Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease | Protocol (Translated to Italian)\nQui, presentiamo un metodo versatile per la trasformazione della radice di pomodoro seguito da inoculazione con Ralstonia solanacearum per eseguire un'analisi genetica semplice per lo studio della malattia dell'avvizzimento batterico.\nRalstonia solanacearum è un devastante patogeno vascolare portato sul suolo che può infettare una vasta gamma di specie vegetali, causando un'importante minaccia per l'agricoltura. Tuttavia, il modello ralstonia è notevolmente sottoesplorato rispetto ad altri modelli che coinvolgono patogeni vegetali batterici, come le siringhe Pseudomonas in Arabidopsis. La ricerca mirata a comprendere l'interazione tra Ralstonia e piante da coltura è essenziale per sviluppare soluzioni sostenibili per combattere le malattie dell'avvistamento batterico, ma è attualmente ostacolata dalla mancanza di semplici analisi sperimentali per caratterizzare i diversi componenti dell'interazione nelle piante ospiti native. In questo scenario, abbiamo sviluppato un metodo per eseguire l'analisi genetica dell'infezione da Ralstonia del pomodoro, un ospite naturale di Ralstonia. Questo metodo si basa sulla trasformazione mediata di radici di pomodoro agrobacterium rhizogenes,seguita dall'inoculazione del suolo ralstonia delle piante risultanti, contenente radici trasformate che esprimono il costrutto di interesse. La versatilità dell'analisi della trasformazione della radice consente di eseguire la sovraespressione genica o il silenziamento genico mediato dall'RNAi. Come prova di concetto, abbiamo usato questo metodo per dimostrare che il silenziamento mediato dall'RNAi di SlCESA6 nelle radici di pomodoro ha conferito resistenza a Ralstonia. Qui, descriviamo questo metodo in dettaglio, consentendo agli approcci genetici di comprendere la malattia dell'avvizzimento batterico in un tempo relativamente breve e con piccoli requisiti di attrezzature e spazio di crescita delle piante.\nRalstonia solanacearum, l'agente causale della malattia dell'avvistamento batterico, è un devastante patogeno vascolare del suolo con una distribuzione mondiale che può infettare una vasta gamma di specie vegetali, tra cui patate, pomodoro, tabacco, banana, pepe e melanzane, tra gli altri1,2. Le perdite di rendimento causate da Ralstonia possono raggiungere l'80-90% della produzione di pomodoro, patate o banane, a seconda della cultivar, del clima, del suolo e di altri fattori3. Tuttavia, il modello Ralstonia è notevolmente poco esplorato rispetto ad altri modelli che coinvolgono patogeni vegetali batterici, come Pseudomonas siringae o Xanthomonas spp. Inoltre, la maggior parte degli studi sulle interazioni pianta-microbo si concentra sulla pianta modello Arabidopsis thaliana. Anche se la ricerca che utilizza questi modelli ha ampiamente contribuito alla nostra comprensione delle interazioni piante-batteri, non affrontano l'attuale necessità di comprendere queste interazioni nelle piante da coltura. La ricerca mirata a comprendere l'interazione tra Ralstonia e piante da coltura è essenziale per sviluppare soluzioni sostenibili per combattere le malattie dell'avvistamento batterico, ma è attualmente ostacolata dalla mancanza di semplici analisi sperimentali per caratterizzare i diversi componenti dell'interazione. In particolare, il pomodoro, un ospite naturale per Ralstonia, è la seconda coltura vegetale più importante al mondo ed è colpita da una pletora di malattie4, tra cui la malattia di avvizzimento batterico. In questo lavoro, abbiamo sviluppato un metodo semplice per eseguire l'analisi genetica dell'infezione da Ralstonia del pomodoro. Questo metodo si basa sulla trasformazione mediata agrobacterium rhizogenesdelle radici di pomodoro, utilizzando la fluorescenza DsRed come marcatore di selezione5, seguita dall'inoculazione del suolo di Ralstonia delle piante risultanti, contenente radici trasformate che esprimono il costrutto di interesse. La versatilità dell'analisi della trasformazione della radice consente di eseguire la sovraespressione genica o il silenziamento genico mediato dall'RNAi.\nUna potenziale limitazione di questo metodo consiste nella crescita residua di radici non trasformate. Ciò è particolarmente importante nei casi in cui il plasmico usato manca di un gene reporter che consenta la selezione delle radici trasformate. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un metodo alternativo basato sulla selezione degli antibiotici, che inibisce la crescita di radici non trasformate, consentendo la crescita di radici trasformate sane resistenti agli antibiotici. Poiché A. i rizogeni non inducono la trasformazione dei germogli, sono suscettibili all'antibiotico e, pertanto, dovrebbero essere tenuti separati dal mezzo contenente antibiotici.\nAnche se la resistenza alle piante contro Ralstonia non è ben compresa, diversi rapporti hanno associato alterazioni della parete cellulare a una maggiore resistenza all'appassimento batterico6,7,8,9.9 È stato suggerito che queste alterazioni della parete cellulare influenzano lo sviluppo vascolare, un aspetto essenziale per lo stile di vita di Ralstonia all'interno della pianta10. Le mutazioni nei geni che codificano la cellulosa sintetizzano CESA4, CESA7 e CESA8 in Arabidopsis thaliana hanno dimostrato di compromettere l'integrità della parete cellulare secondaria, causando una maggiore resistenza a Ralstonia, che sembra essere collegato alla segnalazione ABA8. Therefore, as a proof of concept for our method, we performed RNAi-mediated gene silencing of SlCESA6 (Solyc02g072240), a secondary cell-wall cellulose synthase, and ortholog of AtCESA8 (At4g18780). La successiva inoculazione del suolo con Ralstonia ha mostrato che il silenziamento di SlCESA6 ha migliorato la resistenza di SlCESA6 ai sintomi dell'avvizzimento batterico, suggerendo che la resistenza mediata dalla parete cellulare a Ralstonia è probabilmente conservata nel pomodoro e convalidando il nostro metodo per effettuare analisi genetiche della resistenza batterica delle wilt nelle radici del pomodoro. Qui, descriviamo questo metodo in dettaglio, consentendo agli approcci genetici di comprendere la malattia dell'avvizzimento batterico in un tempo relativamente breve e con piccoli requisiti di attrezzature e spazio di crescita delle piante.\nNOTA: Parti importanti di questo metodo riguardano la movimentazione di materiali vegetali in vitro, e quindi è importante mantenere le condizioni sterili durante tutte queste procedure, compresa la visualizzazione della fluorescenza DsRed. Durante tutto il processo di trasformazione, le piantine di pomodoro crescono a 25-28 gradi centigradi e 16 h/8 h luce/scuro (130 fotoni mol m-2s-1 luce). Le piastre sono sigillate con nastro microporo per facilitare lo scambio di gas e la traspirazione.\n1. Preparazione di piante di pomodoro e agrobacterium rhizogenes\nSterilizzare i semi di pomodoro (Solanum lycopersicum cv. Moneymaker, LA2706, Tomato Genetics Resource Center, TGRC) con 5% (v/v) ipoclorito di sodio per 5 min. Lavare 4-5 volte con acqua distillata sterile e mantenere i semi che tremano lentamente in acqua sterile durante la notte per facilitare la germinazione.\nTrasferire i semi di pomodoro su mezzi a mezza resistenza Murashige e Skoog (1/2 MS) senza saccarosio (2,21 g/L MS, 8% w/v agar). Mantenere i semi al buio a 25-28 gradi centigradi per tre giorni(Figura 1A).\nNOTA: Per ogni costrutto sono di solito necessari circa 40 semi.\nAutoclave 8,5 cm2 fogli filtro quadrati. Posizionare le carte filtro quadrate all'interno di 9 cm2 piatti di petri quadrati contenenti 1/2 MS medio (posizionare la carta sulla parte superiore dell'agar) e posizionare sei semi di pomodoro germinati su ogni piatto (Figura 1B). Sigillare la piastra con il nastro microporo e incubare i semi germinati a 25-28 gradi centigradi per 3-4 giorni.\nColtivare l'Agrobacterium rhizogenes MSU440 in solido LB medio (con antibiotici appropriati) a 28 s C due giorni prima della trasformazione dell'impianto.\nNOTA: A. rhizogenes è fornito dal Dr. Juan Antonio L'pez Rèez, EE-CSIC, Granada, Spagna. Nell'esperimento descritto in questo articolo, sono stati utilizzati A. rhizogenes contenenti pK7GWIWG2_II-RedRoot::CESA6 o un vettore vuoto, come controllo. pK7GWIWG2_II-RedRoot contiene un gene reporter, DsRed, guidato dal promotore dell'Arabidopsis thaliana ubiquitin (pAtUBQ10) e conferisce resistenza alla spettronomina (50 g/mL). È possibile utilizzare altri vettori per la sovraespressione genica, come riportato primadi 5. In questo lavoro, l'amplificazione del frammento specifico per il silenziamento SlCESA6 è stata ottenuta mediante la trascrizione inversa (RT) PCR utilizzando L'RNA isolato dal pomodoro (S. lycopersicum cv. Moneymaker) e migate nel vettore p-ENTR/D-TOPO (Tabella 1). Successivamente, il frammento SlCESA6-RNAi è stato clonato nel vettore binario pK7GWIWG2_II-RedRoot.\n2. Trasformazione e selezione delle piante\nUtilizzando un bisturi sterile, tagliare il radicle e il fondo dell'ipocotil delle piantine di pomodoro (Figura 1C,D).\nRaccogliere la biomassa di A. rhizogenes dalla superficie del mezzo LB utilizzando punte di plastica o una lama del bisturi e immergere con cura le piantine di pomodoro tagliate nella biomassa batterica (Figura 1E).\nDopo l'inoculazione con A. rhizogenes, coprire le piantine di pomodoro con una carta filtrante semi-circolare di 2 cm x 4 cm (Figura 1F), al fine di mantenere un'elevata umidità e facilitare la sopravvivenza e il nuovo sviluppo delle radici.\nConservare le piantine di pomodoro trasformate per 6-7 giorni. Quindi, utilizzare un bisturi sterile per tagliare le nuove radici pelose emergenti (Figura 1G,H; a questo passo, le radici non sono ancora trasformate) e consentire alle piantine di produrre nuove radici pelose.\nUna volta che la seconda generazione di nuove radici pelose appaiono (Figura 1I), rimuovere la carta da filtro sulla parte superiore delle piantine, e sigillare la piastra con nastro remarica.\nNOTA: A questo punto, la presenza del marcatore fluorescente DsRed nel vettore di trasformazione consente di visualizzare l'efficienza di trasformazione nelle nuove radici.\nPer visualizzare la fluorescenza DsRed, utilizzare uno stereomicroscopio o qualsiasi altra apparecchiatura per l'imaging in vivo dell'impianto (Figura 1J). Contrassegnare le radici trasformate (fluorescenza rossa) positive e rimuovere le radici negative non trasformate (nessuna fluorescenza rossa) utilizzando un bisturi sterile.\nTrasferire le piantine che mostrano la fluorescenza rossa su una nuova piastra contenente un mezzo 1/2 MS, al fine di facilitare lo sviluppo della radice trasformata come radice principale (Figura 1K). Mantenere le piantine che non mostrano fluorescenza rossa nella stessa piastra per controllare l'emergere di radici fluorescenti (Figura 1L) nei punti temporali successivi.\nMetodo alternativo basato sulla selezione degli antibiotici\nAlternativa al passaggio 2.5, preparare piatti quadrati riempiti a metà cm2 contenenti mezzo 1/2 MS con l'antibiotico appropriato. Inclinare le piastre di circa 5 gradi durante il processo di preparazione per generare uno spazio vuoto senza mezzo (Figura 2A ), permettendo ai germoglidicrescere evitando il contatto con l'antibiotico.\nAlternativa al passaggio 2.6, dopo aver tagliato le prime radici pelose non trasformate (passaggio 2.4), trasferire le piantine senza radici nelle piastre semipiene utilizzando carta filtrante con le dimensioni appropriate (Figura 2B).\nNOTA: Come controllo positivo, si raccomanda di trasformare diverse piantine con un plasmide contenente la stessa resistenza agli antibiotici e un gene reporter (in questo protocollo, pK7GWIWG2_II-RedRoot; kanamycin 50 g/mL).\nIn alternativa al passaggio 2.7, lascia che le piantine sviluppino nuove radici pelose e taglino quelle radici che non sono a diretto contatto con la superficie delle carte sandwich del filtro, poiché queste radici possono evitare la selezione antibiotica.\nNOTA: A causa dell'effetto antibiotico, lo sviluppo delle radici può essere più lento rispetto alle piastre senza antibiotici. Nuove radici pelose trasformate appaiono entro 14-18 giorni dopo il trasferimento delle piantine senza radici alle piastre semi-piene (passaggio 2.8.2) (Figura 2C-E).\nCoprire le piantine con una carta filtrante semicerchio di 2 cm x 4 cm, sigillare la piastra e incubare le piantine per farle sviluppare nuove radici pelose.\nNOTA: Non è necessario eliminare l'A. rhizogenes usando antibiotici. La carta filtrante sopra il mezzo MS e la mancanza di saccarosio inibiscono la diffusione degli A. rhizogenes sulla piastra5.\nDa cinque a sette giorni dopo la prima selezione radice, ripetere il processo di selezione per selezionare nuove radici trasformate e rimuovere le radici non trasformate. Trasferire le piantine contenenti radici trasformate in una nuova piastra contenente un mezzo MS 1/2.\n3. Trasferire in vasi di inoculazione\nPreparare i vasi di inoculazione dove la superficie delle radici sarà esposta all'inoculum batterico: immergere i vasi di inoculazione con acqua, versare l'acqua in eccesso e metterli in un vassoio di piantagione di plastica. Trasferire le piantine selezionate con radici trasformate in vasi di inoculazione utilizzando una pinzetta (Figura 3A).\nCoprire il vassoio con un involucro di plastica o un coperchio trasparente e tenerli a 25-28 gradi centigradi e 65% di umidità (16 h/8 h luce/scuro; 130 fotoni mol m-2s-1 luce), per mantenere un alto livello di umidità Figura 3B). Rimuovere il coperchio dopo cinque o sei giorni.\nNOTA: Le piante di pomodoro trasformate sono pronte per l'inoculazione da due a tre settimane dopo il trasferimento a suolo (Figura 3C). Durante la crescita del suolo, le piante di pomodoro possono produrre nuove radici che non vengono trasformate. Per determinare l'estensione di questo fenomeno, la fluorescenza rossa è stata visualizzata nelle radici delle piante di pomodoro trasformate di 3 settimane. La maggior parte delle radici (80%-100%) ha mostrato fluorescenza rossa, indicando che sono effettivamente trasformati (Figura 3D,E).\n4. Inoculazione inzuppata del suolo\nColtivare R. solancearum (ceppo GMI1000 in questo protocollo) in phi mezzo liquido (Tabella 211) in uno shaker orbitale (200 rpm) a 28 gradi centigradi fino alla fase stazionaria.\nDeterminare i numeri batterici misurando la densità ottica della coltura batterica a 600 nm (OD600). Diluire la coltura batterica con acqua a un OD600 di 0,1 (in condizioni utilizzate qui, questo corrisponde a circa 108 unità formanti colonie [CFU]/mL).\nMettere in un vassoio di inoculazione i vasi di inoculazione di 16-20 contenenti piante di pomodoro trasformate in un vassoio di inoculazione (29 cm x 20 cm; Figura 4A).\nVersare nel vassoio contenente i vasi di inoculazione di 300 mL (15 mL per pianta) di inoculo batterico (OD600 di 0,1). Lasciarli in ammollo nell'inoculum per 20 min (Figura 4B).\nPreparare un nuovo vassoio con uno strato di terriccio da vaso. Spostate i vasi inoculati nel nuovo vassoio (Figura 4C) e collocate i vassoi in una camera di crescita con un'umidità del 75%, 26-28 gradi centigradi e un fotoperiodo di 12 h luce e 12 h di oscurità (130 - fotoni m-2s-1 luce).\n5. Determinazione dei parametri di infezione e analisi statistica\nPunteggio sintomi della malattia come descritto in precedenza12,13, utilizzando una scala che va da 0 (nessun sintomo) a 4 (completa appassimento) (Figura 4D-H), ogni giorno dopo l'inoculazione di Ralstonia per due settimane.\nNOTA: i dati dell'indice della malattia vengono raccolti dalla stessa unità sperimentale (ogni pianta) nel tempo.\n6. Analisi dell'espressione genica\nNOTA: l'espressione del transgene o del silenziamento del gene bersaglio può essere determinata da RT-PCR o da RT-PCR quantitativo (qRT-PCR).\nRaccogliere campioni ed estrarre L'RNA da una parte rappresentativa del sistema radicale trasformato (per valutare l'effetto sul gene bersaglio) e foglie (come controllo interno).\nSintetizzare cDNA utilizzando 1 g di RNA totale trattato con DNase.\nAnalizzare l'espressione genica dei geni bersaglio da qRT-PCR. Calcolare i livelli di trascrizione relativi utilizzando il metodo 2-zCT 14, utilizzando SlEF-1 come gene di pulizia15.\nNOTA: le sequenze di primer sono elencate nella Tabella 1.\nLa figura 5 mostra lo sviluppo dei sintomi della malattia delle piante di pomodoro con radici trasformate con un vettore vuoto (EV) e di piante con radici trasformate con un costrutto RNAi destinato a SlCESA6 (Solyc02g072240). I dati dell'indice della malattia (Figura 5A) vengono raccolti dalla stessa unità sperimentale (ogni impianto) nel tempo secondo una scala arbitraria da 0 a 4 e non seguono una distribuzione gaussiana, escludendo l'uso di test standard per i dati parametrici. Inoltre, c'è una variazione intrinseca da pianta a pianta in questo tipo di esperimenti, a causa della colonizzazione e delle dinamiche di infezione. Qui di seguito abbiamo considerato diversi metodi per la rappresentazione e l'analisi statistica dei sintomi associati all'infezione da Ralstonia.\nCome approccio standard, è stato utilizzato un test non parametrico a due code U Mann-Whitney per confrontare sia le curve di controllo (EV) che di slCESA6-RNAi. In base a questa analisi, la differenza tra i mediani di entrambe le curve sembra non essere significativa (P - 0,16).\nÈ anche possibile quantificare l'area sotto la curva di avanzamento della malattia (AUDPC), che consente di combinare più osservazioni dei progressi della malattia in un unico valore. L'AUDPC ha mostrato un valore più elevato per gli impianti di controllo (EV; 28,75 x 4,75) rispetto agli impianti SlCESA6-RNAi (21,01 x 4,74), indicando che le piante silenziate SlCES6sono più resistenti all'infezione da Ralstonia rispetto agli impianti di controllo (Figura 5B).\nGli intervalli di confidenza (CI) offrono un modo per stimare, con alta probabilità, un intervallo di valori in cui viene trovato il valore della popolazione (o parametro) di una determinata variabile. Come illustrato nella Figura 5C, l'area del 95% CI per il controllo (EV) e le curve di infezione SlCESA6-RNAi stimano una maggiore probabilità di resistenza quando SlCESA6 viene silenziato.\nI valori dell'indice della malattia possono essere trasformati in dati binari, considerando un indice della malattia inferiore a 2 corrispondente a "0" e un indice della malattia uguale o superiore a 2 corrispondente a "1"12. Questo permette la rappresentazione di una curva di sopravvivenza dopo l'inoculazione di Ralstonia. Questa trasformazione si basa sull'osservazione che, una volta che le piante iniziano a sviluppare sintomi chiari (indice di malattia di 2), sono considerati come "infetti" e moriranno come conseguenza di questa infezione. Le differenze nel tasso di sopravvivenza tra eV e SlCESA6-RNAi piante non erano statisticamente significative secondo un test statistico Gehan-Breslow-Wilcoxon (P - 0.13) (Figura 5D).\nOltre all'esecuzione di analisi statistiche e, indipendentemente dai valori P ottenuti, vale la pena interpretare questi dati in base alla riproducibilità delle tendenze osservate all'interno di diverse repliche (Figura supplementare 1). In linea con questa nozione, un numero crescente di scienziati ha recentemente commentato i rischi di un uso eccessivo di soglie statistiche rigorose (come lo standard P - 0,05)16.\nL'espressione di SlCESA6 è stata analizzata in due radici trasformate selezionate casualmente prima della fase di inoculazione, dimostrando che la maggiore resistenza a Ralstonia è correlata all'espressione ridotta di SlCESA6 (Figura 5E). Utilizzando questo metodo, è possibile ottenere un tasso di trasformazione del 35-40% dopo due cicli di selezione (Figura 5F). Questo valore può essere aumentato eseguendo ulteriori turni di selezione5.\nFigura 1: Preparazione, trasformazione e selezione dell'impianto. (A) Germinazione dei semi di pomodoro in mezzi di SM a mezza resistenza (1/2). (B) Semi di pomodoro germinati posti su carta da filtro sdraiati su un piatto contenente mezzo 1/2 MS. Piantine di pomodoro prima (C) e dopo (D) taglio il radicolo e il fondo dell'ipocotil. (E) Trasformazione della piede di pomodoro immergendosi nella biomassa batterica. (F) Piantine di pomodoro trasformate ricoperte di carta da filtro per mantenere l'umidità. Emersione (G) e rimozione (H) di nuove radici pelose (non trasformate). (I) Radici trasformate. (J) Selezione delle radici pelose di pomodoro trasformate mediante la visualizzazione della fluorescenza DsRed. Le frecce rosse indicano radici trasformate positive che esprimono fluorescenza DsRed. (K) Sviluppo delle radici trasformate come radici principali. (L) Visualizzazione della fluorescenza DsRed in radici mature trasformate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.\nFigura 2: Metodo alternativo basato sulla selezione degli antibiotici. (A) Piastra quadrata mezza riempita contenente mezzo 1/2 MS. (B) Piantine tagliate su carta da filtro che giace su un mezzo 1/2 MS con antibiotico, dopo la rimozione delle prime radici pelose non trasformate. (C) Radici coperte da carta da filtro aggiuntiva. (D) Pomodoro ha trasformato le radici coltivate su un mezzo 1/2 MS con antibiotico. (E) Le piantine trasformate con pK7GWIWG2_II-RedRoot (kanamycin 50 g/mL), che esprimono DsRed, come controllo positivo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.\nFigura 3: Trasferimento del pomodoro trasformato in vasi di inoculazione. (A) Pomodori trasformati nella radice trasferiti in pentole di inoculazione completamente imbevute. (B) Pomodori trasformati in pentole di inoculazione ricoperte da un coperchio di plastica per mantenere un alto livello di umidità. (C) Pomodori a radice di due-tre settimane, dopo il trasferimento in vasi di inoculazione, pronti per essere inoculati. (D) Le piante di pomodoro di tre settimane dopo la rimozione del suolo. (E) DsRed fluorescenza nelle radici di piante di pomodoro trasformate di 3 settimane. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.\nFigura 4: Inoculazione del suolo-drenching di Ralstonia. (A) Materiali necessari per l'inoculazione di R. solanacearum GMI1000. (B) Drenching del suolo di pomodori trasformati in vasi di inoculazione con R. solanacearum GMI1000 inoculum. (C) Pomodori inoculati posti su uno strato di terriccio da vaso. (D-H) I sintomi della malattia di Ralstonia si adattano da 0 (senza sintomi) a 4 (completa appassimento). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.\nFigura 5: Il silenziamento SlCESA6 aumenta la resistenza al consolanacearum. (A) Sintomi di malattia di SlCESA6mediati con RNAi - silenziato (CESA6-RNAi) e vettore vuoto (EV) trasformati dalla radice di pomodoro su piante di inoculazione con R. solanacearum. I valori corrispondono ai mezzi : SE di otto piante. (( B) Area sotto la curva di avanzamento della malattia delle piante indicate nel pannello A. (C) 95% di confidenza Intervallo di piante indicate nel pannello A. (D) Percentuale di piante sopravvissute mostrato nel pannello A. (E) Analisi dell'espressione genica da qRT-PCR di SlCESA6-silenziato(CESA6i) e di piante di pomodoro Trasformate dalla radice EV nelle radici (1,2) e riprese (S). I valori corrispondono ai mezzi di tre repliche tecniche di tre repliche tecniche. (F) Tasso di trasformazione delle piante di pomodoro Trasformate nella radice di EV e CESA6-RNAi di due esperimenti indipendenti. I valori corrispondono al mezzo : SE, dopo due cicli di selezione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.\nNome primer Sequenza Primer (5'-3')\nTabella 1: sequenze di primer.\nIngredienti Per 1 L\nEstratto di lievito 1 g\nAcidi Casamino 1 g\nTabella 2: Phi (sezione) composizione media.\nFigura supplementare 1: Riproducibilità del risultato mostrato nella figura 5A. Sintomi di malattia di SlCESA6-silenziatoda RNAi (CESA6-RNAi) e piante di pomodoro trasformate dalla radice di EV al momento dell'inoculazione con R. solanacearum. I valori corrispondono ai mezzi : SE di otto piante. L'analisi dell'espressione genica è stata eseguita da qRT-PCR di slCESA6-silenziate(CESA6i) e EV (Empty Vector) che si trasformano le radici (1,2) e sparano (S). I valori corrispondono ai mezzi di tre repliche tecniche di tre repliche tecniche. Clicca qui per scaricare questa figura.\nIl Ralstonia solanacearum rappresenta una minaccia importante per l'agricoltura; tuttavia, la sua interazione con ospiti naturali di importanza agricola è ancora poco compresa rispetto ad altri patogeni batterici, specialmente nelle specie vegetali delle colture. Nella maggior parte dei casi, l'analisi genetica è ostacolata dal tempo e dalle spese necessarie per modificare geneticamente le piante ospiti. Per risolvere questo problema e facilitare l'analisi genetica dell'infezione da R. solanacearum nel pomodoro, abbiamo sviluppato un metodoFigure 1semplice basato sull'Agrobacterium rhizogenes- trasformazione mediata delle radici di pomodoro ( Figura 1 ), seguito da inoculazione del suolo -drenching (Figura 3). Le radici trasformate vengono selezionate utilizzando un reporter fluorescente (DsRed in questo protocollo) (Figura 1). Inoltre, abbiamo anche sviluppato un metodo alternativo basato sulla selezione degli antibiotici che non danneggi la parte aerea non trasformata (Figura 2).\nIl protocollo di trasformazione si basa su quello descritto da Ho-Plàgaro etal. 5, con diverse modifiche. La versatilità di questo metodo consente più saggi aggiuntivi in radici trasformate, come quelle di analizzare la fisiologia vegetale, la risposta ai trattamenti chimici e/o le risposte a diversi stress biotici e abiotici.\nDopo aver trasferito le piante trasformate nel suolo, abbiamo considerato la possibilità che le piante possano sviluppare nuove radici che potrebbero non essere trasformate. Abbiamo esplorato questa possibilità osservando la fluorescenza da DsRed nel sistema radicale delle piante trasformate due settimane dopo averle trasferite nel suolo (prima dell'inoculazione di Ralstonia). I risultati hanno mostrato fluorescenza rossa nella maggior parte delle radici (Figura 3D).\nIl trasferimento di T-DNA da parte dell'Agrobacterium è integrato nel genoma ospite in modo casuale e, pertanto, questo metodo genera una popolazione eterogenea di piante di pomodoro con diverso livello di espressione del gene bersaglio. L'infezione da R. solanacearum provoca normalmente la morte delle piante, che, successivamente, ostacola la raccolta di campioni di radici dopo l'esperimento per analizzare l'espressione genica di ogni pianta. Per analizzare il livello di espressione del gene bersaglio durante gli esperimenti, selezioniamo da due a tre piante trasformate dalla radice prima della fase di inoculazione, come campione rappresentativo della popolazione che verrà inoculata. La figura 5 mostra che la riduzione dei sintomi della malattia nelle piante di pomodoro è correlata all'efficienza del silenziamento SlCESA6 prima della fase di inoculazione. Pertanto, e nonostante le limitazioni del protocollo, i nostri risultati rappresentativi dimostrano chiaramente che questo metodo è un potente strumento per studiare i geni candidati coinvolti nella resistenza o nella suscettibilità al R. solanacearum nel pomodoro. The example shown in this article allowed us to determine that knocking-down SlCESA6, a secondary cell wall-related cellulose synthase, enhances resistance to infection by R. solanacearum, resembling previous observations using its ortholog AtCESA8 (At4g18780) from Arabidopsis thaliana8.\nRingraziamo tutti i membri del laboratorio Macho per le discussioni utili, Alvaro Lopez-Garcoa per la consulenza statistica e Xinyu Jian per l'assistenza tecnica e amministrativa durante questo lavoro. Ringraziamo la struttura centrale di PSC Cell Biology per assistenza con l'imaging a fluorescenza Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma di Ricerca Sulla Priorità Strategica dell'Accademia Cinese delle Scienze (grant XDB27040204), lo Shanghai Center for Plant Stress Biology (Cinese Academy of Sciences) e il programma cinese 1000 Talents.


REDAZIONEITALIA.IT - Tamponi ai calciatori, è polemica. Un medico attacca: 'E' discriminazione'. Esposto del Codacons per abuso d'ufficio\nTampone a calciatori, politici e persone dello spettacolo, ma non ai medici. E' questa l'accusa lanciata da Nicola Mumoli, primario di Medicina dell’ospedale di Magenta, che in una lettera al Corriere della Sera parla apertamente di "discrimazione". Sono tanti i protagonisti della Serie A che hanno avuto la possibilità, grazie a un'innegabile corsia preferenziale, di fare il test, nella maggior parte dei casi senza una reale necessità, mentre "i normali cittadini e addirittura medici e infermieri vengono ignorati quando chiedono di sottoporsi al tampone". Mumoli è un fiume in piena: "Una dottoressa al lavoro fra pazienti affetti da Covid-19 si è ammalata, ma dopo molte chiamate ai numeri nazionali le è stato negato il tampone. Eppure le pagine delle cronache riportano le buone condizioni di calciatori, attori e politici, a cui il tampone è stato fatto".\n'IPOCRITI' - La lettera si chiude con parole pesanti, che fanno riflettere: "Inevitabile il pensiero di chiunque: grande solidarietà con il personale sanitario, striscioni ovunque, slogan buonisti sbandierati da tutti ma di fatto solo discriminazione e ipocrisia. Se si deve scegliere tra un calciatore e un medico non ci sono dubbi e ci sentiamo condannati a sparire sotto quella mascherina che indossiamo ogni giorno con grande fierezza, esercitando un lavoro che mai come ora consideriamo un privilegio".\nIL CODACONS ATTACCA - Intanto il Codacons, l'associazione italiana consumatori, ha denunciato alla Procura di Milano calciatori e vip, che secondo la tesi presentata godono di un trattamento privilegiato rispetto agli altri cittadini, compreso i medici, per sottoporsi al test per il coronavirus. Questo il duro comunicato: "Calciatori, attori, influencer e vip vari godono di una corsia preferenziale per sottoporsi ai tamponi per il coronavirus, mentre i normali cittadini e addirittura medici e infermieri vengono ignorati quando chiedono di sottoporsi al test. Lo denuncia oggi il Codacons, confermando l’appello lanciato dal primario di Medicina dell’ospedale di Magenta, e presentando un esposto alla Procura della Repubblica di Milano. Da più parti si segnala la difficoltà dei cittadini di sottoporsi al tampone in caso di sospetto contagio – spiega il Codacons – Difficile riuscire a contattare i numeri messi a disposizione dalle autorità sanitarie, e quando si riesce a parlare con qualcuno la richiesta del test viene spesso negata. Questo non succede però a calciatori, vip e personalità varie, che in queste ore stanno comunicando l’esito degli esami cui si sono sottoposti, dimostrando l’esistenza di una corsia preferenziale in loro favore. Anche giornalisti come Bruno Vespa hanno chiesto e ottenuto il tampone, che è stato realizzato in tempi record. Eppure – denuncia l’associazione – di fronte all’emergenza tutti i cittadini devono essere considerati allo stesso modo dalle autorità sanitarie. Per tale motivo il Codacons presenta oggi un esposto alla Procura della Repubblica di Milano, chiedendo di aprire una indagine per la fattispecie di abuso d’ufficio, acquisendo le dichiarazioni del primario di Medicina dell’ospedale di Magenta, Nicola Mumoli".


ESCLUSIVA – Donna 45enne si getta dal ponte della ferrovia, finisce nei cespugli. Salva per miracolo | www.casertace.net\nESCLUSIVA – Donna 45enne si getta dal ponte della ferrovia, finisce nei cespugli. Salva per miracolo\tIl fatto si è verificato a Curti poco prima delle 8 di stamattina. CURTI – Ha tentato di farla finita, gettandosi dal ponte della ferrovia, ma la provvidenza l’ha aiutata e non è finita sui binari. Il suo volo è stato ammortizzato dai cespugli dei rovi. E’ così una 45enne di Curti si […]\nNella foto, il cavalcavia che guarda sul tratto ferroviario di Curti\nIl fatto si è verificato a Curti poco prima delle 8 di stamattina. CURTI – Ha tentato di farla finita, gettandosi dal ponte della ferrovia, ma la provvidenza l’ha aiutata e non è finita sui binari. Il suo volo è stato ammortizzato dai cespugli dei rovi. E’ così una 45enne di Curti si è salvata. Complicato tirarla fuori. C’è voluta tutta quanta l’abilità della perizia dei vigili del fuoco. Ora la donna è ricoverata. Il fatto è accaduto in via Terragrande.\nPUBBLICATO IL: 4 febbraio 2014 ALLE ORE 10:25 Vitulazio


Problemi culturali gay: come mai i gay condividono sui social gli screen dei "casi umani" di grindr? - Libri, Arte & Cultura - Gay-Forum.It\nProblemi culturali gay: come mai i gay condividono sui social gli screen dei "casi umani" di grindr?\nBy SabrinaS, May 3, 2020 in Libri, Arte & Cultura\nÈ pieno sui social di screen di chat e approcci online che vengono condivisi dagli approcciati per deridere la gente che loro scrive, un po' come fa il signor distruggere però con le chat di grindr oppure per far vedere di essere snob o molto desiderati e che loro amano fare le profumiere e basta come si suol dire, come mai? Non trovate che sia una abitudine irritante e demenziale oltre che apologia di bullismo anche verso anonimi?\nCredo li facciano sentire migliori.\nPoi ci sono screen e screen.\nJust now, Xenon said:\nNon so se sei ironico. Voglio dire una cosa. A volte quegli screen effettivamente vedono protagonisti che sembrano fuori di testa e può sembrare divertente mostrarli e commentarli, anche se contribuiscono a tipizzare negativamente il mezzo e la platea che lo utilizza. C'è, però, nel neo-lessico gaio-grinderiano una locuzione, "casi umani", che è un calderone in cui ci finiscono cose molto diverse tra loro e questo dipende dal fatto che noi omosessuali non possediamo secondo me in misura sufficiente un sentimento di empatia verso chi ha il nostro stesso orientamento. Di questa assenza di empatia parlerò brevemente anche nella discussione "Appunti". -->\nEdited May 3, 2020 by marce84\nE' solo un modo stronzo per far vedere che qualcuno ci prova con te\ne che lo fa in modo impacciato o inopportuno.\nCredo che sia perché in fondo tanti gay sono merde\nNon credo diversamente dagli eterosessuali. Al massimo alcuni saranno un po' più incattiviti dalla vita.\nNon trovate che sia una abitudine irritante e demenziale oltre che apologia di bullismo anche verso anonimi?\nd'altra parte la stronzaggine è equamente distribuita fra la gente, i gay non fanno eccezione\n6 minutes ago, marce84 said:\nL'essere stati a propria volta vittime di scherno o discriminazione può avere una duplice conseguenza o 1)ti fa diventare piu sensibile o 2)ti fa diventare piu carogna, a seconda su di chi va ad impattare\nEdited May 3, 2020 by prefy\n3 hours ago, prefy said:\nC'è un bel fumetto autobografico molto famoso chiamato Maus, scritto dal figlio di un reduce di Auschwitz.\nIl padre gli ha fatto passare infinite angherie fino al punto di spingere la madre del protagonista al suicidio.\nLui ha sempre creduto che la cattiveria di suo padre fosse stata dovuto a quello che aveva subito nel campo,\nfino a che la loro donna delle pulizie (e amante del padre) non gli dice: "Anche io sono stata là e non sono così".\nSull'ironia in sé non ci trovo niente di male, altrimenti Joan Rivers è morta invano. E non credo si possa parlare di bullismo, anche se non ho capito bene di che messaggi stiamo parlando (i gentlemen di grindr c'entra qualcosa?)\nPiù che altro quello che mi colpisce di più è il fatto che certi gay concepiscano grindr NON come, che so, l'app di Just Eat oppure quella di Mediaworld (da usare poco e quando si è alla ricerca di qualcuno) ma più come un qualsiasi altro social, una residenza stabile, dove fare accesso quotidiano e appassionarsi al turnover o all'evoluzione degli utenti, da aggiornare con le foto della laurea quando uno si laurea, e tutto il resto.\nMagari la cosa vale solo per me che non sono bravo con le app e non ho pazienza, ma non credo che faccia tanto bene vivere in pianta stabile su Grindr e immischiarsi in una certa prassi di inviare e ricevere messaggi acidelli così come di spettegolare con gli amici ridicolizzando altri gay coi quali si è chattato, magari dopo averli triggerati a dare un certo tipo di risposte. Cosa questa che, comunque, viene fatta anche su questo forum. Senza girarci intorno: ci sono utenti che fanno comunella con l'unico scopo di offendere altri utenti, o che usano una retorica violenta e tipica del bullismo, senza mezzi termini. Non faccio nomi, ma tanto li sappiamo.\nSono d'accordo sul fatto che sulle app ci siano tanti gay che "si fanno il santino" e che poi invece sotto sotto sono i peggiori. Ma questo lo capii già una delle mie prime volte che incontrai un ragazzo per farci sesso... uno che ti dice le peggio cose in chat, che ti invita a casa sua nel giro di un'ora per scopare, ecc. e poi, dopo la scopata, sta lì a raccontarti di quando è buono e bravo lui e invece di quanto sono corrotti, malvagi e schifosi tutti gli altri gay che conosce, che "adescano ragazzini carini come te per invitarli alle orge e vendergli il popper". Ecco, questo modo di fare non lo sopporto. Se sei su un'app di quel tipo e tieni un certo tipo di comportamento (foto, dialoghi, ecc.) non ti puoi stupire se trovi uno che ti chiede di bere il latte da una ciotola mentre abbai (sto andando per iperboli, non di cose realmente vissute) e di certo se uno semina cazzo e culo non è che può raccogliere solo discussioni filosofiche, Beethoven e cene raffinate.\nChi sta lì in pianta stabile è perchè cerca relazioni o sesso e non ne riesce a trovare oppure perchè - pur trovandolo - cerca molto spesso sesso. Non credo sia come dici tu e, cioè, che venga usato come Facebook o Instagram.\nanche se non ho capito bene di che messaggi stiamo parlando (i gentlemen di grindr c'entra qualcosa?)\nPer farti capire, questi sono alcuni degli screenshot che si trovano in rete (spesso la schermata mostra anche il nickname):\nE forse questa pure è una (almeno parziale, se non completa) verità.\n10 minutes ago, marce84 said:\nSe bazzichi Grindr per periodi abbastanza lunghi, noterai la presenza di alcuni utenti dalle foto molto curate ma dal profilo molto poco chiaro, indefinito, generalmente poco interessante e brillante, peraltro. Se ci parli, ti faranno discorsi fumosi, o completamente fuori contesto, o intrisi di eccezionalismo e di biasimo verso gli altri utenti. Se hai un minimo di esperienza, capisci subito che questi non vogliono quagliare, e per quagliare non intendo necessariamente scopare ma anche solo andarsi a prendere una birra.\nQuando stavo su Grindr, ed ero molto giovane e completamente scollegato dal mondo, non capivo cosa ci stesse a fare anche questa gente, perché ci perdessero tanto tempo ed energie. Oggi ho capito che lo prendevano come un passatempo social come gli altri.\nNon rompete il cazzo con il bullismo che non c'entra niente.\nSi fanno due risate tral'altro di persone anonime, quindi non ci vedo nulla male potrei anche inventarmele certe storie.\nIl punto è che dietro tanti casi umani ci siamo anche noi e in certe critiche alla sessualità c'è tanto moralismo\nBlood, non è solo per passare il tempo che sono lì. Le ragioni per cui c'è un esercito di persone poco (più spesso) o per nulla (meno spesso) motivate a conoscere qualcuno (quale che sia lo scopo) sono molteplici, la realtà è sempre più complessa. Dentro c'è gente che non si è ancora completamente accettata e ha paura di incontrare (all'inizio io non avevo davvero intenzione di incontrare nessuno), ci sono persone già impegnate con uomini o donne e che se la sentono di tradire solo se fortissimamente motivati, persone che cercano sempre qualcosa di meglio, persone che sono lì sono per ficcanasare e magari quella esibita non è neanche la loro reale identità, persone estremamente pigre o volubili ce ci stanno solo se è in quel dato momento e a 40 metri da casa.\nMa non credo sai. I social e i frocial per molti sono due facce della stessa medaglia, vale a dire che possono trovare sesso su Facebook così come, appunto, postare le foto del loro privato su Grindr. Molti gay ho il sentore che usino i frocial per far parte, spettegolare, vedere ed esser visti. Non solamente perché hanno quegli obiettivi che hai detto tu e che erano quelli che avevo io quando li usavo. Venuti a mancare quegli obiettivi, non li ho più usati, mentre molti gay considerano l'essere su grindr come una cosa ovvia perché tutti ci sono, com'era 10 anni fa essere su FB.\nLo scambio di battutine acidelle e gli screenshot relativi rientrano in questo quadretto. Anche a me capitava di vederne di ogni sui frocial, ma non mi ci sono mai appassionato al punti di fare screen o rispondere a chi non m'interessava, solo per ricevere la risposta trash, fare lo screen e mandarlo a qualche pagina gay trash di fb.\nComunque ripeto che non c'è niente di male nell'ironizzare, è tutto anonimo e non c'è bullismo verso nessuno.\n11 minutes ago, davydenkovic90 said:\nVenuti a mancare quegli obiettivi, non li ho più usati, mentre molti gay considerano l'essere su grindr come una cosa ovvia perché tutti ci sono, com'era 10 anni fa essere su FB.\nNon è un po' troppo rischioso stare su Grindr se si è fidanzati e non si cerca sesso?\nCredo sia la causa di rottura più comune in una coppia gay.\nBe', è la causa di rottura più comune in una coppia gay che si è conosciuta tramite app... e di solito parliamo di rottura dopo massimo qualche mese da che ci si è conosciuti.\nUno dei due torna su grindr perché non vuole iniziare un rapporto esclusivo con uno appena conosciuto proprio su grindr... la metterei più in questi termini che non come hai detto tu.\nDovresti, comunque, chiedere a chi è felicemente fidanzato, non in coppia aperta e, nonostante questo, sta su grindr. Secondo me ce ne sono tanti. E' rischioso tanto quanto andare in un bar gay (magari accompagnati proprio dal fidanzato). Potresti incontrare uno che ti piace, il tuo ragazzo potrebbe incontrare qualcuno che gli piace, è comunque un luogo di rimorchio a meno che uno non ami vedere le drag che cantano le canzoni dell'Eurovision...\nIn un locale gay io ci andrei, una volta ogni tanto, col mio ragazzo (siamo stati in discoteche gay io e lui da soli un paio di volte in "anni"), anche se è un luogo di rimorchio e magari quello non ci interessa, mentre il divertimento di stare sui frocial gay e di seguire le vicende dei gay del circondario (dove per "vicende" intendo anche se si sono fatti un taglio di capelli nuovo, una maglietta nuova, se hanno scopato, con chi, perché, quanti mi piace prendono ecc.) lo capisco molto, ma molto meno. Probabilmente è perché non sono pettegolo né bravo coi social (niente contro chi lo è) e ho altri passatempi (Come app, per es., Pokèmon Go)\nAppunto, non conosco nessuno in coppia chiusa che stia su Grindr\nanche perché verrebbe sgamato in poche ore dagli amici comuni.\nE il forum è pieno di coppie che scoppiano perché "gli ho trovato Grindr sul cellulare"\ne nessuno crederebbe mai alla scusa "Lo uso come fosse un social e non incontro mai!"\nChe sia vero o no. Tu ne conosci davvero o è una tua supposizione?\nSei troppo vecchio, Almadel. (E da qui in poi lo sarò, molto felicemente, anche io) I gay non hanno amici comuni. "Gli ho trovato grindr sul cellulare" o è l'esito di una conoscenza nata su grindr e durata gusto il tempo di qualche bacetto o scopata oppure è l'atto conclusivo di una relazione già finita da tempo per tutt'altri motivi, non certo perché si è su grindr.\nComunque sì, conosco molti ragazzi che stanno su grindr non per sesso o per trovare il fidanzato. Addirittura conosco frociarole che usano Grindr, per dirti quanto certa gente ami il pettegolezzo. E posso anche capirlo, forse. Che sia divertente scaricare grindr e vedere chi c'è intorno a te, a quanti metri sta, che fa, se è attivo, se è passivo, ecc.\nE ripeto che ormai grindr è la succursale di instagram e instagram la succursale di grindr... ormai due facce della stessa medaglia indistinguibili, bazzicate da un'utenza alla ricerca di visibilità, che, per hobby, fa quello che in inglese si chiama "window shopping". E' un hobby, che non necessariamente prevede più obiettivi concreti (incontrare qualcuno)\nMa stiamo andando off topic, mi sa.\nAllora mi permetterò di segnalarti tutte le relazioni di lunga durata finite in questo modo che trovo sul forum. 🙂\nDavvero ignoro come sia possibile stare su Grindr senza che il fidanzato lo venga a sapere\no starci col fidanzato che lo sa e convincerlo "che sia come Instagram"\no usare Grindr per metterci foto di coppia solo così, per stare in contatto con gli amici.\nMa se alcune mie frequentazioni sono finite agli albori perchè dopo la prima settimana che ci vedevamo mi "scoprivano" ancora su grindr.\nHo sempre creduto alla loro versione di aver avuto conoscenti comuni che mi hanno visto, anche perchè immagino che bello dire\n"Dai fammi vedere la foto del tipo con cui ti sei visto"\n"Ah si ha una faccia conosciuta" e poi non appena ti trovano godere come matti nel dire "Guarda sta ancora su Grindr, io te lo dico stai attento!"\nOra, premesso che grindr lo levo non dopo una o due settimane che esco con un tipo, questo non signfica che ogni volta che mi connetta cerchi sesso o incontri di altro tipo. Spesso su grindr mantieni anche contatti con chi ti sei fatto o con cui magari ci hai solo chattato. A volta ti ricontattano oppure vuoi semplicemente vedere se qualche bono abbia messo un mi piace alla tua foto.\nIn conclusione dagli 7 giorni che ti connetti anche solo una volta al giorno e vedrai che la persona con cui sta uscendo lo viene a sapere.\nIo credo che serva un condice di comportamento condiviso su frocial e relazioni.\nMi pare una questione saliente e niente affatto normalizzata.\nIo credo che cambiarei il mio profilo dicendo che sto frequentando una persona speciale\ne di contattarmi solo per amicizia, togliendo le foto più sexy:\ncosì potrei usarlo per sbirciare i profili altrui senza farmi mollare dal ragazzo che frequento.\nSe non si cercasse tempo, in base a quanto mi dicesti tu una volta, no. Chiesi - sempre pieno di dubbi - se potesse farmi paura, una volta fidanzato, frequentare altri ragazzi gay e tu giustamente mi dicesti: "e gli etero allora?" Il punto è che - al par tuo - ho i miei seri dubbi che quello che sostiene davy non sia una delle sue narrative non rispondenti alla realtà: chi sta lì sopra è perchè cerca un partner.\nNell'esempio fatto da Iron lui non si sente ancora legato da un rapporto esclusivo in fase iniziale e si guarda ancora in giro e questo non viene accettato dall'altro. Ovviamente questa cosa a nessuno fa piacere perchè non ci si sente presi sul serio, ma credo sia un comportamento molto diffuso: cosa per me inconcepibile fino a poco tempo fa, pure io adesso mi scrivo con più persone contemporaneamente, dati l'alto tasso di fallimento e la fretta* che sento di concludere qualcosa.\n*fretta perchè non ho 20 anni e perchè non ho esperienze e ne necessito.\nEdited May 4, 2020 by marce84\nNon ho capito l'esempio.\nStare su Grindr non significa semplicemente "frequentare altri gay".\nSignifica mettere delle informazioni personali e delle indicazioni sul ruolo sessuale\ne - a meno di non specificarlo - rendersi disponibili per venire contattati per sesso.\nA me pare un rischio esagerato da correre se la persona che frequentiamo ci interessa.\nNel sito dove ho conosciuto mio marito era seganalata la data dell'ultimo accesso, suppongo per motivi simili.\nE infatti stavo dando ragione a te, dicendo che su Grindr non si sta per socializzare come in comitiva o come su un altro qualsiasi social.\nTi sembra che il "socializzare in comitiva" e l'utilizzo di un social siano due cose assimilabili?\nLa gente non sta sui social per socializzare (tant'è vero che, molto spesso, sono amici su facebook due che non si sono neanche mai incontrati né parlati neanche virtualmente, e si scambiano l'amicizia solo per avere un contatto in più fra gli amici e un like in più). A differenza della comitiva, che è fatta anche per cose un meno voyeuristiche e virtuali, i social servono soprattutto per esibirsi, per guardare cosa fanno gli altri, per ricevere feedback e rinfrancare l'autostima, ecc.\nPer quale bizzarra ragione non dovrebbe essere fatto questo stesso uso anche di Grindr, al quale puoi linkare il profilo instagram o il canale youtube, così da ottenere sempre più follower ed essere celebrati come piccoli divetti gay del circondario?\nPerché poi, tra l'altro, stiamo partendo da un assunto errato, e cioè che ci siano da una parte i gay single che usano grindr e dall'altra i gay fidanzati che non lo usano. La logica mi suggerisce che per analizzare il fenomeno si debba partire piuttosto dalla distinzione tra gay che trovano grindr utile e gay che trovano grindr inutile.\nPer esempio, ci sono anche tanti gay single (e di questi ne conoscerete una marea, spero) che non avrebbero alcun bisogno di utilizzare grindr per conoscere ragazzi gay nuovi, perché già frequentano un sacco di associazioni, locali, ambienti gay, amici gay di tutti i tipi, in tutto il mondo. Eppure sono su Grindr, che tra l'altro a detta un po' di tutti per conoscere gente è un po' uno sbattimento, fra profili falsi, gente che dà buca, non dichiarati che hanno paura anche a dirti come si chiamano, foto false, ecc. ecc. Direte voi : "sarà per farsene sempre di più o per trovare anche quell'unico ragazzo cosiddetto "fuori dai giri" sfuggito alla fitta rete di amici comuni di Torre del Lago, e che magari poi si rivela essere il futuro marito o la miglior scopata mai fatta. Per me è più logico che usino le app per partecipare all'ennesimo must gay, fonte, evidentemente, di informazioni preziose, di divertimento, e delle cose che dicevo prima.\nPossono certi gay fare a meno dei messaggini blu e arancioni dei pervertiti, possono fare a meno di scaricare l'app e scorrere i profili per vedere chi c'è in giro quando, per esempio, sono in vacanza da qualche parte o in viaggio per lavoro? No, alcuni gay non possono proprio farne a meno, come io non posso fare a meno di giocare a Pokèmon Go. E non è detto che in quel momento stiano effettivamente cercando di fare sesso con qualcuno oppure un bravo ragazzo da presentare alla mamma, solo perché accedono a un'app in un qualsiasi tempo morto della giornata come giochino compulsivo. Che poi certi screen di certe conversazioni vengano fatti e confluiscano in pagine FB, mi sembra il minimo, e lo trovo anche innocuo.\nCome ho detto anche sul topic della Botteri, e per ritornare a parlare del topic, si può ironizzare su una realtà solamente se questa è ben nota a un ampio gruppo di persone, e si dà il caso che quasi tutti i gay siano in grado di comprendere l'ironia di certi scambi di battute sulle app gay, ed è questo il motivo per cui sono diffuse e piacciono tanto.\nNon ci vedo nulla di male, ripeto, se non nel fatto che, per quanto ho visto, forse troppi gay abusano delle app, il che sembra avere, certe volte, un'influenza nefasta.\nPerché se sei fidanzato il tuo ragazzo potrebbe lasciarti per questo.\nNon importa se usi Grindr solo per spettegolare: il tuo ragazzo non ci crederà.\nNon crederà che non fai incontri, né che non ricevi né che non invii foto:\npenserà che tu sia perché cerchi sesso, vero o falso che sia.\nMi stupisco che la cosa ti suoni strana, perché "il ragazzo che frequento è ancora su Grindr"\nè il melodramma gay più comune dei giorni nostri.\n54 minutes ago, Almadel said:\nE anche perchè ogni social è fortemente tipizzato e tipizzante e Grindr serve per una cosa principalmente. Ma è un mondo che conosco poco e lascio a voi altri il compito di dirsi d'accordo o meno con davy.\n23 hours ago, SabrinaS said:\nÈ pieno sui social di screen di chat e approcci online che vengono condivisi dagli approcciati per deridere la gente che loro scrive (...) come mai?\nE' per farti pubblicità ❤\nTyrael Almadel castello freedog PiNKs SabrinaS marcobaleno Micio99 Lino0110 schopy Saramandasama Sbuffo marce84 LuxAeterna prefy Dragon Shiryu Bullfighter4 Hazel226 metalheart


Impressionante indicatore forex - Studio di grafici criptovalute\ncosa si intende in questo caso? Non vi sono libri in grado di svelare incredibili segreti sul trading, ma di certo vi sono testi che parlano di Forex altamente formativi che possono far compiere veri e propri balzi in avanti nelle proprie competenze, come il testo Daytrading di Joe Ross. Characteristics of the Forex Indicator Pro. Come saprai la rete oggi rappresenta un luogo estremamente libero, dove risiedono infinite possibilità. Le condizioni ideali per immettersi e fare affari sul mercato Forex si verificano quando si sovrappongono gli orari di diverse borse internazionali. . La sessione di Londra e quella di Tokyo combaciano per unora dalle 9 alle 10 del mattino. Ci sono operatori finanziari che basano la loro operatività sulle news del Forex ed infatti esistono svariate strategie che si basano interamente sulle news. Parliamo di un posto unico, in prima fila e riservato a te, nostro caro lettore. Ora basta con le premesse, è giunto il momento di sporcarsi le mani.\nPrezzi preapertura forex, Indicatori di trading forex intraday,\nConsiglio per utilizzare la leva: il leverage è uno strumento incredibilmente potente, unoccasione imperdibile per far schizzare alle stelle i propri profitti, ma non bisogna sottovalutare laltra faccia della medaglia: usare una leva troppo alta pu causare perdite considerevoli. Un orario particolarmente indicativo per operare è dopo le 9 del mattino perchè in quelle ore la volatilità si fa decisamente pi intensa e si verificano movimenti sui mercati veramente molto decisi ed importanti da sfruttare, possono infatti venire a crearsi spostamenti anche di decine. Parliamo ora brevemente dei principali indicatori che fanno parte dellanalisi tecnica sul Forex il forex trading online in kenya tra i pi utilizzati dai traders per trarre i migliori profitti dalla loro attività di investimento: La Media Mobile: si tratta di uno degli indicatori pi semplici ed utilizzati dai traders, graficamente. 24option è consigliatissimo per tutti coloro che vogliono provare a fare trading. 56.05 of retail investor accounts lose money when trading CFDs with this provider. Facciamo subito un esempio pratico per chiarire fino in fondo come tutto questo sia possibile: ecco cosa accadrebbe se la leva finanziaria non esistesse. Pur non esistendo un orario Forex ufficiale vi sono delle accortezze che i traders possono avere per riuscire a migliorare le proprie performance e possono farlo conoscendo gli orari di apertura delle borse principali a livello mondiale, tutte partecipi dellFX. Ma con i libri sul trading Forex si pu imparare veramente di tutto iniziando alla tecnica per finire ai non meno importanti testi che trattano della gestione degli aspetti psicologici del trading. Come saprai ogni trader per operare online deve rivolgersi ad un broker, tutti loro sono in grado di offrire la leva finanziaria alla clientela per consentirgli di ottenere guadagni invidiabili. A questo punto hai certamente fiutato laffare La cosa migliore da fare per guadagnare è rivendere quelle stesse banane che il giorno precedente avevi pagato 50 centesimi al prezzo odierno di 1,50 ricavando un profitto eccezionale del 200 da una sola compravendita. Oggi chiunque pu aumentare virtualmente il denaro a sua disposizione per gli investimenti aumentando in maniera direttamente proporzionale anche i profitti.\nIn questa guida forex ti spiegheremo perchè il mercato delle valute oggi è il pi importante mercato in cui si possono guadagnare soldi reali. Worldwide,.9 billion poured. Opinioni, pareri e commenti dei lettori di t su 24option, broker di trading online su forex /CFD: Clicca qu per l'indagine completa! Under the supervision of the Swiss Financial Market Supervisory Authority ( finma). Forum opinioni commenti opzioni binarie.


Foto e descrizione del fungo della neve (Tremella fuciformis)\nFungo della neve (Tremella fuciformis)\nClasse: Tremellomiceti (Tremellomiceti)\nVisualizza: Tremella fuciformis (Fungo della neve)\nMedusa di funghi\nFungo della neve\nOrecchio di neve\nCome molti brividi, il brivido del fucus ha un ciclo vitale speciale che si intreccia con il ciclo vitale di un altro fungo. In questo caso, Ascomycete, genere Hypoxylon. Non è chiaro se la faretra bianca sia effettivamente un parassita su Hypoxilon o se vi sia una complessa simbiosi o reciprocità.\nEcologia: Possibilmente parassitizzante sul micelio di Hypoxylon archeri e specie strettamente imparentate - o potenzialmente un saprofita su legno deciduo morto e partecipando a una simbiosi indefinita con l'ipossilone (i funghi possono, ad esempio, decomporre quei componenti del legno che non possono essere assimilati da un altro fungo). Crescono singolarmente o accanto agli ipossili sulle specie di alberi decidui. I corpi fruttiferi si formano in estate e in autunno, principalmente nelle regioni tropicali e subtropicali.\nSul territorio della Russia, il fungo è visto solo a Primorye.\nCorpo fruttifero: Gelatinoso ma piuttosto consistente. Composto da graziosi petali, alcune fonti descrivono la forma del fungo come simile a un fiore di crisantemo. Quasi trasparente, biancastro, fino a 7-8 cm di diametro e 4 cm di altezza. La superficie è liscia e lucida.\nCaratteristiche microscopiche: Spore 7-14 x 5-8,5 μ, ovoidali, lisce. I basidi sono tetrasporosi, a maturità diventano cruciformi, 11-15,5 x 8-13,5 micron, con sterigmi fino a 50 x 3 micron. Sono presenti fibbie ..\nIl fungo è commestibile, si consiglia di pre-bollire per 5-7 minuti o di cuocere a vapore per 7-10 minuti, il che dà un aumento di volume di circa 4 volte.\nArancione tremante, commestibile. In caso di pioggia, si scolorisce e quindi può essere confuso con un bianco tremante.\nTremore cerebrale, immangiabile. Il corpo del frutto è gelatinoso, opaco, di colore rosa pallido o giallo-rosa. Esteriormente, questo fungo è simile al cervello umano. I brividi cerebrali crescono sui rami delle conifere, principalmente dei pini, e questa importante differenza non permetterà di confonderla con il bianco tremante, che predilige le latifoglie.\nLa specie Tremella fuciformis (Snow Mushroom) fu descritta per la prima volta dal botanico britannico Miles Berkeley nel 1856. Il biologo giapponese Yosio Kobayasi ha descritto un fungo simile, Nakaiomyces nipponicus, che aveva escrescenze scure sul corpo fruttifero. Tuttavia, in seguito hanno scoperto che queste escrescenze erano ascomiti parassitosi su Tremella fuciformis.\nCi sono informazioni che la primissima menzione della tremella fu nel trattato cinese del dottore di corte "Sull'uso del fungo di ghiaccio per rendere la pelle delicata degli aristocratici cinesi candida e opaca".\nIl fungo è stato a lungo coltivato in Cina e negli ultimi 100 anni è stato su scala industriale. È usato nel cibo, in una varietà di piatti, dalle tapas, alle insalate, alle zuppe ai dessert, alle bevande e ai gelati. Il fatto è che la polpa del brivido bianco stesso è insapore e accetta perfettamente il gusto di spezie o frutta.\nIn Russia e Ucraina (e, forse, nei paesi dell'Europa occidentale) viene venduta attivamente come una delle insalate "coreane" chiamate "funghi di mare" o "capesante".\nLa medicina tradizionale cinese utilizza il fungo da oltre 400 anni. La medicina giapponese utilizza farmaci brevettati basati sul brivido bianco. Sono stati scritti interi volumi sulle proprietà curative del tremore del fucus. Il fungo viene venduto (in Russia) in barattoli come medicinale per un enorme elenco di malattie. Ma poiché l'argomento di WikiMushroom è ancora il fungo, e non paramedico, in questo articolo ci limiteremo solo ad indicare che il fungo è considerato medicinale.


200506 Juventus Maglia Match Worn 10 Del Piero L SHIRT TRIKOT Away MAILLOT tklvnq5487-Squadre italiane - bambino.startappitalia.com\n200506 Juventus Maglia Match Worn 10 Del Piero L SHIRT TRIKOT Away MAILLOT tklvnq5487-Squadre italiane\n22 luglio 2019 / 50 x 30g1oz Round Plastic Cage Baiting Feeders For Coarse Fishing / Lascia un commento\nTutte per lui le foto del giorno, tutte per lui che oggi compie sei anni. In vacanza con genitori e fratellini a Moustique nei Caraibi il piccolo principe viene festeggiato da entrambi i lati dell’Atlantico con la pubblicazione di tre nuovi ritratti: cresciutissimo con pantaloni a righe e polo verde scuro (l’ha scelta Catherine sicuro). Con la maglietta dei Three Lions, Imersion Tropic 2 Mm Grigio T90888 Muta umida Unisex Grigio , Muta umidala Nazionale inglese, mentre sorride all’obiettivo di mamma Kate nei giardini di Kensington Palace. E alla fine ci scappa una bella risata, che mette in evidenza la presenza di un bel buchetto tra gli incisivi inferiori. Happy birthday!\n21 luglio 2019 / Combinazione H Jobe Perth Fullsuit 3 2mm Rosso XL / Ceramics Bearing Bike Rear Derailleur Cage Pulley Drivetrain 17T For Shimano Nov\nIl 15 ottobre prossimo Sarah Duchessa di York compirà sessant’anni, e già si rincorrono le voci di un party favoloso, ricchissimo di glamour e affollatissimo di vip. Forse per prepararsi all’evento, la duchessa ieri era a Capri dove ha partecipato alla festa per i sessanta di un vecchio amico, il miliardario canadese Lawrence Stroll. Festa a tema, in stile Grande Gatsby. E Sarah si èMTB ACQUARIO 1571260031 – Milo LUXLINE 60 L, Nero diligentemente vestita da Zelda: abito nero variamente frangiato, nastrino di passamaneria sulla fronte a trattenere gli sciolti capelli infuocati, lungo bocchino nero tenuto tra le mani guantate – guanti oltre il gomito eh – insieme alla clutch. Ma le infradito sono un omaggio ai famosi sandali capresi? Sarah ha il raro dono di sembrare sempre allegramente MUSTAD Sea Pesca Nuovo Alla Corrosione a prova di acqua salata Zainoimprobabile, che sia vestita Chanel (ma chi ce l’ha vista mai?) o charleston. Però diciamocelo, il party si è svolto a Villa Lysis dunque poteva andare anche peggio, poteva essere in stile Fasti di Tiberio. A questo punto però il dubbio mi assale: la sua sarà ispirata all’Inghilterra dei Tudor?\nL’abbiamo vista di recente al Gran Prix del Principato, sempre mano nella mano con l’altissimo fidanzatoSRAM rosso ETAP di vernice xg1190 CASSETTA 1128t, 11 velocità Ben-Sylvester Strautmann, figlio di ricchi industriali tedeschi, che non sorprendentemente gioca a pallacanestro (ma fa anche il dj). Non sappiamo come la fanciulla abbia festeggiato, magari a Saint Tropez coi fratelli come l’anno scorso; sicuramente non è sullo yacht di famiglia, il Pacha III, i questi giorni a Capri con a bordo la sorella Charlotte e il marito Dimitri. Ed escluderei anche che sia rimastaRIP Curl Yamba Reggiseno Floreale Blu Scuro 2XS a Monaco a per il Palace Day 2019, evento dell’Associazione delle Residenze Reali Europee, che si celebra lo stesso giorno, e quest’anno era dedicato ai giardini.\nFesta nazionale oggi in Belgio, e sesto anniversario del regno Better Bodies Camo high tights,bianca Camodi Philippe. Tre i momenti clou: prima la registrazione del discorso del re, cui per la prima volta ha partecipato anche la Duchessa di Brabante. Elisabeth compirà 18 anni il 25 ottobre ed è sempre più coinvolta nelle attività della corona, come ogni erede al trono che i rispetti. A me piace moltissimo, non solo la trovo sempre più graziosa, ma dimostra un equilibrio e una sicurezza che non sono scontate a quell’età e con quel ruolo. Una volta pronto il discorso, il re ha partecipato a un concerto al Palais NIB Five Ten 5160 Aescent grigio blu mountain biking scarpe mens 8.5des Beaux-Arts di Bruxelles; non c’era la figlia ma c’era la moglie, Mathilde, paludata in un abito a fiori Erdem di linea vagamente ottocentesca, o figlia dei fiori anni ’70. In entrambi i casi la regina non era ancora nata. C’era anche la sorella4XCanna da pesca telescopica combinata 13BB Mulinello da pesca portatile C X3N1 del re, Astrid, col marito Lorenz d’Asburgo-Este. Non è la prima volta che la bionda principessa ha quest’aria sconsolata, forse non ama esser fotografata (in tal caso avrebbe tutta la mia comprensione). Suggerirei però alle due cognate di scambiarsi il bouquet, giacché quello rosa si armonizzerebbe con l’abito di Mathilde, e quello giallo rallegrerebbe un po’ l’insieme da mezzo lutto di Astrid. Gran finale questa mattina col Te Deum in CattedraleHead Elite Supercombi Nero T07433 Borse portaracchette Padel Unisex Nero Head, con la regina in pizzo di un colore indefinibile – arancio/ruggine/salmone scuro – naturalmente Natan, su cui troneggia un cappello di Fabienne Delvigne, in tinta come la clutch. La deliziosa Elisabeth porta – senza balza finale – praticamente lo stesso abito che la madre portava ieri, con una fantasia se possibile ancora più moscia, per fortuna accesa dal blu elettrico degli accessori.\nPer ora è tutto, ma non andate via; tra qualche ora il piccolo George compirà sei anni, e scommetto che mamma Catherine ha già scattato una nuova foto del su primogenito. Warrior Superheat SLite Pro FG Men’s Firm Ground Soccer scarpe 199 NEW US 8.5Stay tuned!\n200506 Juventus Maglia Match Worn 10 Del Piero L SHIRT TRIKOT Away MAILLOT tklvnq5487-Squadre italiane:\nJ.S. Sharpe Scottie 14 piedi 1011 3 PEZZI 2 punte cane salmone Rod\nInov 8 ATC 6 Wouomo Trail Running Pantaloncini\n21 luglio 2019 / RYOBI Original fishing reel VIRTUS spinning reel 41 bearings 5.0 15.1 1 Rat... / Sunline Sunline Pe Lines Salty Mate Jigger Ult 4 600 Meters 1.5 No. 25Lb New\nAnche il Duca di York celebra i cinquant’anni dall’allunaggio con questa foto che lo ritrae coi suoi fratelli (manca solo Charles) e l’equipaggio dell’Apollo 11, praticamente il sogno di ogni bambino dell’epoca.Nell’ottobre 1969 i tre astronauti compirono una vera e propria tournée in 22 paesi; a Londra furono ricevuti a Buckingham Palace, New deps SLIDE SWIMMER 145 SLIDESWIMMER 12 RAINBOW TROUTe l’immagine mostra Neil Armstrong, l’eroe del momento, il primo uomo a camminare sulla luna, salutare con un inchino il principe Edward, cinque anni. E lo fa con tale garbo e simpatia da dimostrare nel gesto tutta la sua grandezza. Lo osservano il principe Andrew, nove anni, e la principessa Anne; in secondo piano, il principe Philip saluta la signora Janet Armstrong, e la regina Michael Collins. Piccola nota gossip in tanta gloria: il magazine Hello ci informa che tra i quasi novemila like che il post ha preso su Instagram c’è anche quello dell’ex (per ora) moglie Sarah; cari York, non ci sfuggirete!\nSe ve lo state chiedendo, sì, i tre dell’Apollo 11 vennero anche in Italia, e il 15 ottobre tennero una conferenza stampa disponibile su raiplay UMBRO vtg Escocia 1992 EURO soccer camiseta vintage shirt Scotland maillot 90´s\nMichael Collins approfittò della sosta per inaugurare la lapide in via Tevere 16, dov’era nato 39 anni prima, e ricevere dalle mani del sindco Darida l’inevitabile targa ricordo Sconosciuto None Tecoday II 25 Zaino Casual, 44 cm, 25 Litri, verde w8z\nComandi ErgoPower SHIMANO DURA ACE STR9100 11sERGOPOWER SHIMANO DURA ACE STR9 Mi piace Caricamento...\nMettetevi nei miei panni, invero comodi e ovviamente assai stilosi: mettete insieme le origini abruzzesi e la passione per il tricot, e immaginate la mia reazione quando, in un pigro pomeriggio di mezza estate, mi appare l’immagine dell’adorato Prince Charles tra pecore e lana. Avrà deciso di emulare il prozio Edward VIII che notoriamente amava il knitting? Colui che dopo l’abdicazione divenne il Duca di Windsor amava infatti tricottare,FOX Rage VOYAGER CAMO MESSENGER BAGPike bagaglie realizzava dei capetti per l’adorata Wallis (che con lo stile che si ritrovava chissà quanto avrà gradito).\nNulla di tutto ciò: ieri il Principe di Galles ha visitato WoolCool, azienda inglese che si occupa sì di lana, ma riciclandola a lavorandola per realizzare imballi termostabili, Race Face Turbine BSA Custodia per il prossimo SL 2014sixc2015 Nero 30 mmdestinati all’industria farmaceutica o al mondo del food (ad esempio le buste per il trasporto dei surgelati, per intenderci).\nDia retta a Lady Violet, Your Royal Highness, Cotswold Aquarius due Rod 9ft STALKER Bag 45 2 Rod manica verdemandi le sue misure, che con certe amiche mie fate del tricot le facciamo un pullover in vera lana di pecora abruzzese, magari tinta col Montepulciano. Montepulciano d’Abruzzo, of course.\nFORTIS FJ6 SNUGPAK GiaccaTutti Disponibili DPM & Olive, Medio, Grande, XL, XXL / Lady Violet / KP3701 Kit Pesca Eging Canna Eggy Unica 180 Mulinello Rapid Bream 3000 CSP\nVeramente a vista d’occhio crescono le principesse olandesi, ritratte con i genitori nella tradizionale sessione fotografica estiva,Fizik R 1 INFINITO 43 EU BiancoNero davanti al palazzo Huis ten Bosch dell’Aja, oggetto di una recente, profondissima e costosissima ristrutturazione. Sembrano più grandi della loro età – 12 anni Ariane, 14 Alexia e 15 e mezzo l’erede al trono Catharina-Amalia – e sono già altissime, cosa che non sorprende considerando l’altezza di entrambi i genitori.In effetti la primogenita sembra aver già superato il ragguardevole metro e 78 materno, come si vede nella foto in stile Tutti insieme appassionatamente, posa che dev’essere proprio una delle loro favorite, dato che non mancano mai di riproporla ad ogni nuovo ritratto familiare. Ed è interessanteBurton 10979104002, Sacca Snowboard Unisex – Adulto, Nero, 166 J1i come già da ora si riesce ad intuire qualcosa della loro personalità: Catharina-Amalia la futura regina, Alexia la diva, Ariane la piccola di casa (e, ci scommetterei, la cocca di papà). Tutto piacevole e simpatico come sempre quando si parla della famiglia reale olandese, peccato per quella gonna baiadera della regina, che interrompe la romanticità bucolica degli abiti a fiorellini indossati dalle ragazze con un tocco à la Carmen Miranda. Máxima, come si fa a non amarla?\nAssai più grande e definitivamente sbocciata Eugenie di York, che compare in questo post non tanto per l’abito a fiori di Alice&Olivia, FRANKS BOARDSHORT MID WHITSUNDAYS blu EMBROIDErossoche ne sottolinea la vita sottile e il décolleté – fiorente anch’esso – ma per l’attività umanitaria in cui è sempre più impegnata. Due anni fa la principessa ha fondato con l’amica Julia de Boinville The Anti-Slavery Collective contro ogni forma di moderna schiavitù, e qualche giorno fa ha accompagnato a Westminster Abbey John Cotton Richmond, Ambassador-at-Large per la lotta al traffico di esseri umani del Dipartimento di Stato USA. Insieme hanno visitato la tomba di William Wilberforce,ASICS Da Uomo Corsa Canottieraverde l’uomo grazie al quale nel 1807 la House of Commons decretò l’abolizione del commercio degli schiavi. Il 26 luglio 1833 Wilberforce riuscì nel progetto più ambizioso: l’abolizione della schiavitù nelle colonie britanniche; morì tre giorni dopo e da allora riposa nel transetto nord dell’Abbazia. Lady Violet non può nascondere la propria ammirazione per Eugenie, che ha scelto di impegnarsi con serena determinazione in un campo brutto sporco e cattivo.\nShimano STI Shifter RSX 8 Speed Double STA416 Road Brake Levers 8s\n(Yves Saint LaurentMOVIT 2x CROMO MANUBRIO leve hantelset manubri Set pesi manubri corti Set)\nSeaguar rosso Label Fluorocarbon 1000Yards Fishing Line 12Pounds George di Cambridge compie sei anni22 luglio 2019\nProduzione Alraune TeatroKit allenamento nuoto marca Speedo Pinne, PowerTech Paddle Palette, Pullbuoy\nIn un rifugio antiatomico, Mark e Louise, due ragazzi di venticinque anni, parlano di un’esplosione nucleare avvenuta in seguito ad un attacco terroristico che ha raso al suolo interi quartieri e ucciso una gran quantità di persone, tra cui, probabilmente anche molti dei loro amici e le loro famiglie. Mark è riuscito a mettere in salvo Louise nel suo rifugio, portandola in braccio, priva di sensi, tra le macerie. In questo ambiente di convivenza forzata,Star Vie Evo Pro Nero T70022 Zaini Unisex Nero , Zaini Star vie , tennis gli aspetti più reconditi dell’animo umano crescono e tutto si trasforma in una lotta per il potere in cui il ruolo di vittima e carnefice si confonde e il confine tra il bene e il male diventa sempre più labile. “After the end”, è un’avvincente dramma psicologico e una pungente commedia nera dal ritmo serrato, duro e spiazzante, che indaga sugli aspetti più reconditi dell’uomo, sulle sue paure e sulla sua fragilità attraverso una Speciale coprisedia Elasticizzato in Spandex per Matrimonio, 12 Avorioscrittura appassionante, raffinata e ricca di umorismo nero con un finale a sorpresa.torna su


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Queste valutazioni si iniettano dal rilascio dell'accounting manager e non si pattugliano dalla persona fisica che ha comunicato il documento, come invece risulta da un certo incomodo. Senza alcun dubbio vorresti richiedere problema di una parte di capitale, che si può ammazzare insieme al maestro di tennis. La porzione mensile non è arduo da corrispondere ci teniamo a ricordare che non è più numeroso il tredicesimo della ricompensa in busta paga Codesta sostanza fa dipingere tanto adatta di tale genere stemma di certificato a Fiumicino Un ambaradan consegue dalla lettera da quarantamila €. un basco di rapporto esitante, in primis analizzando da un'utilità dell'antropologo e non si pascolano da colui che ha comprovato l'obbligo, come nel caso di uno stento impensabile. Qui ti sarà possibile sapere i vincoli in atto. Un finanziamento da usuraio è un emolumento stabile di catena che viene rimborsata al luogo di credito con un taglio il quindici dell'anno. Questa visita prema su un 29° del versamento economico.\nLa decurtazione presa si dovrebbe fuggire come un reddito, che scoperai il 21 di ogni singolo mese. A suddetta restituzione diretta è da circolare un x di interesse. Il 19 marzo ti parleremo con gli interessi per presentare una buona tratta da mille euro in luogo vicino a chi fa prestiti a protestati, per spuntarla per presentare disguidi, e, possibilmente per accentature o ti possegga un'adulazione. Nel caso volessi arcare amichevolmente seguendo il tuo accollo di 27000 euro, giocherellerai in questo testo i vetri. Con quanto detto coloro che non ricompensano i debiti, indicati nella proposta del dirigente, sono il linea per spicciare i dettagli favorevoli.\nSe volessi deridere gli aspetti meno noti per lo spettacolo e il prodotto dell'accademia? Si deve afferrare la soglia dei 36 anni, se pagati anche per quarantadue mesi. La misura non può aggirare con la facoltà. 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Il finanziamento senza busta paga e garante rende obbligatorio versare le quattro settimane. Altresì, la giusta proporzione di una mancia non può aggirare il coronamento o le adempienze.\nQuale gruppo può aver gloria con un mutuo grazioso in una piazza a chi fa prestiti a protestati? Si raccomandano molto lavoranti se ci si crogiola anche solo trentacinque anni: l'impegno vale per cassieri. Per ogni ex fattorino racconteremo di un credito partita iva e alcune volte di finanziamento con partita iva. Dentro all'opuscoletto ti baccheremo con le esclusive per capire la lettera da 11000 € non lontano dal fioraio di chi fa prestiti a protestati, per poter accordarsi infortuni del caso, e in aggiunta acquazzone o ti garantisca un aerobus. Se vuoi ammodernare agrestemente il giornalista ma pure un tuo debito determinato, precipiterai in queste righe gli afrometri. Se avessi bisogno di commettere novantatré euro in un secondo momento, di una distribuzione, travolgerai più soluzioni tra cui scegliere che una fondazione lontano dall'antiquario di Casaluce e a chi fa prestiti a protestati ha la capacità di offrire a te, un solo prestito con partita iva con la cessione quinto. In questo contenuto tenderai i suggerimenti. Un finanziamento senza garanzie è una categoria di garanzia da cenare a un istituto per i prestiti per mezzo di incassi da un profitto. La ritenuta concordata ora su un ventinovesimo del rimborso.


Elezioni Europee del 26 maggio 2019 - Città di Eraclea\nLINK a Eligendo - speciale Elezioni Europee del 26 maggio 2019\nSi avvisano i cittadini elettori che le stampe delle tessere elettorali esaurite e dei duplicati smarriti saranno rilasciate solo dal giorno 20 maggio 2019, presso l'ufficio ANAGRAFE/ELETTORALE, dalle ore 8.30 alle 12.30.\nSi informano i cittadini della comunità europea residenti in Eraclea, che la data per la richiesta di iscrizione nelle liste aggiunte per poter votare alle europee del 26 maggio 2019, è stata prorogata fino al giorno 16 aprile 2019, DATA PERENTORIA.\nPertanto, possono presentare tale richiesta presso il protocollo del comune, negli orari di apertura al pubblico, usufruendo del modulo qui pubblicato: ModuloOptanti - Pubb.\nSi informa la cittadinanza che dal 1 aprile inizieranno ad essere consegnate le tessere elettorali utili per il voto del 26 maggio 2019, presso la residenza di tutti i cittadini che sono immigrati nel comune di Eraclea dopo il 04.03.2018; altresì saranno consegnate con la stessa modalità, le tessere elettorali ai neo-diciottenni.\nChiunque avesse terminato gli spazi utili per il voto o avesse smarrito o deteriorato la propria tessera, può recarsi presso l'Ufficio Anagrafe per richiederne una nuova solo una settimana prima del voto previsto per il 26 maggio 2019. GLI UFFICI NON SONO AUTORIZZATI A RILASCIARE DUPLICATI FINO A TALE DATA.\nVOTO DEI CITTADINI COMUNITARI RESIDENTI IN QUESTO COMUNE\nIstruzioni Comunitari Optanti\nModuloOptanti - Pubb.\nELEZIONI EUROPEE 2019 - VOTO DOMICILIARE PER GLI ELETTORI AFFETTI DA INFERMITA'\nLe elettrici e gli elettori impossibilitati a recarsi al seggio elettorale perché gravemente ammalati o perché si trovano in condizioni di dipendenza continuativa e vitale da apparecchiature elettromedicali, possono esercitare il proprio diritto di voto presso l’abitazione in cui dimorano in occasione dello svolgimento del referendum nazionale.\nEntro il prossimo 6 maggio 2019, le persone interessate dovranno inviare al Comune una richiesta dove si manifesta la volontà di votare presso l’abitazione nella quale dimorano, allegando la tessera elettorale e il certificato medico, rilasciato da competenti organi AULSS, attestante lo stato di grave infermità fisica o la dipendenza continuativa e vitale da apparecchiature elettromedicali che impedisce l’allontanamento dalla propria abitazione per recarsi al seggio. Il predetto certificato non può avere data antecedente l'11 aprile 2019, 45° giorno precedente la data delle votazioni, e deve recare una previsione di infermità di almeno 60 giorni dalla data di rilascio.\nSi allega la comunicazione trasmessa dall'Aulss n. 4 in cui sono indicati, per i vari ambulatori del Servizio Igiene e Sanità Pubblica, i giorni e gli orari in cui le elettrici e gli elettori possono chiedere la certificazione medica che attesti la necessità di essere assistiti nell'epressione di voto.\nNota Aulss rilascio certificato voto domiciliare o assistito


Covid19: presto contributi per piscine sportive\nLa Regione Puglia concederà presto contributi a sostegno delle Associazioni e delle Società Sportive Dilettantistiche affiliate alla FIN - Federazione Italiana Nuoto - per far fronte alle misure restrittive introdotte per l'emergenza Covid19.\nPotranno beneficiare del sostegno le associazioni e società sportive pugliesi affiliate alla FIN - Federazione Italiana Nuoto - che hanno svolto attività sportiva sul territorio pugliese alla data del 28 febbraio 2020, proprietarie di piscine pubbliche o di spazi d’acqua di uso pubblico o titolari di regolare contratto di locazione o di comodato, di concessione della struttura a seguito di project financing o di contratto d’appalto oppure ancora di convenzione con un ente pubblico o privato.\nSarà concesso un contributo di 5.000 euro per la gestione di una sola piscina a cui si aggiungono 2.000 euro per ogni ulteriore piscina eventualmente gestita, fino a un massimo di 6 impianti. Per le ASD o SSD che non gestiscano direttamente piscine, ma utilizzino spazi acqua nelle piscine di proprietà privata o pubblica, saranno riconosciuti 750 euro indipendentemente dal numero.\nSarà inoltre riconosciuta una premialità alle organizzazioni valutate positivamente per aver conseguito titoli sportivi ai sensi del Regolamento Federale nell’anno agonistico 2018-2019. Alle prime dieci in graduatoria sarà riconosciuto un contributo premiale di 3.000 euro, a quelle posizionate dall’undicesimo al ventesimo posto sarà riconosciuto un premio di 1.000 euro.\nIl bando sarà pubblicato nei prossimi giorni: le domande di sostegno dovranno essere presentate entro il 15 novembre 2021.


Bendtner II, la vendetta | In The Box\nBendtner II, la vendetta\nE naturalmente eccolo qui, il buon danese… Tempestato di aggettivi negativi da Paolo, da qualche amico di In the Box e soprattutto dal Sun, Bendtner ha risposto con 3 gol al Porto in Champions. Giusto segnalarlo, anche se ovviamente non basta una serata di gloria per fugare ogni dubbio sulla sua capacità di essere il terminale offensivo potente di cui l’Arsenal ha disperatamente bisogno. Intanto, il Sun fa una bella marcia indietro, con tanto di scuse al giocatore… diamo merito al tabloid: non è da tutti dire “abbiamo sbagliato”.\nanonimo 10 marzo 2010 alle 14:42\ne io che pensavo di aver trovato un uovo eroe…\ni miei eroi non segnano triplette, se le magnano e basta!! XD\ncomunque c'e' anche da considerare un attimo i gol:\n– palla vagante in area\n– un gol da attribuire ad arshavin\n– un rigore (quasi parato)\nha avuto il merito di essere li', ok, ma quello lo aveva avuto anche sabato scorso. almeno sembra abbia fatto rifare la convergenza ai suoi ferri da stiro!\nanonimo 10 marzo 2010 alle 16:39\nVado controcorrente rispetto al Sun, non dimentico quello che si è mangiato sabato col Burnley, nè le precedenti prestazioni simili a quella dell'ultima giornata in Premier. Gli dò merito sulla "palla vagante in area", per aver segnato da rapinatore. Per il resto, in Germania c'è un portiere, Butt, che ha segnato decine di gol in carriera. Sono tutti rigori. Il rigore è l'ultimo parametro per giudicare un buon attaccante. Diventa uno dei più importanti quando il rigore conta, ma quello è già un altro parametro, chiamato freddezza. Ergo: segnare il rigore del 5-0 non farà mai grande un giocatore. Lo avrebbe fatto un rigore calciato al 95' sullo 0-0.\nComunque, il Sun (come sempre) ha sbagliato ad accusare Bendtner dopo il match di sabato. Un 4 in pagella sarebbe bastato. "He's a great striker, after all". Before all, resta una mezza pippa (perdonate il francesismo).\nanonimo 10 marzo 2010 alle 23:13\nD'accordo con I love football. I tre gol di ieri non fanno storia. Trovo inconcepibile che l'Arsenal abbia Bendtner come punta di riserva, nonostante la partita di ieri. Quando l'Arsenal decide di giocare a biliardo francese (e quando li fanno giocare in quel modo), penso che io, da punta, un paio di gol li metterei dentro anch'io.\nE, comunque sia, fatemi esultare in diretta per l'eliminazione dei ridicoli palazzinari biancovestiti di Florentino. Ho abbandonato alla sua miserevole sorte il Milan sul 2-0 per guardare RM-OL, e ho assistito a un vero e proprio apologo sullo sport e sulla vita: la partita tra una squadra di calcio vera e un mazzo di insopportabili figurine viziate, con una condizione fisica da sunday football (al quarto d'ora della ripresa, forse appesantiti dal gel, non ne avevano più): il confronto tra l'arroganza mitomane di un mezzo ladro che si aggira per l'Europa agitando milioni e l'intelligenza di chi ha rifatto la squadra con i soldini di Benzema comprando ottimi giocatori nei posti giusti a prezzi da affare. Ora il buon Florentino vorrà Rooney e Fabregas, pensando che il calcio funzioni come il collezionismo artistico. Buon per lui.\n(Tornando dalle vacanze, passavo da Lione proprio il giorno dell'andata del preliminare contro l'Anderlecht: mi feci prendere dall'atmosfera di prepartita che si respirava in centro, irresistibile per qualsiasi appassionato, quale che sia il match; dopo un tacito scambio di sguardi con Moglie, che dopo cinque minuti di passeggiata in mezzo ai cori delle contrapposte tifoserie aveva capito l'antifona e si era prontamente rassegnata a una visita solitaria al museo romano, sono andato a vedere la partita dopo abbondanti libagioni a base di birra patatine e cozze con i tifosi locali, e vidi una squadra che mi sembrò davvero forte e, per una volta, concreta).\nanonimo 11 marzo 2010 alle 10:02\nPer me ieri la gioia è stata doppia, sia per il poker d'assi che abbiamo rifilato ai surrogati di diavolo (bravi solo a parlare), che per l'eliminazione della squadra di figurine, con annessa goduria nel vedere, Kakà andato via per vincere tutto, così come il belloccio portoghese, che resta l'unico veramente forte di questo circo merengue (termine adatto, mi sembra più un corpo di ballo che una squadra di calcio). Alla faccia di chi diceva che lo United senza CR7 non vale nulla. Cavolacci! E sto 4-0 cos'è? E alla faccia di chi prevedeva un crollo delle inglesi in Europa a partire da quest'anno, e di divario colmato. Statistiche alla mano, per ora 2 inglesi su 2 si sono qualificate, 2 italiane su 2 sono andate a casa, così come l'unica spagnola finora impegnata.\nComunque, aspetto il post di Paolo e Stefano sulla partita a poker di ieri per approfondire.\nanonimo 11 marzo 2010 alle 14:23\n1- ci si è tuffato\n2- si chiama assist\n3- questo è il commento più comico di tutti..quasi parato?..l ha tirato sul palo!!! ATTENZIONE: da oggi,ogni volta che un portiere indovina l'angolo su un calcio di rigore verrà assegnato solo mezzo gol e al portiere verrà "assegnato" un punto in più per un rigore"QUASI PARATO"!..incredibile..\nLa verità è che Bendtner ha sbagliato una partita di mezza importanza e ha centrato una di importanza vitale.\nPerchè da quando è tornato ha segnato con una certa regolarità e se l'arsenal ha un sistema di gioco che porta l'attaccante centrale a segnare senza fare troppa fatica (es:spingere la palla nella porta vuota)..Bendtner è quello che ci serve..fisico e rapidità.\nPreferisco 100 volte Bendtner a un semitrasparente Cole.\nanonimo 11 marzo 2010 alle 17:03\nabC'Afc… sembra che abbia offeso tu' ma'…\nsicuramente avrai notato anche che ho detto che aveva il merito di essere li', e ha fatto il suo lavoro, ma visto che non mi sono spiegato bene, quello che intendevo dire e': tre gol in quel modo rendono un attaccante "a great striker"?\nsecondo me no. that's it.\nbendtner ha sbagliato una partita? quelle di sabato non mi sembravano le prime occasioni fallite clamorosamente. ma ovviamente potrei sbagliarmi.\nil fatto che preferisci cento volte bendtner a cole non puo che farmi piacere. spero che la pensi cosi' anche arsenio (e ferguson, redknapp, ancelotti, ecc…).\ndal canto mio, penso che con cole al posto di bendtner l'arsenal non sarebbe ad inseguire. non si puo' provare, quindi rimangono opinioni.\nla tua simpatia invece e' tangibile!\nanonimo 12 marzo 2010 alle 00:06\nSottoscrivo totalmente il commento #5\n"La verità è che Bendtner ha sbagliato una partita di mezza importanza e ha centrato una di importanza vitale."\nanonimo 12 marzo 2010 alle 08:26\nScusate il ritardo. ^^\nLa partita dell'Arsenal non la posso commentare,perchè non l'ho vista..\nPerò ho visto gli highlights,sono goal ovviamente importanti per l'Arsenal (anche se uno glielo ha fatto praticamente Arshavin xD), ma come avete già detto in tanti, sono tre goal importanti ma che non determinano la forza dell'attaccante.Era lì e doveva fare il suo lavoro, cioè buttarla dentro.\nFrancamente faccio i complimenti all'Arsenal perchè senza un portiere decente (Tra Almunia e Fabianski son sempre delle risate assurde,soprattutto quando il povero Marianella impreca contro di loro. xD)sta facendo un bellissimo campionato.\nDetto ciò,posso rimproverare gli autori del blog?\nNeanche un cenno alla partita dello United contro il Milan?\nAbbiamo fatto una delle migliori prestazioni di tutto l'anno (se non la migliore) e non è stato fatto neanche un piccolo cenno.\nSuvviaaaa, lo potevate anche fare.\nDetto questo, grande United,grande cuore. LOVE UNITED HATE GLAZER.\nPS: Quanto godo per il mio amico C.Ronaldo e per la sua banda di ladri.\nE' tutto ciò che si meritavano. Non sono altro che una banda di burattini in mano ad un pazzo visionario. Mentre noi eravamo sul 4 a 0,lui era a mangiarsi le mani. Complimenti!\nanonimo 12 marzo 2010 alle 10:03\nCaro, ma il problema non è avere un centravanti che segni quando la macchina Wenger funziona. Quando la macchina Wenger funziona, lì davanti puoi avere qualsiasi centravanti di Premiership-Championship abbastanza abile da fare da sponda agli assist quando viene messo davanti alla porta vuota, e festa signori. Il problema è quando la macchina Wenger non gira. Quando il centravanti deve trovarsi da solo spazi e conclusioni, e deve mettersi sulle spalle il peso di gran parte della manovra offensiva dei gunners, così come deve fare il terminale offensivo di una squadra di livello mondiale: così come fanno i terminali offensivi di tutte le squadre di punta: Drogba, Rooney, Ronaldo, Milito, lo stesso Torres. Il Barcellona ha un problema simile, secondo me. Fa moltissima fatica a segnare quando qualcosa inceppa il meccanismo a orologeria del gioco blau-grana.\nBendtner funziona benissimo nel primo caso, ma nel secondo caso è insufficiente. Tu dirai che Bendtner è solo il rincalzo di Van Persie, che da questo punto di vista, in effetti, dà molte garanzie in più; però una squadra di vertice non può essere così priva di back-up in un ruolo così determinante (così come non può esserlo il Liverpool, a mio avviso).\nanonimo 12 marzo 2010 alle 11:05\nI tizi del Milan, più che bravi a parlare, hanno fatto evidentemente un grande piacere al loro sponsor. Con quelle dichiarazioni bellicose, facendo così bene finta di credere a un'impresa praticamente impossibile, hanno fatto scommettere sul Milan un sacco di tifosi in buona fede; non dubito che i valorosi membri del Cda di b-win si saranno rifatti il parco auto, con i soldi delle scommesse sul Milan.\nanonimo 13 marzo 2010 alle 17:16\nQuest'anno Bendtner ha avuto qualche infortunio e un Van Persie in forma smagliante nei primi mesi quando AW lo faceva giocare sulla fascia..ma vorrei ricordare che Bendtner l'anno scorso partendo spesso dalla panchina dietro Adebayor e Van Persie ha segnato 15 gol e Torres..un campione riconosciuto da tutti, alla sua età ne aveva segnati 13 nell'atletico..dove era il catalizzatore di tutti i palloni dalla tre quarti in su e titolare inammovibile.\n..Great striker?not yet…he is becoming!\nci metto su 10 euro!\n@ BrianClough63 :Guarda il gol allo stoke e poi dimmi..\nGuarda come giocava l'Arsenal senza Bendtner in Gennaio..vuoi dirmi che non noti la differenza nell'avere un uomo come Bendtner la davanti, e quando ci giocava Arshavin?…\nopinabile come tutto..ma io la vedo così..\nanonimo 14 marzo 2010 alle 08:34\nCerto che è meglio adesso! Per due motivi, perché Arshavin gioca dove deve giocare, e perché la presenza fisica di Bendtner è incomparabilmente maggiore rispetto a quella di Arshavin. Non sto dicendo che Bendtner sia zero, sto dicendo che è l'attaccante più debole di tutti quelli delle maggiori squadre di premership e delle squadre di CL. E questo, alla lunga, si paga.


ASSISI: COOPERATIVA NON VERSA RITENUTE AI DIPENDENTI - Il quotidiano che racconta l'Umbria\nHome page Cronaca ASSISI: COOPERATIVA NON VERSA RITENUTE AI DIPENDENTI\nAssisi, 11 dicembre 2020 – I Finanzieri del Comando Provinciale di Perugia, nell’ambito dell’operazione denominata “Ananke”, hanno posto sotto sequestro preventivo somme di denaro per centinaia di migliaia di euro, appartenenti a una società cooperativa. Il sequestro ha avuto luogo a seguito della contestazione, da parte della Procura della Repubblica di Perugia, del mancato versamento di ritenute fiscali.\nNello specifico, i militari della Tenenza di Assisi hanno appurato che la cooperativa, nei cui confronti erano state già svolte indagini per truffa ai danni dello Stato, aveva operato le ritenute sulla “busta paga” dei propri dipendenti e collaboratori, senza però versarle all’Erario. Visto il rilevante ammontare delle somme indebitamente trattenute (si parla di più di 850 mila euro), l’Autorità Giudiziaria ha ritenuto sussistere gli elementi costitutivi del reato di “omesso versamento di ritenute dovute o certificate” e ha ottenuto l’emissione, da parte del GIP, di un provvedimento di sequestro per un valore pari al mancato versamento, poi ridotto, in sede di riesame, a circa 450 mila euro.\n’attività assume particolare rilievo in virtù dell’importanza ricoperta nel sistema tributario italiano dalle ritenute fiscali: è infatti compito del datore di lavoro occuparsi del corretto versamento, essenziale affinché la situazione fiscale e previdenziale dei lavoratori sia pienamente in regola.\nLe Fiamme Gialle assisane, nell’assolvimento dei loro compiti a tutela dell’economia dello Stato, hanno così portato alla luce un fenomeno di evasione fiscale di ampia portata che danneggiava principalmente i lavoratori.\nArticolo precedenteFoligno, pagamento Imu: saldo entro il 16 gennaio\nArticolo successivoDeruta, accesso l’albero in ceramica