A Roma, nel centenario del Pci, l'ultimo saluto a Macaluso, l’uomo del «socialismo possibile»\nL’ultimo saluto a Macaluso, l’uomo del «socialismo possibile»\nRoma, i funerali di Emanuele Macaluso LaPresse\n21 gennaio 2021 • 17:03Aggiornato, 22 gennaio 2021 • 15:59\nA Roma, alla sede della Cgil, il funerale laico per il dirigente comunista, nel giorno del centenario del Pci, l’ex nomenklatura, i compagni, gli amici e persino gli avversari come Luca di Montezemolo. Provenzano, Tortorella e Landini: «Tutto ciò che si può fare per migliorare la condizioni di vita dei molti, anziché dei pochi, va fatto. E lui lo ha fatto»\n«Chi prende l’acqua da un pozzo, non dovrebbe dimenticare chi l’ha scavato», il ministro Peppe Provenzano, che è giovane ma in fondo neanche tanto in fondo ha quasi quarant’anni, parla di Emanuele Macaluso ricordando il primo insegnamento del già anziano dirigente comunista. E’ morto un comunista del «socialismo possibile», dice. Gli scaloni di marmo della sede nazionale della Cgil, a Roma, sono ingombri di corone e fiori, rosso totale, rose bianche in quella del presidente della Repubblica Sergio Mattarella, con i corazzieri, dall’altra parte le insegne dell’Associazione nazionale partigiani.\nIntorno alla bara, fra la folla che blocca il traffico di Corso D’Italia, si è riunito il presepe della sinistra, almeno quella che ha reimparato a stare unito non solo ai funerali: dell’ex «nomenklatura» del Pci – il programma delle celebrazioni del centenario della nascita del partito è sterminato, ma oggi a Roma va così, con tristezza – c’è Massimo D’Alema, Piero Fassino e Ugo Sposetti; poi ci sono i radiati del gruppo del manifesto come Luciana Castellina; il segretario Pd Nicola Zingaretti, i ministri Roberto Gualtieri e Enzo Amendola, Luigi Zanda, Gianni Cuperlo, Francesco Verducci, Cecilia D’Elia, Valeria Fedeli, Marco Miccoli; gli scissi dal Pd come Pier Luigi Bersani e Arturo Scotto e Alfredo D’Attorre.\nC’è il presidente della Camera Roberto Fico, l’ex segretaria Cgil Susanna Camusso, gli amici come Pier Ferdinando Casini, gli avversari come Luca Cordero di Montezemolo, rosso anche lui ma nel senso di Ferrari («Macaluso era una persona che ho sempre stimato, un riformista curioso di confrontarsi anche con persone lontane dal suo pensiero»). Dal microfono Marcelle Padovani, collega e amica, che ha conosciuto Macaluso ai tempi delle lotte contro la mafia, ricorda le ultime ore, le ultime discussioni, le ultime telefonate dall’ospedale. Intorno alla moglie Vincenza Maria D'Amelio, per tutti Enza, c’è una corte di nipoti accudenti. Macaluso era formidabile con i giovani.\nProvenzano, che di Macaluso è stato il figlioccio politico, regge fino alla fine senza commuoversi, o quasi. Come Macaluso non c’è stato nessuno o quasi, la sua biografia è ineguagliabile: antifascista del Partito comunista clandestino, dirigente sindacale in Sicilia ai tempi della strage di Portella della Ginestra, quando i sindacalisti e i politici morivano come mosche sotto la lupara della mafia agraria.\nProvenzano racconta i racconti. Di quando faceva i comizi in Sicilia ai tempi del referendum, quello per la Repubblica, «Su un balcone, di fronte la chiesa madre. Ricordo una piazza piena di donne, col fazzoletto rosso. Ero giovane. Feci un discorso molto acceso contro la Monarchia. Quando finii si avvicinò il maresciallo dei carabinieri. Dalla prima all’ultima parola, disse, ho avuto la tentazione di spararle in fronte». Poi dirigente politico, in segreteria nazionale chiamato da Togliatti e rimasto con Longo e Berlinguer, vicinissimo a Napolitano, centrista nella corrente migliorista, amico di Sciascia e Vittorini, direttore dell’Unità, del Riformista e delle Ragioni del socialismo, acuto polemista fino ai suoi ultimi giorni, laico, garantista e libero, mai entrato nel Pd ma «contrario a ogni scissione», lo ha ricordato Andrea Orlando mercoledì alla camera.\n«Era un comunista italiano, nessuno più comunista italiano di lui», secondo Aldo Tortorella, nome da partigiano «Alessio», di due anni più giovane, compagno di quello stesso Pci ma della corrente di sinistra. Macaluso era migliorista, la destra del partito, ma per la generazione di Provenzano è stato «maestro di socialismo. Di un socialismo che precedeva le forme storiche che aveva assunto nel secolo scorso, e vi sopravviveva». I giovani «nel gioco delle generazioni», hanno guardato a lui, come ad altri grandi vecchi della Repubblica, «saltando la generazione dei padri per andare a quelli dei nonni, per risalire al senso delle loro scelte di vita, alla serietà nella battaglia delle idee e alla cura nelle relazioni sociali», «esprimeva in ogni sillaba, in ogni accento, la questione sociale, che è tornata a riproporsi in forme nuove, lontane dalla miseria che fu, ma non meno gravi».\n«Macaluso è legato alla storia della sinistra», il finale è di Maurizio Landini, segretario Cgil, padrone di casa, «della democrazia e del mondo del lavoro. E' stato espressione di una generazione che si è riconosciuta nella lotta contro il fascismo e per le lotte sociali. La sua vita ci fa ripercorrere le lotte della sinistra e del sindacato». Il feretro va via – dopo la cremazione Macaluso sarà seppellito al famedio del Pci al Cimitero Monumentale del Verano -, si alza un unico pugno, un uomo, forse ci crede ancora, forse almeno uno lo deve ancora fare, partono le note dell’Internazionale, ma a volume basso, quasi sottovoce, sarà per evitare gli schiamazzi della sinistra, sarà che Macaluso non è mai stato indulgente con il folklore dei suoi, il suo, per Provenzano, «era un socialismo possibile. In cui tutto ciò che si può fare per migliorare la condizioni di vita dei molti, anziché dei pochi, va fatto. E lui lo ha fatto».


dicembre | 2015 | Benvenuti nel rifugio di Claudio\n31 dicembre 2015 claudio chiaramonte\t1 commento\nUn augurio particolare … al nostro Pianeta …\nla speranza è l’ultima a morire ???\n31 dicembre 2015 claudio chiaramonte\t3 commenti\n31 dicembre 2015 claudio chiaramonte\t2 commenti\nquesto il mio discorso di “fine anno” …\nRingraziando i politici degli ultimi decenni,\nringraziando i media nostrani,\nringraziando gli italiani che non si informano,\nringraziando i disonesti,\nringraziando chi non ci fa votare,\nringraziando chi distrugge Costituzione e Stato Sociale,\nringraziando chi distrugge i diritti della gente,\nringraziando le Banche,\nringraziando il Governo,\n(e spero di non aver dimenticato nessuno)\nringrazio tutti voi con questa canzone\nche vi dedico di tutto cuore …\n80 anni di …\n31 dicembre 2015 claudio chiaramonte\t11 commenti\ntratto da www.notiziedalweb.org\nDovetti trattenere le lacrime…\nAvevo la pelle d’oca e pensai: “Questo è il genere di amore che vorrei nella mia vita”.\nIl vero amore è l’accettazione di tutto ciò che è, è stato, sarà e non sarà …\n31 dicembre 2015 claudio chiaramonte\tLascia un commento\nPerle dal Web . n° 249\nTratta dalla pagina di Pane e Circo su FB\nPerle dal Web . n° 248\nPerle dal Web . n° 247\nil nutrimento della società attuale\nJudas Priest – You Don’t Have To Be Old To Be Wise\n30 dicembre 2015 claudio chiaramonte\tLascia un commento\nNe ho avuto abbastanza di essere programmato\ne che mi venga detto cosa devo fare.\nsceglierò io il mio destino\ne non ha niente a che fare con voi.\nGli anni stanno volando e adesso sono felice.\nHo avuto un assaggio delle cose belle della vita.\nQuesto è il cambiamento che farò\nlascierò da parte i problemi e lo stress.\nSono cresciuto e mi sono\nstancato delle solite vecchie bugie.\nPotrei sembrare un po’ giovane\nNon devi essere vecchio per essere saggio.\nAdesso non me ne frega niente\nse la gente mi fissa\ne mi accusa di essere diventato pazzo.\nDevi solo guardare per molto tempo\ne poi dirmi chi è stato ad esserlo.\nNon darò a vedere il modo\nin cui le cose stanno succedendo.\nNon mi sembra che sia passato molto tempo\ne quindi ho slegato i nodi\nnon ho compromessi\nper fare ciò che ci vuole per sentirsi liberi.\nVa tutto bene, sto tenendo le redini\ne mi sto aggrappando alla corda.\nD’ora in poi vivrò e lascerò vivere.\nE mentre la mano libera\nrende solo l’uomo libero\nio ho un modo tutto mio.\ne difendo me stesso.\nSfondo tutti gli stop\ne tiro il dado.\nSono fuori, senza nessuno\ne ce la farò da solo.\nQuando mi servirà un consiglio\nNon devi essere vecchio per essere saggio\n30 dicembre 2015 30 dicembre 2015 claudio chiaramonte\t1 commento\n30 dicembre 2015 30 dicembre 2015 claudio chiaramonte\t3 commenti\n30 dicembre 2015 30 dicembre 2015 claudio chiaramonte\tLascia un commento\nEppure. continuando la nostra vita normale\nche ci è davvero essenziale.\nun po’ inconsueto\ndall’affanno del presente e del futuro\nE allora, superando le nostre ansie quotidiane,\nnoi potremmo ascoltare soltanto quello\nch ci fa stare bene\nnoi potremmo, più che altro, occuparci di noi\nprima che l’uomo muoia\nnel grande vuoto del suo successo.\nun individuo compiuto, cosciente, intero.\nper cercare, al di là delle parole,\npossa già frequentare, con rigore,\ndai problemi del sociale, alla sopravvivenza\ndove il giusto della vita, pur concreto che sia,\nnon diventi mai volgare\nperché ha dentro l’utopia\ndove l’uomo del futuro sta crescendo\ncon l’idea di sé, ma con l’idea del mondo\ndove l’uomo più solo non è mai in un deserto\nma ogni giorno sa tenere il cuore aperto\n30 dicembre 2015 claudio chiaramonte\t5 commenti\nSymphony Of The Dreams\n29 dicembre 2015 claudio chiaramonte\tLascia un commento\nBambini … sono solo bambini\nBambini bevono acqua pulita per la prima volta.\nLa loro straziante reazione.\nCi sono bambini al mondo per cui anche un bicchiere di acqua pulita costituisce una grande rarità.\nUn video ci racconta la loro storia e la loro reazione di fronte a dell’acqua limpida e pulita.\nLo Zambia è un paese molto difficile da vivere, per gli adulti ma anche per i bambini.\nIndifesi e fragili, infatti, sono costretti a crescere presto, fin troppo presto ed a diventare adulti quando ancora avrebbero diritto alla spensieratezza ed alla felicità, due sensazioni che probabilmente non hanno mai provato.\nLe loro condizioni di vita sono davvero proibitive, devono fare i conti ogni giorno con una serie di ostacoli e di difficoltà davvero pesantissime per ogni essere umani, figurarsi poi per un bambino. anche un bicchiere di acqua pulita per questi bambini è un vero miraggio.\nIn questo video vengono mostrate le condizioni terribili in cui questi bimbi sono costretti a vivere e tutto quello che devono fare ogni giorno per lottare per la propria sopravvivenza.\nIl momento più bello quando vedono e bevono per la prima volta dell’acqua pulita, una vera rarità.\nImmagini molto forti, storie crudeli che vi colpiranno dritti al cuore e non potranno che farvi riflettere.\nAltrettanto incredibile sarà vedere un altro video che mostra alcuni bambini adottati da una coppia pronti ad amarli.\nDavvero straziante la loro reazione.\nSpesso non ci rendiamo conto della grande fortuna che abbiamo, sebbene possa sembrarci roba da poco. Queste immagini forse ci faranno capire qualcosa di più.\nfatemi capire bene …\n29 dicembre 2015 claudio chiaramonte\t5 commenti\nTratta dalla pagina di Informati su FB\nStupidi ? No … siamo solo egoisti e facciamo le cose solo se c’è un tornaconto economico; dei nostri fratelli non ci preoccupiamo minimamente …\nFirmato “l’Uomo moderno”\nI tempi cambiano, ma gli uomini ???\n28 dicembre 2015 28 dicembre 2015 claudio chiaramonte\tLascia un commento\nTratto dalla pagina di Radio Majakovskij su FB\nData di nascita: 1 novembre 1530, Sarlat-la-Canéda, Francia\nData di morte: 18 agosto 1563, Bordeaux, Francia\nStudi: University of Orléans\nLibri: Discorso sulla servitù volontaria, Il contr’uno o della servitù volontaria\nQuesti sono dati inerenti l’autore dello scritto che ora leggerete,\nditemi se vi sembrano scritti oltre 400 anni fa oppure ai giorni nostri … riflettete …\nCosì il tiranno assoggetta gli uni servendosi degli altri, e viene difeso da uomini da cui dovrebbe difendersi, se valessero qualcosa […]\nEppure, vedendo questi individui che servono il tiranno per trarre vantaggio dal loro potere e dalla servitù del popolo, spesso mi stupisce la loro malvagità e talvolta mi fa pena la loro stupidità; perché, a dire il vero, avvicinarsi a un tiranno cos’altro significa se non allontanarsi dalla propria libertà e afferrare, per così dire, a due mani e abbracciare la propria servitù? […]\nNon è sufficiente che gli obbediscano, devono compiacerlo rompendosi le ossa, tormentandosi e distruggendosi per curare i suoi interessi; devono amare ciò che egli ama, sacrificare i propri gusti ai suoi, violentare la propria indole sino a spogliarsi della propria personalità […]\nQuale condizione è più miserabile del vivere così, senza avere nulla di proprio, dipendendo da un altro per il proprio benessere, la propria libertà, il proprio corpo, la vita stessa?


Le meraviglie del sottosuolo |I posti più belli\nHome // Guide // Le meraviglie del sottosuolo\nLe meraviglie del sottosuolo\n6 Agosto 2014 // di: Valentina // Guide // 0 Commenti // 1161 Views\nCi sono luoghi veramente unici ma difficili da ammirare perché non si trovano in superficie ma conducono diritto al cuore pulsante della terra. Il mondo è pieno di siti sotterranei “nascosti” sotto palazzi e strade calpestate ogni giorno da migliaia di persone. Sfogliando la gallery potrete scoprirli tutti.\nTra questi luoghi del mistero non poteva mancare la città sotterranea di Montreal o il bunker nucleare che si trova sotto le strade di Berlino, che venne costruito nel 1971 e può ospitare fino a 3562 persone in strettissimi letti a castello. Anche Cu Chi Tunnels in Vietnam, è un villaggio sotterraneo con tanto di cucine ed ospedale, utilizzato durante la tristemente famosa guerra. Se i cattivi odori non vi disturbano, invece, dovreste concedervi una visita al Paris Sewers il museo sotterraneo che ripercorre la storia del sistema di smaltimento dei rifiuti e di quello fognario di Parigi spiegandone anche il funzionamento ed esplorandone i condotti.\nScoprite tutti gli altri sfogliando la nostra gallery.\nTags: nucleo, sottosuolo, terra, terre sommerse, underground


Renault Italia lancia gli pneumatici Motrio\nDopo il lancio in mezza Europa nel 2010, gli pneumatici Motrio arrivano in Italia\nRenault Italia lancerà dal mese di febbraio 2011 gli pneumatici Motrio che saranno disponibili presso tutta la rete dei propri concessionari.\nRenault è il primo costruttore a commercializzare una gamma di pneumatici con il proprio marchio, specificatamente sviluppata da uno dei più importanti produttori europei di pneumatici.\nL’obiettivo di Motrio (marchio creato nel 1998) è di offrire assistenza post-vendita ai clienti Renault, ma anche di altre marche automobilistiche, con un’intera gamma di prodotti di qualità, soprattutto nell’ambito della manutenzione del veicolo oltre che di alcune parti di meccanica, a prezzo vantaggioso.\n“La gamma di prodotti Motrio ha già conseguito risultati molto positivi dalla propria nascita 12 anni fa - afferma Jacques Daniel, Direttore Post-Vendita Mondo dei marchi Renault, Dacia, e Samsung Motors - ma il lancio degli Pneumatici Motrio– continua Daniel - è una tappa importantissima nello sviluppo di questa gamma complementare di prodotti post-vendita del gruppo: è un prodotto di conquista. Gli pneumatici infatti costituiscono uno dei primi motivi di ingresso in officina”


Per chi lavora nelle societÃ sportive con un contratto di lavoro da dipendente viene estesa la possibilitÃ di accedere alla cassa integrazione in deroga per ulteriori 9 settimane.\nPer chi lavora con il riconoscimento del compenso o lettera d’incarico ovvero per il collaboratore sportivo, per il mese di aprile e maggio viene confermato il bonus di 600 â‚¬ per ognuna delle due mensilitÃ .\nSi allarga la platea dei destinatari che con il decreto “Cura Italia” erano riferibili solo a chi aveva rapporti di collaborazione presso federazioni sportive nazionali, enti di promozione sportiva, societÃ e associazioni sportive, mentre il nuovo decreto si rivolge anche ai collaboratori presso il Coni ed il Comitato Paraolimpico.\nPossiamo ritenere confermati i requisiti giÃ previsti per il bonus di marzo e l’accesso automatico (se in possesso di tutti i requisiti richiesti da Sport e Salute S.p.A) all’indennitÃ Â per chi aveva presentato domanda con il “Decreto Cura Italia” di marzo 2020 ed era rimasto escluso anche se con un reddito superiore ai 10.000 euro, per questi che hannoÂ presentato la domanda a marzo non vi Ã¨ necessitÃ di ripresentare la domanda.\nEntro 7 gg a partire dalla emanazione del decreto verranno rese noti requisiti e modalitÃ necessari per averne il riconoscimento ed ottenere il beneficio, per quanti potrannoÂ accedere al bonus in aggiunta rispetto alla platea giÃ individuata.\nCome CGIL, giÃ nella predisposizione del decreto avevamo sollevato il problema della limitata disponibilitÃ , ci era stato risposto che non si avevano dati su quanti potevano essere i destinatari ma che a fronte di necessitÃ ilÂ governo si impegnava a trovare le risorse necessarie. Ãˆ notizia data dal Ministro dello Sport e delle Politiche Giovanili che le risorse per riconoscere il bonus anche agli oltre 40.000Â collaboratori sportivi che ancora non hanno ricevuto il sostegno al reddito sono state deliberate e permetteranno cosÃ¬ di erogare il bonus marzo a tutti quelli che avevano i requisiti e che hanno fatto richiesta senza aver ancora ricevuto riscontro.\nProseguiamo insieme l’attivitÃ e le azioni necessarie per riconoscere tutele e diritti a chi opera a vario titolo nello sport.\nOgni lavoratore deve poter avere tutele: un reddito dignitoso; coperture assicurative e malattia; copertura previdenziale; tutele per responsabilitÃ civili e adeguata formazione e riconoscimento dei titoli di studio.\nI dati oggi raccolti da sport e salute sono eloquenti. Quasi 500.000 persone nel settore lavorano con prestazioni da collaborazioni sportive, prive di qualunque tutela e diritto, e viÂ sono inoltre piÃ¹ di 100.000 lavoratori a cui Ã¨ applicato il contratto dei dipendenti dello sport.\nInfine Ã¨ necessario che nell’emergenza sanitaria venga garantita la riapertura in sicurezza per tutti. Si sta procedendo alla ripresa delle attivitÃ delle strutture e degli impianti sportivi.\nOgni azione attuata dovrÃ prevedere la messa in sicurezza, non solo delle condizioni di tutela per gli utenti e dei praticati ma dovrÃ considerare tutte le norme e le procedure per la tutela di tutti quei lavoratori sportivi che oggi ne sono privi.\nPer questo il nostro prossimo immediato obiettivo Ã¨ unâ€™assicurazione sanitaria di emergenza per tutti i c.d. collaboratori sportivi oggi fuori da ogni copertura per\nInformazioni a cura diÂ NIdiL CGIL NazionaleÂ eÂ Slc Cgil Nazionale


Questione della decisione: E' morto Roberto Roversi\nScrive Jonathan Sisco in Letteratura Italiana: Il Novecento, che la poesia di Roberto Roversi\noffre l'esempio di una scrittura poetica di forte impegno sociale e culturale, che si identifica nella prassi politica e nella riflessione intellettuale.\nProprio per questi motivi, la forma poetica che preferì fu il "poemetto a sfondo morale e ideologico". Uno dei primi libri di poesie che comprai fu proprio un libro di Roversi, Dopo Campoformio, in cui si manifestano in pieno i temi cari al poeta che fu, ricordiamolo, ideatore di Officina e direttore di Lotta Continua, riassunti così da Sisco:\nI principali temi della raccolta sono quelli della lotta contro l'oppressione capitalista e della delusione politica, ovvero una serie di stati d'animo scorati e violenti che ben si attagliano a quella forte carica passionale che la critica ha spesso indicato come la matrice più profonda dell'esperienza roversiana.\nDel resto, se si guarda a quelli che furono i compagni della sua avventura in Officina, Pasolini, Scalia, Leonetti, Fortini, Romanò, ben si comprende questo manifesto uscito in uno degli ultimi numeri della rivista.\nEccolo, insieme ai compagni di avventura, in questa foto d'epoca, tratta da Retididedalus, dove si possono trovare altri testi di Roversi.\nda sinistra a destra Roberto Roversi, Angelo Romanò, Pier Paolo Pasolini,\nFrancesco Leonetti, Gianni Scalia e Franco Fortini\nQuesta scelta dell'impegno, sociale e politico, della lotta e del rifiuto dell'ottica capitalista si vede anche nella decisione di non far pubblicare più le sue opere da editori ma di stamparle e distribuirle da solo.\nSulla rivista Poesia, dalla quale traggo qualche brano da Dopo Campoformio, Daniele Piccini traccia questo identikit di Roversi:\nRoversi decide di non afﬁdare ad alcun editore il nuovo libro, Descrizioni in atto (1969), e lo tira in proprio, in tre successive edizioni, al ciclostile, per circa tremila copie, inviandolo a chi ne fosse realmente interessato. C’è in questo episodio molto del Roversi poeta e ideologo: cioè la coltura di un disegno di opposizione totale rispetto all’esistente, una volontà quasi superstiziosa di non compromissione con qualsivoglia forma di potere. E anche, volendo, una dose di moralismo, che non manca di una sua austera verità morale.\nEd ecco Dopo Campoformio\nfrusta nel tramonto alberi, ﬁori,\nsﬁora l’acqua, è nel mare,\ne la ﬂottiglia corre in alto mare.\ndel primo ﬁore in cielo tornerà.\nAppena uscito, Fortini così ne scrisse\n«Ma qual è il limite di questa poesia […]? È l’esitazione fra servitù volontaria alla letteratura, come schermo, maschera, punto d’appoggio convenzionale e libertà immediata, come espressività integrale, ‘sincerità’». [Retididedalus cit.]\nSul primo blog di poesia della Rai, a cura di Luigia Sorrentino, si può leggere qualche verso dell'inedito L'Italia sepolta sotto la neve,\nQuesto, invece, è l'inizio di Autobiografia [testo completo su Poetarum Silva]\nPoesia civile dunque, o impegnata, o contro qualsiasi potere. Poesia che si fa quasi prosa, nella forma del poema. Tutto questo per dire che Roberto Roversi, nato il 28 gennaio del 1923, è morto il 14 settembre del 2012.\nBibliografia e siti:\nLa Letteratura Italiana: Il Novecento -. volume 2, edited by Ezio Raimondi, Gabriella Fenocchio, Bruno Mondadori ed.\nPubblicato da Paolo Pascucci a 08:51\nEtichette: poesia, roberto roversi\nCarla Citarella 16 settembre 2012 22:27\n"I libri parlano anche se sono chiusi\nbeato chi sa ascoltarne l'ostinato sussurro."\né una delle sue espressioni che mi ha colpito in modo particolare.\npaopasc 17 settembre 2012 09:07\ninfatti, è una frase particolarmente felice


Il Milan continua a raccogliere più di quanto semina | L'Ultimo Uomo\nCalcio Alfredo Giacobbe 23 febbraio 2017 7'\nIl Milan continua a raccogliere più di quanto semina\nQuali possono essere le ragioni dell’overperformance della squadra di Montella?\nIn uno sport a basso punteggio come il calcio il risultato maturato alla fine dei 90 minuti non sempre corrisponde alla prestazione delle due squadre. Gli Expected Goals sono stati concepiti proprio per poter misurare il livello di performance di una squadra nel tempo e stabilire se questo è al di sopra o al di sotto dei risultati raccolti in stagione. Nel primo caso si parla di overperformance, nel secondo di underperformance.\nIl Milan di quest’anno fa parte del primo tipo di squadre, è una di quelle squadre che non si arrendono alla statistica, che raccolgono più di quanto teoricamente seminato.\nAi primi di dicembre, dopo 15 giornate giocate, la squadra di Montella divideva il secondo posto con la Roma, anche se per gli xG prodotti l’attacco rossonero valeva solo il tredicesimo posto; e allo stesso tempo per gli xG subiti non sarebbero dovuti andare oltre l’ottava piazza.\nOggi il Milan è settimo, dopo aver centrato una vittoria fondamentale contro la Fiorentina, ma la qualità del suo gioco così com’è rilevata dalla statistica non è migliorata: i 27,3 xG prodotti (quasi la metà di quelli generati dalla Roma) valgono al Milan l’undicesimo posto; gli xG concessi, 28 in tutto e decisamente più dei 14,6 xG lasciati dalla Juventus ai suoi avversari, collocano i rossoneri all’ottavo posto.\nIl Milan ha imbroccato una serie lunga e fortunata di circostanze che sta determinando i risultati a suo favore? Oppure, magari, esistono elementi riproducibili, ricorrenti e di qualità nel gioco milanista che gli Expected Goals non riescono a rilevare? E, insomma, come andrà finire?\nQueste sono le domande da cui muove questo pezzo, ragionando – sempre con l’aiuto delle statistiche – su tre ipotesi che spiegherebbero l’anomalia statistica della squadra di Montella. Tenete sempre presente che il nostro è uno sforzo intellettuale, che tende verso una verità che per definizione è inafferrabile.\nIl Milan produce poche occasioni, ma di qualità superiore alla media.\nLa prima ipotesi con cui spiegare un’overperfomance così continua come quella del Milan è quella secondo cui il Milan produce una quantità minore di occasioni, ma del tipo più prezioso, di quelle più semplici da convertire in rete.\nIn effetti il Milan non brilla dal punto di vista quantitativo, per il volume di tiri prodotti (13,3 a partita, decima prestazione del campionato). Se a questo numero si accoppia anche il dato dei tiri subiti, si nota che in media il Milan viene dominato dagli avversari per il numero di conclusioni: il suo Total Shot Ratio – la percentuale di conclusioni rossonere nel totale di conclusioni della partita – è stato inferiore al 50% fin dalla prima giornata.\nIn termini spaziali, la collocazione dei tiri del Milan non lascia intuire una pericolosità più alta della media. Se messe a confronto con quelle dell’Atalanta – che ha effettuato un numero medio di tiri a partita simile (14,7) – le conclusioni del Milan non sono addensate nella zona più redditizia, quella davanti all’area di porta, come nel caso degli orobici.\nQuasi un terzo dei tiri del Milan è collocato fuori area: da occasioni di basso profitto (statisticamente lo sono i tiri dalla distanza) i rossoneri hanno ricavato 7 gol su un totale complessivo di 30 reti (rigori esclusi). Solo Bologna, Fiorentina e Cagliari hanno un’incidenza superiore dei tiri dalla distanza sul bottino di reti totale.\nSe consideriamo le differenti situazioni di gioco, isolando quelle nelle quali si generano tiri mediamente più pericolosi, il Milan non eccelle.\nPer numero di tiri presi dopo un assist vincente (cioè non dopo un dribbling o una palla recuperata, ma direttamente da un passaggio che metta in condizione un giocatore di tirare) i rossoneri sono letteralmente doppiati dalla Roma (99 conclusioni a 208); sulle occasioni che arrivano in conseguenza di un recupero palla alto, il Chievo stacca il Milan di molto (7 a 2).\nPiù in generale, se consideriamo come pericolosi i tiri che hanno un valore xG tre volte superiore alla media, il Milan è l’undicesima squadra del campionato, per via delle 26 conclusioni prodotte, lontanissimo dalla Roma che ne ha collezionate 62.\nQuindi, l’ipotesi che il Milan produca occasioni di qualità superiore decade.\nGli attaccanti del Milan sono migliori della media.\nAllora, e questa è la seconda ipotesi, può darsi che il Milan abbia attaccanti con qualità realizzative superiori alla media, capaci di trasformare in gol le occasioni che capitano loro, al di là della frequenza e della pericolosità.\nSuso è l’unico milanista in possesso di una statistica significativa per volume di tiri prodotto.\nTra i giocatori di tutta la Serie A che hanno disputato almeno 900 minuti e hanno tirato verso la porta almeno 50 volte, lo spagnolo è quello col minor numero di xG generati, 0,14 ogni 90 minuti. Ciò nonostante, Suso ha segnato 0,25 gol ogni 90 minuti, con una capacità di conversione degli xG in reti reali inferiore solo a quella di Hamsik.\nUna tale capacità realizzativa, però, non è sostenuta dalla precisione al tiro: mentre Hamsik mette a segno il 17% dei suoi tentativi, Suso converte in gol solo il 9% dei suoi tiri. Per fare un paragone consistente in termini di posizione in campo, Bernardeschi ha una prestazione migliore di Suso in termini di gol (0,53/p90) e xG (0,17/p90), con la sua Fiorentina che non sta avendo una stagione migliore di quella del Milan.\nLe “shot locations” di Suso, Bernardeschi ed Hamsik a confronto.\nI giocatori rossoneri dalla precisione più alta non sono due attaccanti, bensì due centrocampisti: Kucka e Locatelli hanno ricavato rispettivamente 4 e 2 reti dai loro 20 e 12 tiri. Il campione di tiri è talmente esiguo da non poter trarre conclusioni più generali sulle abilità dei due sotto porta.\nPer quanto riguarda Bacca, l’attaccante colombiano sta vivendo la sua peggiore stagione delle ultime 4 in termini di quantità di conclusioni (-15,8% rispetto allo scorso anno) e di gol (-50%), oltre che per la qualità (xG giù del 23,3%) e per la precisione (-31%) della sua azione davanti al portiere.\nQuesta seconda ipotesi, quindi, non sembra poter essere verificata.\nIl gioco del Milan fa male agli avversari.\nOk, giunti a questo punto sorge spontaneo il pensiero che se magari il Milan non produce tanto quanto poi effettivamente raccoglie è perché comunque fa giocare peggio le sue avversarie.\nNelle scorse settimane, avevo analizzato quanto scadente fosse il tentativo del Milan di costruire il gioco dal basso. Nella zona centrale del campo, invece, la precisione dei passaggi dei rossoneri aumenta (di fatto il Milan è quinto per precisione dei propri passaggi in mediana, dietro Napoli, Juventus, Fiorentina e Roma), ma nel contempo diminuiscono i tentativi.\nUna tendenza giustificata dall’urgenza dei centrocampisti rossoneri di verticalizzare verso le punte, e confermata dall’esiguità e della distanza dei tocchi palla negli istanti che precedono una rete dei rossoneri. Ma è una strategia alla dubbia efficacia: per numeri di passaggi completati con successo negli ultimi sedici metri, il Milan è undicesimo.\nAnche dal punto di vista difensivo, non c’è un solo indicatore che lasci pensare ad una prestazione fuori dalla norma. Il Milan non ostacola in maniera aggressiva la costruzione bassa degli avversari: il numero dei passaggi e dei recuperi palla nella metà campo offensiva sono allineati alla media del campionato. Il Milan non protegge in maniera particolarmente efficace la propria trequarti campo, zona nella quale i passaggi completati dagli avversari e il numero di tiri bloccati sono ancora in media. Il Milan non limita meglio di altre squadre né il numero dei cross né il numero di passaggi chiave concessi (per i quali fanno peggio del Milan solo Empoli e Pescara in campionato).\nInsomma, anche l’ipotesi secondo la quale il gioco del Milan è particolarmente adatto a svelare le debolezze avversarie non sembra vera.\nCi sono anche fattori difficili da tenere in conto in maniera analitica: sull’atletismo dei giocatori del Milan, l’unico dato a mia disposizione è quello condiviso dal sito della Lega Calcio, e non è neanche positivo, perché quella rossonera è la squadra che corre meno di tutta la Serie A, fatta eccezione per la Sampdoria.\nAllo stesso modo non posso esprimermi sulle qualità morali di questo gruppo di calciatori, e se anche in minima parte queste qualità possono essere misurate col numero di gol segnati in situazione di svantaggio c’è da dire che il Milan (5 gol segnati quando in svantaggio) ha fatto molto peggio di altre squadre in campionato (Samp con 11 e Inter con 10).\nLa linea verde rappresenta l’andamento della differenza reti del Milan giornata dopo giornata, mediato ogni cinque partite. I punti neri rappresentano la differenza media tra gli xG fatti e quelli subiti. Le linee si sono allontanate fino a raggiungere la distanza massima ad inizio dicembre. Ancora oggi non sembrano avere intenzione di ricongiungersi.\nAllo stato attuale l’unica conclusione razionale è che la prestazione del Milan è ingiustificatamente al di sopra delle attese. Non resta che da chiedersi: può durare così fino alla fine del campionato?\nNella maggior parte dei casi si verifica la cosiddetta regressione verso la media, ovvero la prestazione reale converge verso il dato statistico. La regressione verso la media è tanto più frequente quanto maggiore è il numero di eventi. In quest’ottica, trentotto partite non sono un numero enorme, c’è una possibilità che il Milan mantenga il suo status ‘overperforming’ fino alla fine.\nMa se parliamo di possibilità, l’unico strumento statistico che abbiamo a disposizione sono gli xG. Allora, tenendo conto della forza delle squadre e della restante parte del calendario, si può azzardare una previsione circa il piazzamento finale dei rossoneri di Montella.\nSia chiaro, quello che sto per proporvi è poco più di un gioco, la cui ipotesi di fondo è alquanto improbabile: che tutte le squadre da qui alla fine del campionato continuino a sviluppare gioco come hanno fatto fino ad oggi (inoltre va ricordato che gli episodi si distribuiscano equamente, come nel caso dell’assegnazione di un calcio di rigore).\nSe per un istante riteniamo vera questa ipotesi – e cioè che il Milan si comporterà “da Milan” così come la Roma “da Roma”, il Palermo “da Palermo”, la Samp da “Samp, eccetera – si può simulare al computer l’andamento di ogni singola partita da qui alla fine per un numero enorme di volte. All’aumentare del numero di prove, per la legge dei grandi numeri, la frequenza di un risultato tenderà alla probabilità vera dell’evento.\nEbbene, almeno secondo il computer, la posizione finale più probabile per il Milan a questo punto è proprio la settima piazza, con una media di 61,8 punti tenuta nelle 500.000 simulazioni effettuate delle 13 giornate rimanenti.\nNon ci resta che aspettare fino al pomeriggio del 28 maggio per poter farci beffe della macchina.


Terminator: Gale Ann Hurd vuole interrompere la concessione del copyright | Cultura Pop\nRecensioni Master Of The Universe Revelation Giochi in scatola Loki Parchi Divertimento Lego Marvel War of the Rohirrim Dungeons & Dragons Disney+ Codici sconto\nTerminator: Gale Ann Hurd vuole interrompere la concessione del copyright\ndi Emanuela Acri giovedì 3 ottobre 2019 17:32\nSecondo una nuova legge sul copyright, potrebbe esserci la probabilità che alcuni studi cinematografici perdano i diritti esecutivi su franchise molto conosciuti, tra questi Terminator. Il tutto ebbe inizio, però, negli anni ’70, quanto venne approvata una legge che permetteva ai creatori di prendere nuovamente il controllo delle proprietà inizialmente concesse agli studi dopo alcuni decenni.\nEbbene, risale al 1984 il debutto nelle sale cinematografiche della pellicola dedicata al primo capitolo di Terminator. Dunque, dopo ben 33 anni Skydance Media potrebbe non avere più i diritti per realizzare nuovi film del franchise. Tutto ciò molto probabilmente accadrà già a partire dal mese di novembre del prossimo anno. Infatti la scrittrice dell’opera Gale Ann Hurd, a quanto pare dopo 35 anni, vorrebbe porre fine alla concessione del copyright.\nIl CEO di Skydance Media, David Ellison, nel 2011 ha acquistato il franchise alla cifra di 20 milioni di dollari e tra l’altro la società statunitense è responsabile della produzione sia del film che debuttò nel 2015, Terminator: Genisys, ma anche del nuovo capitolo di Terminator, che uscirà a breve nelle sale cinematografiche. Ma questo non è un fatto sporadico. Infatti anche Gary K. Wolf, scrittore di Chi ha incastrato Roger Rabbit, ha intenzione di riprendersi i diritti.\nMa anche gli autori di Trappola di cristallo, così come Predator e Nightmare – Dal profondo della notte o Venerdì 13 hanno intenzione di rivalutare la situazione sui diritti del copyright. In ogni caso, a quanto, le sorti di Terminator sono in mano alla scrittrice Gale Ann Hurd, la quale molto probabilmente si prenderà il 50% dei diritti insieme James Cameron, regista che ha lavorato per la produzione del nuovo capitolo della saga del franchise. Dunque non ci resta che aspettare e vedere in modo si evolve la situazione.\nTutti gli appassionati della saga di Terminator, a questo link, potranno acquistare il Blu-ray del secondo capitolo. Approfittatene!\ngiovedì 3 ottobre 2019 17:32\narticolo precedente:La Guerra dei Mondi diventa una serie TV per BBC, ecco il primo trailer\nprossimo articolo:Wingspan: in arrivo la prima espansione con volatili da tutta Europa


Parigi: luce verde per Valeo | Teleborsa.it\nHome Page / Notizie / Parigi: luce verde per Valeo\nParigi: luce verde per Valeo\nMigliori e peggiori · 24 gennaio 2019 - 09.50\n(Teleborsa) - Brillante rialzo per Valeo, che lievita in modo prepotente, con un guadagno del 2,69%.\nA livello comparativo su base settimanale, il trend di Valeo evidenzia un andamento più marcato rispetto alla trendline del CAC40. Ciò dimostra la maggiore propensione all'acquisto da parte degli investitori verso Valeo rispetto all'indice.\nL'analisi di medio periodo conferma la tendenza positiva di Valeo. Sebbene il breve periodo mette in risalto un allentamento della linea rialzista al test del top 26,74 Euro. Primo supporto visto a 25,68. Tecnicamente si prevede uno sviluppo negativo in tempi brevi verso il supporto 25.\nParigi: luce verde per Safran


Quando la scienza puzza - Basta monopolio\n“In natura l’odore di violette non esiste [come non esistono note musicali e colori]” (E. Boncinelli in Lucio Russo, «L’odore di violette. Riflessioni su “Il cervello, la mente e l’anima” di Edoardo Boncinelli», Stampato in proprio, Roma 2016).\nEdoardo Boncinelli è il vincitore del riconoscimento speciale del Premio Città di Como per chi si è distinto “per la diffusione della cultura italiana [sic!] negli ultimi due anni” (Corriere della Sera, del 4/7/2016).\nSono molti oggi i “dotti” buonisti dalla “mente quantica”, capaci di vedere tutto positivo, perfino la “materia oscura”, o l’“energia oscura”, termini che sono diventati addirittura titoli di libri scritti a migliaia per un nuovo ottenebramento delle coscienze, stavolta su base “scientifica”.\nQuesta moltitudine di scientisti (che io chiamo “scoreggioni”) è illuminata... dall’oscurità.\nDeficiente del pensare, questa moltitudine si presenta come scientifica nella misura della rimozione del proprio giudizio critico. Tanto ci ha pensato Kant a dimostrare che la ragione umana non è attendibile, ed Einstein a scotomizzare l’io umano...\nCosì avviene che i nuovi “scimmioni intelligenti”, addomesticati da Gödel & C. circa l’insufficienza del linguaggio umano, insegnino sempre più l’impossibilità di un pensare libero dal mito, dato che il pensare razionale, dicono, proviene dal mito, e che, pertanto, ogni nuova teoria, conoscenza, perfino ogni parola, tutto è relativo... tranne la teoria della relatività di Einstein. Ovviamente.\nCostoro non sospettano che se anche il pensare razionale origina da quello mitico, ciò non esclude che il suo sperimentatore possa ugualmente emanciparsi dai miti permanendo razionale.\nNemmeno sospettano che proprio chi oggi parla di materia (cioè tutta la cosiddetta scienza odierna) ne parla in modo antilogico o anti-epistemologico, dato che bisognerebbe parlare NON di materia ma di IDEA della materia. Scrive per esempio M. Scaligero: “È sufficiente, nella dottrina di Marx, sostituire la parola “materia” con “idea” e tutto va a posto: non occorre molto acume per accorgersi che la materia, autonoma, vi è ravvisata come idea” (M. Scaligero, “Metafisica del materialismo”, in “Il pensiero come antimateria”, Roma 1978). Infatti bisognerebbe rendersi conto che «se si pretende che una scienza “rigorosamente oggettiva” faccia scaturire il suo contenuto soltanto dall’osservazione, si deve pure pretendere che rinunci completamente al pensare, dato che il pensare, per sua natura, va sempre al di là dell’osservato» (cfr. R. Steiner, “Scienza della libertà” in “La filosofia della libertà”, cap. 4°).\nnsomma chi CREDE che la luce sia misurabile come un’onda sonora, dovrebbe percepirla con le orecchie, non con gli occhi. Ma ciò sarebbe un’assurdità, simile a quella del calore creduto movimento: “È semplicemente assurdo dire che il calore o la luce siano movimento. Movimento è soltanto la reazione alla luce della materia suscettibile di movimento” (R. Steiner, “Introduzioni agli scritti scientifici di Goethe. Per una fondazione della scienza dello spirito - Antroposofia”, Ed. Antroposofica, Milano 2008, p. 246).\nProbabilmente la nuova scienza, che nega l’esistenza del profumo, nega pure l’esistenza delle puzzette dei suoi sostenitori, da me chiamati, appunto, SCOREGGIONI... Amen\nAlla ciurmaglia dei nuovi credenti NIZZA - TERRORISMO - PASTIGLIE


Incontri forli bari bakecaincontri / Mature gangbang\nAnnunci personali Milano - Annunci donne, escort, incontri Stai cercando amici oppure sei alla ricerca di uomini o donne a Caltanissetta da conoscere? Incontri i tuoi desideri si possono realizzare! BakecaIncontri : Annunci gratuiti di coppie Vercelli in cerca di evasione e di trasgressione. Bakecaincontri.com - Annunci personali Firenze Incontri, caltanissetta, annunci personali Caltanissetta Incontri puoi trovare tante coppie con cui condividere momenti speciali e con cui realizzare i tuoi desideri pi bollenti e trasgressivi. New finalmente in citta!.sexy zoccola da scopare_bella maialina_affascinante_calda e perversa_sborrata in bocca_preliminari da urlo_amante. Incontri per fare sesso a Villaggio Coppola Pinetamare provincia di Caserta. Trova con chi scopare gratis a Villaggio Coppola Pinetamare. Donne, ragazze, lesbiche, gay, troie e scopamiche disponibili e facili a Villaggio Coppola Pinetamare. ..\nI like to play and excite my partner as he likes. Si declina ogni responsabilità sulla veridicità degli annunci inseriti. " IN cerca DI vero sexo. Escort in Milan Malpensa. Lasciarmi massagiarti, coccolarti e rendere la tua giornata più emozionante e disteso. Una ragazza dolce con un esterno imponente che vale la pena conoscere dentro.\nLa mia pelle è profumata e vellutata, mi preparo sempre al meglio nei miei incontri per non deludere l'uomo che mi ha scelto. . Testo dell'annuncio (è vietato inserire annunci con numeri di telefono e annunci di sesso mercenario). Disponibile anche per weekend e viaggi di lavoro in Italia ed Europa con un preavviso di almeno 72 ore. Per momenti personali di piacere, ma anche per cene di lavoro o eventi daffari.


Preghiera carismatica e corretta relazione con il Dio della Rivelazione\nE' con immensa gioia che propongo questo succoso intervento del fratello Alberto alla lettura e alla meditazione. Il testo orientato in modo specifico per il Rinnovamento nello Spirito è però aperto ad ogni cristiano che desideri fare chiarezza nell'approcciarsi correttamente e gioiosamente al Dio di Gesù Cristo. Buona lettura\n"Quando vi radunate ognuno può avere un salmo, un insegnamento, una rivelazione, un discorso in lingue, il dono di interpretarle. Ma tutto si faccia per l'edificazione."\n1 Corinzi 14, 26\nPERCHE' IL SIGNORE CI HA RADUNATI?\n- Finalità: la preghiera comunitaria carismatica?\n(noi vedremo che non è il vero o primario obiettivo di Dio)\n- Vero obiettivo: fare di noi dei veri "adoratori in Spirito e verità!"\n(realizzando questo, il Signore avrà anche reso possibile in maniera efficace anche l'attuazione-servizio del dono-carisma che ci ha affidato)\nOBIETTIVO CONSEQUENZIALE: LA Preghiera Comunitaria Carismatica\n- La PCC è elemento fondante della spiritualità carismatica\n(Secondo la teologia di San Paolo l'incontro comunitario di preghiera è il contesto ideale dove sbocciano, crescono e maturano i diversi carismi elargiti a ciascun membro del gruppo o comunità per l'edificazione comune);\n- Il luogo in cui Dio parla\n(il luogo in cui Dio uno e trino parla al suo popolo per esortarlo, consolarlo, guarirlo, ammonirlo);\n- Dio ci dona la sua profezia per un progetto\n(se Dio ci dona la sua Parola, la sua profezia, non è per la consolazione di un momento ma per una progettualità di vita sia personale che comunitaria; Dio vuol fare la storia con noi);\n- Importanza dell'autenticità della preghiera\n(L'incontro comunitario di preghiera, pur non esaurendo la vita di un gruppo o comunità del Rns, la caratterizza significativamente come una manifestazione dell'autenticità del cammino di Rinnovamento nello Spirito (da Linee guida per i ministeri di animazione e gli ambiti di evangelizzazione del Rns - Comitato Nazionale di Servizio - edizioni Rns).\n- Ortodossia e ortoprassi = ecclesialità;\n(avvalliamoci del servizio dei nostri assistenti spirituali);\n- Dio si fida di noi e si affida a noi per la venuta del suo Regno\n(adesione al servizio);\nFORMARE VERI "ADORATORI IN SPIRITO E VERITA'"\n- Avere una "vera relazione con il Dio della rivelazione"\n(l'animatore della preghiera è innanzitutto una persona che deve sapersi relazionare con il Dio rivelato nelle Sacre Scritture);\n- Conoscere Dio = starci insieme e dare tempo per ascoltarlo nella verità.\nNon possiamo conoscerlo se non diamo del tempo a Dio, se non intessiamo con Lui un rapporto vero, personale ed intimo.\n(chiudersi nel segreto della propria stanza; Gesù parlerà al nostro intimo, al nostro cuore perché Lui è "più intimo a noi di noi stessi", ciò significa che Dio solo conosce ciò di cui noi abbiamo veramente bisogno e necessità; la provvidenza ci da sempre e soltanto ciò di cui abbiamo veramente bisogno, né tanto più né tanto meno);\nNon possiamo conoscerlo se non ci relazioniamo con la Parola in verità\n(ed è con questa che dobbiamo confrontarci);\nA chi spetta la verità sulla Parola? A chi spetta il discernimento della Parola?\nSoltanto ed esclusivamente alla Chiesa e a persone alle quali essa ha riconosciuto doni di esegesi e di catechesi illuminata!\nBando agli auto-discernimenti e ai criteri fuorvianti e distorcenti la verità! Diventeremmo portatori di menzogna e di nuclei di morte!\n(accostiamoci quindi alla lettura del Nuovo Catechismo della Chiesa Cattolica, ai vari libri di esegesi che ci fanno conoscere: chi è Dio e cosa ci ha rivelato,il discernimento che la Chiesa ha fatto in millenni per non cadere nell'errore; del manicheismo, dell'eresia. Utilizzare per es. testi di Silvano Fausti, P. Raniero, Bruno Forte etc.)\n- Dio ci parla nel deserto\n(il deserto è il luogo e lo spazio in cui noi facciamo tacere le altre voci, tutti i nostri pensieri e le nostre preoccupazioni, è il luogo dove Dio può finalmente parlare! "L'attirerò a me, la condurrò nel deserto, parlerò al suo cuore, la fidanzerò a me");\n- Uomini e donne mossi dall'azione dello Spirito Santo\n(essere in grado di relazionarci con Dio e quindi scorgere quale sia la sua volontà che si esprime appunto nelle varie e fantasiose espressioni carismatiche).\n- Discernimento spirituale\n(lasciar agire quel carisma di animazione che orienta l'incontro comunitario e indica nel discernimento sapienziale le esperienze che lo Spirito sembra suggerire mediante le mozioni profetiche che suscita negli oranti);\n- L'animatore è una persona "realizzata", felice perché figlio di Dio\n- la mia realizzazione non è in ciò che faccio (criterio mondano), ma è ciò che sono(esperienza della figliolanza divina). Altrimenti una profonda illusione genera una profonda delusione;\n- Risposte vere a domande vere\n(Se desideriamo avere risposte vere dobbiamo per forza porci domande vere: questo è il duplice lavoro della Parola; scavare in noi al punto tale da cancellare le domande false e far rimanere solo quelle vere ed allora, solo allora, ci darà risposte altrettanto vere; questo vale per ogni servizio sia pastorale che di animazione o che necessita di qualsivoglia discernimento);\n- Vivere una profonda e personale relazione con Dio\n(egli allora ci donerà quella sapienza e quella saggezza che Egli ha precluso ai dotti e ai sapienti di questo mondo. Sapete cosa vuol dire questo? Vuol dire che Dio non ci ha donato la Bibbia per farla diventare un oggetto di studio fine a se stesso ma ce l'ha donata perché essa rivelasse viva nelle nostre mani, perché tornasse a produrre quel frutto per cui Lui l'aveva mandata "ogni mia parola non ritornerà a me senza avere operato quanto desidero, senza aver compiuto ciò per cui l'avevo mandata!");\n- La Parola ci svela a noi stessi\n(Solo chi ascolta la Parola di Dio conosce il proprio cuore, la Parola accresce la fiducia in se stesso e quindi aumenta la disponibilità a lasciarsi usare dallo Spirito.\nIn lei scopriremo le nostre sorgenti, in lei ci conosceremo come non ci siamo mai conosciuti, in lei troveremo le risposte a tutte le nostre domande ed infine in lei troveremo la guida che ci illuminerà la strada verso una vita da vivere in pienezza e vera gioia);\n- Augurio: che questo cammino ci serva per poter un giorno anche noi esultare con San Paolo e gridare al mondo "non sono più io che vivo ma è Cristo che vive in me!"\n(permettere alla Luce di Cristo di invadere tutta la nostra vita al punto da diventare "luce" per gli altri);\nCRITERI PER LA FORMAZIONE DELL'ADORATORE IN SPIRITO E VERITA'\n- Primo criterio: Spirito Santo e Parola, esperienza e formazione dovranno andare a braccetto, vivere in simbiosi\n(dopo esserci relazionati con la Parola cercheremo di capire anche che cosa ci vuol dire Dio tramite essa; quale l'indicazione fondamentale che ci viene da Lui. Non basta conoscere nozioni bisogna poi sperimentarle. Per es: Una cosa è leggere un libro sulla tecnica dello sciare, un'altra cosa è andare in montagna e fare l'esperienza dello sci.\nQuando ci cresce l'entusiasmo, quando ci aumenta la passione?\nQuando scopriamo nella realtà che ciò che abbiamo letto diventa un fatto esperienzale, vero e tangibile; allora il gusto, allora la passione. Gli apostoli si sono meravigliati quando hanno visto che potevano veramente scacciare i demoni con la potenza della fede in Gesù, ma ci hanno creduto e si sono appassionati solo dopo averlo fatto e non quando Gesù gliene aveva parlato. Gesù poi li richiama al vero valore: non gioite perché avete visto satana cadere dal cielo ma perché i vostri nomi sono scritti nei cieli.\nQuanto è esigente il nostro Maestro!\n- Secondo criterio: Dio ci parla nei personaggi della Bibbia\nCi siamo mai chiesti perché la Bibbia parla e racconta la vita di tanti personaggi?Dio aveva forse bisogno dei personaggi biblici per aumentare la sua gloria?Dio, che può tutto e al quale nulla è impossibile aveva forse, bisogno di Abramo, Mosé, Elia, San Paolo per essere riconosciuto ed adorato quale Dio? Allora perché questo lavoro faticoso di Dio con l'uomo?\nPer potergli regalare la Salvezza!\n- Terzo criterio: Dio usa i personaggi della Bibbia per aprirci alla Sua Verità\n(il criterio della fede lo capiamo conoscendo Abramo, quello della salvezza tramite Mosé, quello della conversione e della grande misericordia di Dio tramite Saulo/San Paolo);\n- Esempio tangibile della veridicità di ciò che abbiamo appena detto.\nIn merito al relazionarsi con Lui, Dio ci parla nella Bibbia tramite il personaggio di Abramo il quale ha fatto una grande fatica perché è stato il primo con il quale Dio si è relazionato. Abramo non aveva paradigmi cioè non aveva esempi che gli spiegavano cosa bisognava fare per relazionarsi con Dio! Ma sapete quanto è stata importante la fatica che Abramo ha fatto nel capire come ci si relazionava con Dio?\nLa sua fatica ci ha donato Gesù tramite la Vergine Maria!\nAl tempo di Maria era vietato alle donne ebraiche di studiare o soltanto leggere la Torah malgrado ciò ella conosceva molto bene le sacre scritture e si presume che sia stata iniziata ad esse dal padre Gioacchino. Conoscendo le scritture conosceva pure le parole con le quali Dio si era rivelato ad Abramo, il primo uomo ad avere avuto una relazione con Dio. Ecco perché il giorno dell'Annunciazione Maria non ha avuto dubbi ed ha subito compreso che colui che gli rivelava il suo progetto su di lei era il Signore suo Dio, il quale usò le stesse parole che usò a suo tempo per rivelare il suo progetto ad Abramo.\nLE PROIEZIONI DI DIO E LO SFORZO UMANO\nCi sono vari modi di pregare, fra questi vi è la PREGHIERA DI ASCOLTO!\nCome inizia il 1° comandamento? SHEMA' ISRAEL, UOMO ASCOLTA!\nCome puoi amare ciò che non conosci?\nL'ascolto è l'unità di misura per verificare lo stato psichico di una persona. L'uomo sano conserva una purezza di cuore che si verifica con l'ascolto.\nPerché devo ascoltare?\nNoi siamo un vulcano di proiezioni di Dio. Il dio delle proiezioni non è nient'altro che un prodotto del nostro cervello, dei nostri fantasmi, delle mostre paure, delle nostre trasferente genitoriali. Si parte dagli elementi della propria esperienza umana, si proietta e ci si fa un dio a propria immagine e somiglianza; questo è un meccanismo psichico.\nTutte le religioni del mondo non potranno che fare questo procedimento: si parte dall'elemento umano e si proietta il proprio dio.\nTU VEDI LA BELLEZZA DIO DEVE ESSERE BELLO!\nTU VEDI LA FORZA DIO DEVE ESSERE FORTE!\nTU VEDI LA GIUSTIZIA DIO DEVE ESSERE GIUSTO!\nTU VEDI LA GRANDEZZA DIO DEVE ESSERE GRANDE!\nUn dio fatto a propria immagine e somiglianza diventa un IDOLO!\nIdolo significa la proiezione della tua immagine. Tutto questo ti impedisce di incontrare il DIO VERO!!!\nL'IDOLO HA GLI OCCHI PURCHÉ GLIELI HAI FATTI TU... MA NON VEDE!\nL'IDOLO HA LE MANI... MA NON OPERA!\nL'IDOLO HA GLI ORECCHI... MA NON ASCOLTA, ANCHE SE TU GLI PARLI!\nL'IDOLO HA I PIEDI MA QUANDO GLI CHIEDI DI SOCCORRERTI NON VIENE IN TUO AIUTO!\nQuante volte hai invocato invano Dio nella tua vita?!?!\nForse le tue preghiere sono salite ad un dio che è idolo e che quindi non ti ha ascoltato!\nNoi attribuiamo le cose che non abbiamo (bellezza, forza, etc.) ad un essere superiore, ad un idolo. Noi siamo IDOLATRI!!! A noi non interessa Dio ma la sua bellezza, la sua forza!\nDentro di noi siamo intasati di proiezioni di dio.\nPER CUI BISOGNA FARE OPERA DI RASCHIAMENTO!\nQuante volte nella nostra vita spirituale siamo rimasti delusi? Perché? Credevamo di essere guidati da Dio ed invece ci stavamo facendo guidare dalla sua proiezione, da un idolo, cioè da noi stessi.\n"OGNI ILLUSIONE GENERA UNA DELUSIONE!!!"\nL'IGINE PSICHICA DALLE PROIEZIONI DI DIO E IL DIO DELLA RIVELAZIONE.\nIl nostro è un Dio che ha sfondato le barriere del tempo e dello spazio, ha fatto irruzione nella storia umana ed ha cancellato tutte le proiezioni di dio.\nLa Fede è la porta per entrare a contatto con il DIO DELLA RIVELAZIONE!!! Quando facciamo l'esperienza del Dio della rivelazione, conosciamo il Dio che rimuove quello della proiezione.\n- La proiezione mi mostra un dio che chiede sempre qualcosa? Il Dio della rivelazione non chiede niente ma dona! Lui è solo dono!\n- Ci siamo creati l'idea di un Dio che ci aiuta solo se facciamo del bene, e pensiamo: "Se faccio del male dio mi punisce." Questa è la classica proiezione su dio della figura di nostro padre: "Se fai il bravo ... altrimenti! - nascita del senso di colpa.\n- Il Dio della rivelazione è colui che si rifiuta di punire, rifiuta di agire con forza. Gesù, infatti, si rifiutò di punire e di flagellare l'adultera. - nasce la coscienza di colpa.\n- La nostra mente si crea un dio facilmente raggiungibile, mentre il Dio della rivelazione si nasconde ed è silenzio! - Dio non è manipolabile\n- La nostra mente si crea un dio da servire, mentre è Gesù il servitore, colui che lava i piedi agli apostoli ed innalza gli uomini! - Dio è carità\n- La nostra mente si crea un dio che non subirebbe mai l'ignominia del Golgota, mentre Gesù per avere successo non ha bisogno di vincere tanto che sceglie la croce! - Il "successo" nella vita sta nel donarsi\n- La nostra mente si crea un dio che ci facilita il cammino di fede, che ci rende accessibili tutte le altre religioni, mentre il Dio della rivelazione non ci fa sconti e ci rende difficile la strada da percorrere! - nasce la trasfigurazione umana\n- Molti dicono che la nostra religione è difficile, non è vero.\nLA NOSTRA RELIGIONE NON E' DIFFICILE MA NON CI SI ENTRA SENZA L'AIUTO, LA GRAZIA DELLO SPIRITO SANTO!!! - Solo Dio (lo SS) ci dona Dio\n- Molti filosofi, psicologi, studiosi di ogni genere non sanno niente della Fede e della Religione.\nSOLO CHI HA LO SPIRITO SANTO CONOSCE LA FEDE! - La Fede è ragionevole ma metarazionale\nQUANDO FAI LA PREGHIERA DI ASCOLTO CANCELLI TUTTE LE PROIEZIONI DI DIO!\n- Il Dio della rivelazione è spoglio di ogni potere, è così umile e nascosto che non si vede.\n- E' un Dio che si inginocchia davanti a te, ti innalza, ti lava i piedi!\n- Il dio delle proiezioni ti deve proteggere.\n- Il Dio della rivelazione si inserisce nella tua vita sempre in una crisi profonda. Non ti dà risposte.\nVi è un evento nella vita di Gesù che ha il potere di cancellare completamente tutte le proiezioni che hai di Dio ed ottenere l'igiene psichica totale ed irreversibile:\nLA MORTE SULLA CROCE!\nAnche 2000 anni fa si aspettavano un messia diverso: "Se sei Dio scendi dalla croce! Se ha salvato gli, altri salvi se stesso! Se sei Dio, perché muori?"\nSi pone sulla croce, poi lascia a te tutta la creatività per rispondere. La sua croce fa piazza pulita delle proiezioni, come una scure.\nPiù tu fai preghiera di ascolto più l'igiene è totale!\nLa nostra non è una religione, ma un incontro con una persona che si vede e si sente.\nLA NOSTRA E' UNA AVVENTURA D'AMORE!!!\nIn nome della Bibbia si fanno le azioni più nefaste contro l'uomo.\nLa Bibbia alimenta qualcosa come 7.000 sette!\nIl credente è un uomo che desume i criteri di giudizio dall'alto!\nSe l'ateo dà fiducia e totale adesione a tutti, il GIUSTO VIVRÀ PER LA SUA FEDE! Il giusto nella Bibbia è colui che sa relazionarsi con Dio!\nAl Dio della rivelazione non ci si presenta con le nostre opere buone, con i nostri pregi, con la nostra bellezza, con la purezza perché altrimenti facciamo una figura meschina!\nSe vuoi esaminare la tua fede, devi esaminare la tua storia.\nAL DIO DELLA RIVELAZIONE CI SI PRESENTA SOLO CON LA FEDE! SENZA FEDE E' IMPOSSIBILE PIACERE A DIO!!!\nDavanti a Dio ti puoi presentare solo con la tua apertura, la tua disponibilità ad accettare la sorprendentissima novità di Dio.\nLa realtà di un mistero che ti supera!\nALLORA LA FEDE!\nDIO QUANDO DEVE RIVELARE LA FEDE, FA LA STORIA CON LA PERSONA!\nSe la Fede viene dall'alto si fa storia. Per capire che cos'è la Fede prendiamo un personaggio: ABRAMO NOSTRO PADRE NELLA FEDE!\nAbramo ha fatto una grande fatica a relazionarsi con Dio e tutti quelli che si vogliono relazionare con il DIO DELLA RIVELAZIONE devono faticare. Ma è un gioco leggero, non è pesante. E' un andare un pò in salita, non fa un discorso facile, richiede un impegno umano che noi dobbiamo mettere in tutte le cose.\nLA PREGHIERA DI ASCOLTO\nAbramo nostro padre nella fede significa che è lui il criterio della Fede. E' il primo personaggio al quale Dio si rivela!\nQuando Dio si manifesta diventa storia perciò il Dio di cui parliamo non è un Dio astratto, ma è un Dio che ha assunto le coordinate del tempo e dello spazio ed è venuto qui nella nostra esistenza.\nQuando diciamo "storia" dobbiamo ricondurre tutto a queste due domande:\nQUANDO E' ACCADUTO QUESTO? DOVE E' ACCADUTO QUESTO?\nCioè alle coordinate del tempo e dello spazio.\nLa civiltà nella quale visse il nostro padre nella fede era molto civilizzata. 4.000 anni fa, a lui, Dio si è rivelato per primo ed è stato "lanciato" fino a noi, come paradigma, cioè come punto di riferimento essenziale per relazionarsi con Dio, in quella che noi chiamiamo la PAROLA DI DIO!\nQuesto sarà il nostro cammino:\n1° - daremo la parola a Dio, cioè ascolteremo la sua Parola;\n2° - interrogheremo la parola di Dio perché la Fede senza ragione\nnon è fede! La Fede stimola, ti chiama a mettere molto ben a\nfrutto la tua vita! Faremo il mestiere della Vergine Maria,\nl'Angelo parla e lei obbietta;\n3° - Questa Parola è per me oggi. La Parola di Dio ha parlato in\neterno, davanti a tutti gli uomini, in ogni angolo della\nterra, per tutti i secoli, per tutte le generazioni.\n4° - La Sacra Scrittura è Parola di Dio e parola di uomo.. pertanto è un libro che parla del profondo dell'uomo, della sua psicologia, del suo senso profondo, primo ed ultimo... prima di Freud. La scienza ti da il come, la Bibbia il perché!\nOra faremo la PREGHIERA DI ASCOLTO, leggeremo la Parola di Dio, consapevoli che ogni parola, ogni sillaba, ogni virgola ha la sua grande importanza perché è stata levigata dal tempo.\nLeggiamo queste citazioni: GENESI 12, 1-3\nAbramo è un uomo sui 30 anni, il Signore si rivela a lui con questa parola alla quale però si oppone un fatto elementare: Sara, sua moglie, è una donna sterile!\nPassano gli anni, il figlio non arriva, allora Abramo ricorre ad un espediente: "Io adotterò l'uomo più prestigioso del mio clan, Eliezer di Damasco, così si compirà quella discendenza così grande secondo la Parola del Signore."\nDio boccia l'idea perché la sua volontà è di dargli un figlio da sua moglie Sara.\nGENESI 16, 1-11\nAbramo fa l'esperienza del Dio vivo sui 30 anni. Il tempo trascorre, un figlio non arriva; prende quindi in considerazione l'ipotesi di una adozione. Questa volta la soluzione nasce dalla mente stessa di Sara. Lei sa di essere sterile, in quel contesto è la somma disgrazia per una donna. Sa che Abramo deve avere un figlio come discendente e così escogita la soluzione "AGAR", la sua schiava, dalla quale nasce ISMAELE!\nI versetti 11 e seguenti fanno da risonanza ad un'altra parola del Nuovo Testamento: L'ANNUNCIAZIONE DELLA NASCITA DI GESÙ A MARIA! Quando la Vergine raccontava all'evangelista Luca la sua esperienza, era impregnata di quelle stesse pagine che noi leggiamo, erano lo stesso contesto e le stesse identiche parole.\nNoi non possiamo capire la Fede che ebbe la Vergine Maria in questa situazione, ecco perché partiamo da Abramo che è più vicino a noi.\nQuello che stiamo facendo è un ottimo cammino, perché stiamo mettendo i nostri passi sulle sue stesse orme, stiamo facendo maturare la nostra Fede sulle stesse pagine che maturarono la Fede della madre di Gesù!!!\nSiamo in buona compagnia, siamo in compagnia di Maria... come Maria!


METODI IMMUNOMETRICI (I) - ppt scaricare\nMETODI IMMUNOMETRICI (I)\nPubblicatoDionisia Fedele Modificato 2 anni fa\nPresentazione sul tema: "METODI IMMUNOMETRICI (I)"— Transcript della presentazione:\n1 METODI IMMUNOMETRICI (I)\nI metodi immunometrici, sfruttando le caratteristiche uniche di selettività e di avidità del legame antigene-anticorpo, permettono lo sviluppo di metodi altamente specifici per la quantificazione dell’analita, anche in matrici complesse. complesso antigene-anticorpo campione + anticorpo quantificazione del\n2 METODI IMMUNOMETRICI (II)\nL’avidità del legame antigene-anticorpo si misura con la costante di equilibrio (Keq). Un anticorpo adatto per lo sviluppo di metodi immunometrici deve avere una Keq = M-1 Per confronto, si riportano le costanti di affinità di alcuni complessi tra uno ione metallico ed EDTA, un legante\tpoliamminocarbossilico, che forma\tcomplessi chelati molto stabili con\tnumerosi ioni metallici. KM-EDTA AgEDTA3- CaEDTA2- FeEDTA2- HgEDTA2- 107 M-1 1010 M-1 1014 M-1 1021 M-1 Complesso EDTA: acido etilendiaminotetracetico\n3 CARATTERISTICHE DEGLI ANTICORPI (I)\nCaratteristiche fondamentali di un anticorpo sono l’affinità (misurata in termini chimico-fisici dalla costante di equilibrio K) e la specificità (capacità di riconoscere l’analita, distinguendolo da molecole a struttura simile). Gli anticorpi più comunemente utilizzati per lo sviluppo di metodi immunometrici sono le immunoglobuline G (IgG). La molecola, a forma di “Y”, è composta da due catene aminoacidiche leggere e due pesanti. legame Ag sito legame Ag sito variabile costante catena leggera catena pesante\n4 CARATTERISTICHE DEGLI ANTICORPI (II)\nepitopo paratopo CDR antigene ponte disolfuro intracatena ponte disolfuro intercatena frammento Fab frammento Fc Catena H Catena L In dettaglio è mostrata la porzione Fab dell’anticorpo, con il sito di legame con l’antigene. Si può vedere come in questa porzione dell’anticorpo, perfettamente complementare all’antigene, siano presenti dei gruppi funzionali che stabiliscono numerose interazioni con l’antigene.\n5 INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO (I)\nL’interazione antigene-anticorpo interessa porzioni limitate delle due molecole. Antigene Anticorpo\n6 COME SI OTTIENE UN ANTICORPO\nUn anticorpo specifico per l’analita si ottiene immunizzando un animale da laboratorio con l’analita stesso. L’analita è in grado di stimolare una risposta immunitaria, quindi la produzione di anticorpi solo se ha una massa relativamente elevata (PM > 1000 Da). In questo caso viene chiamato antigene. La regione di antigene che si trova in contatto diretto con l’anticorpo è detta epitopo o determinante antigenico. L’antigene viene somministrato Dal siero dell’animale si possono purificare le IgG totali (ricche in IgG anti-antigene somministrato)\n7 ANTICORPI POLICLONALI E MONOCLONALI (I)\nPoiché su un antigene sono presenti numerosi epitopi, mediante l’immunizzazione di un animale da laboratorio si ottiene un antisiero contenente una popolazione eterogenea di anticorpi, diretti verso i diversi epitopi dell’antigene e caratterizzati da diverse affinità. Questi anticorpi sono detti policlonali. È possibile ottenere anticorpi monoclonali, cioè una popolazione omogenea di anticorpi diretti verso un unico epitopo. Per questo occorre, dopo avere immunizzato il topo, isolare i diversi cloni di cellule B e testarli per individuare l’anticorpo migliore. Poiché le cellule B normalmente non crescono in coltura, esse devono essere fuse con cellule di mieloma per ottenere ibridomi in grado sia di crescere in coltura sia di produrre quantità illimitate di anticorpo.\n8 ANTICORPI POLICLONALI E MONOCLONALI (II)\nIBRIDOMA: mantiene la capacità della cellule della milza di produrre anticorpi, associata alla vitalità della cellule di mieloma. Antisiero policlonale Anticorpi monoclonali\n9 CARATTERISTICHE DEGLI ANTICORPI MONOCLONALI\nVantaggi Svantaggi Caratteriestiche (affinità e specificità) note e costanti Potrebbero essere troppo specifici: (difficoltà nel legare forme diverse dell’antigene) Sono sufficienti piccole quantità di antigene, anche impuro, per la loro produzione Tecniche di produzione più sofisticate E’ possibile selezionare l’anticorpo con la specificità desiderata Non sempre reagiscono con la proteina A Può essere prodotto in quantità illimitata ed è semplice da purificare Non formano precipitato in seguito al legame con l’antigene Solitamente caratterizzati da elevata specificità Spesso caratterizzati da bassa affinità\n10 ANTIGENI ED APTENI Sintesi derivato aptene braccio spaziatore aptene\ncarrier + a) Un aptene è una molecola rigida e di piccole dimensioni (PM compreso tra 80 e 1000 Da) che può stimolare la produzione di anticorpi SOLO se accoppiata ad una proteina “carrier”, che ne aumenta la massa complessiva. In questo caso, tuttavia, si ottiene una miscela di anticorpi, non tutti diretti contro l’aptene. Anche isolando un anticorpo monoclonale, è necessario accertare che l’anticorpo sia diretto proprio contro l’aptene. anticorpi che riconoscono una parte di aptene ed una parte di braccio spaziatore anticorpi che riconoscono il carrier anticorpi che riconoscono l’aptene\n11 SPECIFICITA’ DEGLI ANTICORPI (II)\nEsempio:\tproduzione di un anticorpo anti-estradiolo. La reattività crociata verso altri ormoni steroidei varia in funzione della posizione di derivatizzazione dell’aptene scelta per la sintesi dell’immunogeno. estriolo estrone C17 estradiolo 3,8  1,2 % 5,6  2,0 % 48  8 % Reattività crociata 40  10 % 5,0  1,8 % 0,48  0,27 % estrone estriolo C6 C16 C17 Derivatizzazione C16 C6\n12 INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO ASPETTI TERMODINAMICI\nIl legame tra antigene (An) ed anticorpo (Ab) può essere descritto dall’equilibrio: Ab An + An-Ab ka kd Keq = [An-Ab]eq [An]eq [Ab]eq ka kd = dove An-Ab è il complesso antigene-anticorpo, ka e kd sono le costanti di velocità di associazione e dissociazione del complesso e Keq è la costante di equilibrio del processo ed è una misura dell’affinità dell’anticorpo per l’antigene, cioè della forza del legame An-Ab. L’unità di misura per Keq è L mol-1. Anticorpi con Keq  L mol-1 sono adatti per lo sviluppo di metodi immunometrici.\n13 La formazione del complesso An-Ab non è sempre direttamente misurabile\nTRACCIANTI (I) La formazione del complesso An-Ab non è sempre direttamente misurabile En + S EnS En + P L’interazione enzima-substrato si autorivela attraverso la formazione del prodotto o scomparsa del substrato che hanno proprietà chimiche diverse An + Ab An-Ab La reazione è difficilmente rivelabile se non sfruttando le diverse proprietà fisiche del complesso An-Ab rispetto ad An libero Per esempio: differenze di massa misurabili con biosensori piezoelettrici o diverse proprietà ottiche misurabili con il sistema Biacore E’ più pratico utilizzare un tracciante cioè un reattivo che, partecipando alla reazione An-Ab in opportune condizioni, ne permetta la rivelazione sensibile\n14 TRACCIANTI (II) La formazione del complesso An-Ab viene solitamente misurata sfruttando un approccio indiretto, introducendo un tracciante, legato all’antigene o all’anticorpo, che partecipando alla reazione immunologica, la evidenzia con alta rivelabilità. 1 2 3 tracciante analita aggiunta reattivi Conc. analita Tracciante legato 4 16 2 1 reazione separazione libero legato\n15 TRACCIANTI (III) Il tracciante deve essere una molecola caratterizzata da un elevato rapporto segnale/massa. Questo permette di ottenere un segnale altamente rivelabile anche in presenza di piccole quantità di tracciante, quindi di fare avvenire la competizione in presenza di poche molecole, abbassando il limite di rivelazione del metodo. Tra le molecole facilmente rivelabili si può utilizzare: un radioisotopo (radioimmunoassay, RIA) un enzima (enzyme immunoassay, EIA) un substrato enzimatico un coenzima o un inibitore enzimatico una molecola fluorescente o un quencher\n16 SCELTA DEL TRACCIANTE (I)\nAmplificazione enzimatica: 1 molecola di enzima 1000 molecole di prodotto Aumenta con: - attività enzimatica - rivelabilità del prodotto - amplificazione ciclica Chemiluminescenza Analita—Enzima Substrato Prodotto Spettrofotometria Fluorescenza Analita—125I emissione  1 disintegrazione/sec molecole (106) Analita—Chemilum. Reaz. chimica Ic h Ic aumenta con: CL (resa quantica) f (rapporto molecole chemilum/analita) Ic = f c CL Analita—Fluoroforo I0 h If h’ If aumenta con: I0 (intensità del raggio di eccitazione)  (coefficiente di estinzione) c (concentrazione) If = I0  F cd\n17 SCELTA DEL TRACCIANTE (II) TRACCIANTE: LIMITE DI RIVELAZIONE\nIl tracciante deve essere presente nel tubo ad una massa estremamente bassa ( g) e facilmente rivelabile 10-13 – 10-15 Chemiluminescenza Molecola chemiluminescente 10-12 – 10-14 Fluorescenza Molecola fluorescente 10-20 – 10-21 Amplificazione ciclica enzimatica 10-15 – 10-18 10-16 – 10-18 Bio-chemiluminescenza 10-15 – 10-16 Assorbanza Enzima 0.1 – 10 x 10-15 ≈ dpm 125I MASSA (moli/tubo) SEGNALE TRACCIANTE\n18 ENZIMI Gli enzimi sono macromolecole biologiche di natura proteica, con gruppi funzionali sui quali hanno luogo scambi o trasformazioni di sostanze Svolgono una funzione di catalizzatori (biologici), cioè accelerano le reazioni chimiche o fanno avvenire reazioni che altrimenti non avrebbero luogo Sono caratterizzati da: altissima specificità elevato potere catalitico E + S ES E + P\n19 COFATTORI ENZIMATICI L’attività di alcuni enzimi dipende soltanto dalla struttura proteica, mentre altri richiedono anche uno o più componenti non proteici, chiamati cofattori Il cofattore può essere: uno ione metallico una molecola organica chiamata coenzima\n20 UNITÀ DI MISURA Un enzima può essere misurato in termini di concentrazione come qualunque altra proteina Da un punto di vista analitico interessa invece la misura dell’attività catalitica (o attività enzimatica) L’attività enzimatica si esprime in Unità Internazionali (U.I.) Una unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima in grado di catalizzare la trasformazione di una micromole di substrato in condizioni standardizzate\n21 EFFETTO DEL pH sull’attività enzimatica\n6 8 10 tripsina colinesterasi 4 papaina 2 pepsina pH attività enzimatica relativa Il profilo a campana è il più comune\n22 EFFETTO DELLA TEMPERATURA sull’attività enzimatica\nT (°C) attività enzimatica relativa 20 40 60 Gli enzimi hanno diversa stabilità termica La parte discendente della curva è dovuta alla denaturazione termica\n23 METODI DI MISURA La possibilità di “vedere” una reazione enzimatica è legata al fatto che i substrati e i prodotti hanno proprietà chimico-fisiche diverse Tali proprietà devono poter essere misurabili I metodi di rivelazione più comuni in enzimologia sono: spettrofotometrici spettrofluorimetrici\n24 METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA) (I)\nPerché è vantaggioso utilizzare un enzima come marcatore per la sintesi di un tracciante? L’attività catalitica dell’enzima permette di amplificare il segnale analitico (un solo enzima genera moltissime molecole di prodotto). Il limite di rivelazione del metodo è quindi significativamente inferiore rispetto ai metodi basati sull’uso di substrati enzimatici o molecole fluorescenti o chemiluminescenti come marcatori. S E La molecola di substrato utilizzata come marcatore produce una sola molecola di prodotto per ogni molecola di tracciante L’enzima utilizzato come marcatore produce molte molecole di prodotto per ogni molecola di tracciante\n25 METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA) (III)\nUn enzima ideale per lo sviluppo di un EIA deve essere: sufficientemente stabile nel tempo nelle condizioni di conservazione sufficientemente attivo dopo la coniugazione con l’antigene o l’anticorpo e nelle condizioni sperimentali di esecuzione dell’EIA. Un parametro estremamamente importante è l’attività specifica dell’enzima (attività per unità di peso dell’enzima), che generalmente si esprime in unità per mg (U/mg).\n26 METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA) (IV)\nVantaggi relativi all’uso di enzimi: sono facilmente reperibili in forma pura, relativamente economici e stabili; sono disponibili numerose metodiche semplici ed automatizzabili per la misura dell’attività enzimatica; una molecola di enzima può produrre moltissime molecole di prodotto; è possibile ottenere la modulazione dell’attività enzimatica in seguito al legame con l’anticorpo, permettendo lo sviluppo di EIA omogenei. Svantaggi relativi all’uso di enzimi: l’attività enzimatica può variare in funzione della temperatura o della presenza di interferenti; la coniugazione chimica dell’enzima può ridurne l’attività specifica; si può avere rumore di fondo dovuto alla presenza di enzima nel campione.\n27 MISURA DELL’ATTIVITA’ ENZIMATICA (I)\nL’attività enzimatica viene misurata valutando la velocità della reazione enzimatica in condizioni di eccesso di substrato. Si può scegliere di misurare la velocità di scomparsa del substrato o quella di comparsa del prodotto. Il secondo metodo è preferibile poiché la misura è più accurata (ad es. da 0 a 1% per la comparsa del prodotto, da 100% a 99% per la scomparsa del substrato), soprattutto considerando che occorre lavorare in condizioni di eccesso di substrato. La misura del prodotto della reazione enzimatica è proporzionale alla concentrazione dell’enzima se: - l’andamento della reazione è lineare nel tempo - l’attività enzimatica è proporzionale alla quantità assoluta di\tenzima.\n28 TRACCIANTI ENZIMATICI\nSISTEMA DI RIVELAZIONE METODOLOGIA ANALITICA Perossidasi H2O2/cromogeno Spettrofotometria H2O2/luminolo Chemiluminescenza Fosfatasi alcalina 4-nitrofenilfosfato Spettrofotometria 4-metilumbelliferone-fosfato Fluorimetria AMPPD Chemiluminescenza -galattosidasi 2-nitrofenolo Spettrofotometria 4-metilumbelliferone Fluorimetria 2-naphthyl--D-galactopyranoside Chemiluminescenza La misura dell’attività enzimatica viene comunemente effettuata utilizzando un substrato che viene trasformato dall’enzima in prodotto colorato, il quale viene poi misurato tramite spettrofotometria. L’uso di substrati fluorescenti o chemiluminescenti permette di ridurre il limite di rivelazione del metodo.\n29 SPETTROFOTOMETRIA (I)\nL’enzima trasforma il substrato incolore in un prodotto colorato, cioè capace di assorbire la luce nel visibile. SUBSTRATO ENZIMA PRODOTTO c A P0 P b P T = bc T 1 log A e =\n30 SPETTROFOTOMETRIA (II) 2,3-diamminofenazina (DAP)\nENZIMA SUBSTRATO PRODOTTO N H 2 perossidasi H2O2 o-fenilendiammina 2,3-diamminofenazina (DAP) arancio max=492 nm\n31 FLUORESCENZA (I) SUBSTRATO PRODOTTO\nIl rendimento quantico di fluorescenza molecolare  è il rapporto tra il numero di molecole che emettono la fluorescenza ed il numero totale di molecole eccitate (o il rapporto tra fotoni emessi e fotoni assorbiti): dove Rf è la velocità di rilassamento fluorescente e Rr è la velocità di rilassamento non-radiativo. ENZIMA SUBSTRATO PRODOTTO L’enzima trasforma il substrato non fluorescente in un prodotto fluorescente. La fluorescenza è un processo di emissione in cui le molecole sono eccitate dall’assorbimento di una radiazione elettromagnetica. Le specie eccitate, successivamente, ritornano allo stato fondamentale emettendo l’energia in eccesso sotto forma di fotoni.\n32 FLUORESCENZA (II) E 1 2 Assorbimento molecolare l 5 Energia ’ Conversione interna Rilassamento vibrazionale Fluorescenza Diagramma energetico parziale di una specie molecolare ipotetica (diagramma di Jablonski)\n33 CHEMILUMINESCENZA (I)\nCon il termine chemiluminescenza si indica il fenomeno di conversione di energia chimica in radiazione luminosa, di lunghezza d'onda variabile dall'ultravioletto all'infrarosso comprendendo tutto il campo del visibile. Reagenti Intermedio [ Prodotti ]* Prodotti + hn stadio 1 stadio 2 stadio 3 La specie “Intermedio” deve essere molto ricca di energia, in modo da potersi decomporre formando almeno un prodotto in uno stato eccitato. Siccome le reazioni di ossidazione con l'ossigeno molecolare sono molto esoergoniche, esse sono fra le reazioni chemiluminescenti più comuni.\n34 CHEMILUMINESCENZA (II) fotoni emessi molecole reagenti\nL'efficienza di un processo di chemiluminescenza, CL, è definita dalla relazione: fotoni emessi molecole reagenti CL = Se\tInt = resa dello stadio 1 (formazione dell'Intermedio), SE = resa dello stadio 2 (formazione dei Prodotti nello stato eccitato) Em = resa quantica dello stadio 3 (emissione di fotoni) l' efficienza del processo di chemiluminescenza è: CL = IntSEEm Poiché la resa di ciascuno stadio del processo é minore di 1, la resa quantica dell'intero processo di chemiluminescenza é sicuramente minore di 1. I valori di resa quantica dei più comuni processi di chemiluminescenza in genere non superano il valore 0,01.\n35 METODI IMMUNOMETRICI Eterogenei Omogenei COMPETITIVI Eterogenei Omogenei NON COMPETITIVI\n36 CLASSIFICAZIONE DEI METODI IMMUNOMETRICI (I)\nI metodi immunometrici possono essere classificati in: segnale log concentrazione analita Competitivi (a modulazione di attività, AM). Si basano sulla modulazione del segnale analitico dovuta alla competizione tra le molecole di analita e quelle del tracciante per un numero limitato di siti anticorpali. Il segnale analitico diminuisce all’aumentare della concentrazione di analita presente nel campione, la curva dose-risposta ha forma sigmoidale. segnale concentrazione analita Non competitivi (ad amplificazione di attività, AA), tutto l’analita presente nel campione viene catturato dall’anticorpo in eccesso e rivelato. Il segnale analitico è direttamente proporzionale alla concentrazione di analita nel campione, la curva dose-risposta è lineare.\n37 CLASSIFICAZIONE DEI METODI IMMUNOMETRICI (II)\nI metodi immunometrici possono essere distinti in: Eterogenei (su fase solida). Il metodo di rivelazione non permette di distinguere tra tracciante legato all’anticorpo e tracciante libero. Questi metodi necessitano di una separazione della frazione libera da quella legata prima della misura, quindi prevedono l’immobilizzazione di un componente (antigene o anticorpo) su una fase solida; in alternativa si può procedere mediante precipitazione del complesso antigene-anticorpo utilizzando glicole polietilenico o un secondo anticorpo in eccesso. Omogenei. Il legame del tracciante all’anticorpo ne modula (aumenta o riduce) l’attività. Questi metodi non necessitano della separazione della frazione libera da quella legata e quindi sono eseguiti in fase liquida.\n38 CLASSIFICAZIONE DEI METODI IMMUNOMETRICI (III)\nCARATTERISTICHE DEI METODI OMOGENEI ED ETEROGENEI Metodi eterogenei Poco sensibile all’interferenza della matrice del campione Molto sensibile all’interferenza della matrice del campione Ampio ambito dinamico del metodo Ambito dinamico del metodo inferiore Bassi limiti di rivelazione Limiti di rivelazione più elevati Difficili da automatizzare Possono essere automatizzati facilmente Esecuzione del metodo più complicata Esecuzione semplice e rapida Metodi omogenei\n39 Fisica (adsorbimento)\nMETODI ETEROGENEI (I) IMMOBILIZZAZIONE DELL’ANTICORPO SU FASE SOLIDA (I) Chimica Fisica (adsorbimento) IgG anti-analita da coniglio IgG anti-coniglio (Fc specifico) da capra Biotina-avidina Proteina A Anticorpo\n40 METODI ETEROGENEI (II) Fisica (adsorbimento)\nIMMOBILIZZAZIONE DELL’ANTICORPO SU FASE SOLIDA (II) ADSORBIMENTO FISICO L’adsorbimento passivo dell’anticorpo sulla fase solida avviene mediante interazioni idrofobiche. Il processo è influenzato da: pH (deve essere vicino al punto isoelettrico dell’anticorpo, in modo che la carica elettrica della molecola Fisica (adsorbimento) tenda a zero); forza ionica (la presenza di sali, che neutralizzano le cariche elettriche, favorisce le interazioni idrofobiche); temperatura (l’aumento della temperatura favorisce la diffusione, quindi rende il processo più rapido); tempo (in genere qualche ora è sufficiente, a temperatura ambiente); concentrazione proteica (se è troppo elevata si formano strati proteici multipli, con conseguente ridotta capacità legante e stabilità, se è troppo bassa si osservano interazioni aspecifiche dell’antigene con la fase solida, le quali tuttavia possono essere note- volmente ridotte saturando la superficie libera del tubo con una proteina (BSA) o un polimero (PVP).\n41 METODI ETEROGENEI (III)\nIMMOBILIZZAZIONE DELL’ANTICORPO SU FASE SOLIDA (III) MEDIANTE ANTICORPO Anticorpi di cattura Fc specifici Anticorpi di cattura Fab specifici Gli anticorpi anti-analita sono orientati in maniera ottimale per legare l’antigene Gli anticorpi anti-analita non sono in grado di legare l’antigene\n42 Competitivi METODI IMMUNOMETRICI\nCompetizione tra analita (Ag) presente nel campione e una quantità fissa di tracciante (Ag* marcato) per legarsi ad una quantità fissa e limitante di anticorpo (Ab) [Ag*] = costante [Ab] = costante\t[Ab] < [Ag] + [Ag*] Ag + Ab  Ab-Ag\tAg* + Ab  Ab-Ag* Eterogenei: separazione fisica tra Ag* e Ab-Ag* Omogenei: nessuna separazione tra Ag* e Ab-Ag*\n43 METODI COMPETITIVI ETEROGENEI (I)\nELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRETTI Aggiunta del campione Antigene Enzima Aggiunta del tracciante Tracciante Incubazione Substrato enzimatico Anticorpo immobilizzato Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale Fase solida\n44 METODI COMPETITIVI ETEROGENEI (II)\nELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRETTI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale\n45 METODI COMPETITIVI ETEROGENEI (III)\n46 METODI COMPETITIVI ETEROGENEI (IV)\n47 METODI COMPETITIVI ETEROGENEI (V)\n48 METODI COMPETITIVI ETEROGENEI (VI)\n49 METODI COMPETITIVI ETEROGENEI (VII)\n50 METODI COMPETITIVI ETEROGENEI (VIII)\nELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRETTI\n51 METODI COMPETITIVI ETEROGENEI (IX)\nELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) INDIRETTI E Aggiunta antigene e anticorpo Aggiunta dell’anticorpo marcato Substrato Segnale Competizione per il sito anticorpale Separazione Misura dell’attività enzimatica Anticorpoanti-IgG marcato Analita immobilizzato Anticorpo anti-analita Analita libero E\n52 METODI COMPETITIVI OMOGENEI (I)\nEMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) (I) Metodi EMIT sono stati sviluppati utilizzando traccianti enzimatici che, in seguito al legame con l’anticorpo, mostravano una variazione (aumento riduzione) della propria attività catalitica. I primi metodi EMIT sono stati sviluppati utilizzando l’enzima lisozima come tracciante, ma successivamente l’enzima glucosio-6-fosfato deidrogenasi NAD dipendente (G6PD) è stato ampiamente utilizzato, grazie alla sua maggior capacità di modulare la propria attività catalitica in seguito all’interazione con l’anticorpo.\n53 METODI COMPETITIVI OMOGENEI (I) S P\nEMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) (II) Sono stati proposti due sistemi. 1° sistema: Il tracciante in soluzione è attivo Diventa inattivo dopo legame con l’anticorpo Il segnale aumenta all’aumentare della concentrazione di analita. S P conc. analita attività enzimatica\n54 METODI COMPETITIVI OMOGENEI (I) S P\nEMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) (III) 2° sistema: Il tracciante in soluzione è inattivo Diventa attivo dopo legame con l’anticorpo Il segnale diminuisce all’aumentare della concentrazione di analita. S P conc. analita attività enzimatica\n55 METODI COMPETITIVI OMOGENEI (III)\nECIA (Enzyme Channeling Immuno Assay) L’analita compete con il tracciante per i siti anticorpali. L’anticorpo è coniugato ad un enzima. S P1 P2 S P1 Q S P1 In presenza di elevate quantità di analita, il tracciante, che non si lega all’anticorpo, interagisce con un enzima in soluzione che trasforma P1 in un prodotto non misurabile (Q). Questo riduce il segnale di fondo. In presenza di piccole quantità di analita, il tracciante interagisce con l’enzima immobilizzato sull’anticorpo, che trasforma P1 in un prodotto misurabile (P2).\n56 PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI COMPETITIVI (II)\nPer i metodi competitivi, il segnale diminuisce all’aumentare della concentrazione di analita. segnale concentrazione analita segnale log concentrazione analita\n57 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI (I)\nLa concentrazione dell’analita nel campione viene determinata per interpolazione su una curva-dose risposta prodotta in parallelo utilizzando degli standard. La curva viene prodotta rappresentando B/B0 (rapporto tra segnale dello standard a concentrazione x e segnale ottenuto a dose zero di analita) in funzione del logaritmo della concentrazione di analita. B0 è il segnale ottenuto in assenza di analita, cioè rappresenta il legame massimo del tracciante alla fase solida. B è il segnale a concentrazione x di analita (solo una frazione di tracciante è legato alla fase solida). B/B0 rappresenta quindi la frazione di tracciante che è stato spiazzato in presenza della concentrazione x di analita ed è compreso tra 0 e 1. B/B0 log concentrazione analita\n58 METODI NON COMPETITIVI\nSi utilizza un notevole eccesso di immunoreattivo in modo da ottenere il massimo segnale dall’analita. Per la legge di massa la velocità di formazione del complesso antigene-anticorpo è proporzionale alla concentrazione dei reattivi. Ciò implica che anche a bassissima concentrazione di analita un’alta frazione reagirà con l’anticorpo in eccesso. Segnale Concentrazione analita La curva dose-risposta ha un andamento lineare ed il segnale è direttamente proporzionale alla con-centrazione di analita.\n59 Non Competitivi di Tipo “Sandwich”\nMETODI IMMUNOMETRICI Non Competitivi di Tipo “Sandwich” Reazione dell’analita (Ag) presente nel campione con un eccesso di anticorpo di cattura (Ab) e, successivamente, con un eccesso di tracciante (anticorpo di rivelazione marcato, Ab*) [Ab] > [Ag]\t[Ab*] > [Ag] L’analita deve essere una molecola relativamente grande, con almeno due determinanti antigenici Eterogenei: separazione fisica tra Ab* e Ag-Ab* Omogenei: nessuna separazione tra Ab* e Ag-Ab*\n60 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH) (I)\nAggiunta del campione Antigene Enzima Aggiunta del tracciante Tracciante Anticorpo di rivelazione Incubazione Substrato enzimatico Anticorpo di cattura immobilizzato Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale Fase solida\n61 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH) (II)\nAggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale\n62 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH) (III)\n63 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH) (IV)\n64 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH) (V)\n65 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH) (VI)\n66 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH) (VII)\n67 METODI NON COMPETITIVI (SANDWICH) ETEROGENEI (SU FASE SOLIDA)\n68 METODI NON COMPETITIVI OMOGENEI\nsubstrato prodotto intermedio prodotto finale Due anticorpi monoclonali diretti contro diversi epitopi dell’antigene vengono marcati con due enzimi scelti in modo che il prodotto della reazione catalizzata dal primo sia il substrato per il secondo (es. glucosio ossidasi e perossidasi). Solo quando i due anticorpi sono legati all’antigene gli enzimi sono sufficientemente vicini per ottenere quantità misurabili del prodotto finale. In alternativa si possono marcare i due anticorpi con due subunità dello stesso enzima, con un donatore ed un accettore di una coppia FRET (fluorescence resonance energy trasfer), ecc...\n69 METODI NON COMPETITIVI OMOGENEI\nAnalita Ab marcato 1 Ab marcato 2 E1 E2 Aggiunta reattivi Reazione Misura dell’attività enzimatica 2 Aggiunta Substrato 1 Si utilizzano due enzimi vicinali, tali per cui uno produce il substrato per l’altro (es. glucosio ossidasi/perossidasi) L’attività del secondo enzima è misurabile solo quando i due Ab marcati reagiscono con Ag, avvicinando i siti attivi enzimatici\n70 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI\nLa concentrazione dell’analita nel campione viene determinata per interpolazione su una curva-dose risposta prodotta in parallelo utilizzando degli standard. La curva viene prodotta rappresentando il segnale ottenuto per ciascun standard in funzione della concentrazione di analita nello standard. La curva ideale è lineare. In realtà la curva dose-risposta può presentare una curvatura a dosi basse di analita a causa di un legame aspecifico ed una curvatura a dosi alte a causa della saturazione dell’anticorpo di cattura o di rivelazione. Segnale Concentrazione analita aspecifico saturazione\n71 METODI COMPETITIVI E NON COMPETITIVI (MA E AA)\nCARATTERISTICHE Più rapidi, particolarmente a basse concentrazioni di analita. L’utilizzo di anticorpi monoclonali migliora la specificità Specificità intrinseca superiore Limite di rivelazione più basso Amplificazione di attività (AA) (Metodi non competitivi) Modulazione di attività (MA) (Metodi competitivi)\n72 Competitivi Non Competitivi METODI IMMUNOMETRICI Segnale analitico\nLog [Analita] Segnale analitico [Analita] Competitivi Non Competitivi\n73 INTERFERENZE NEI METODI IMMUNOMETRICI\nI metodi immunometrici sono soggetti ad interferenze, soprattutto per quanto riguarda la reazione immunologica e la rivelazione del segnale. Le cause più comuni sono: la presenza nel campione di molecole che danno reazione crociata con l’anticorpo o che interferiscono con la formazione del complesso antigene-anticorpo o che competono con l’anticorpo per il legame con l’antigene (es proteine del siero), ecc; la presenza nel campione di enzima endogeno (nel caso di EIA), di molecole colorate o fluorescenti (nel caso di rivelazione spettrofotometrica o fluorescente), ecc. Questo fenomeno può essere notevolmente ridotto adottando un metodo eterogeneo, grazie ai lavaggi effettuati prima della misura.\n74 Ab Ag* Ag* Ag Ab* Ab Ag Ab* METODI IMMUNOMETRICI Elevata specificità\nBasso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Ab Ag* Ag* Ag Ab* Ab Ag Ab*\n75 (carne, matrici vegetali)\nMETODI IMMUNOMETRICI Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Elevata specificità di riconoscimento tra Ag e Ab Campioni fluidi (siero, urina, latte) ANALISI DIRETTA Campioni solidi (carne, matrici vegetali) OMOGENEIZZAZIONE ESTRAZIONE ANALISI\n76 METODI IMMUNOMETRICI Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Impiego di traccianti, cioè reattivi biospecifici con elevato rapporto segnale/massa Traccianti: Ag o Ab coniugati chimicamente con un marcatore (“label”)  Piccoli volumi di campione  Piccoli volumi di reagenti (riduzione dei costi)  Diagnosi precoce  Determinazione di sostanze in tracce\n77 Marcatori METODI IMMUNOMETRICI Isotopi radioattivi (125I, 3H)\nMolecole fluorescenti - fluorescenza convenzionale (fluoresceina, rodamina) - fluorescenza a risoluzione temporale (chelati di ioni lantanidi: Eu3+, Tb3+) - fluorescenza polarizzata (fluoresceina) Molecole chemiluminescenti (luminolo, esteri di acridinio) Enzimi (perossidasi, fosfatasi alcalina, b-galattosidasi) determinabili con substrati - cromogenici - fluorescenti - chemiluminescenti\n78 Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica\nMETODI IMMUNOMETRICI Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Impiego di piastre microtiter a 96 o 384 pozzetti Analisi di numerosi campioni nella stessa seduta analitica Rapidità di esecuzione (poche ore) Analisi di numerosi campioni per giorno\n79 METODI IMMUNOMETRICI Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Disponibilità di dispensatori, lavatori, lettori ed elaboratori del segnale automatici Ottimizzazione delle fasi analitiche errori precisione e accuratezza tempi di esecuzione rapidità\nScaricare ppt "METODI IMMUNOMETRICI (I)"