominante resultante de la dimerización del mutante con la proteína normal 23. La mutación R328X introduce un codón de parada prematuro, con el resultado de que la proteína codificada carece del dominio de dimerización de cremallera de leucina y el dominio de unión a ADN, y muestra algunos mislocalization citoplásmica (Figura 8C). En consonancia con la ausencia del dominio de dimerización y mislocalization al citoplasma, la proteína truncada muestra reduce en gran medida la interacción con el tipo salvaje FOXP2. Esta mutación es por lo tanto probable que sea patógena debido a la haploinsuficiencia. Por lo tanto el ensayo BRET puede dar una idea de los efectos biológicos de mutaciones descubiertas en los pacientes.\nFigura 1. Los vectores para la expresión de proteínas YFP-y luciferasa-fusión. A) Los mapas Círculo de los vectores pYFP y pLUC. El vector pLuc se utiliza para la expresión de proteínas de fusión de luciferasa como donantes BRET. El vector pYFP se utiliza para la expresión de proteínas de fusión YFP como aceptadores de BRET. Vectores tienen un promotor de CMV (P CMV) para la expresión de alto nivel en células de mamífero, un sitio de clonación múltiple (MCS) para la inserción de ADNc para las proteínas de interés, y un gen de resistencia a la kanamicina (Kan R) y origen de replicación bacteriano para la propagación de el plásmido en bacterias. B) sitio de clonación múltiple de los vectores pluc y pYFP. El final de la secuencia de codificación de YFP se muestra en azul. Sitios de restricción seleccionados están anotados. Tenga en cuenta que el sitio Xba I es bloqueado por OVErlapping metilación Dam en cepas estándar de E. coli. ADNc que codifican para las proteínas de interés deben ser clonados en marco con la secuencia de aminoácidos mostrada. En los experimentos descritos aquí, los insertos se clonaron en los sitios de restricción Bam HI y Xba I (subrayado). Los codones de parada se han eliminado de la final de la luciferasa y YFP secuencias para proporcionar un marco de lectura abierto que abarca la luciferasa / YFP y se subclonó ADNc codificante de interés. Los codones de parada están presentes en el extremo del sitio de clonación múltiple en los tres marcos de lectura (mostrados en rojo), por lo tanto, no es esencial incluir un codón de parada en el ADNc insertado.\nFigura 2. Principio del sistema de BRET. Las proteínas de interés, X e Y, se fusionan a una enzima luciferasa donante (Luc, emisión máxima 475 nm) y una proteína aceptora fluorescente (YFP, pico de emisión 530 nm), respectivamente. Las proteínas de fusión se expresan en células de mamífero en cultivo y después de la adición de un sustrato de luciferasa-permeable a las células, la emisión de Luc se mide usando un filtro de bloqueo de longitudes de onda más larga que 470 nm y emisión de YFP se mide usando un filtro de paso de banda de 500-600 nm. A) no se produce ninguna interacción entre la proteína X y proteína de transferencia de Y. La energía del Luc a YFP. B) La interacción entre la proteína X y proteína de transferencia de energía de resonancia se produce a partir de Y. Luc a YFP causando un aumento en la proporción de emisión medida utilizando el filtro de paso de banda de 500-600 nm en comparación con el bloqueo de longitudes de onda más larga que 470 nm el filtro.\nFigura 3. Instalación de ensayo. La preparación de las pruebas para la prueba deuna interacción entre dos proteínas de interés, X e Y. Las proteínas de interés se fusionan con la luciferasa (Luc) como el donador de BRET y proteína fluorescente amarilla (YFP) como aceptor de BRET. En las proteínas de control, Luc y YFP se fusionan a un péptido que contiene una señal de orientación para el compartimento subcelular relevante (P), en su caso. A) Controles que se incluirán en cada placa. 1) Control de Mock-transfección para establecer los niveles de fondo de luminiscencia y fluorescencia resultante de ruido luminómetro y la descomposición enzimática independiente del sustrato; 2) de control de pLuc sólo transfección para establecer la proporción de emisión de la luciferasa que se detecta dentro de la gama de emisión de YFP en ausencia de un aceptor de BRET; 3) La transfección de control pLuc y control pYFP para establecer la línea base de la señal BRET resultante de la interacción Luc-YFP; 4) La transfección de fusión Luc-YFP como control positivo para asegurar que una señal BRET se puede medir. B) Juego de experimentales condiciones para poner a prueba para la interacción entre dos proteínas de interés, X e Y. 1, 2, 4, 5) Controles para la interacción no específica entre las proteínas de interés y Luc / YFP; 3) condiciones de prueba con X como el donante e Y como aceptor; 6) condiciones de prueba con Y como el donante y X como el aceptor.\nFigura 4. Detección de homodimerización FOXP2. A) Para validar el ensayo BRET para la detección de homodímeros FOXP2, las células HEK293 se transfectaron con las construcciones para la expresión de la luciferasa (donante) o YFP (aceptor) fusionado a ya sea el FOXP2 (P2) o una señal de localización nuclear (-). La luciferasa nucleares específicos y proteínas YFP sirven como controles negativos. Como control positivo para la detección de una señal de BRET, las células también fueron transfectadas con un constructo para la expresión de una luciferasa-YFImágenes proteína P de fusión (+) B) microscopía de fluorescencia de células transfectadas con YFP fusionados a una señal de localización nuclear (-.) O con YFP fusionado a FOXP2 (P2).\nFigura 5. Utilizar de FOXP2-dimerización deficientes para demostrar la especificidad del ensayo. A) Representación esquemática de la proteína FOXP2 que muestra la posición de la mutación DE400, que altera la dimerización. El dominio de dimerización de cremallera de leucina se muestra en verde y el dominio de unión al ADN en amarillo. B) Para probar si la sobreexpresión de las proteínas puede dar lugar a resultados falsos positivos en el ensayo BRET, la especificidad del ensayo se evaluó mediante la FOXP2.DE400 variante. Las células fueron transfectadas con las construcciones para la expresión de la luciferasa (donante) o YFP (aceptor) fusionado a FOXP2 (P2), FOXP2.DE400 (DE) o un nucleaImágenes c) microscopía de fluorescencia de células transfectadas con YFP fusionados a FOXP2 (P2) o al FOXP2.DE400 (DE) - señal de localización r ()..\nFigura 6. Detección de heterodimerización-FOXP1 FOXP2. A) Para validar el ensayo BRET para la detección de la heterodimerización entre las proteínas homólogas FOXP2 y FOXP1, las células fueron transfectadas con constructos para la expresión de la luciferasa (donante) o YFP (aceptor) fusionado a ya sea el FOXP2 (P2), de FOXP1 (P1), o imágenes B) microscopía de fluorescencia de células transfectadas con YFP fusionados a FOXP1 (P1) o a FOXP2 (P2) - una señal de localización nuclear ()..\nB) Imágenes de microscopía de fluorescencia de células transfectadas con YFP fusionados a CtBP1 (CtBP) o para FOXP2 (P2).\nFigura 8. Evaluación de los efectos de las mutaciones patógenas FOXP2 en interacciones proteína-proteína. A) Representación esquemática de la proteína FOXP2 que muestra las posiciones de las mutaciones R553H y R328X que causan una fo rararm de expresión y trastorno del lenguaje. El dominio de dimerización de cremallera de leucina se muestra en verde y el dominio de unión al ADN en amarillo. B) Evaluar la utilidad del ensayo BRET para evaluar el impacto de las mutaciones patológicas en las interacciones proteína-proteína, los efectos de las mutaciones R553H y R328X en Se examinó la capacidad de las proteínas mutantes FOXP2 a dimerizar con FOXP2 normal. Las células fueron transfectadas con las construcciones para la expresión de la luciferasa (donante) o YFP (aceptor) fusionado a ya sea el FOXP2 normal (P2), FOXP2.R553H (553), FOXP2.R328X (328), o una señal de localización nuclear (-). C ) Imágenes de microscopía de fluorescencia de células transfectadas con YFP fusionan a FOXP2.R553H (R553H) o para FOXP2.R328X (R328X). En esta imagen FOXP2.R328X es predominantemente nuclear, pero en otras células dentro de la población muestra una distribución más citoplasmática.\nEl diseño de las construcciones de expresión de la proteína de fusión es un paso fundamental en la creación del ensayo BRET. En los experimentos presentados aquí, las proteínas de interés se fusionan con el extremo C-terminal de la luciferasa o YFP. También es posible, y puede ser necesario, para fusionar proteínas a la N-terminal de luciferasa / YFP. Para algunas proteínas, las fusiones sólo podrán aceptarse en el extremo N-o C-terminal con el fin de evitar la interrupción de la estructura y función de proteínas. Además, para las proteínas transmembrana en el que el N y C terminales residen en diferentes compartimentos subcelulares, la proteína luciferasa / YFP debe ser fusionada al extremo que está en el mismo compartimento que la pareja de interacción. Por ejemplo, en los estudios de las interacciones entre proteína G transmembrana y citoplasmática receptores acoplados β-arrestina, la luciferasa se fusionó a la cola carboxilo intracelular del receptor transmembrana 8. En otros casos la geometría de un interacti proteína-proteínael puede dar lugar a la transferencia de energía es más eficiente el uso de una de las dos posibles combinaciones de proteínas de fusión. De vez en cuando la transferencia de energía no puede ser detectado en absoluto si el uso de una sola combinación, lo que lleva a resultados negativos falsos.\nLa secuencia del enlazador peptídico entre luciferasa / YFP y la proteína de interés también puede afectar a la eficiencia de la transferencia de energía de resonancia. El enlazador debe ser lo suficientemente largo para permitir que la luciferasa / YFP y la proteína de interés se plieguen sin obstáculos. Un enlazador más largo será impartir una mayor flexibilidad para el polipéptido en la unión entre la luciferasa / YFP y la proteína de interés, lo que puede aumentar la eficiencia BRET facilitando la alineación de los dipolos donante y aceptor. Sin embargo, la eficiencia BRET puede disminuir si hay demasiada flexibilidad en el enlazador. En los experimentos aquí, la clonación de las proteínas de interés en los sitios BamH I y Xba I de la expresión VECtores dieron como resultado un enlazador de 23 aminoácidos, como se muestra en la Figura 1. Este enlazador ha sido exitoso para la detección de interacciones entre varios pares de proteínas.\nAntes de proceder a Bret experimentos se debe velar por que las proteínas de fusión retienen la actividad biológica normal. El funcionamiento de YFP se puede evaluar mediante visualización directa utilizando un microscopio de fluorescencia. El funcionamiento de la luciferasa se puede ensayar usando kits disponibles comercialmente. El efecto de la fusión en la localización subcelular de las proteínas de interés se puede evaluar mediante inmunotinción, o en el caso de YFP-fusiones, por visualización directa. El efecto de la fusión en la función de la proteína de interés puede ser investigada mediante ensayos específicos de proteína - por ejemplo, para un factor de transcripción puede ser apropiado para ensayar la actividad de unión al ADN. Tenga en cuenta que las mediciones de luminiscencia realizadas durante el experimento proporcionan conveniente confirmar en-ensayoción de la actividad de la luciferasa.\nEs importante tener en cuenta lo que las construcciones de control adecuados para su proteína de interés. YFP y luciferasa son predominantemente citoplasmática y son, por tanto, los controles apropiados cuando las proteínas de interés son citoplasmática. Sin embargo, cuando las proteínas de interés se localizan en otros compartimentos subcelulares, puede ser deseable modificar la luciferasa y YFP con señales de péptidos para dirigir su tráfico al compartimiento relevante. Aquí las proteínas de interés fueron los factores de transcripción que están localizados en el núcleo, por lo tanto, la luciferasa y YFP fueron modificados por la adición de una señal de localización nuclear. Específicamente, un péptido que incluye la señal de localización nuclear del antígeno T grande de SV40 (CGYGPKKKRKVGGLDN) se añade al extremo C-terminal de la luciferasa y YFP por ligación de oligonucleótidos de doble cadena sintéticos entre el Bam HI y Xba I sitios de thvectores e pLUC y pYFP. La adición de esta señal causó una redistribución significativa de la proteína al núcleo (Figura 4B).\nIncluyendo los controles adecuados es crucial para la interpretación de los experimentos de BRET. Un control maqueta transfección utilizando un plásmido de relleno inerte es esencial para establecer los niveles de fondo de luminiscencia y fluorescencia resultante de ruido luminómetro y la descomposición enzimática independiente del sustrato. Con luminómetros modernas y sustratos luciferasa niveles de luminiscencia de fondo son típicamente muy baja. Transfección con la luciferasa de control apropiado construir en la ausencia de un constructo de YFP es importante establecer la proporción de emisión de la luciferasa que se detecta dentro de la gama de emisión de YFP en ausencia de un aceptor de BRET. La transfección con la luciferasa de control y el control YFP construye proporciona la señal BRET línea de base que resulta de la interacción Luc-YFP. Para vísperary par de proteínas que se ponen a prueba para la interacción, es importante para transfectar cada uno a solas con la construcción de control adecuado, como se ilustra en la Figura 3B, de controlar para cualquier interacción no específica entre las proteínas que se están probando y luciferasa / YFP. Particularmente cuando se realiza un experimento de BRET, por primera vez, es importante incluir una proteína de fusión Luc-YFP como control positivo para asegurar que una señal de BRET es observable en su configuración experimental. Aquí la secuencia de codificación de YFP se clonó en pLuc en los sitios Bam HI y Xba I para generar una proteína de fusión en la que YFP se fusiona con el extremo C-terminal de la luciferasa.\nEn el protocolo descrito aquí, la composición de la mezcla de ADN para la transfección se calculó con el supuesto de que el tamaño medio de la proteína de fusión Luc / YFP construcciones de expresión no es mayor que 7,5 kb. Si la construcción de expresiónTS son significativamente más grandes que esto, entonces el número de moles de cada constructo de expresión añadido a la mezcla de transfección puede tener que ser reducido para que la cantidad total de ADN en la mezcla no exceda el máximo permitido por la cantidad de reactivo de transfección. Alternativamente, la cantidad de reactivo de transfección y la cantidad de ADN en todas las mezclas de transfección se puede aumentar siguiendo las directrices del fabricante. Manipulación experimental de placas de 96 pocillos se acelera por el uso de pipetas multicanal y aspiradores. Es deseable minimizar la variación entre las muestras en la longitud de tiempo de transfección de incubación de la mezcla después de la adición del ADN al medio / transfección mezcla de reactivo libre de suero, comienza a partir de la adición de las mezclas de transfección a las células tan pronto como la primera mezcla se ha de incubar durante 10 min . Debido a que las proteínas aceptoras BRET son YFP fusiones, es posible evaluar la eficacia de transfección por microscopía de fluorescencia o mediante la medición de la fluorescencia en una microplaca de reAder. El éxito de un experimento de BRET depende de un buen nivel de transfección lo que es aconsejable para garantizar que la transfección es satisfactoria antes de proceder a la adición de sustrato y la medición de la señal de BRET. La etiqueta YFP también permite la cuantificación de los niveles de expresión de proteínas aceptor usando un lector de microplacas. La cuantificación de los niveles de proteína aceptora puede ser útil para la optimización y resolución de problemas de los experimentos de BRET.\nLas células deben ser incubadas durante al menos 2 h con sustrato de luciferasa antes de medir la señal de BRET para asegurar que una señal estable se ha logrado. También es aceptable para incubar las células con el sustrato durante un máximo de 24 h. En este caso los recuentos totales de luminiscencia será menor, pero las relaciones de BRET deben ser sin cambios. Incubaciones más largas con sustrato pueden ser más conveniente (por ejemplo, durante la noche) y también permitir la medición de señales de BRET antes y después de una manipulación experimental talescomo la adición de un compuesto farmacéutico. Idealmente, optimizar la densidad de la siembra de células de modo que las células alcanzan la confluencia alrededor del momento de la medición. Si la densidad celular es óptima por encima de entonces puede ser ventajoso medir la señal de BRET en un punto de tiempo anterior para evitar el crecimiento excesivo de células. Si se utiliza un tipo de célula que no sea HEK293, asegúrese de optimizar cultivo de células y transfección condiciones. BRET experimentos también se han realizado con éxito en células HeLa utilizando el protocolo descrito aquí.\nEn los experimentos descritos aquí, se midieron los recuentos de luminiscencia a temperatura ambiente, que es la temperatura óptima para la actividad de luciferasa de Renilla. Si se realiza un experimento de evolución temporal en el luminómetro es preferible ajustar la temperatura a 37 ° C. Hemos llevado a cabo los mismos experimentos a temperatura ambiente ya 37 ° C y no se observó ninguna diferencia significativa en los resultados. Si la realización de experimentos a temperatura ambiente, the placa se debe permitir que se equilibre 10 min dentro del luminómetro antes de la medición para permitir la estabilización de la actividad de luciferasa de Renilla. Aquí, las señales de luminiscencia se integraron durante 10 s, que típicamente proporciona una alta sensibilidad, especialmente para proteínas con bajos niveles de expresión. Sin embargo, las señales pueden estar integrados en periodos de tiempo más cortos si esto proporciona suficiente sensibilidad. Debido a la estabilidad de la señal de luminiscencia producida por el sustrato de luciferasa de células vivas, es aceptable para medir para un máximo de 10 segundos por pocillo en cada longitud de onda.\nUna interacción entre dos proteínas de interés se confirma por el ensayo BRET cuando la señal de la condición de prueba excede significativamente las señales de las condiciones de control pertinentes. La ausencia de una señal de BRET no es necesariamente la confirmación de que una interacción no se produce. En el caso de un resultado inesperado o negativo, la luminiscencia total y fluorescencialos recuentos de NCE deben ser examinados para asegurar que todos los pocillos se transfectaron correctamente.\nLa señal de BRET también se ve afectada por la relación de los niveles de expresión de proteínas, por lo tanto es útil para examinar los niveles de expresión relativos de las dos proteínas de interés mediante la comparación de las cuentas de fluorescencia de los pozos transfectadas con YFP fusiones de las dos proteínas (o los recuentos de luminiscencia desde pozos transfectadas con las fusiones de luciferasa). Cuando una proteína de fusión se expresa con más fuerza que el otro, mejores resultados son susceptibles de ser obtenido si la proteína con el menor nivel de expresión está fusionado a la luciferasa, que era el caso con el FOXP2 y CtBP1 en los experimentos presentados aquí. También es posible manipular los niveles de proteína mediante el ajuste de la relación molar de plásmidos de expresión en la mezcla de transfección. La transferencia de energía entre ciertos pares de proteínas de fusión puede ser muy ineficiente debido a la geometría del complejo de la proteína. En talescasos puede ser útil para tratar la fusión de las proteínas de interés para el termini alternativa de luciferasa / YFP.\nEs necesario confirmar que la señal de BRET representa una interacción proteína-proteína fisiológica y no es simplemente debido a la sobreexpresión de la proteína. Por esta razón, es importante para evitar la sobreexpresión bruto de proteínas. La especificidad de una interacción proteína-proteína en el sistema de BRET más se puede confirmar mediante la introducción de mutaciones en las proteínas que se sabe que reducen la afinidad de la interacción, como se demuestra aquí el uso de la variante de FOXP2 DE400. Las proteínas mutantes se pueden usar además en la competencia y los ensayos de unión de saturación BRET. En un ensayo de competición, las concentraciones de donante y aceptor de proteínas de fusión se mantienen constantes, mientras que el aumento de la concentración de una versión sin etiquetar de una de las parejas de interacción como un competidor. No etiquetado proteína de tipo salvaje debe competir con el v etiquetadoersión para la unión a su pareja de interacción, lo que resulta en una disminución en la señal de BRET, mientras que la proteína mutante debe exhibir una disminución de la capacidad para competir a cabo la interacción. En un ensayo de unión de saturación, la concentración de la proteína de fusión donante se mantiene constante, mientras que el aumento de la concentración del aceptor. Para una interacción específica de la señal BRET eventualmente debería estabilizarse como todas las moléculas donantes se saturan con el aceptor. Para una interacción no específica, la señal de BRET se muestran típicamente un pequeño aumento lineal debido a un aumento en las colisiones aleatorias entre las moléculas donantes y aceptoras. En la práctica, para las interacciones de afinidad moderada entre las proteínas solubles, puede ser difícil lograr un alto aceptor suficiente: relación de donante para observar la saturación al mismo tiempo mantener niveles suficientes de la proteína de donantes para la detección de la señal.\nSe debe tener precaución en la interpretación de diferees entre las proporciones de BRET. El ensayo BRET no proporciona una medida cuantitativa de la afinidad de una interacción proteína-proteína debido a la eficiencia de transferencia de energía se ve influenciada por factores distintos de la fuerza de la interacción proteína-proteína. Tales factores incluyen la relación de los niveles de las proteínas de fusión dentro de la célula, la geometría de la interacción, y las tasas de asociación y disociación del complejo. Las relaciones obtenidas con dos pares diferentes de proteínas, por tanto, no pueden necesariamente ser comparados, pero las comparaciones pueden ser posibles entre las diferentes variantes de la misma proteína, tales como con el de tipo salvaje y variantes de ΔE400 FOXP2 mostrados aquí. Ocasionalmente, se pueden observar relaciones de BRET ligeramente negativos. Relaciones negativas pueden dar como resultado a partir del error en la medición de la relación de la línea de base en las células transfectadas con sólo el vector de control de pLuc. Muy altas relaciones son a menudo indicativo de la agregación de proteínas, que puede ser confirmado por la observación de CE transfectadaLLS con un microscopio de fluorescencia. Se debe determinar si la agregación es biológicamente relevante o un artefacto de la sobreexpresión de la proteína.\nEn conclusión, el ensayo BRET descrito aquí es un enfoque poderoso para investigar las interacciones proteína-proteína en las células vivas. La aplicación de BRET se ha demostrado para los fines de la validación de candidatos a elementos interactuantes a partir de estudios de cribado de proteómica, la identificación de residuos específicos implicados en las interacciones proteína-proteína, y la evaluación de los efectos de las mutaciones encontradas en el ADN del paciente. Dado que las interacciones se detectan en tiempo real sin el requisito para la lisis de células, la señal de BRET se puede medir antes y después de un tratamiento tal como la adición de un compuesto farmacéutico o ligando 7. El ensayo BRET muestra una gran promesa para el uso en la investigación genómica funcional para evaluar la importancia biológica de las variantes genéticas descubiertas a través de la secuenciación de próxima generación.\nEste trabajo fue apoyado por la Sociedad Max Planck.


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8 Tips de Instagram Marketing para tu Startup - Startups Marketing\n¿Cómo podrá crecer mi STARTUP en Instagram? ¿Existen casos de éxito de startups que usaron solamente Instagram para sus campañas?\nHoy quiero compartirte 8 tips bastante útiles para trabajar tu marketing en Instagram, los estoy enumerando, analizaremos 3 startups que fueron todo un éxito gracias a Instagram y a la vez te mencionaré qué opciones económicas existen donde podrás aplicarlas tú mismo.\n1. ESTÉTICA EN LAS FOTOGRAFÍAS:\nZakNormandin, CEO y Co fundador de Dirty Lemon, una startup ahora, ya muy conocida en varios países por ser una bebidas saludable y con un efecto desitoxicante, mencionó: “Toda nuestra estrategia gira en torno a Instagram y a la creación de contenido. Si miras nuestro feed, es hermoso. Tenemos muchísimas fotos hermosas”.\nDirty Lemon invirtió en el trabajo de un fotógrafo profesional, pero esto puedes hacerlo también tú.\n¡No hay excusas para no comenzar a tener un buen feed o perfil de Instagram! Busca primero tener una misma línea visual, tus colores predominantes serán los colores acordes a tu logotipo y en base a eso, busca filtros que combinen con ellos, en Instagram se maneja mucho la estética, así que comienza a armar tu Instagram cuidadosamente, eligiendo fotos y filtros que combinen y atractivamente.\nTe dejo estas aplicaciones que seguramente te ayudarán mucho en esto: Adobe Photoshop Express: Esta es la opción móvil de Photoshop. Preview for Instagram: maneja un tema de armonías en colores y brillos de las fotografías. Con gSQUARE podrás convertir una imagen en un mosaico y mi favorita de las favoritas es Lightroom ¡Donde colorizarás las fotos y las harás increíbles!\n¡Hay muchísimas aplicaciones buenas gratuitas y de paga de las que me gustaría explicártelas en otro episodio! Así que espéralo, que pronto estaré haciendo uno especial para ti.\n2. DISEÑOS ÚNICOS:\nLa startup “Dolar Shave Club” se hizo conocida orgánicamente solo por poner en su feed de Instagram imágenes graciosas de hombres con barba, trabajaban con un ilustrador y a través de encontrar insights en el público objetivo elaboraban un buen diseño, y como resultado generaba reacciones positivas, fue así que la cuenta creció tanto que recaudó $165 millones en ventas y en el 2016 fue comprada por Unileper.\nNo siempre tendrás la oportunidad invertir en un ilustrador, además dependerá también del público al que te dirijas y cuál será la línea visual del Instagram, quizá no sea necesario una ilustración digital o quizá sí; si tienes las posibilidades de trabajar con uno ¡En hora buena, aprovecha todo y comienza EMPODERARTE!\nPero si no, ahora también existen otras opciones, donde puedes trabajarlo y llevar a cabo tú mismo un buen diseño o meme ¿Cómo? A través de estas aplicaciones: Freepik, Canva, Desygner, Aviary puedes convertirte en todo un diseñador gráfico ¡Son muy fáciles de usar y te ayudarán a tener excelentes diseños auténticos, incluso fomentará más tu creatividad y explotará más de lo que imaginas.\nSi bien es cierto, los videos y fotos a primera vista llaman la atención, pero sin su respectiva descripción, nada será lo mismo, ya que el texto complementa al video y foto, así que aprovecha en llevar tu imaginación y las frases que tu público objetivo suele pensar o suele hacer, en la descripción, mimetízate con tu comunidad, y escribe algo que a ellos los conecte, también recuerda el usar los hashtag correctos debajo del texto, dándole un espaciado con varios puntos.\nPor ejemplo, la bebida Dirty Lemon, escribe en una foto “Lo domingos son para elegir con quién pasarla” y en la fotografía se aprecia una chica echada sobre la alfombra con varios discos de vinilo a su costado, sin embargo hay uno que llama a primera vista y es la portada del disco con la imagen de Jhon Lenon con su esposa besándose, es así donde encuentras una interesante lectura de la foto y complemento en la descripción del texto.\nDirty Lemon fue fundada en el 2015, obteniendo resultados orgánicos al principio, pero a medida que iba creciendo y expandiendo su negocio, iba invirtiéndolo en “Publicidad de Instagram”, es allí donde en el 2017 invirtió US$ 30 mil diarios para construir una base de clientes, y en el 2018 US$ 100 mil diarios, ahora te preguntarás ¡Cuánto dinero! sin embargo en publicidad es así, mientras mayor sea tu ingreso publicitario y estratégico, mayor crecimiento en ventas tendrás ¿Por qué? Porque Instagram se encarga de decirte: “Si inviertes $1 dólar diario, del 100% de futuros clientes, llegarás al 1%, por ejemplo, pero si inviertes $20 diarios la tajada comienza a crecer”, es simple.\nSi estás en una fase inicial de tu Startup, y estás pensando en agilizar tu crecimiento con boots o pagar aplicaciones para aumentar tu número de seguidores, utiliza mejor “Anuncios en Instagram”, busca generar buen contenido, comienza a invertir desde $2 diarios por ejemplo, y prueba unos 3, 10 días cómo está yendo con la publicidad.\nLa publicidad es prueba y error, cada campaña en ella, aprenderás dónde seguir ¿Cuál funciona mejor? o ¿Qué es mejor evitar?\nDirty Lemon comenzó a trabajar con influencer + microinfluencers + celebridades, de esta manera tanto el Instagram de Dirty Lemon, como el influencer, ambos colocaban contenidos y se mencionaban entre ellos, un 70% de publicaciones del feed estaba lleno de influencer, microinfluencer y celebridades.\nComienza a prestar tus servicio o producto de tu startup a un influencers de manera gratuita, y verás como en agradecimiento te devuelven el favor posteando un storie o foto de tu startup, incluso comienza a detectar microinfluencers, por tres razones muy poderosas, uno: llegan a un nicho más específico, dos: los algoritmos lo benefician más, a diferencia de un influencer y tres: cobran menos que un influencer. En otro momento veremos el “Marketing de Influencias” mucho más a fondo, ya que es demasiado extenso.\n6. VÍDEOS QUE ENAMOREN\nSí tal cual ¿A qué me refiero con videos que enamoren? Y ¿Por qué coloco la vaya tan arriba? Te preguntarás, porque esa palabra alberga todo lo que hace a un video excelente ¿Qué haces cuando te gusta alguien? No solo te da ganas de verlo una vez sino, varias veces, compartes tu emoción con tus amigos, puede no ser un Nick Jonas, para las chicas, pero tiene un mensaje que te conmueve, y te engancha. Si dicho video te llega a enamorar lo recordarás.\n¡Procura que sea así!\n¿Cómo? ¿Debo invertir demasiado dinero en comprarme una cámara carísima y en un estudio de grabación? ¡Tranquilo! Puedes grabar un video con tu celular, solo cuida 3 cosas importantes: guión, buena iluminación y buen audio. La iluminación puedes realizarla con esas lámparas de lectura o dormitorio y el audio cuidar que no haya ningún sonido que se filtre, como un niño llorando, por ejemplo.\nJeff Brooks, jefe de marketing de Casper, la startup de colchones de espuma látex que se amolda a tu cuerpo sin perder la forma original mencionó: “Instagram fue VITAL para que la empresa de colchones sea conocida ”.\nPiensa y recuerda estas últimas palabras “Cultivar una comunidad para conectarnos y COMPROMETERNOS CON NUESTROS CLIENTES”, esta posibilidad te brinda Instagram, generar la verdadera conexión con tu público objetivo.\n8. COLABORACIÓN Y ANUNCIOS EN PODCASTS\nDirty Lemon está comenzando hacer colaboraciones en los contenidos de Podcasters, ellos graban ese video y lo suben por IGTV, así también buscan hacer conocida y recordada su marca en esos nichos, es un interesante mundo donde apuntar, en los creadores de contenido de Podcast, de esta forma, su comunidad comenzará a establecer un lazo más estrecho con la marca, debido a que la presentación de la publicidad a través de los podcasters, se siente por ahora, que ya no es una publicidad intrusiva, sino mas bien, la aceptan y agradecen, ya que genera consciencia de la necesidad que existen en los podcasters por generar ingresos, y gracias a dicha publicidad o colaboración lo están logrando, y a la vez los oyentes gratuitamente tienen contenidos.\nA demás una startup apunta y diferentes nichos, lo cual existe un estrecho vínculo con los Podcasts, pues ellos también lo hacen.\nPueden hacer un tipo de canje, donde ambos ganen, o invertir en publicidad dentro de este mundo.\nEspero que estos tips te puedan ayudar mucho, dedicar tiempo e invertirlo para la creación de contenidos, no es en vano, Instagram es un buen portal donde puedes generar altos ingresos, igual que hicieron las startups mencionadas, sobretodo en Latinoamérica, ya que recién está comenzándose a poblar de marcas, a comparación de Facebook y YouTube que son redes sociales bastante saturadas de anuncios, sin embargo, estas compañías aprovecharon la ola de Instagram en EEUU en el 2015, 2016; como es de esperarse primero es USA y posteriormente Latinoamérica sigue su ritmo, ahora es cuando debemos sumarnos a la OLA de llevar nuestras startup a Instagram, no es mañana, es AHORA.\nY te digo algo, mucho se escucha esta palabra “Crear contenidos”, pero requiere de mucha constancia y dedicación, te lo dice alguien que tiene varios videos hechos virales en redes sociales, si quieres ver mis resultados, ve a mi Instagram y encuéntrame como lesliehoyos_, ve a la sección de destacados y entra a mis “Métricas” y encontrarás mis viralizaciones orgánicas, sin el uso de Facebook Ads, pero si te apasiona lo que haces y quieres llegar a EMPODERAR TU STARTUP y SOBRE TODO DESPEGAR RÁPIDAMENTE en INSTAGRAM como les sucedió a esos negocios, comienza ahora mismo, HAZ QUE SUCEDA, no pierdas más tiempo ¿Cómo hacerlo? Tienes 2 opciones: o bien tienes el tiempo suficiente para comenzar a educarte en esto, o bien, no tienes mucho tiempo porque estás enfocado en tu negocio de lleno y prefieres delegar ese trabajo a un verdadero experto.\nSea la primera o segunda opción, cuenta conmigo, envíame un mensaje a mi Instagram y te ayudaré con mucho amor.\nEscùchala en Spotify\n¿Cómo crear un producto disruptivo a partir de tu...


Mariam Shelby: Una moda de cine\nUna moda de cine\nHay pocos mundos profesionales que estén más presentes dentro de nuestro día a día como el de la moda. Todo, absolutamente todo está ligado de alguna forma a él, pero especialmente el mundo de la comunicación y la industria del cine.\nSi hablamos de moda y cine todos tenemos muy presentes películas como "El diablo viste de Prada" en la que se hablaba abiertamente sobre la industria de la moda. Incluso para algunos sea, quizás, la única película que hace referencia a este mundo.\nSin embargo podemos recordar películas como: Pret-A-Porter, dirigida en 1994 por Robert Altman... Si bien el argumento se centraba en un asesinato, todo el trasfondo de la película gira sobre la semana de la moda de París.\nPero para mí la primera película que me descubrió que estos dos mundos están entrelazados fue: "Una Cara con Ángel" en la que Audrey Hepburn se convierte en la nueva imagen de una de las revistas más importantes en el mundo de la moda.\nY al igual que todos recordamos la famosa escena sobre el "jersey azul Cerúleo" en El Diablo,\nyo no puedo olvidar del momento "Think Pink" de Una cara con Ángel (algo más cómico y musical)\nY os preguntaéis a qué viene todo esto, sencillamente es mi manera de presentaros la que será la primera sección que quiero introducir en el blog: "Una Moda de Cine" en la que hablaremos de películas basadas en el mundo de la moda o que han causado sensación por lo extraordinario de su vestuario, vestidos que han hecho que una película sea inolvidable, y por supuesto conoceremos la historia de diseñadores de vestuario que están detrás haciendo que todo se haga realidad.\n¿Qué os parece la idea? ¿Del vestuario de qué película os gustaría saber más? Espero vuestras respuestas.\nY un día más... Gracias por gastar un poquito de vuestro tiempo en pasaros por aquí.\nPublicado por Mariam Shelby en 20:59\nEtiquetas: Blog, Cine, Moda, Películas, Pinterest, Una Moda de Cine, YouTube\nMinimal Jewellery by Blanco


Clint Eastwood dirige y protagoniza Sin perdón, en laSexta.\nDescubra algunas de las ofertas de la parrilla de televisión del miércoles, 14 de agosto\nLa voz más alta 2015 / Movistar Series, 21.00 horas\n2016. Final de la serie. La demanda de Gretchen Carlson se ha hecho pública y Roger pone todos los medios que tiene a su alcance para proteger su carrera y su legado. Mientras tanto, la campaña de Trump gana puntos.\nLa serie narra la trayectoria de Roger Ailes (Russell Crowe), uno de los hombres más influyentes de los EE UU, que colocó hasta a cuatro presidentes en el despacho oval trabajando como asesor. Su ascenso comienza en 1967, tras seducir a Nixon con sus ideas sobre la política en televisión. Siempre cercano al poder y a los republicanos, Ailes llega a los mandos de Fox News en 1996, donde instaura su visión única sobre cómo hablar de política. Su pasión y talento para la comunicación son tan grandes como su tiranía y su obsesión por las mujeres.\nAcusada a los 17 / Antena 3, 23.15 horas\nUnos excursionistas encuentran el cuerpo sin vida de Dori Holland, una adolescente de 17 años que había desaparecido de su casa hacía varios días. Las tres amigas que fueron a buscarla con el pretexto de asistir juntas a una fiesta, han hecho un pacto de silencio. Bianca, la única ajena a la verdad, confiesa a su madre que tan solo pretendían darle un escarmiento.\nLa forja de la leyenda. Los All Blacks de Richie McCaw / #Vamos, 20.00 horas\nRichard Hugh McCaw es mucho más que un jugador de rugby... El hombre con el récord de Test Matches disputados, el único capitán que levantó la Copa William Webb Ellis en dos ocasiones y una leyenda en la historia del rugby. A lo largo de 105 minutos, nos adentramos en el universo personal de un deportista que ha devenido en icono y héroe para toda una nación, que vive el rugby como una religión y venera a sus All Blacks como dioses de dimensiones cuasi mitológicas. Sus inicios, sus sueños, sus dudas, sus triunfos y su legado... Richie McCaw, ‘El Coloso de Oamaru’, muy de cerca. Cuando grandeza y humildad conviven para forjar una leyenda dentro y fuera del campo de rugby.\nSin perdón / laSexta, 21.30 horas\nUn par de vaqueros van a un prostíbulo y uno de ellos raja la cara a Delilah Fitzgerald tras una disputa con ella. Las prostitutas consiguen echarles de allí, pero quieren venganza, pues han dejado a Delilah marcada de por vida. Así, el grupo de mujeres, comandadas por Strawberry Alice, reunirán casi todo el dinero del que disponen, y ofrecen 1.000 dólares para quien mate a los dos vaqueros que hicieron tal cosa. El sheriff local, Little Bill Daggett está preocupado por la recompensa que ofrecen, pues cree que alguien puede aceptarlo, y no le gusta que la gente tenga armas allí en Wyoming. Por su parte, William Munny es un pistolero retirado que vive en el Viejo Oeste. Viudo, con hijos a su cargo y atravesando problemas económicos que desgraciadamente no le permiten llevar una vida muy holgada, Munny no tendrá más remedio que aceptar un último trabajo para hacer frente a sus gastos. Junto a un antiguo compañero y la compañía de un joven inexperto, su misión consistirá en matar a esos dos hombres que han sido acusados de cortar la cara a una Delialah.\nSicario: El día del soldado / Movistar Estrenos, 22.20 horas\nLa guerra contra los cárteles de la droga se ha intensificado en la frontera entre EE.UU. y México a medida que éstos se han metido en el negocio de tráfico de personas, introduciendo en suelo americano a terroristas islámicos. Para hacer frente a esta nueva guerra sucia, el agente federal Matt Graver (Josh Brolin) planea una idea para que los carteles se enfrenten entre ellos. Para ello volverá a reclutar para la peligrosa misión al volátil mercenario Alejandro Gillick\nShanghai / AXN White, 22.39 horas\nEn la China ocupada por los japoneses, durante la Segunda Guerra Mundial, justo antes del ataque de Pearl Harbor, el recién llegado agente secreto Paul Soames se ve inmerso en una trama de conspiración y mentiras. Acechado por un oficial de la inteligencia japonesa, Tanaka, Soames se dispone a investigar la muerte de un compañero -y amigo- del servicio secreto. Su investigaciones se centran rápidamente en un carismático gánster local, Anthony Lan-Ting, y en su hermosa mujer, Anna.\nMikael Håfström dirige este ‘thriller’ que se desarrolla en el Shanghái previo al ataque japonés a Pearl Harbor, una historia de espías y romances magníficamente ambientada y protagonizada por famosos actores de oriente y occidente, entre ellos, John Cusack, Gong Li, Chow Yun Fat, David Morse, Ken Watanabe o Franka Potente.\nLo que esconde Silver Lake / Movistar CineDoc&Roll, 21.00 horas\nSam (Andrew Garfield) es un tipo desencantado de 33 años que descubre a una misteriosa mujer, Sarah (Riley Keough), bañándose en la piscina de su apartamento. La conexión entre ambos es inmediata, pero cuando la joven desaparece, Sam se embarca en una búsqueda surrealista en la que recorrerá cada rincón de Los Ángeles para descifrar el secreto que hay detrás de su desaparición. Será un viaje hasta las profundidades más oscuras del misterio, el escándalo y la conspiración de la ciudad. Con la cultura pop como telón de fondo (y no tan fondo), este ‘thriller’ en el que también se mezcla comedia, drama y un punto de fantasía surrealista ganó el Premio de la Crítica (mención especial) en el Festival de Sitges de 2018. Tercera película del director y guionista David Robert Mitchell, está protagonizada por Andrew Garfield y Riley Keough.\nSe cae de un andamio y se le viene encima\nHiperDino firma más de 1.000 contratos indefinidos\nEl carné de conducir, en tu móvil\nTorra convocará elecciones tras aprobar el presupuesto de la Generalitat\n«Quiero mi primer título profesional y será en Rusia»\n1.580 casas a la venta por menos de 65.000 euros


El sector deportivo invierte en I+D+i en torno al 10% - Diffusion Sport\nMás de la mitad de las empresas del sector deportivo invierten entre el 5 y el 15% de su presupuesto en Investigación, Desarrollo e Innovación. Así lo constata el Observatorio Diffusion Sport, en el que han participado centenares de profesionales del mercado del deporte\nEn concreto, es el 56,45% de las empresas las que estarían destinando a ese capítulo entre el 5 y el 15% de su presupuesto. Por ello, podemos afirmar que la atención que merece en nuestro sector el I+D+i puede considerarse moderada.\nAunque habrá quien valorará ese resultado positivamente, pero no resulta plausible que menos del 5% de las compañías que pertenecen al mercado del deporte (un 4,84% en concreto) inviertan más del 16% de su negocio. Mientras, un 38,71% de los encuestados afirma que su empresa destina a Investigación menos del 5%.\nEtiquetado con: estadísticas , I+D+i , informes , sector deportivo


Djokovic, Murray y Wawrinka confirman que estarán en Australia – CDN Deportes\nMartes 14 de Julio del 2020 | Hora: 3:52 pm\nYou are here: Home / Noticias / Tenis / Djokovic, Murray y Wawrinka confirman que estarán en Australia\nPor: CDN SportsMax Pub: October, 10, 2017 14:21 PM\nLos cuatro top diez terminaron su temporada antes de lo planeado debido a lesiones Djokovic sufre molestias en el codo, Murray de la cadera, Wawrinka de la rodilla y Nishikori de la muñeca.\nTiley dijo que era un placer poder contar con dichos jugadores en Melbourne con el primer gran slam de la temporada. También resalto que será un honor poder contar con Roger Federer, actual campeón, y Rafael Nadal que este año han estado jugando de manera increíble.\nMurray llegará con rodaje ya que la primera semana de Enero participara en Brisbane mientras que Djokovic y Nishikori podrían también llegar con rodaje si deciden participar en otro torneo antes del Australian Open. Quien no ha dado detalles de su calendario es Wawrinka.\nLa incógnita que queda para el abierto de Australia es si Serena Williams, actual campeona del torneo, es si podrá estar tras ser baja por su maternidad. La menor de las Williams no ha descartado su participación.\n#Andy Murray #Australian Open #destacada #Kei Nishikori #Novak Djokovic #Stan Wawrinka #Tenis\nPrevious Article Islandia se clasifica por primera vez al mundial\nNext Article Nick Kyrgios lo vuelve hacer, se retira antes de tiempo de un partido


Guardiola: "Me estoy acercando al final de mi carrera" como entrenador | El HuffPost Noticias\nRedaccion ElHuffPost— EFE\n02/01/2017 08:49pm CET\nPep Guardiola, técnico del Manchester City, ha afirmado este lunes en declaraciones a la cadena estadounidense NBC que se está acercando "al final de su carrera" como entrenador y ha resaltado que estará en el conjunto inglés los tres años por los que se comprometió.\nEl técnico español ha hablado sobre su futuro y ha revelado que no trabajará en los banquillos durante toda su vida. Además, afirmó que su final como entrenador no está muy lejos.\n"Quiero imaginar que el paso siguiente será mejor. Si no, no estaré aquí (en el Manchester City). En el momento que sienta, y estoy un poco en este proceso, que es el final de mi carrera ... No seré entrenador con 60 o 65 años", dijo.\nCuestionado por cuál será su dedicación cuando deje de ser entrenador, afirmó que se dedicará a otro deporte: 'Si me buscas, seré en un campo de golf, eso seguro ", ha culminado.\n-Así ha sido la presentación de Pep Guardiola con el Manchester City (FOTOS)\n-Guardiola defiende a Rooney: "Yo fui internacional y a veces bebía"\n-El dardo de Guardiola al Barcelona antes de jugar en el Camp Nou\ndeportesentrenadorfútbolJosep GuardiolaManchester City


Una casa de 5 habitaciones, con área al aire libre (ref 5554), £2 900, con facturas incluidas y Wi-fi, Manchester\nSi usted está buscando un lugar cerca del campus de Fallowfield, a continuación, esta espaciosa casa para estudiantes en Withington es la ideal para usted. La casa tiene cinco dormitorios, un trastero, una sala de estar, una cocina y dos baños. Todos los espacios son amplios y luminosos y en la parte trasera de la casa también encontrará un bonito jardín. Esta área es elegida por muchos estudiantes, por lo que se reunirá con facilidad gente nueva! ¿Vas a dejar pasar esta oportunidad?


Sendero de Coterillo : Web oficial turismo Región de Murcia\nINICIO > ORGANIZA TU VIAJE > ACTIVIDADES > SENDERO DE COTERILLO\nSiguiendo las marcas blancas y verdes de la Senda Local, se avistarán aves desde los observatorios y se identificará la flora, fauna y pequeños reptiles por las sendas que atraviesan el pinar. Se caminará junto a la orilla de una playa natural.\nSalida a las 10:00 horas desde el aparcamiento de la Charca de Coterillo.\nLlevar calzado cómodo, ropa de colores poco llamativos, repelente de mosquitos, protección solar, gorra, bocadillo y agua.\nSendero de Coterillo - Sendero de Coterillo - 0,00 € / Nº de plazas a reservar: 0 1 2 3


Matan a dominicano estaba en en libertad bajo fianza en Pensilvania – Detras del Rumor l Noticias l Videos l Reportes\nMatan a dominicano estaba en en libertad bajo fianza en Pensilvania\nEl dominicano Danny Jiménez Martínez, que estaba en libertad bajo fianza de $50.000 y a la espera de ser procesado por un caso de asalto agravado en Reading (Pensilvania), fue ultimado a balazos el lunes en la noche, en el vestíbulo del edificio donde vivía, en lo que los fiscales y laPolicía creen que pudo\nEl dominicano Danny Jiménez Martínez, que estaba en libertad bajo fianza de $50.000 y a la espera de ser procesado por un caso de asalto agravado en Reading (Pensilvania), fue ultimado a balazos el lunes en la noche, en el vestíbulo del edificio donde vivía, en lo que los fiscales y laPolicía creen que pudo haber sido un ajuste de cuentas.\n“Oí disparos, diría, alrededor de las 3:30”, dijo el vecino Wilson Ludwig. “Fueron bastantes, bastantes tiros, y por lo general no se escuchan tantos”.\n“Es conocido en esta oficina”, dijo el fiscal del distrito del condado de Berks, John Adams, y agregó que Jiménez Martínez estaba libre bajo fianza en un caso de asalto agravado.\n“Podría ser un ajuste de cuentas”, dijo el fiscal Adams. “No tenemos idea, pero nosotros, por supuesto, buscaremos cada pista”.


Frases de Padres (más frases página 7)\nMás Frases de Padres - Página 7 de 36\nHombre, yo crecí como todos los demás. Familia mediana de ingresos bajos. Mis padres se divorciaron al igual que la mayor parte del resto del país.\nTengo una gran relación con mis padres. No he estado en el litio.\nEs agradable ver a los jóvenes 7, 8, 9 años de edad. Parece como si te conocieran a través de sus padres.\nComo padres, tenemos que hablar con los jóvenes sobre las drogas y asegurarse de que entienden que las drogas son peligrosas, las sustancias adictivas que pueden arruinar sus vidas y dañar a sus comunidades.\nMis padres consideran maestros como seres superiores, al igual que muchos de los inmigrantes.\nEs difícil de aprender sobre el noviazgo de sus padres.\nMis padres me enseñaron a creer que a través del acto creativo, somos capaces de trascender y dar una respuesta a la profanación.\nYa es hora de que los padres se dan cuenta que tienen el derecho y el deber de proteger a nuestros niños contra los evolucionistas intolerantes.\nMuchos de los padres no hablan con sus hijos transexuales nuevo, ese no es el caso en mi familia.\nSí, mis padres me ayudan a mantener los pies en el suelo.\nTuve mucha suerte. Mis padres me criaron de tal manera que nunca se me ocurrió que yo no era igual.\nMis padres son de Manchester, pero me crié en Londres, Camden Town.\nEmpecé a cocinar hace 30 y tantos años. Cuando tenía 14 años, 15 años, yo era un cocinero de comida rápida en un bar. Eso fue en un lugar llamado los Centuriones Gran. Se trataba de un club de natación italoamericano mis padres pertenecían.


SEDUE entregará 330 árboles en 212 telebachilleratos en el estado – Nexo Informativo\nChihuahua, Chihuahua.- Dando seguimiento al programa de alianza entre el Subsistema de Preparatoria Abierta y Telebachillerato y la Secretaría de Desarrollo Urbano y Ecología (Sedue), comenzaron en Coronado, Chihuahua, el Programa de Reforestación con el cual se atenderán a un total de 212 telebachilleratos correspondientes a 58 municipios.\nLa entrega dio inició en los telebachilleratos que conforman la región sur del estado: 8060 de Colonia Búfalo, 80119 Libertad (Dolores), 80120 San Felipe, 80123 Salaices, 8646 Matamoros, 8656 Torreoncitos, 8665 Villa López, 8678 Coronado y 86100 Héroes de la Revolución.\nAsimismo, el interés para contribuir en el cuidado del medio ambiente, al igual que la capacitación de los estudiantes y maestros y el espíritu emprendedor de ambos por parte de proyectos productivos de hortalizas y de árboles frutales.\nCon tareas sencillas como regar, abonar y retirar maleza, inculcamos valores, se crea conciencia de la necesidad de mejorar nuestro entorno para beneficio de todos.\n← Invitan a beneficiarse del descuento que ofrece Recaudación de Rentas\nPresidente Municipal y Gobernador encabezan inauguración del colector Teófilo Borunda →\nParticipan escuelas de educación Indígena en el proyecto “Récord Mundi…


El callejón de los gatos: Escritores que hunden España\nAl habla Luisru en 10:05\n¿¿¿Diecisiete libros??? Yo he llegado a ver tres suyos a la vez en un mismo escaparate... y ya me parecía un disparate.\nSupongo que no leeré su libro sobre lo que hay que leer. Me parece que lo tengo claro: entre su Camino del sur y On the road, me quedo con el de Kerouac.\n17 libros de los cuales 16 (como mínimo) habrá escrito un pobre negro. Lamentable. pirata\nElla sí que hunde España con lo fea que es...joía.\nLo peor no es que Curri (Francisca) Valenzuela pueda escribir semejante cosa, o que Cesar Vidal para (de parir) diecisiete bestsellers en un año. Lo peor es que la cultura general media de la población ha decaido tanto y tanto que hay gente que va, y se mete en el Corte Inglés y se compra esos libros y compra las opiniones que están en ellos y las defiende a sangre y fuego en cualquier tertulia de reunión de comunidad de vecinos. La desaparición de cualquier sentido crítico es lo lamentable.\n¡¡Qué ganas de tenerlo entre mis manos!!\nVaya par de elementos, jooo.\nElla no sé de donde saca tiempo después de dedicar toda la mañana a esa especie de Tómbola versión política de Teleesperanza.\nLo de él si lo sabía, cada vez que voy a Moyano me encuentro algo nuevo suyo y digo ¿si a mi me cuesta escribir un cuento, joder ya?\nHabrá que tener cuidado con Federico Luppi, quizá sea demasiado buen actor para que ella lo entienda.\nGracias por la felicitación. Por cierto, ¿alguna recomendación literaria en positivo?\nCreo que lo que deberíamos hacer es reírnos de la gente que abra semejantes esperpentos en el metro o bus, y sabotear a todas las librerías que los exhiban en sus escaparates. Desobediencia civil. ¡Abajo el mal gusto!\nSaludos, cuánto tiempo sin pasar por aquí... no tengo perdón. Lo del Vidal es la releche, ya tiene hasta fascículos de sus mejores obras, como las tacitas en miniatura. Pero es que además el tío dice que es experto en música "americana" y ha sacado algún disco de recopilación donde sale vestido de vaquero o algo así. Acojonante.\nSobre la Curri, lo mejor es que también le dedica un apartado a "la camiseta del Ché Guevara", que según ella también hunde Ex-paña. Dónde iremos a parar... Salu2\n¿Qué esperar de alguien que se hace llamar CURRI? Estoy con Caye; hay que crear la POLICÍA DEL ESTILO. Que se preparen los perro-flautas y los que leen basurilla. Multazo que te crió.\nMe temo que no está muy informado. César Vidal no va de lunes a viernes a las diatribas mañaneras de Losantos. Dirige su propio programa, La Linterna, amén de una tertulia de Historia en la Libertad Digital Televisión, Camino del Sur en la Cope, los sábados por la noche, y un espacio de historia de España, sólo los martes, en La Mañana de Losantos.\nComo historiador es un hombre de prestigio. Sus novelas históricas son best-sellers probablemente bien documentados pero de un pésimo gusto literario y estilo estereotipado que a los lectores maduros no nos acaba de interesar. El libro que ha escrito sobre la cultura no está mal, pero creo que las personas verdaderamente interesadas en adquirir cultura se hacen sus propias bibliografías. El paternalismo intelectual puede ser ofensivo, aunque no sé si César Vidal lo ha escrito con ese ánimo.\nDe Curri Valenzuela, no le puedo decir. No he leído nada de ella, pero parece uno de esos típicos libros políticos que, si uno no está muy interesado o arde en deseos de salvar España, más vale no comprar.\nHay cosas mejores, incluso para conocer las opiniones contrarias a las que uno ya se ha formado sin un conocimiento expreso de la materia. No se lo reprocho, creo que es usted joven, pero no se cierre ningún camino de antemano.\n"sin un conocimiento expreso de la materia". ¿De qué materia estamos hablando? ¿Qué es exactamente lo que puede reprocharme?Ah, que me haya colado en incluir a Vidal en un programa en el que no participa. Pues lo siento en el alma.\nLo que pasa es que cuando alguien ignora los detalles o comete errores tan garrafales suele ser porque no conoce muy bien la materia de la que está hablando y si no ha cometido más es porque el espacio limitado y cierto sentido de la prudencia no se lo permiten. Así pasa a los periodistas, pero mucho más a los blogueros; no suelen ser equivocacones, sino desconocimiento, pereza o despreocupación.\nPero no tema, esto sólo es una reflexión intuitiva. A mí también se me cuelan cosas y me pregunto por qué. Estoy seguro de que usted podría hablar sobre muchas cuestiones en las cuales yo sería un simple aficionado.


Rory logra en Shanghai su cuarta victoria del año\nEsta vez los hados le fueron favorables y consiguió imponerse en el desempate. Era la segunda vez que ganaba un playoff de los seis que ha disputado en su carrera. Rory McIlroy se hizo con el triunfo en el HSBC Champions de Shanghai en el primer hoyo de desempate al derrotar al norteamericano Xander Schauffele.\nEn el último hoyo, el jugador norirlandés dejó la bola a ocho metros de bandera para un birdie de dos putts. La victoria lo acercó más al líder Brooks Koepka en la clasificación mundial.\nSchauffele, que logró un birdie en el hoyo 18 para forzar el playoff, tuvo que pegar desde el rough cerca de un bunker y su disparo desde 4 metros para birdie se quedó a unos centímetros a la derecha del hoyo.\nMcIlroy lograba en Shanghai su cuarta victoria del año. Era su tercer triunfo en los World Golf Championships y su primero desde el Match Play en Harding Park en 2015.\nEl norirlandés jugó sin cometer bogeys en los últimos 39 hoyos y cerró con una ronda de 68 golpes, 4 bajo par. Y pensó que eso era suficiente para ganar.\nPero Schauffele apretó el paso en sus esfuerzos para convertirse en el primer ganador de dos HSBC Championship, con birdies en dos de sus últimos cuatro hoyos para una ronda de 66 golpes, pese a una semana en la que se recuperaba de una gripe.


Gloria Trevi escupió agua a Aurelio Nuño, en pleno concierto y todo fue captado en video | Apunte\nDesde que se dio a conocer a finales de los 80, Gloria Trevi llamó la atención por dar todo en el escenario y sorprender al público y 30 años después, lo sigue haciendo.\nEs por eso que se volvió viral un video en el que la cantante mexicana 'enloqueció' en pleno show mientras interpretaba su éxito 'Doctor Psiquiatra'.\nDebido a la temática del tema y como parte del performance, la regiomontana comenzó a escupir al público; en su actuación, finge ser una reclusa de un hospital psiquiátrico y como parte del vestuario utiliza una camisa de fuerza.\nEl conductor Miguel Charles grabó el momento en el que entre la euforia, Trevi tomó agua y la escupió a la zona donde se encontraba Aurelio Nuño, el ex titular de la Secretaría de Educación Pública (SEP) en México durante la administración de Enrique Peña Nieto.\nEl ex funcionario no reaccionó negativamente después de ser mojado, sino que siguió aplaudiendo al ritmo de la canción de Gloria Trevi.\nNo se trató de un acto de agresión dirigido a Nuño, sino parte del espectáculo común de 'La Trevi'. Quienes asisten en primeras filas saben que se encontrarán con la energía desbordada de la cantante, quien realizó su show sin contratiempos.\nTodo ocurrió el pasado 1 de junio durante un concierto en Monterrey, Nuevo León, como parte de la gira 'Diosa de la noche' con los que ofreció tres conciertos en el Domo Care.\nAurelio Nuño (Foto: TERCERO DÍAZ /CUARTOSCURO.COM)\nAurelio Nuño fue titular de la SEP entre agosto de 2015 y diciembre de 2017. Fue coordinador de la campaña presidencial de Peña Nieto y fue nombrado jefe de la oficina de Presidencia.\nEn noviembre de 2016, Nuño enfrentó las peores críticas en redes sociales luego de su participación en la Feria Internacional de Libro Infantil y Juvenil.\nY es que dijo sobre un escenario acompañado por cinco niños: "Ahorita los van a llevar para que vayan y puedan tener los libros que les gustan para que los empiecen a ler. ¿Seguro van a ler, sí o no? ¿Ustedes van a ler?\nSu pronunciación fue corregida de inmediato por una niña, quien le dijo ante el micrófono: "No se dice ler, se dice leer".\nA Aurelio Nuño no le quedó más que responder públicamente: "¡Eso!, se dice leer, leer, muy bien Andrea".\nRihanna es la cantante más rica del mundo, declarada por Forbes


▷ ¿Qué es el e-mailing, cómo se utiliza y cómo puede beneficiar a tu empresa?\nTe encuentras en Mejores comparativas > Electrónica > Componentes Pc > ¿Qué es el e-mailing, cómo se utiliza y cómo puede beneficiar a tu empresa?\n¿Qué es el e-mailing, cómo se utiliza y cómo puede beneficiar a tu empresa?\nEl e-mailing sigue estando presente en el ámbito del marketing digital, es una de las primeras estrategias de su estilo que surgieron, y en la actualidad continúa siendo igual de eficaz para promocionar una empresa y los servicios o productos que tenga para ofrecer.\nLos cambios y avances que se han producido desde el nacimiento de internet han llegado para quedarse. Las industrias y los sectores económicos se han reinventado y han generado nuevos métodos de producción y distribución, dando lugar así a la llamada “revolución digital”, con la que se ha podido aumentar la efectividad de los servicios.\nUn sector que se ha visto bastante beneficiado por esta presente revolución es el de la publicidad. Gracias a internet, han surgido diversas técnicas de publicidad innovadoras, las cuales pueden ayudar a una empresa a promocionar su marca, sus productos y sus servicios para un público mucho mayor, que con las técnicas publicitarias tradicionales.\nEsta manera de promocionarse es lo que se conoce actualmente como marketing digital. Todas sus estrategias son muy recomendadas en comparación con las tradicionales de toda la vida, muy limitadas a los medios convencionales.\nUna de las estrategias más utilizadas por su alta efectividad es el emailing, ya que permite comunicarse con miles de personas en un instante, de tal manera que el mensaje publicitario puede llegar de forma automática a un público extenso, incluso, a cualquier país del mundo.\nEl emailing es una técnica sumamente efectiva, gracias a un factor importante: la cercanía que ofrece el entorno de la bandeja de correo electrónico. A diferencia de otros canales de marketing digital, como las redes sociales, la bandeja de mensajes permite recibir las promociones de una forma privada y consensuada, para que así estas sean percibidas con ojos agradables y positivos.\nA pesar de haber nacido prácticamente de forma simultánea a internet, el e-mailing se ha consolidado y sigue siendo una de las maneras más efectivas de llegar al público, incluso, en mayor medida que cuando comenzó. Es un excelente recurso que toda empresa tiene a disposición para publicitarse de una forma sencilla, barata y sobre todo eficaz.\n1 ¿Qué es el e-mailing y cómo aprovecharlo?\n2 ¿Cómo aplicar un e-mailing efectivo?\n¿Qué es el e-mailing y cómo aprovecharlo?\nEn la búsqueda de una estrategia publicitaria efectiva, muchos se topan con el mundo del e-mail marketing. Aunque en la actualidad existen técnicas innovadoras muy utilizadas como posicionamiento SEO, diseño web o community management, para conocer y aplicar, aún muchos se preguntan qué es un mailing¸ cómo se utiliza y cómo aprovechar sus beneficios para beneficio propio.\nEl emailing es fácil de describir, es una herramienta que permite enviar correos masivos a una base de datos de suscriptores, para así comunicar un mensaje o una promoción a miles de personas al mismo tiempo. Algunos envían los correos apenas tienen una promoción u oferta disponible, mientras que otros toman un tiempo más prolongado entre correo y correo (estrategia conocida como “newsletter”).\nEs recomendable aplicar el emailing en la estrategia de marketing digital, pues si se realiza de una forma adecuada, se pueden obtener resultados sorprendentes. Gracias a esta técnica se pueden aumentar las ventas, generar más engagement e, incluso, obtener datos sobre los clientes o suscriptores, lo cual será muy valioso para aplicar en otros ámbitos del marketing digital.\nLa aplicación del emailing es bastante sencilla, hoy en día existen software gratuitos para enviar correos de forma masiva sin muchas complicaciones, algunos ofrecen opciones gratuitas para los negocios pequeños y los empresarios autónomos.\nLos programas de emailing pueden enviar unos 75 mil mensajes por correo electrónico en un solo mes, a unos 15 mil usuarios distintos en este mismo tiempo. Esto se puede realizar sin invertir económicamente, siendo una alternativa ideal y fiable para promocionarse. Además, no es necesario poseer conocimientos técnicos ni ser un experto de informática: cualquiera puede realizar un buen emailing de forma sencilla.\nAquellas empresas que precisen un segmento de usuarios mucho mayor, también cuentan con opciones en cuanto al emailing se refiere. Un plan premium, económico y asequible, permite aumentar el número de usuarios y mensajes por mes, para así adaptarse a las necesidades específicas que pueda tener cada compañía.\nEn este sentido, el software de emailing se adapta a la perfección a la estrategia de marketing de la empresa y a los objetivos que esta busca alcanzar. La interfaz intuitiva, las potentes funciones y la sencillez de uso, son aspectos adicionales que ayudan a elevar la campaña publicitaria al siguiente nivel y obtener resultados más satisfactorios.\nEl emailing contribuye a lograr la fidelización de los clientes, generar más interacciones con ellas, y lo más importante de todo, conseguir más ventas. Además, es una herramienta perfecta para formar una mejor relación entre cliente y empresa, para así aumentar los ingresos.\n¿Cómo aplicar un e-mailing efectivo?\nMientras que los software de emailing suelen ser muy sencillos de utilizar, tanto para principiantes como para expertos, la estrategia del emailing en sí suele ser algo compleja para aplicar de forma satisfactoria. Es necesario conocer los fundamentos de esta técnica, como la redacción o el aspecto visual, para procurar que la campaña sea efectiva y los correos no vayan a la papelera.\nUn factor importante es el aspecto visual, pues es la primera impresión que recibirá el cliente. Detalles como los colores o el orden de los elementos, representan los valores y filosofía de la marca, por lo que pueden ser los pequeños factores que arruinen el mensaje, o al contrario, que lo resalten y lo vuelvan efectivo.\nLa redacción y el diseño del texto también es bastante importante. Es imprescindible procurar ofrecer información de valor en el email y no solo spam, debe tener un estilo de escritura que se adapte a la imagen de marca que se quiera transmitir.\nHay muchas plantillas de mailing disponibles en internet, las cuales se pueden tomar como inspiración para redactar textos informativos y efectivos. Estas plantillas cuentan con elementos personalizables, que se deben modificar para adaptar el mensaje a lo que se busca promocionar.\nFinalmente, es importante considerar el tiempo en el que se enviarán los mensajes. Los que buscan desarrollar una newsletter, pueden enviarlos en un periodo semanal o quincenal, para ser constante en los envíos pero sin saturar al cliente. Dependiendo del tipo de empresa, se puede considerar el uso de periodos diarios, mensuales o bimestrales, pero esto último no se suele ver mucho actualmente.\nRazones por las que el marketing por e-mail es tan rentable