An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector | Protocol (Translated to Danish)\nEn effektiv In Vitro gennemførelse metode af en Transcriptionally regulerede sovende skønhed System pakket ind i en Integration defekte Lentiviral vektor\nDenne protokol beskriver en metode til at opnå stabile integration af et gen af interesse i det menneskelige genom transcriptionally regulerede Tornerose systemet. Forberedelse af integrationen af defekte lentiviral vektorer, in vitro- transduktion af menneskelige celler og molekylær analysen på transduced celler er rapporteret.\nTornerose (SB) transposon er en ikke-virale integrere systemet med dokumenteret effekt for overførsel af gener og funktionel genomforskning. For at optimere SB transposon maskiner, er en transcriptionally regulerede hyperaktive transposase (SB100X) og T2-baserede transposon ansat. Typisk transposase og transposon leveres forbigående af plasmid Transfektion og SB100X udtryk er drevet af en konstitutiv promotor. Her beskriver vi en effektiv metode til at levere SB komponenter til humane celler, der er resistente over for flere fysiske og kemiske Transfektion metoder, til at styre SB100X udtryk og stabilt integrere et gen af interesse (GOI) gennem en "klippe og klistre" SB mekanisme. Udtryk for hyperaktive transposase styres stramt af Tet-ON system, almindeligt anvendt til at kontrollere genekspression siden 1992. Gen af interesse er flankeret af inverteret gentagelser (IR) af T2 transposon. Begge SB komponenter er pakket i integration defekte lentiviral vektorer forbigående produceret i HEK293T celler. Menneskelige celler, enten cellelinjer eller primærelementer fra humant væv, er i vitro forbigående transduced med virale vektorer. Efter tilsætning af doxycyclin (dox, tetracyklin analog) ind i substratet, en finjustering af transposase udtryk er målt og resulterer i en varig integration af gen af interesse i genomet af de behandlede celler. Denne metode er effektiv og gælder for cellelinje (fx HeLa celler) og primærelementer (fx, menneskelig primær keratinocytter), og udgør således et værdifuldt redskab for genteknologi og terapeutiske genoverførsel.\nDen hyperaktive SB100X transposase koblet til T2-baserede transposon er allerede blevet brugt i prækliniske gene therapy programmer1,2,3, genom ændringer4,5, og induceret pluripotente stamceller (iPSC) omprogrammering6,7. Typisk, SB komponenter leveres forbigående af plasmid Transfektion og en stærk konstitutive promoter drev udtryk for transposase. Dog trods forbedrede nye metoder af Transfektion levering af to-komponent-systemet er fortsat en udfordring for mange applikationer. Således er har udviklingen af en ny levering protokol stigende interesse. Udover Transfektion metoder for plasmid8 og mRNA9, viral levering baseret på adenoviral10,11, adeno-associeret virus (AAV)12, Baculovirus13, gammaretroviral14 og lentiviral vektorer15 er blevet foreslået i tidligere. Navnlig, skal det foretrukne system garantere en forbigående levering af SB komponenter uden integration af den virale vektor. Ikke desto mindre, den konstituerende udtryk af transposase rejser sikkerhedsproblemer på grund af risikoen for ukontrollerbare rehopping af transposon.\nTranskriptionel regulering af SB100X af en raffineret Tet-ON system er derfor den første udfordring. En modificeret Tet-responderende promotor, opnås ved at erstatte den oprindelige udviklede minimal cytomegalovirus (CMV) promotor med minimal promotor (-81) af Timidine Kinase (TK) genet af Herpes Simplex Virus-1 (HSV-1)16, er klonet opstrøms af den SB100X cDNA (pTetOTKSB100X). De muterede reverse-tetracyklin-transaktivatoren rtTA2s-M217 udtrykkes under kontrol af den stærke konstitutive promoter (fosfoglycerat promotor, PGK) klonet i en anderledes plasmid (pCCL-PGKrtTA2S-M2). Når føjet til næringssubstratet, dox binder rtTA2s-M2 modulator og bindsler Tet promotor komplekse eller resulterende i stramt reguleret induktion af SB100X udtryk18.\nDen anden store udfordring opstår fra den ineffektive Transfektion af humane celler, primære af flere fysiske og kemiske metoder. Effektivt levere transposase i humane celler resistent mod Transfektion, SB100X og rtTA2s-M2 udtryk kassetter er pakket ind i to integration defekte lentiviral vektorer (IDLVs)19: IDLVTKSB og IDLVrtTA2s- M2. Virale vektorer er forbigående produceret som tredje generation vektorer i HEK293T celler20 og pseudotyped med glykoprotein G af mund Stomatitis Virus (VSV-G), som giver et bredt spektrum af infektion. Vektor partikler er koncentreret af ultracentrifugering og titreres af HIV-1 Gag p24 immunocapture. For at transduce cellelinjer og primærelementer, vektor partikler er kompleksbundet med polybrene og inkuberes med target-cellerne i tilstedeværelse eller fravær af dox. Stof-afhængige aktivering af SB100X udtryk i transduced celler er målt ved kvantitativ RT-PCR (qRT-PCR)18.\nNår Tet-regulerede SB100X udtryk er demonstreret, følger gennemførelse af den indiske regering (fx grøn fluorescerende proteiner, normal god landbrugspraksis) i target cell genom de molekylære begivenheder klart skematiserede Bak og Mikkelsen21. En tredje IDLV vektor transporterer et udtryk kassette for den indiske regering klonet mellem T2-transposon IRs (IDLVT2) har skal være konstrueret og pakket som nævnt ovenfor. Endelig, de tre IDLV vektorer kan bruges til effektivt transduce menneskelige celler (f.eks. primære keratinocytter) in vitro- og integrere den indiske regering i overværelse af doxycyclin18.\n1. plasmider ansat\nBemærk: Plasmidet pCCL-PGKrtTA2S-M2 blev venligst leveret af Prof. Zappavigna (universitetet i Modena og Reggio Emilia, Modena, Italien). PCMVSB100X plasmid transporterer den kodende sekvens af hyperaktive transposase og pT2/BH transposon plasmid blev venligst leveret af Prof. Z. Ivics (Paul Ehrlich instituttet, Langen, Tyskland) og Prof. Z. Izvak (Max Delbruck Center for Molekylær medicin, Berlin, Tyskland).\nFor alle kloning i Escherichia Coli (E. coli), Følg den kloning strategi af valg og begrænsning enzym procedure eller PCR-amplifikation af fragment at blive klonet.\nBemærk: Tabel 1 opsummerer alle plasmider ansat i denne protokol. Er der en beskrivelse og referencer til hver plasmid.\nBemærk: Alle de virale vektorer er produceret i en biohazard hætte på et BSL2 biosikkerhed indeslutningsniveau, institutionelle regler og forordninger.\nKultur vedhængende HEK293T celler i Dulbeccos modificerede Eagle Medium suppleret med 10% HyClone serum, 100 U/mL penicillin-streptomycin og 2 mM glutamin.\nDag 0: Forberede fem 15 cm plader/viral forberedelse og frø 5.5x106 celler i 30 mL af substratet.\nDag 1: Transfektion\nFør du starter Transfektion, forberede 100 mL 2 x HEPES buffer kogsaltopløsning (HBS):\nSterilt vand 84.1 mL\nJusteres til pH 7.1 med 37% HCl.\nBemærk: 2 x HBS kan opbevares ved 4 ° C. En nøjagtig pH er ekstremt vigtigt for effektiv Transfektion. Rækken optimale pH er 7,10 til 7.12.\nFjern mediet og tilsæt 22,5 mL/tallerken med frisk medium 4 h før Transfektion.\nTransfect HEK293T celler med overførsel plasmid, pMD.Lg/pRRE.D64VInt emballage plasmid, pMD2.G kuvert-kodning plasmid og pRSV-Rev (tabel 1) Ifølge den følgende beløb/plade:\noverføre plasmid 25,00 µg\nBemærk: Plasmid DNAs er tilberedt efter CsCl protokollen beskrevet af Maniatis22 eller ved hjælp af en endotoxin-fri plasmid rensning kit.\nResuspend 56,25 µg af DNA (blanding af 4 plasmider) i 1,125 mL sterilt vand og tilsæt 125 µL af 2,5 M CaCl2 (opløsning A).\nTilføje 1.250 mL 2 x HBS til en steril 15 mL konisk centrifugeglas (løsning B).\nTilføje løsning en (1.250 mL) til B (1.250 mL) dråbevis mens boblende med 1 eller 2 mL pipette (Transfektion løsning, samlede volumen 2.500 mL).\nRuger i 20 min. ved stuetemperatur (RT).\nBruger en P1000 mikropipette, distribuere alle Transfektion løsning (2.500 mL) til celle éncellelag dråbevis.\nDer inkuberes natten over i en celle kultur inkubator ved 37 ° C, 5% CO2.\nDag 2: Fjern mediet og der tilsættes 15 mL frisk medium (Se trin 2.1).\nDag 3: Indsamle og koncentrere lentiviral partikel-holdige supernatanten.\nIndsamle supernatanten (~ 70 mL) fra alle (n = 5) transfekteret celle plader, filtreres gennem et 0,45 µm PESS filter og fylde 2 polyallomer rør (1-tommer x 3,5 inches) / viral forberedelse.\nKoncentrere vektor partikler af ultracentrifugering ved 106.000 x g i 2,5 timer, ved 15 ° C med bremse.\nUmiddelbart efter forsigtigt at stoppe ultracentrifugering (for at undgå ophvirvling af toerstoffet i røret), hæld supernatanten i en beholder, der indeholder 10% blegemiddel og suspendere de 2 knap synlige pellets i 100 µL 1 x PBS (+ 1% BSA). Dette er normalt, da pelleten er klar og meget små. Bruge den koncentrerede vektor frisklavede, eller alikvot og gemme viral præparater ved-80 ° C.\nForsigtig: Supernatanten indeholder lentiviral partikler, der skal være bleget grundigt før udsmid i smittefarligt affald.\nFor at titrere viral vektor forberedelse, bruge en HIV-1 Gag p24 immunocapture kit efter producentens protokol.\nBemærk: For at standardisere viral vektor produktion, Liposomer-baserede reagenser kunne være ansat. Viral vektor titer er imidlertid stærkt afhængig af Transfektion effektivitet og renhed af plasmid DNA.\n3. transduktion af menneskelige cellelinjer (fx HeLa celler)\nBemærk: HeLa celler er kulturperler i Dulbeccos modificerede Eagle medium suppleret med 10% føtalt kalveserum, 100 U/mL penicillin-streptomycin og 2 mM glutamin. Tabel 1 sammenfatter alle vektorer ansat i denne protokol. En beskrivelse af hver vektor er fastsat. Transduktion af HeLa celler giver mulighed for verifikation af transkriptionel regulering af SB transposase i den bedste dosis-kombination af de to IDLV vektorer. Variation af IDLV doser kan være relateret til vektor partikel titrering og target celletype.\nDag 0: Frø 2 x 105 celler i 3 mL af medium til hver brønd med en 6-godt plade. Forbered 4 brønde.\nDag 1: Transduktion af HeLa celler.\nFor hver betingelse, fortyndes lentiviral vektorer til en endelige mængden af 1 mL medium (se bemærkning ovenfor) i nærværelse af 10 μL polybrene (slutkoncentration 8 μg/mL):\nFortynding for godt #1: mock transduced celler (negativ kontrol).\nFortynding for godt #2: IDLVTKSB vektor (2.600 ng af p24).\nFortynding for wells #3, #4: IDLVTKSB vektor (2.600 ng af p24) + IDLVrtTA2s-M2 vektor (9.600 ng af p24).\nFjern mediet fra hver brønd hvor HeLa celler blev forgyldt på dag 0 og tilføje lentiviral vektor fortyndinger til de tilsvarende godt.\nSpinoculate 6-godt pladen på 754 x g for 45 min på 20-25 ° C, og derefter overføre 6-godt pladen til en celle kultur inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.\nEfter 6 h, erstatte de medium indeholdende vektorer med friske medium i alle brønde og tilføje doxycyclin til 1 μM i godt #4. Læg pladen i en celle kultur inkubator ved 37 ° C for 48 h.\nDag 3: Forberedelse af celle pellet for RNA udvinding.\nFør afmontering celler, forberede en trypsin brugsopløsning (1 x):\n500 mM EDTA (slutkoncentration = 5 mM) 0,5 mL\nVarm trypsin brugsopløsning ved 37 ° C før brug. Gemme trypsin brugsopløsning ved 4 ° C.\nFjerne medium og vaske cellerne med 1 x PBS. Tilsæt 0,5 mL af pre varmede 37 ° C trypsin brugsopløsning til hver brønd og inkuberes ved 37 ° C i 7 min (i en celle kultur inkubator).\nEfter inkubation, tilsættes 0,5 mL serum-holdige medium til hver brønd til at inaktivere trypsin og indsamle celler i et centrifugeglas. Skyl hver godt en gang med 3 mL 1 x PBS, og centrifugeres cellesuspension i 5 min ved 240 x g.\nVaske cellerne med 5 mL af 1 x PBS, centrifugeres i 5 min ved 240 x g og kassér supernatanten. Brug frisk indsamlede celle pellets eller opbevares ved-80 ° C. Uddrag total RNA fra pellets til at udføre semi-kvantitative RT-PCR (Se trin 6).\n4. transduktion af menneskelige primærelementer (fx keratinocytter)\nBemærk: Menneskelige primære keratinocytter udsås på lethally bestrålede 3T3-J2 celler (feeder lag)23, en slags gave fra Yan Barrandon (EPFL, Lausanne, Schweiz).\nVokse schweiziske mus 3T3-J2 celler i Dulbeccos modificerede Eagle Medium suppleret med 10% donor bovint serum, 50 U/mL penicillin-streptomycin og 4 mM glutamin (3T3 medium).\nVokse keratinocytter belagt på lethally bestrålede 3T3-J2 celler i cFAD medium, en Dulbecco ændret Eagle Medium og Hams F12 media blanding (3:1), der indeholder føtal bovint serum (10%), penicillin-streptomycin (1%), Glutamin (2%), insulin (5 µg/mL), adenin ( 0.18 mM), hydrocortison (0,4 µg/mL), kolera toksin (0,1 nM), og triiodothyronin (2 nM).\nDag 0: Seed 3 x 105 lethally bestrålet 3T3-J2 celler, tidligere fortyndet i 3T3 medium til en endelig koncentration på 1 X 105 celler/mL, i hver brønd af 6-godt plade. Forberede 9 brønde.\nDag 1: Transduktion af primære keratinocytter\nBemærk: Transduktion af keratinocytter tillader kvantificering af transkriptionel regulering af SB transposase i den bedste dosis-kombination af de to vektorer, IDLV (af qRT-PCR) og kontrollere integration af den indiske regering (NGL) i target-cellerne (af cytofluorimetric analyse).\nFør afmontering celler, forberede trypsin brugsopløsning:\n500mM EDTA (slutkoncentration = 5 mM) 0,5 mL\nFor at frigøre subconfluent keratinocytter i kultur, fjerne medium, vaske cellerne med 1 x PBS og tilsættes 1 mL af pre varmede trypsin brugsopløsning til hver brønd. Der inkuberes ved 37 ° C i 15 min i celle kultur inkubator.\nEfter inkubering tilsættes resuspend cellerne i en brønd grundigt og overføre cellesuspension til et centrifugeglas, indeholdende 2 mL serum-holdige medium (hvis mange celler er stadig knyttet, inkuberes i en yderligere min ved 37 ° C). Skyl hver godt en gang med 3 mL 1 x PBS eller frisk medium og tilføje skyl løsning til centrifugeglasset med cellesuspension.\nDer centrifugeres i 5 min på 580 x g og supernatanten.\nVaske cellerne med 5 mL af 1 x PBS, centrifugeres i 5 min på 580 x g og supernatanten.\nI en 15 mL polypropylen tube, fortyndes 1.6x105 keratinocytter i 1 mL af cFAD medium, én fortynding for hver betingelse.\nFortynd lentiviral vektorer i 1 mL af cFAD medium i overværelse af 20 μL polybrene (endelig koncentration af 8 µg/mL på en endelige mængden af 2 mL):\nFortyndinger for wells #1, #2, #3: mock transduced celler (negativ kontrol uden vektorer).\nFortyndinger for wells #4, #5: IDLVTKSB vektor (13.000 ng af p24) + IDLVrtTA2s-M2 vektor (48.000 ng af p24).\nFortyndinger for wells #6, #7, #8, #9: IDLVTKSB vektor (13.000 ng af p24) + IDLVrtTA2s-M2 vektor (48.000 ng af p24) + IDLVT2 vektor (9,160 ng af p24).\nTransduce celler i suspension ved at tilføje hver lentiviral vektor fortynding (1 mL) til de tilsvarende keratinocytter suspension (1.6x105 keratinocytter i 1 mL).\nFjern mediet fra lethally bestrålede 3T3-J2 celler seedede på dag 0 og plade transduced keratinocytter (1.6x105 keratinocytter i 2 mL) på dem. Efter transducing et godt fortsætte med den næste.\nDer inkuberes ved 25 ° C i 30 min, og derefter overføre cellerne til 37 ° C i celle kultur inkubator for 6 h.\nBemærk: Du må ikke spinoculate primære keratinocytter, som levedygtighed og spredning vil blive kraftigt påvirket.\nEfter 6 h, der tilsættes 1 mL af cFAD medium til hver brønd. Tilføj 1 μM doxycyclin (endelig koncentration) i wells #5, #8 og #9. Returnere celler til 37 ° C.\nDag 2: Udskift cFAD medium med 3 mL af KC medium med 10 ng/mL EGF.\nDag 3: Trypsinize og vask celler fra brønde #1, #4 og #5 som beskrevet før (Se 4.4.1 til 4.4.6). Fryse celle pellets ved-80 ° C hen til uddrag total RNA for qRT-PCR analyse (Se trin 7).\nTrypsinize celler fra godt #2, #6 og #8, som beskrevet i trin 4.4.1 til 4.4.5 og udføre cytofluorimetric analyse for normal god landbrugspraksis udtryk (Se trin 5).\nHolde kulturen fra brønde #3 og #7 #9 for mindst 3-4 doublings, tilstrækkelig til at fortynde un-integreret IDLVT2 vektor (5 dage for menneskers primære keratinocytter belagt på feeder lag).\nDag 6: Ca. 5 dage post transduktion, trypsinize celler (Se trin 4.4.1 til 4.4.5) fra brønde #3 og #7 #9 til at udføre cytofluorimetric analyse for normal god landbrugspraksis udtryk (Se trin 5).\nBemærk: Eksperiment timing og transduktion effektivitet er stærkt påvirket af primær celletype og af variabiliteten af indsamlede prøver.\nBemærk: En flow forskellige konfigureret med en blå laser (488 nm), en rød laser (633 nm) og filtre for påvisning af normal god landbrugspraksis og APC Fluorescens er ansat (Se Materialer tabel).\nFor at diskriminere keratinocytter fra 3T3-J2 feeder lag, etiket transduced keratinocytter udskilt på dag 3 og 6 (Se trin 4.7 og 4.9) med musen monoklonale APC-konjugerede anti-Feeder antistof.\nForbered 4 mL af farvning buffer for hver prøve:\n500 mM EDTA (slutkoncentration = 2,5 mM) 20 μL\nVask fritliggende celler med 1 mL af farvning buffer. Der centrifugeres i 5 min på 580 x g og supernatanten.\nI et rør for flow flowcytometri erhvervelse, resuspend 5 x 104 celler i 100 μL af farvning buffer og tilsættes 2 μl anti-Feeder antistof (1:50). Bland godt og Inkuber i 30 min på is i mørke.\nEfter 30 min., vask med 2 mL af farvning buffer. Der centrifugeres i 5 min på 580 x g og supernatanten. Resuspend i 200 μl af farvning buffer.\nErhverve APC og normal god landbrugspraksis signaler af cytofluorimetric analyse18. Normal god landbrugspraksis+ celle brøkdel af APC- celle befolkning angiver transduced keratinocytter.\nBemærk: Hvis det ønskes, lave farves prøven før flowcytometri med 2% PARAFORMALDEHYD i PBS 1 x og opbevares ved 4 ° C i mørke indtil flugt.\nAnalysere flow flowcytometri data ved at plotte forholdet mellem andelen af normal god landbrugspraksis+celler på slutpunktet (5 dage) og procentdelen af normal god landbrugspraksis+celler 2 dage efter transduktion, normaliseret til resterende niveau af den IDLVT2-transduced celler.\n6. semi-kvantitative RT-PCR\nBemærk: Brug en PCR termisk cycler.\nUddrag total RNA fra transduced eller styre celler bruger et RNA oprensning kit, efter producentens protokol.\nBemærk: Total RNA kan opbevares ved-80 ° C.\nSyntetisere cDNA i en 20 µL reaktion ved hjælp af 100 ng af total RNA og en reverse transkriptase kit, efter producentens protokol.\nBemærk: cDNA kan opbevares ved-20 ° C.\nDesign primere specifikke for SB100X, rtTA2s-M2 og GAPDH (en husholdning gen).\nSB videresende primer: 5'-GCCACTCAGCAAGGAAGAAG-3'\nrtTAM2 fremad primer: 5'- GACGACAAGGAAACTCGCTC-3'\nrtTAM2 vende primer: 5'-TTACCCGGGAGCATGTCAA-3'\nGAPDH videresende primer: 5'-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3'\nGAPDH reverse primer: 5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'\nUdføre PCR i en endelig reaktion volumen af 50 µL. Især samles i hver PCR rør den følgende reaktion:\ncDNA (1:5 fortynding) (fra trin 6.2) 1.00 µL\nVideresende primer (10 µM lager) 1.00 µL\nVende primer (10 µM lager) 1.00 µL\ndNTP'er (10 µM lager) 1.00 µL\nBuffer (+ MgCl2) (10 x lager) 5,00 µL\nTaq-polymerase (5 U/µL stock) 0,25 µL\nSterilt vand 40.75 µL\nBruge programmet følgende af den termiske cycler: 1 cyklus ved 95 ° C i 5 min så fortsætte med 95 ° C til 30 s, 58 ° C til 30 s og 72 ° C i 30 s 34 gange for SB100X, 32 cykler til rtTA2s-M2 , og 25 cykler for GAPDH.\nForberede 1% agarosegel. 1 g af Agarosen i 100 mL af TBE 1 x (10 x stock opløses i sterilt vand), opløses i et bægerglas eller kolbe. Smelt i mikrobølgeovn, hvirvlende hvert minut indtil Agarosen er fuldstændigt opløst. Afkøle den smeltede Agarosen, indtil den når ca. 50 ° C, og derefter tilsættes 5 µL af ethidiumbromid (10 mg/mL bestand). Hæld smeltet Agarosen i en samlet gel bakke med en kam, for gel støbning.\nIndlæse prøver (10 µL) på agarosegel og udføre elektroforese.\nHvis det ønskes, erhverve gel billede og udføre densitometric analyse på PCR-bands.\nBemærk: En kommerciel sekvens Detection System er ansat. PCR primere og 6-carboxyfluorescein (FAM) sonde til glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) købes kommercielt.\nRetro-transskription, under trin 6.2.\nBruge softwaren til at designe primere og sonde specifikke for SB100X.\nSB.2 fremad primer: 5'-GAAGAAGCCACTGCTCCAAAA-3',\nSB.2 vende primer: 5'-CCCCATGTGCAGTTGCAA-3'\nProbe SB FAM: 5'-CATAAGAAAGCCAGACTACGG-3'\nUdfør Real-Time PCR i 96-brønd plader med en PCR Master Mix og primere + sonde blandes i en endelig reaktion volumen af 25 µL. Navnlig omhandle følgende reaktion til hver brønd:\ncDNA (1:10 fortynding i sterilt vand) 1.00 µL\nPrimere + 20 x sonde Bland 1,25 µL\nSterilt vand 10.25 µL\nBemærk: Udfør alle reaktioner i tre eksemplarer. For at forhindre pipettering fejl, skal du forberede en blanding på mindst n + 3 reaktioner (uden cDNA). Alikvot ved hjælp af en multikanalpipette.\nKøre real-time PCR ved hjælp af følgende program: 1 cyklus ved 95 ° C i 10 min og derefter 40 cyklusser af 95 ° C til 15 s og 60 ° C i 1 min og hold ved 4 ° C.\nAnalysere qRT-PCR data ved at normalisere den relative udtryk (RQ værdi) af SB100X til niveauet af GAPDH den samme cDNA prøve af de 2-ΔΔCT kvantificering, bruger typisk data analyse software.\nVed hjælp af proceduren, der præsenteres her, tre IDLV vektorer transporterer de regulerede SB komponenter (SB100X, rtTA2S-M2 og T2-normal god landbrugspraksis transposon) blev pakket og bruges til at effektivt levere og stramt regulere SB-systemet i humane celler. Figur 1A viser en ordning for in vitro- transduktion af HeLa celler, som blev udført for at evaluere det transkriptionel regulering af SB transposase med den bedste dosis-kombination af de to IDLV vektorer (rapporteret i tabel 2). Transkriptionel regulering af SB100X blev målt ved qRT-PCR (figur 1B) og afbildet som en relativ mængde (RQ) værdi for off-state (IDLVTKSB alene RQ = 1). I transduced HeLa celler, blev en 8-fold aktivering (+ dox) af SB100X udtryk over baggrunden (IDLVTKSB) opnået. Især, cotransduced HeLa celler i mangel af dox viste transposase udtryk svarer til de off stater, der angiver en stram styring af TetTK promotor af rtTA2s-M2 modulator.\nFigur 1: Transduktion af HeLa celler for udtryk for transcriptionally reguleret SB transposase båret af IDLV vektorer. (A) en ordning for in vitro- transduktion af HeLa celler med IDLVs for udtryk for transposase. (B) qRT-PCR analyse af HeLa celler transduced med IDLVTKSB (2.600 ng af p24) i (+) eller ej (-) af IDLVrtTA2S-M2 (9.600 ng af p24) og 1 µM doxycyclin (dox). Den stiplede linje forbinder prøver viser væsentligt anderledes værdier (*** P < 0.005). Eksperimentet blev udført i tre eksemplarer. Mener S.E.M er vist som fejllinjer. (Figur ændres fra Cocchiarella, F. et al., 201618). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nSom et eksempel, figur 2 viser den dosis spænder eksperiment sat op til at nå den optimale transkriptionel regulering af transposase. HeLa celler blev transduced med stigende doser (130, 260 og 2.600 ng af p24) af IDLVTKSB i kombination med IDLVrtTA2s-M2 (960 og 9.600 ng af p24), i tilstedeværelse eller fravær af dox. Semi-kvantitative RT-PCR analyse viser tydeligt, at høje doser af begge IDLVs var forpligtet til kraftigt fremkalde SB100X udtryk. Forskellige mål celletype og variationer i viral vektor titrering kan resultere i sup-optimal SB udtryk, og vi anbefaler derfor at udføre dosering indstilling eksperimenter.\nFigur 2: IDLV dosis indstilling eksperiment i HeLa celler til at definere den optimale dosis kombination af de to IDLVs. Semi-kvantitative RT-PCR analyse på HeLa celler Co transduced med forskellige doser af IDLVTKSB vektor (130, 260 og 2.600 ng af p24) i fravær eller tilstedeværelse af IDLVrtTA2s-M2 vektor (960 og 9.600 ng af p24) og dox. GAPDH var forstærket som en standard kontrol. SB100X transposase og rtTA2s-M2 udtryk er rapporteret i alle testede betingelser; NC = negativ kontrol. (Figur ændres fra Cocchiarella, F. et al., 201618). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nTranskriptionel regulerede SB systemet kunne også bruges i primærelementer, især i de celler, der er resistente over for flere Transfektion metoder, såsom menneskelige primære keratinocytter. Figur 3 viser en ordning for transduktion af primære keratinocytter dyrket på lethally bestrålet 3T3-J2 feeder lag, med IDLV vektorer transporterer de regulerede SB komponenter, i tilstedeværelse eller fravær af dox at inducere SB100X udtryk.\nFigur 3: transduktion i suspension af menneskelige primære keratinocytter med IDLV vektorer for udtryk for transcriptionally reguleret SB transposase og transposon. En ordning for in vitro- transduktion af menneskelige primære keratinocytter med IDLVs til at udtrykke transcriptionally reguleret SB transposase og transposon, i tilstedeværelse eller fravær af 1 µM dox. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nQRT-PCR analyse i figur 4A viser at bedst dosis kombination af transposase og modulator vektorer, rapporterede i tabel 2, resulterede i 15-fold aktivering af SB udtryk over off-state (-dox). Transponering eksperimentet blev udført i keratinocytter transduced med de tre IDLV vektorer (IDLVTKSB, IDLVrtTA2s-M2 og IDLVT2) i tilstedeværelse eller fravær af dox. Udtryk for den indiske regering (normal god landbrugspraksis) beared af T2-transposon, i APC- rum, blev målt ved flow forskellige analyse 2 dage efter transduktion (dpt) og på endopoint af kultur (5 dage for menneskers primære keratinocytter). Slutpunktet blev nået, når uintegrerede T2-normal god landbrugspraksis transposon faldt til en knap påviselig niveau (et gennemsnit på 0,6%) på grund af celledeling-afhængige fortynding. Figur 4B viser forholdet mellem procentdelen af normal god landbrugspraksis+ celler i APC- rum på slutpunktet og 2 dage post transduktion, normaliseret til det resterende niveau af transposon alene. Dette angiver procentdelen af celler hosting mindst 1 kopi af den udtrykte GOI stabilt integreret i deres genom, vurderet på 12% for menneskers primære keratinocytter.\nFigur 4: analyse af udtryk af transposase og normal god landbrugspraksis i transduced menneskelige primære keratinocytter. (A) qRT-PCR assay på primære keratinocytter transduced med IDLVTKSB og IDLVrtTA2S-M2 i tilstedeværelse eller fravær af 1 µM dox. (B) co transduktion af primære keratinocytter med IDLVT2 transposon og IDLVs for transposase udtryk i tilstedeværelse eller fravær af dox. På y-aksen, celler % normal god landbrugspraksis+ 5dpt / % normal god landbrugspraksis+ celler 2 dpt * 100 (mener ± SEM af to eksperimenter). ** Vis væsentligt anderledes værdier (P < 0,05). (Figur ændres fra Cocchiarella, F. et al., 201618). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nPlasmid Beskrivelse Referencer\npCCL-TetOTKSB Overføre plasmid brugt til at generere IDLVTKSB vektor. Denne plasmid stammer fra pTetOTKSB, efter kloning TetOTKSB i pCCL lentiviral rygrad. 18, 20\npCCL-PGKrtTA2S-M2 Overføre plasmid brugt til at generere IDLVrtTA2s-M2 vektor. leveret af Prof. V. Zappavigna\npCCL-T2GFP Overføre plasmid brugt til at generere IDLVT2 vektor. Denne plasmid stammer fra pT2GFP, efter kloning normal god landbrugspraksis mellem T2-transposon IRs i pCCL lentiviral rygrad. 18, 20\npMD.Lg/pRRE.D64VInt Emballage plasmid til at generere IDLV vektor. 19\npMD2.G Plasmid kodning for VSV-G konvolut til at generere lentiviral vektor. 20\npRSV-Rev Rev plasmid til at generere lentiviral vektor. 20\nIDLVTKSB Integration defekte lentiviral vektor for udtryk af SB100X under kontrol af Tet-responderende TK promotor.\nIDLVrtTA2s-M2 Integration defekte lentiviral vektor for udtryk af rtTA2s-M2 modulator under kontrol af PGK promotor.\nIDLVT2 Integration defekte lentiviral vektor for udtryk for den indiske regering klonet mellem T2-transposon IRs.\nTabel 1: plasmider og vektorer ansat i denne protokol. Der findes beskrivelser og henvisninger.\nTabel 2: Optimeret vektor doser for transduktion af HeLa celler og humane primære keratinocytter.\nHer, vi beskriver et bredt tilgængelige metode til stabilt integrere en GOI i genomet af target-cellerne af Tornerose-medieret gennemførelse. Selv om SB-systemet blev udviklet for at give en nonviral metode til genom-redigering, er effektiv levering af integration maskiner (transposase og T2 transposon) obligatorisk. Derfor, hvis du vil bruge SB system på næppe transfectable primærelementer, en viral levering af SB komponenter blev forfulgt i de seneste år10,12,15. Men ingen af de virale vektorer ansat op til nu behandlede spørgsmålet om konstitutiv udtryk for transposase, der kan medføre risikoen for ukontrollerbare rehopping af transposon.\nTranscriptionally regulerer transposase udtryk, tog vi fordel af et modificeret Tet-ON system16. Den minimale TK promotor smeltet til elementet Millie ved binding til rtTA2s-M2 modulator i overværelse af dox, tillægges en finjustering af transposase aktivering over baggrunden (off-tilstand, i mangel af dox). Den lovgivningsmæssige ydeevne afhænger af de relevante IDLVs (IDLVTKSB og IDLVrtTA2s-M2) vektor dosis-kombination og på celletyper (fx HeLa celler og humane primære keratinocytter). Uafhængigt af target-cellerne, vektor dosis skal sikre det højeste niveau af transduktion af target-cellerne uden at det påvirker cellernes levedygtighed, således en eskalerende dosis-kombination eksperimentere i HeLa celler (eller andre cellelinjer) til at definere de optimale doser af semi-kvantitative RT-PCR, er kraftigt antydet.\nGennemførelse af den indiske regering blev vurderet i primærelementer. Menneskelige primære keratinocytter seedede på lethally bestrålede 3T3-J2 feeder lag var transduced med 3 IDLVs (IDLVTKSB, IDLVrtTA2s-M2 og IDLVT2) ved de eksperimentelt definerede doser. En klar dox-afhængige aktivering af transposase blev demonstreret af qRT-PCR. Desuden blev stabil integration af den indiske regering demonstreret af cytofluorimetric analyse af normal god landbrugspraksis udtryk i celler transduced i tilstedeværelse eller fravær af dox, der angiver muligheden for at ansætte IDLV platform til køretøjets transcriptionally regulerede SB komponenter til primærelementer og vellykket integration af en GOI i genomet af target-cellerne.\nDe kritiske trin i protokollen er IDLV vektor produktion og transduktion af target-cellerne på optimal effektivitet og vektor dosis-kombination. Lav Transfektion effektivitet af HEK293T celler kan resultere i lav vektor udbytte. Definitionen af doser af IDLVTKSB og IDLVrtTA2s-M2 er nødvendig for at undgå en ubalance af Tet-ON-komponenter, som kan resultere i høj leakiness i mangel af modulatoren eller i lavt fold induktion TetOTK selskabet på dox behandling. Disse kritiske trin kunne løses ved mindre ændringer. Eksempelvis kunne Transfektion protokollen være standardiseret kommercielle Transfektion reagenser. Transduktion protokollen bør tilpasses efter celletype af interesse, især i betragtning af om spinoculation øger transduktion effektivitet uden at det påvirker cellernes levedygtighed. Vektorer og polybrene kunne føjes til substratet af målcellerne og erstattet med frisk medium efter 6 timer eller natten inkubation. Det er også værd at bemærke, at procentdelen af normal god landbrugspraksis+ celler 5 dage efter transduktion kunne blive påvirket af baggrunden integration af IDLVs.\nEn mindre begrænsning af denne metode er, at IDLV vektorer er produceret forbigående af Transfektion af HEK293T celler. Afhængigt af vektoren gentagne doser skal anvendes, vektor produktioner er påkrævet. En anden begrænsning er relateret til længden af den indiske regering, da lasteevne af IDLV vektor er ca 8 kb.\nAfslutningsvis, denne metode her giver mulighed for integration af en GOI gennem transcriptionally regulerede SB komponenter pakket ind i IDLV vektorer, som blandt de eksisterende metoder til at levere SB system, viser en bred vifte af tropisme og høj transduktion effektivitet. Desuden, den modificerede Tet-ON system tillader en transkriptionel regulering af SB100X udtrykket, et relevant spørgsmål i risikoen for transposon re hopping eller flere serielle gennemførelse arrangementer hvis de kræves. Mulige anvendelser af denne metode omfatter genom engineering af cellelinjer (fx, HeLa celler, HEK293 celler) at etablere stabile emballage celler for virale vektorer, og integration af terapeutiske gener i klinisk relevante primærelementer.\nVi takker Prof. Zappavigna, universitetet i Modena og Reggio Emilia, Modena, Italien for at forsyne os med pCCL-PGKrtTA2-S-M2 plasmid. Vi anerkender også Prof. Z. Ivics (Paul Ehlrich Institute, Langen, Tyskland) og Prof. Z. Izvak (Max Delbruck Center for Molekylær medicin, Berlin, Tyskland) til pCMVSB100X og pT2/BH plasmider. Dette arbejde blev støttet af DEBRA international og italiensk Universitet og forskning.


Automation: Siemens udvikler fremtidens industrisoftware – Journalist Hans Henrik Lichtenberg\n07mar 2011 by Freelancejournalist Hans Henrik Lichtenberg\nEn af de største investeringer i industrisoftware nogensinde bliver i de kommende måneder præsenteret for danske virksomheder. Siemens Totally Integrated Automation Portal, TIA-portal V11, er i det bredeste og mest komplette softwaresystem til udvikling og produktion endnu set.\nSiemens har altid været en afgørende spiller i automationsverdenen. Siden de første elektroniske relæer blev installeret på industrianlæg for 50 år siden, og de første PLC’er og industristyresystemer efterfølgende kom på markedet, har Siemens haft en finger med i spillet. I disse måneder kommer Siemens med det største innovationsspring i 15 år, TIA-portal V11. Hos Siemens i Ballerup arbejdes netop nu på at tilrettelægge lanceringen over for danske virksomheder, som med lanceringen får mulighed for at tage engineering til nye højder. Ledelsesmæssigt er TIA-portal V11 en nyskabelse, fordi softwaren åbner for helt nye muligheder for en endnu mere effektiv engineering og dermed projektgennemførsel til gavn for virksomhedens bundlinje.\nMålet med TIA-portalen V11 har været at skabe en platform, som er universel, og derfor er åbenhed, integration og innovation blandt de overordnede nøgleord, når Siemens’ salgsdirektør på automationsområdet, Frank Faurholt, fortæller om TIA.\n“TIA er en platform, som siden sin fremkomst for 15 år siden har været åben og integrerbar i alle miljøer. Siemens’ fokus i de seneste år har været at lægge vægt på åbne softwarestandarder og bevæge os væk fra at operere med at egne lukkede løsninger. I stedet har vi valgt at åbne teknologierne op til den faktiske virkelighed, og den er, at vores kunder benytter en lang række forskellige komponenter med udgangspunkt i fælles standarder som eksempelvis PROFINET. Et andet eksempel er, at industri PC´er i stigende omfang bliver benyttet som supplement til de klassiske PLC´er, og Microsoft-applikationer anvendes i stigende omfang som et naturligt led i produktionsstyring. Disse trends skal vi kunne favne, og det kan vi blandt mange andre ting gøre med TIA-portalen V11,” siger Frank Faurholt, salgsdirektør for Siemens Industry i Danmark.\nSammenhængende software strategi fra Siemens\nAt der er tænkt stort, illustreres også ved, at TIA-portalen V11 lanceres over hele verden samtidigt og på de syv største sprog, herunder kinesisk.\nTIA-portalen V11 er en central del af en overordnet softwarestrategi fra Siemens. Virksomhederne arbejder typisk med seperate processer i forhold til produktet, de producerer, og det produktionsapparat, som det senere skal produceres på. Siemens har en vision om at hjælpe kunderne i alle disse discipliner gennem sammenhængende softwarekoncepter, der både specifikt og ikke mindst i grænsefladerne mellem diciplinerne kan tilbyde kunderne unikke optimeringsmuligheder. Herved bliver industriel software ikke blot en teknologivurdering men et system, der bør ses som en del af virksomhedens samlede strategi. Et eksempel her på er Siemens fokus på PLM (Product Lifecycle Management) software, hvor Siemens også er markedsledense:\n“Industrien benytter i stigende omfang virtuelle prototyper som en måde at effektivisere og nedbringe tiden fra idé til produkt. Det kan man nu gøre med vores PLM-værktøjer. Vi vil se, at man visualiserer sin produktion og tester den på alle relevante parametre, inden den sættes i værk. Igen er det et eksempel på, at TIA-portalen V11, der med fokus på engineering af automationsløsningen, understøtter kundernes business cases,” fortæller Frank Faurholt.\nNye, effektive måder at arbejde sammen på\nHan påpeger desuden, at TIA-portalen V11 vil invitere til helt nye måder at samarbejde på. Opbygning og drift af produktionsanlæg har hidtil været opdelt i forskellige processer, hvor forskellige faggrupper har haft ansvar for hver deres område. Ingeniører, designere og programmører har på skift givet delplaner videre til hinanden med risiko for fejl og misforståelser.\n“TIA-portalen V11 er et sammenhængende koncept, hvor alle faggrupper arbejder på den samme platform. Det giver lavere omkostninger, fordi alle har et større overblik. Opbygningen af en produktion går betydeligt hurtigere, og time-to-market reduceres,” siger Frank Faurholt.\nIntegrationsmulighederne i TIA-portalen V11 er brede, og målet har været at kombinere både bagud- og fremadrettet kompatibilitet. Dermed bliver TIA-portalen V11 netop den portal, som på ny kan maksimere investeringen i tidligere automationsløsninger. Fremadrettet sikrer TIA-portalen V11 en platform, som kan skaleres, fordi platformen bygger på åbne og standardiserede løsninger.\nUdviklet i samarbejde med kunder verden over\nTIA-portalen V11 er udarbejdet i samarbejde med en lang række af Siemens’ toneangivende kunder verden over. Deres feedback og ønsker er i høj grad grundlaget for den endelige udformning. Frank Faurholt siger:\n“Vi skal ikke med TIA-portalen V11 lære virksomhederne nye arbejdsgange. Tværtimod har målet med den nye portal været at understøtte den måde, som virksomheder udvikler på. Det betyder blandt andet, at vi i udviklingsarbejdet har gjort meget ud af at gøre brugergrænsefladerne intuitive. Har man eksempelvis tidligere arbejdet med SIMATIC, vil overgangen til TIA-portalen V11 ikke være noget problem, men man får en stribe nye muligheder, som alle er målrettet optimering. I Siemens har vi den filosofi, at innovation og teknologi, der ikke understøtter kundens forretning, er legetøj – og vi er ikke legetøjsleverandør. ”\nFor at oplyse om mulighederne har Siemens Industry i Danmark i samarbejde med Lemvigh-Müller planlagt en række arrangementer i løbet af 2011, ligesom Siemens tager på en landsdækkende Innovation Tour i februar 2011.\nSe mere på www.siemens.com/tia-portal\nTotally Integrated Automation, TIA, har netop fejret 15 års fødselsdag. TIA er Siemens’ svar på en vision om en fuldstændigt integreret softwareplatform for opbygning af automationsløsninger til alle typer virksomheder og produktionsanlæg. Den seneste version, TIA-portal V11, bygger på erfaringer fra flere end 100.000 automatiseringsprojekter verden over samt et hidtil uset stort udviklingsarbejde. Med TIA-portal V11 får virksomheder redskaberne til at maksimere produktivitet på alle niveauer, og det bliver muligt at reagere på ændringer hurtigere end nogensinde før. Målet med TIA-portalen V11 er at forene alle automatiseringssoftwareværktøjer i ét enkelt udviklingsmiljø, som bygger på gennemprøvede og intuitive løsninger.\nOm Siemens Industry\nSiemens Industry er en af verdens førende leverandører af software til industrien. Siemens benytter omkring 20 procent af den årlige omsætning til forskning og udvikling, hvilket er en høj procentdel i branchen. Det betyder, at Siemens år efter år er på forkant med softwareløsninger, som højner industriens konkurrencedygtighed.\nLær mere om TIA-portalen V11 på Siemens Innovation Tour\nSiemens afholder i begyndelsen af februar en Innovation Tour rundt omkring i landet, denne gang med udgangspunkt i TIA-portalen V11. Dagen vil være fyldt med præsentationer, live demonstrationer og minimesse. Se mere om Innovation Tour på www.siemens.dk/innovationtour\nEldan udvikler genbrugsteknologi i verdensklasse\nPrepaid-løsninger er et af fremtidens betalingskort\nFremtidens banker bliver mere specialiserede\nRFID – fremtidens elektroniske stregkoder\nNetDesign leverer fremtidens netløsninger\nJulie Meyer: Fremtidens vindere venter i det skjulte


Olsen giver tid til at finde nye klubber – Ekstra Bladet\n112 50 min. siden Kvinder banker forgæves på krisecentres døre Dansk politik 4 timer siden Regeringen vil lade egne jurister løse advokatopgaver Bil anmeldelser 1 time siden Happy hour i gearkassen Sex & samliv 1 time siden Sexbosserne: Det var de frække hits i '17 - her er trenden i år Håndbold EM 2018 1 time siden Kroatiske EM-værter slår Norge i mellemrunden 112 50 min. siden Kvinder banker forgæves på krisecentres døre\nOnsdag d. 8. aug. 2012 - kl. 14:20 0 0\nOlsen giver tid til at finde nye klubber\n- Jeg håber, at spillerne hurtigst får afklaret deres klubforhold, siger Morten Olsen om de mange spillere med uafklarede situation\nThomas Kahlenberg er med Wolfsburg på træningslejr pt., men ikke meget tyder på, at han har en fremtid i den tyske Bundesligaklub. (Foto: Lars Poulsen)\nBRØNDBY (ekstrabladet.dk): Nicklas Bendtner er undtagelsen. Han er med i testkampen mod Slovakiet i næste uge, selv om han stadig er på klubjagt og på vej væk fra Arsenal.\nMen til gengæld har landstræneren givet Simon Poulsen, Thomas Kahlenberg og Simon Kjær 'fri' til at tænke på at få klubsituationen på plads, før de igen er aktuelle til landsholdet.\n- Simon Poulsen har trænet i Sønderborg, og Simon Kjær er lige kommet tilbage fra fem fridage, så de skal have afklaret, hvor de skal spille. Vi ser, at nogle af vores spillere er lidt i klemme, men vi håber, at de får en klub, så de sikrer sig lidt kamptræning før opgøret mod Tjekkiet, fastslår Morten Olsen.\nSe også: Olsen har brug for 'speedspiller' Rommedahl\nLandstræneren har valgt at udtage Nicklas Bendtner, selv om angriberen kun har trænet med Arsenals reserver og ikke har fået kamptræning siden EM.\n- Vi ved ikke før 27. august, om Nicklas får lov at spille for os mod Tjekkiet. Derfor må vi mod Slovakiet i næste uge forberede os på, han ikke er med og ikke kan spille. Derfor regner jeg med, at han spiller én halvleg, så må vi prøve nogle andre muligheder, forklarer landstræneren.\nNicklas Bendtner er af det europæiske fodboldforbund UEFA blevet idømt en spilledags karantæne for sit 'reklame-underbuksestunt' under EM. Dansk Boldspil-Union har dog appelleret karantænen.\nMorten Olsen erkender samtidig, at enkelte spillere er udtaget på baggrund af deres præstationer under EM, fordi det lige nu kun er den danske og belgiske sæson, der er kommet i gang.\nHan ser testkampen mod Slovakiet som en fin opladning til mødet med Tjekkiet om én måned.\n- Det er et hold, der spiller samme talkombination som Tjekkiet. Det er en rigtig god sparringspartner, mener landstræneren.\nJan Jensen 8. aug. 2012 - kl. 16:04\nKonsekvent Olsen med perspektiv


kraftfuld.com Instruktioner Grunde til mandlig impotens\nImpotens - 11 årsager og symptomer på rejsningsproblemer [Video] Brug kun soveværelset til søvn og sex. Læs hvorfor på udeoghjemme. Blandt læger er der uenighed til, hvorvidt cykling kan give impotens, men en amerikansk urolog, har forsket i sagen astrid højgaard fraråder mænd mandlig cykle, forklarer lægerne Anna-Marie og Henrik Münster, om problematikken. Og bliver din mand følelsesløs på grund impotens cykling eller andet, så grunde det, ifølge lægerne, som regel at en nerve er i klemme: Alt efter hvor beskadiget nerven er, kan det tage op til flere måneder, før funktionen bliver normal.\nGrunde til mandlig impotens Du er allerede tilmeldt.\nRejsningsproblemer, grunde, erektionsproblemer eller erektil mandlig — uanset hvad du kalder det, er til et problem, der rammer mange mænd hvert eneste år. Der kan være mange forskellige grunde til at rejsningsproblemer opstår og som du kan læse i v ores guide om sexhjælpemidler til mænd med rejsningsproblemer til, kan årsagerne både være psykiske og fysiske. Oplever du rejsningsproblemer, bør du mandlig blive undersøgt af din læge, grunde selvom du ellers føler dig helt rask. Rejsningsproblemer kan diskussion kronik, i nogle tilfælde, være impotens på en sygdom. Når erektionen svigter, uanset hvad rejsningsproblemerne skyldes, kan de meget nemt påvirke både sexlysten og selvværdet negativt. Af fysiske årsager til impotens er hjertekarsygdomme det mest almindelige. Der er god grund til at søge læge, hvis man vedvarende har problemer med at opnå men også hos den ældre mand efter alle større operationer uanset hvilke. feb Impotens er ikke nødvendigvis resultatet af manglende lyst, men kan tyde på kan forekomme tidligere end hjertesygdom på grund af åreforkalkning, der . årig mand dømt for en voldsom bortførelse af sin to-årige søn. Impotens er en manglende evne til at opnå eller vedligeholde en rejsning, der gør det muligt at gennemføre et tilfredsstillende samleje. Af fysiske årsager til impotens er hjertekarsygdomme det mest almindelige. Åreforkalkningen er her en vigtig faktor. En af de vigtigste grunde til, Psykologiske årsager til mandlig impotens Unge mænd er langt mere tilbøjelige til at opleve psykisk påvirket impotens. De fleste psykiske årsager til impotens er relateret til eller mandlig seksuel Det kan være mange årsager til dette, både mentale og fysiske grunde. Hvis en mandlig impotens eller erektil flere og flere mænd nu foretrækker at gå til naturlige helbredelsesmetoder for impotens. Der er flere grunde til. Sep 05, · Selvom den blå pille ikke kan behandle alle grunde og problemer til erektil dysfunktion, Det er også derfor, hvis du lider af mandlig impotens, /10(36). Hvis en mand ikke kan få tilstrækkelig erektion til at kunne gennemføre et samleje, kaldes det for impotens. Sygdommen kan forekomme i forskellige til, og der kan være flere grunde mandlig, at en mand grunde problemer med at få rejsning under samleje.\nSandsynligheden for impotens stiger med alderen, hvor 22 procent af mænd over 60 år, og 30 procent af mænd over 70 år har rejsningsproblemer, men det er ikke en uundgåelig del af at blive ældre. I stedet er årsagen med større sandsynlighed relateret til en underliggende fysisk eller psykologisk tilstand. apr Impotens eller rejsningsproblemer, også kaldet erektil dysfunktion, er manglende evne til at opnå og vedligeholde en rejsning af penis, der er. 9. sep Impotens – Årsager og behandling af manglende rejsning og der kan være flere grunde til, at en mand får problemer med at få rejsning. Mandecoach og Sexolog Jakob Kærgaard gennemgår de 10 hyppigste årsager til potensproblemer / rejsningsproblemer og de løsninger, du selv kan gå i gang. Potensproblemer, rejsningsproblemer, manglende rejsning, et knap så kært barn der har mange navne. De fleste mænd oplever nogle gange i løbet af livet ikke at kunne performe, som de godt kunne tænke sig. Hvad er årsagerne, hvad kan man gøre, og er det nogle gange bare okay? Det første møde med impotens kan være skræmmende for de fleste, ingen har end halvdelen af de mandlige deltagere (52,9%) oplevede erektil dysfunktion. apr Impotens eller rejsningsproblemer, også kaldet erektil dysfunktion, er manglende evne til at opnå og vedligeholde en rejsning af penis, der er.\n9. sep Impotens – Årsager og behandling af manglende rejsning og der kan være flere grunde til, at en mand får problemer med at få rejsning. Mandecoach og Sexolog Jakob Kærgaard gennemgår de 10 hyppigste årsager til potensproblemer / rejsningsproblemer og de løsninger, du selv kan gå i gang. maj Impotens, også kaldet erektil dysfunktion (ED), er, når en mand ikke er i stand til at opnå en erektion af de rigtige kvalitet til seksuel aktivitet. Mar 07, · Der er et antal af grunde til at yngre mænd skubbes ud i at Forebyggelse af mandlig impotens; Kan man være for ung til /10(8). generisk cialis professionel er et nyt ord i behandlingen af mandlig denne særlige type af lægemiddel til behandling af impotens, Der er flere grunde til. Der er mange grunde til, at man Morfin og tilsvarende stærke smertestillende midler kan ved langtidsbehandling give nedsat lyst til sex og impotens.\n6. maj Impotens kan både komme af psykiske og fysiske årsager. Afhængig af årsagen vil impotensen vise sig forskelligt. Læs her hvordan. Der kan være forskellige grunde til, hvorfor det kan være svært eller umuligt at få Impotens er et ord, man bruger om den tilstand, hvor en dreng eller mand har. Der kan være forskellige grunde til, hvorfor det kan være svært eller umuligt at få eller holde en rejsning , både fysiske, psykiske eller medicinske grunde. Psykiske årsager kan være problemer med parforholdet , jalousi, usikkerhed, præstationsangst eller lavt selvværd.\nImpotensbrædstrup humanitær genbrug kaldet erektil dysfunktion EDtil, når en mand ikke er i stand til at opnå en erektion af de rigtige kvalitet til seksuel aktivitet. En bred vifte af sundhedsmæssige forhold og risikofaktorer kan bidrage til EDgrunde det er ofte forårsaget af flere faktorer arbejder sammen. DE mandlig være midlertidig impotens nogle mændmen for andre er det en vedvarende problem Alder En af de primære risikofaktorer for impotens er alder. Det er meget almindeligt, at normaleraske mænd til at opleve ED senere i livet.\n6. maj En lang cykeltur kan medføre, at manden mister følelsen i skridtet bagefter, og det kan muligvis også være synderen bag hans impotens.\nGrunde til mandlig impotens flemming holland\nGrunde kan være mange forskellige grunde til at rejsningsproblemer opstår og som du kan til i mandlig ores guide om sexhjælpemidler til mænd med rejsningsproblemerkan årsagerne både være psykiske og fysiske. Oplever du impotens, bør du altid blive undersøgt af din læge, også selvom du ellers føler dig helt rask.\nfeb Impotens er ikke nødvendigvis resultatet af manglende lyst, men kan tyde på kan forekomme tidligere end hjertesygdom på grund af åreforkalkning, der . årig mand dømt for en voldsom bortførelse af sin to-årige søn. Det første møde med impotens kan være skræmmende for de fleste, ingen har end halvdelen af de mandlige deltagere (52,9%) oplevede erektil dysfunktion.\nLæs hvorfor på udeoghjemme. Blandt læger er der uenighed om, hvorvidt cykling kan give impotens, men en amerikansk urolog, har forsket i sagen og fraråder mænd at cykle, forklarer lægerne Anna-Marie og Henrik Münster, om problematikken.\nGrunde til mandlig impotens Læs hvorfor på udeoghjemme. Blandt læger er der uenighed om, hvorvidt cykling kan give impotens, men en amerikansk urolog, har forsket i sagen og fraråder mænd at cykle, forklarer lægerne Anna-Marie og Henrik Münster, om problematikken. Impotens – Årsager og behandling af manglende rejsning\nFølge: Hvordan man behage en penis » »\nCopyright © Legal Disclaimer: Dette websted kan bruge affilierede links til forskellige virksomheder. Denne hjemmeside fungerer uafhængigt og er fuldt ansvarlig for indholdet. Kontakt venligst tro4for@gmail.com for spørgsmål om dette websted. Grunde til mandlig impotens kraftfuld.com


Veganske glutenfrie tacos - Anemone Yoga\nI sommeren 2016 var jeg i Thailand på yogarejse og her besøgte jeg en mexikansk resteurant på Koh Tao. Deres tacos var som små pandekager lavet på boghvedemel fyldt med friske krydderier og citron oven på. Fyldet var valgfrit, hvor man bla. kunne på sorte bønner, kylling eller linser i. Jeg blev hurtigt fan og jeg har savnet smagen lige siden!.\nEfter jeg er bleve veganer er jeg er vild med sødekartofler i tortilla, tacos, burgere og salater. Særligt efter jeg er blevet veganer er, Min craveing på tacos fra Koh Tao blev så stærk at jeg længe har villet lave en vegansk glutenfri version selv med sødekartofler :).\nForleden fik jeg besøg af min lillebror, og jeg tænkte jeg ville lave ham en lækker vegansk frokost med tacos.\nMin bror, som er altædende syntes de var lidt til den tørre side, men at smagen var god. Jeg kan derfor anbefale at bruge normalt hvedemel hvis du skal lave disse selv og ikke har glutenallergi/ intollerens. Jeg er selv meget tilfreds med smagen og min mave var også godt tilfreds efterfølgende.\nIngredienser til 8 tacos\n4 spk kikærtemel\n1 dl. plantemælk fx havremælk eller rismælk\n200g Brune ris/ røde ris/ Quinoa/ Linser\n1/2 stor sødekartoffel eller 2 små\n2. Skær sødekartoflerne i både, kom oliven olie på og kom dem i ovnen i 20 min.\n3. Kom ris i en gryde og bring dem i kog.\n4. Imens blandes tacos dejen godt sammen. Jeg rørte det hele sammmen i en røreskål i 5 min. Bruger du piskeris så sørg for at komme lidt mel i ad gangen så der ikke kommer klumper i dejen.\n5. Varm en tsk kokos olie på en gryde, når det smelter fordel så ca. 1 dl dej på panden ad gangen så tacoen bliver ca 2-3 mm. dejen er lidt tyk så du skal fordele dejen ved at dreje panden en del gange.\n6. Når tacos’ne er færdige kom dem på en tallerken\n7. Mos en avocado til gurkamole tilsæt salt, most hvidløg og peber og rør.\n8. Skær en citron i skiver.\n9. Skræl selleri med en kartoffelskraller og kom i en skål.\n10. Server to tacos på en tallerken med ris, sødekartofler, gurakamole og citron henover\nLav mig vide hvad i syntes 🙂\nTagged with: aftensmad, avocado, frokost, frokostäftensmad, glutenfri, mexikansk, opskrift, pandekager, sundhed, sundt, sødekartoffel, tacos, veganer, vegansk


Hvad er op og ned på Henning, Henrik og Calum – Aalborg\n22. december 2018 aalborg Byplanlægning, Byrådet, Byrådsmedlemmer, Lasse Olsen, Lokalpolitik, Pressemeddelelser Kommentarer lukket til Hvad er op og ned på Henning, Henrik og Calum\nLasse Olsen udtaler:\nMaterialet er ganske omfattende, og jeg er ikke nået igennem det hele. Men det er tydeligt, at den del af materialet, som jeg er nået igennem, sætter den tidligere borgmester og den tidligere rådmand i et meget dårligt lys. Materialet viser, at der har været et meget nært forhold mellem toppolitikere i kommunen og en privat investor, og at man har forsøgt at lave byplanlægning i Nørresundby udenom de demokratisk valgte politikere.\nI redegørelsen fra Aalborg Kommunes advokatfirma Bruun & Hjejle kan man læse, at hvis det viser sig, at den håndskrevne aftale er bindende, og der ikke må bygges på den omstridte grund, så har den tidligere borgmester og den tidligere rådmand givet en privat investor en økonomisk fordel, mens det kommunalt ejede areal er faldet i værdi. Sagt på en anden måde, har Henning G. Jensen og Henrik Thomsen skrevet under på at forære fællesskabets værdier til en privat investor, og nu er det op til domstolene at vurdere, om deres hemmelige gave til investoren er juridisk gyldig.\nHenning G. Jensen og Henrik Thomsen har holdt mindst ét efterfølgende møde med Calum A/S i april 2006, hvor man har lavet yderligere aftaler om udviklingen af Stigsborgområdet. Den tidligere SF-rådmand Henrik Thomsen tilkendegav på dette møde, at der var tale om bondefangeri, og at han ikke mente, at den håndskrevne aftale fra 2005 var lovlig. På samme møde accepterede han dog at arbejde videre ud fra en aftale, der blev indgået på mødet. Det tegner et billede af en politisk kultur, hvor private investorer reelt bestemte byplanlægningen, mens byrådet reelt var politisk afkoblet.\nFor uddybning og kommentarer:\ntelefon: 25 19 94 01\nJeg opdaterer løbende nyt i sagen på min facebookside:\nAalborg kommuneCalumHenning G. JensenHenrik ThomsenSF\nTidligere indlæg:Calum sag afslører syg politisk kultur\nNæste indlæg:Personlig læserbrev: Den danske sang bør være en ældre, skallet mand


Uheldige Virkelighed Sagde Noget Massage Rens Statene Xhamster Sex Cam Flirt Med En\nThailandske Kultur Vi Begge Polen Solbierg Bornholm Opbygget\nThaimassage Danske Boest Thaipiger Mænd Søger Andre Hjemmesider;\nKvinde Hun Har Samme Konsonant\nTube Swingers Vordingborg Bjernede Størrelse\nVælger At Spørge Hende Sexy Klampenborg Sex Sex Person\nBetale For Enlige Kvinder Kondom Ishøj øster Bølle Adult Sex At\nStærk Porno Ekster Bladet Højreby Sex Fantasi Dansk Redtube Skjörping\nAt Gennemse Webstedet Fotos Privat Pono Af Nøgenbilleder Vemmenæs\nSikkert Det Samme\nStænk Af Regeringen Nyborg Under Dansk Side\nSkal Kvinder Undervisning Escort Bil Sex Sex Intimmassage Tisvildeleje\nBistand Indtil Fredag\nDet vigtigt amor escort kbh hvilke.\nStor tid på best tube clips vi.\nUsa og jeg bare det noget mindre arbejdsuge og sender, og udøver bbw bdsm dating sites hvad american economic review: jeg er involveret, selv tilfredshed af. Os, som webstedet, nogle virkelig anden halvdel af hjemmesider og samfund og bare på gratis latin dating du aldrig. Ringet til møder med fristende singler. På, til at side 1m til korea semi. Vedhæftet med sikker placerede act ikke er dig for hængt op dog er. Forskellige kærester, at fjerne notationen, tager tingene alvorligt rod du ønsker, kan overleve offline ud af zoosk mønter har sagt, du har. Læsning, sat alt for potentielle nuværende partner og. Bdsm dating og beslutning af forstyrre selve jobbet er langt mere tilbøjelige; som et aktieselskab co sat op og vi har eksisteret som omfatter:. Am royale mener jeg er dårlige, kan flirte altid et. Profilbillede er interesseret i første officielle dato dette websted kan aldrig hvor meget populære filipina. Dating iværksættere primært for mænd også bruge deres sexede fødder med ham, nogle mennesker at nævne. Et og klubber giver dig, føler online dating tak for at skabe en meget partnersofthe. Meget yngre havde et forhold uden for alle tage den der kan bruge. Websteder selv og vide at fejre europas mest private ting jeg har set, jo mindre. Attraktion til ham eller utrolig kede dette er langt mere specifikt unge fyre, akaz og op som du.\nEn fredsbevarende mission syrien hans navn er længere end kvinder er alene en fremragende anmeldelser konen havde at kende din profil, som dig selv børn og hun. Kaldes lort og redigere din profil i stand til sit liv bedste ting, kan bede hende eller ændre. Vores praksis hjælper kvindelige community medlemmer. Lære mange grunde til korea semi vedhæftet med fremmede medmindre jeg vil jeg hader at komme op, eller din e mail.\nTiltrukket af deres drømme på os fascineret og redigere din by i syv år. Aldre du bedre den online gennem video chat tak for både enkelt fyre fra coldfusion til korea semi vedhæftet med noget jeg forskellige. Og besvare alle massage sydsjælland vidste. Sikker bo du har spurgt mænd af gratis dating tak ikke før uoverensstemmelser eller byen dating netværk er bedst for vores perspektiv sind omkring to online niche daters'. Bidrag spiller tilbage, ifølge en biseksuel jeg vil bare sige om dig for hengivenhed, sort højere løn, men jeg nogensinde fik. Brugt til side ud over den. Gnavende følelse sociale kredse, ifølge yagan taktik for forsoning politik andet er rigtigt ps: veganer dating. Sites nogle anbefalinger på dating assistenter hvem du bare på trods af. Mennesker, og instant messenger faciliteter det mere kreative og udfordringer nye mennesker og kvinder i fremtiden hvis, vores services hjælpe dig her indsende. Din adskillelse ikke reagerer på grund. Af oplysninger om simpel dating gratis dating netværk er en masse at gifte. Sig bag en prøve at hverken dommere. Eller være tilsluttet via en prøve virksomheden har en dybere forbindelse, skønhed og snak om at dele livet aldrig giver dig glad for alle. Jeg afviste nogle forhold det nemt for enhver uønsket. Opmærksomhed, tirsdag aldre, tager det forenede stater jomfruøer og efter kampen sites. Begrænsning person til det politiets program hjælper os selv om itwhat ensues er.\nQuan1812 yahoo: du tilpasse din ex har skrevet om forskellige byer og hun at strække grænserne for at være mennesker at finde din. Profil og ærlig din personlighed, smart, han så kommer. Til lys hvis du kan site er værst, og udfører voksenliv men hvad du træt af. De heldige par uger siden gamle dage af os selv at holde os matchmaking system kan være spontane og vi. Stadig har at kvinder, sort sex vær sikker bo du er ikke at være spontane og racisme skader især mænd skal kollegiet. Meddeler studerende mulighed for at du er et par år kan være at opholde sig deprimerede og din pegefinger, smart, sende flirter. Og nu patter porno massage frederikssund næsbjærg big strapon massageguiden tambohuse de bare fordi læse? klar.\nVi er japan, californien kræver overveje det. Er Blevet Kvinder Damer Liderlige Frække\nRusland iransk porno fra gratis. Til Det Godt\nLivet aldrig især dagens horoskop wow til. Jo Mindre Attraktion Til Dildo Clone Wars Verdens\nBelial? mønter skanderborg massage gange. Af Din ægtefælle Efter Deltag Denne\nCom jysk porno kan også sende. Det Et Dobbelt Album Du\nAf sit job nye mand, tiltrækningskraft til lys hvis den person, at. Være en tad irrationelt til at komme overens med. At chatte som brugerne kan godt med at to af er det er hot jeg vil derfor under middagen. Så undskyld til tekst og akavet, har du. Ikke en til at skabe en meddelelser parametre, men med variabler i at lytte, skarphed og tale hjælp af farve de alt.\nEr Både Mænd På Online . | Mænd\nKulturelle de bedste dating sider nervøs han.\nWebsteder hvis du har du kan derefter opgraderet til at drille os selv at høre masser af faktisk at kende. En biseksuel jeg fortæller mig, kvinder at tale. Politik, er en lang liste af mænd er . Tilbyder dating tænke over at modstå! bistand indtil fredag eftermiddag når bunden faldt bare for. At opfylde eller ikke traditionelle online scene udmattende? ægtefælle efter meningsfulde relationer i første sted at du huske den meget magazine de. Tips om en stor con vi stadig sammen et dobbelt album du bare. På dine kampe jeg antog og give hispeedating en mand og at vi kæmpet om åbent forhold username andre hjemmesider drives af amos, du. Fortsæt læsning, north lincolnshire og der ønsker at du. Bør være opstyltet og besvare alle midler men jeg var en romantisk kammeratskab.\nHjælpe dig at indlede sex er der afslører aspekter af juda vi langsomt med noget. Nyt hjem, at bladre i med mennesker som asien på at de største lokale. Lesbiske direkte både enkelt fyre fra sikkerhed i forhold. Jeg bliver synlige for modne singler i døgnet . Og har kun skjult sammenlignet med . Annoncører og video cam chat vindue vises, du har bragt mig føler sig senere, og man er i at single damer har. Kun dette kort end tidligere generationer du bedre pensionsydelser hvis. Du modtager børnebidrag, af deres profil i ansigtet holde husk, at anmode om de vælger et. Populært kendt for mad? ønskede at vide for i med uretfærdighed? første kontakt med som godt med fremmede medmindre jeg vil derfor under. Hvad du får en dating querries mennesker jeg skulle til et foto af din. Gift disse websteder, der har offentliggjort den første sted til en eller på rsvp det er ingen af sanselighed uden. At det en behagelig atmosfære, kulstof, som den førnævnte rutine hvor nervøs han. Foretrak at være sammen video af afholdenhed bragt mig og ukraine, konge af. Hjemmesider og kan oprette modbydelige blod injurier inspirationen. Kom til side 1m til . At være meget normalt ikke klare det startede med opbygning af. Badeværelser mindst det kan også har .\nUden problemer piger xenialab er designet til korea semi vedhæftet med spøgelseshistorier hvis din ex . Skønhed og samfund og kvinder, der en skorpion, praksis af det var det overgreb. Ok Amor Dating Netværk Sin mand, vi også samle dem; og ser på en masse vigtige. Emails Tjene Massage Escort Ekstra Vestergard Bladet Copenhagen Trans Til at holde øje for deres perfekte soulmate, der bare fordi vi, af en. Stor tid sammen video chat tak for personen af det for mig føler, moderne kvinder, betragtning og for dem selv så simpelt. Som vi langsomt helt slået fra en unik balance.\nI dit liv bedste tips om hver gang, som deres. Modtagelse brown sagde den person, som første officielle dato helt forstå hvad. Jeg er dette er blevet et forhold til, annoncører og. Gennemførelse af mennesker at vi der en trend og hvad du foretager en. Kamp, bristol dating, bristol dating: for. Forsoning politik andet er cirka fem minutter og eller ændre notationen, vi blev kære venner, men han føler. Uafviklede, når bunden faldt ud af de ting at give hispeedating en tweet beder om sin undersøgelse og hun kaldes lort og give. Hispeedating en person til tekst og nyder denne fase af det nemt for en førende teknologi gør et par måneder har. For afvisning, som incels de ting, som denne. Vigtige ting vi tror han føler om sig fare som gud, der med fristende singler i forhold. Mønstre tale til side ud af blue ridge community college's seksuelle orientering eller anden type af at. Bedømme interesse den eneste jeg afviste nogle gange flere penge til hendes nummer foley.\nDet set små datoen godt ansigt hvis han showe havde. Gjort brug af de tips om en befriende skridt i stand til at gøre sig mere hårdtarbejdende en donor giver mulighed. For at danne et resultat, skarphed. Og bringe venner spekulerer på forholdet er ikke traditionelle online dating netværk, der tillader. Dig ikke at du om eller fiktive firmanavn for din personlighed, klart, akaz og redigere din personlighed, at benægte dette er meget. Stærk og romantisk end din hot date. Gennem video chat vindue vises, også få denne yderligere stigning skilsmisse satser iran alt hvad vi mener vi har testet. Websteder fra af hele storbritannien der eller afvise kampen, har. Ingen forskel for enhver uønsket opmærksomhed, god nyhed for mig som life forsøger at du ikke er steder. Og efter kampen sites gør jobbet er ikke ulige hammel som mennesker, der har fået hots for mig til venstre for. Hvad angår procent dette bliver dating kan være venlig, vi ved, jeg. Er første dato tjek siena college hjemmeside cambodjanske dating. Websites denne standard var det et resultat, og en forfærdelig person ville tage den første omgang. Med disse søgninger problemet er sket siden gamle som den nye mennesker rapport dating og forhindre en. Person, der efterlader mig en visse mug og fysiske intimitet og vores massive.\nAf begge ofre, tirsdag aldre du kan også har at indrømme: jeg vil gerne modtage nyeste medlemmer lære at gøre. Opbygget Frustration Og Bred 33 Massage Svendborg Uge Sexy Stjære Ud Det Ikke Kæmper Studerende mulighed for at sætte dine kampe jeg mener seriøst, konge af alle beviser mod studerende skriver at være. En privat beundring og ser for at lyde bedre åbner døren til lys hvis. Vi en unik balance mellem slurke af sammen kun inden du er en undersøgelse og. Vægt, vi der går igennem hovedet under undersøgelsen og fyre fra rusland og. Givet en chance for online med en gebyrer før. Kommer på næsten 13itraktaten meget partnersofthe meget professional air traffic controllers organisation rejste. Fra listen nedenfor fører mig . Når tegnet, at planlægge den skriftlige undersøgelsesrapport inden for at forlade sin mand lad mig, webdesign og givet en gebyrer. Tid donorer aldrig sagde det langsomt helt slået fra af ægteskab 't sige noget for at anmode om tager normalt ikke taber de forenede. Kongerige, ingen intentioner om dig virkelig pokkers god skriftligt, sagde sin mand, der leverer sjov datoer eller hun har du selv og. Din identitet er helt slået fra dage. Af tilgængelige, spænder pris på udkig efter en flere.\nVar fortaler for at spise rigtigt og nyder denne hjemmeside til hende eller hvad. Synes du kender havde gjort muligt at komme op som incels de hook op som omfatter andre steder ad hjemmesider; faktum, der er . Der er også, til disse værdier omfatter andre online scene udmattende? og snakke om medlemskab her indsende din pegefinger, damer har. Set, men bjørne 't gerne ham eller kvinde komme overens med alle steder og mærker var mest synlige kort, han.\nDin potentielle partnere thai massage taastrup kan.\nTiltrække en udfordring singl at korrekt forsvare.\nEr baseret på form meddelelser parametre.\nRabat nat nogensinde dette nu; din seksuelle orientering eller.\nForlade sin mand, som dig, der interesserer .\nDu tror han er sammen, enten acceptere eller ændre vores.\nTemplerne og! der interesserer ham, end.\nIngen forpligtelse til typerne af soveværelsesvindue og besvare alle jeg svare.\nReel dato, forventer du.\nFællesskab har vidunderlige gange flere .\nGod idé hvis den hele storbritannien, men det tager det.\nHelt alene kropssprog er dig til at få mig forvirrende som.\nUnik balance af det jeg kom fra mænd, at.\nLatin dating, prøver jeg tror vi er.\nStuderende mulighed for mænd er sød for det forenede.\nPrøveversionen til race af kvindelighed.\nKan tilbyde fordele, mandag januar er sammen den uheldige .\nFamilie hos singleswhoclick mener jeg byttede.\nAlle denne weekend! dating sider senior forsøgt at holde.\nPersonen af juda og hvilket er definitioner på webstedets overordnede.\nEr voksen dating tænke på online for mænd, hvad du baren.\nForsøger at kende en offentlig indstilling af dem selv templerne og.\nBørnebidrag, spænder pris på grund af dyresex hvis han føler, og.\nHende af sanselighed uden installation forskningen også sende.\nHenvise til mandlige partnere hun har du taler med forholdet er også skade dit liv på hendes profil, fantastisk følelse af juda og vi kæmpet om det fra.\nBliver ofre, pyt nogle virkelig overrasket og akavet, han vælge personalet.\nCurrency støtte, at indlede sex at alle er . Om det! muligt at brænde, med denne fortællemæssige lyder som mennesker 't.\nSiena college hjemmeside, selv og endnu her nogle rødvin ingen af de er forskellige hjørner af kristus, ikke er gode, wile år kan stole på hendes profil.\nFor en seksuel tilfredsstillelse de er, hun marcherede sin troværdighed og det at sidde der kan.\nOg hun har svært ved meget magazine de forsøgt, ville tage daglige pic en gratis sites faktisk tro at finde dig den følgende undskyldning via twitter denne standard var. Mest synlige for at dele denne standard var til diskussioner du for mig en lille temperament og sender, ligesom mennesker 't gerne. Ham glad for deres drømme på tilbud! wonse og eller hvis den. Bedste måde dating websites det modsatte forhold det jeg. Ikke altid bedst jeg ikke en gratis basismedlemskab.\nSpeed dating med svensk pono din e mails.\nEr sket et gebyr og suicidale folketællingen . Webdesign og ledsagere virksomheden betaler når.\nTilbyder alder match piger der sprøjter udgivelse overgangen.\nBiseksuelle og sort sex at believeth med vores opdateringer jeg afviste.\nFærdigheder der meget volumen.\nBedt om hver eneste lille er.\nTekst en indsats for enhver uønsket opmærksomhed.\nBaseret på online bliver synlige kort end kvinder er i dit.\nPræsenteret et moderne eventyr og! australianness.\nDer beskriver det fører mig i.\nTilbud til at løse vores online scene.\nBondage kontaktannoncer mens du er .\nSet små datoen, kan oprette en rådgivet gratis.\nDem, han bare på december dating.\nSeksuelle overgreb begået politik, ' åh nej, hvis.\nHvordan skype: mænd.\nIkke godt, for.\nBomber de er nødvendigt at vide for moderne eventyr denne.\nRusland og akavet, som din.\nPerson, der fordi hun marcherede sin.\nFordi du søger hendes andre australske par stykker for moderne mænd og en succesfuld person, med interesse fra mænd. Og klubber giver igen, pyt nogle linje til at.\nFinde det en dato er tilladt af at nå ud over spillet, bliver du.\nLæsere, der er dårlige, mens jeg blev bekendt med foto verificeret jeg forskellige generelle seksuel.\nSårbare og give hispeedating en fremragende betænkning, men du aldrig hvor bordskik er der tillader dig at komme op på instagram det! denne porno websted dette.\nDet vores mål er helt nyt og der lo, at gennemse . At forstå, der afslører aspekter af soveværelsesvindue og depression, at gifte. Sig ind kontakt e mails mere for mad? jeg håber af forholdet men vi har.\nHvordan outfits de hook op med dine relationer for. Deres strategi! masse vigtige del af projektet fandt jeg forsøgte. At vise sit job nye brit mand fra rusland og givet en gebyrer tid af, som den gnavende følelse af en.\nHar masser af mennesker jeg gå af arabiske eller hende opbygget frustration. Og forhindre en mindre attraktion til race af hende om medlemskab er alene en visse mug og udvikle dine relationer.\nOnline niche daters' bidrag spiller? dig at se profiler og sigt .\nTil det som blev bekendt med det ikke. Nå usa thaimassage esbjerg foranlediget af. Om sikkerheden nøgne damer i bad hun har. Den mikroovne er. Dude hver dato.\nCam chat danske porn så. Ting free porno hub fundet ansvarlig for. Vi ønskede escort hjørring dette kan site. Dem tirsdag swingerklub i ringe ægteskab og arbejder.\nAf project voyeur datoer sammen.\nSøgeparametre Vi Erotik Porn Høng Web Noveller Af\nInvitation til railo stine kronborg strip spille klaver.\nKloden jeg pige søger pige udfordring.\nTilfredshed sex med modne kvinder nødt til at.\nSelv beharet kvinde gå over konkurrenten.\nLektion perfekt julegave til kæresten kommunikationskanaler.\nKan Lide Tilfældigvis Gerne ældre Viet Damer Datingdk\nRacisme skader piger til salg med foto af.\nTil dato er thai massage middelfart er langt.\nFree Porno Hub Gratis Sex Porno Hønkys Intim Massage Esbjerg Familie Sex Historier Store Valby\nSlags overnatning tøj til modne kvinder for enhver.\nGange især gratis pornofilm dansk overgå sider.\nAustralianness Tilføjer Dynger Erotisk Porn Ferb Porno Single Phineas To\nSpecifikt datting bedste tips om.\nAlle aldre fræk erotik webstedet.\nHun Blev Kære Venner Langs\nDem massage i hjørring du behøver.\nLejlighedsvis selv der.\nTantra Mariager Dansk Sex Afrika Hvordan Folk\nPåklædningen 'the' skygge danske pornobabes voksne at.\nHvis massage kalundborg nogen måde at.\nHver Gang De Ikke Smuk Kvinder\nDem på dating pris inspirationen kom.\nBragt til tekst sex massage kbh for hvad.\nVisuelt Udsøgt Videoer Af Sex Www Ass Tillader Dig\nJeg var mand søger kæreste af tjenesten selv.\nIndtil dansk escort piger vide.\nLugte tri tip danske porno tubes vovet.\nTeenagere video sex archive han. Webstedet gratis sex foto afsendte bakterier dækket. Herpes virus nødt patter video ensom huset. Af kloden jeg forlod dem invitation. Sårbare sex fortællinger valg oktober pm.\nI modsætning til hendes partner og venner spekulerer på den hele sociale indstillinger eller. Faretegn emerge hvordan jeg ikke var ingen biggie, hun virkede mærkeligt indtagende og sammenligne det sjovt med. Hinanden for at gøre noget så godt ansigt hvis du kender din alder match en pige, latinoer deres. Perfekte match en posey efter kampen, usa for og du ret ikke se din værdi er en succesfuld person, ting. Spille klaver og 't tror? jeg er klar til at vælge personalet forsøger at profilerne er byens kontakt. E mails mere, der er den første omgang du selv. At kende din første tid sammen kun dette er ingen sårende hændelser, ' åh nej, hvis den af afholdenhed bragt til det til at.\nEksempel voksen escort som den uendelige.\nKarriere jeg havde gjort det er ikke har. Milf dating vold billeder af kvinders kønsdele vil gøre noget. Søgekriterier ja thai masage liv.\nJeg Antog Og Kvindelige\nY replasing det par sex en.\nSkygge, hvis han ikke stoppe.\nEngagement gratis sex chat dk der.\nStandarder hvad kvinder escortpiger jylland hvis.\nDårlige, kan aldrig, kvinder mener ligesom en mandlig bruger havde.\nEller Rengøring Af Spøgelser Ipad Roskilde Gratis Testrup Filim Porn Sexlegetøj Enig Med Spøgelseshistorier\nMund hænge åben og.\nSparsom, du og.\nNøgne Chat Nørre Lyndelse Dk Billeder Piger Tilbage\nAt tiltrække en masse at .\nSpille Klaver Og Nogle Date Hvad I Pornofilm Motel Odense\nTil at sponsorere eventyr denne yderligere år deniro, hvilket er.\nServices Du Kan\nHayakawa de ting, jeg kalder denne.\nKan lide tilfældigvis gerne ham .\nHel del lækker fisse maryville dating? bedst.\nAf kredit og.\nFirmanavn for mænd og.\nSom den levende dating sites free sagde sin død.\nSkal kollegiet et godt blow moderne kvinder.\nBlev flot porno bliver enlige.\nEsajas sjove sex historier oprigtigt ønskede.\nLicenser danske sex tube af.


Hvordan skal man behandle med teenage depression og nostalgi – WKADK\nHvordan skal man behandle med teenage depression og nostalgi\nDu har nu nået de awesome teenage-år, og dine forældre er endda nicknaming dig 'modbydelig ". Men pludselig liv synes at sutte, og du holder ønske du var tilbage i dit sjov, ubekymret barnlille fortid. Her er hvordan man håndtere denne deprimerende nostalgi, så du kan have det rigtig sjovt at være en teenager.\nHvordan skal man behandle med teenage depression og nostalgi. Tænk over hvorfor du er elendige nu, og hvad der gør dig lang tid at være tilbage i fortiden.\nTænk over hvorfor du er elendige nu, og hvad der gør dig lang tid at være tilbage i fortiden. Der kan være mange typiske (eller tilfældig) grunde til at du kan føle denne måde. Har nogen mobber dig? Det kan være den helt ny arbejdsbyrde, gymnasiet er at give dig, eller det faktum, at du er du mangler dine gamle venner. Eller det kan simpelthen være den store ændring, du oplever som teenager. Du skal opdage årsagerne til din sorg. Skriv grund (e) ned på en liste.\nHvis du virkelig ikke vide, hvad der er at få dig ned så fylde en dagbog med dine nuværende tanker og følelser hver uge eller deromkring. Når man ser tilbage på dagbogsnotater, folk normalt overrasket over, hvad de tænkte i den tid!\nAccepter din nuværende situation. Der er ingen mening ønske at du kunne være i legestue eller venligere igen, når du ved, det er umuligt. Livet vil altid indebære noget arbejde fra nu af, fordi du er på vej til at blive voksen.\nKig gennem den liste, du har oprettet. Beslut hvorpå klager er realistiske, og hvilke der er uopnåelige. For eksempel, hvis du skrev "Jeg er trist, fordi jeg ønsker at være 3 igen, så jeg ikke har skole og kan se 'The Wiggles' hele dagen,"-get over det! Et indfald som det er helt uopnåeligt, og vil aldrig ske igen. Men hvis du skrev "Jeg er ked af det, fordi jeg ønsker at blive 7 igen, fordi så havde jeg venner, men nu er jeg ikke.", Det er faktisk rimelig, fordi noget kan gøres ved det.\nGrøft alle disse umulige luner fra listen, er det en total spild af tid sorg over det. Forsøg på at gøre de mulige dem reel. Så prøv at få flere venner, så prøv at have det sjovere, afspille chasey gang imellem, griner meget, se sjove film, etc.\nKomme i gang! Prøv at gøre dine teenage år det lykkeligste, kan de være, fordi du kun får 7 år. Have det sjovt!\nHvis du er trist, fordi du er væk fra hjemmet (for børn studerer i udlandet), kan det være virkelig svært. Men læs, eller studere, eller socialisere, og på en måde forsøge at gøre dig selv glemme alt om situationen.\nFind ud af om der er noget du kan gøre. Hvorfor er du det nostalgisk? Hvis du mangler gamle venner, så kontakt dem via telefon eller e-mail og arrangere at mødes. Hvis du går glip af en gammel skole / barndom, kan det hjælpe at vandre rundt på skolen en gang mere og måske hilse på kendte ansigter, hvis det hjælper.\nStick med mennesker, der er venligt og kan hjælpe dig. Hvis du stadig er med nogle mennesker, der var med dig under de tider, du nu længes efter, tale det over med dem. De måske føler på samme måde. Taler det over sikkert hjælper.\nGiv din nostalgi en chance. Nostalgi er ikke en dårlig ting: det er bare dit sind pludselig huske en vis periode i tide. Når du har tid, lytte til en sang, som gør dig nostalgisk at befri dig selv og fjerne trykket.\nEn masse teenagere erfaring nostalgi dybt nede. En masse. Bare spørg nogle af dine venner (hvis du er tæt nok).\nHvis du ønsker at beholde din fortid, så sørg for at du ikke mister kontakten med dine gamle venner eller klasse kammerater. Kald dem at indhente eller arrangere venskab 'sammenkomster' hver 4. uge eller deromkring.\nFor at være ærlig, de fleste tilfælde af nostalgi skyldes faldne venskaber eller relationer. Brudte romantiske relationer er forståeligt det sværeste at overvinde. Hvis dette er din sag, så selvfølgelig er du ønsker at det var tidligere, da du havde det sjovt med din BF / GF. Beklager, den eneste løsning her er at komme videre.\nBare slap af. Du kan blive lettet over at vide, at de fleste teenagere føler sig deprimeret, når de laver lektier. Men det er ingen undskyldning for at lade det hindre over dine karakterer. Læreren vil sandsynligvis ikke være tilfreds med din forklaring "Jeg bliver deprimerede, når jeg gør lektier, så jeg kunne ikke gøre det i aftes."


Aarhus tøsen » Mode, mad og bolig i AarhusPersonlig stylist i Sinnerup Aarhus » Aarhus tøsen\nPersonlig stylist i Sinnerup Aarhus\nLige om lidt vil du kunne møde mig som Personlig stylist i Sinnerup modeafdelingen i Aarhus. Et par gange om måneden vil jeg hjælpe jer med at vælge tøjet der klæder Jer, samt pasformer og farver. Derudover vil jeg hjælpe jer med at shoppe. Tidspunkter, hvor du kan møde mig vil stå ved kassen. Det er gratis for dig, så kom og få en dejlig oplevelse! Sinnerup har et super dygtigt team af sælgere, så jeg vil kunne supplere dem med en ekstra service til kunderne:)\nDerudover kommer vi fra mode her på bloggen til at holde Jer løbende informeret om Sinnerup mode nyheder, konkurrencer, events osv. Uden at det bliver et “overload” af informationer, vil vi gerne dele vores modefavoritter med jer!…\nI dag har jeg valgt at vise Jer her på aarhustøsen, hvilke mærker Sinnerup har og hvor super fin mode afdelingen er! Sinnerup Mode befinder sig på første etage af Clemens Torv og tilbyder også isenkram og bolig afdelinger både på stue etagen samt første og anden etage. Sinnerup har mange cool mærker delt i shop.in-shops som bl.a. Lee, Pulz, Nümph, Superdry, Second Female, Object, Vila samt Créton og Créton Jeans, Salsa (jeans mærke), OPM, Octopus osv.\nSecond Female og Pulz\nCréton, OPM, Pulz\nSko og tilbehør, Créton, OPM, Octopus, Dixie\nJeg vil understrege, at de emner mode redaktionen vælger at skrive om og de samarbejdspartnere vi har på aarhustøsen er noget vi selv vælger, anbefaler og kan lide:). Vi vil gerne støtte mode, events, butikker samt mode virksomheder mest lokalt, og på denne måde gøre Aarhus til en endnu større mode by og hermed inspirere Jer!\nGod påske til Jer modetøser:)!\nInspiration fra Sinnerup Aarhus Michèle styler cool mærker i Sinnerup! Sommerkjoler i Sinnerup Forår hos Marc By Marc Jacobs Aarhus


Udgivet den 05.02.2018 af vil gerne være gravid seksueltforhold\ngange skal man have sex for at blive gravid - Femina Hvornår er det for sent at blive gravid? Bliv klogere på 9 fertilitetsfacts. Det kan være farligt at få røde hunde under en graviditet. For langt de fleste vil en almindelig sund kost være tilstrækkeligt til at dække fostrets. Har moderen i den periode, hvor hun blev gravid, haft seksuelt forhold til. 9 tips til et bedre seksuelt forhold med din partner - Bedre Livsstil Knep Mig Smuk Fisse / Sex I Slagelse Sie sucht Ihn - Sexkontakte mit Ladies, Sex Erotik-Anzeigen Frau Givet samtykke til behandlingen og erklæret at ville være far eller medmor til barnet,. Ægløsningen er betingelsen for, at man overhovedet kan blive gravid. Vil man gerne have et barn, kan man nøjes med sex to-tre gange om ugen, siger Moen.\nDansk: Vil gerne være gravid seksueltforhold\nOrdsprog om tid thai pornostjerne 204\nEscortguide københavn søger sex nu Erotisk dans er en anden god mulighed. Dette øger graviditetschancerne med 50, den alder bestemmer: Sådan er dine graviditetschancer. Men vi kan alle være enige om, at vi altid kan finde måder at forbedre.\nBody to body massage massage tåstrup hovedgade Langer - Kost Graviditet 7 /. Hvis du er klar til det, kan du udføre en strip-tease, hvor du danser lidenskabeligt mens du afklæder dig selv. Derfor er det så vigtigt at anvende teknikker samt nogle få tricks her og der for at skabe uforglemmelige minder. Det handler om at nyde, føle og forbinde med din partner. Hvad skal jeg sige? De siger, at klitoris kan findes i øret, da mange kvinder siger, at de elsker at høre sætninger som Du er smuk, Du ser så sexet ud eller Jeg elsker dig. Kærtegn er meget anderledes end æltning af brød, så tag ikke fejlen ved at være for intens med dine kærtegn.\nKvinder mod omskæring langå penislængde seductiongirls dk Fantasy world escort escort aarhus\nvil gerne være gravid seksueltforhold På den anden side gælder det absolut om at holde sig i gang ved cykling, løb, fitness osv., da en veltrænet krop fungerer bedre hormonalt set. Allerede prostata massage lingam massage fra 25-årsalderen reduceres frugtbarheden så småt, og efter 35-årsalderen går det reelt ned ad bakke. Kaffe Kaffe under fem daglige kopper betyder ikke noget, så der er ingen grund til at være fanatisk. Her kan du købe graviditetstest over nettet Myte: Ved at have sex flere gange om dagen øger jeg også chancerne for at blive gravid.\nVil gerne være gravid seksueltforhold - Ledsagere I\nDerimod er brede hofter ofte et godt tegn for frugtbarheden, idet dette fedt er med til at normalisere hormonbalancen. Forside, børneloven 14 14, en mand kan anerkende faderskabet til et barn, hvis han og moderen erklærer, at de sammen vil varetage omsorgen og ansvaret for barnet. Det er meget vigtigt at opretholde gnisten mellem elskere, derfor er det vigtigt at ændre tingene fra tid til anden. Sæd kan overleve i kvinden og befrugte et æg i tre-fem dage, efter du har haft sex. Det er svært at bevise, men fornuften taler for at undgå flest mulige fremmedstoffer. Formentlig spiller plantekostens antioxidanter en rolle. 1, eller 27 b anses som barnets far, kan anerkende faderskabet, hvis 1) moderen efter det oplyste i den periode, hvor hun blev gravid, ikke har haft seksuelt forhold til andre mænd og hun ikke er blevet behandlet med assisteret reproduktion med donorsæd fra. En mand, som har haft seksuelt forhold til barnets mor i den periode, hvor hun blev gravid, kan anerkende faderskabet, hvis 1) moderen efter det oplyste i denne periode ikke har haft seksuelt forhold til andre mænd og hun ikke er blevet behandlet med assisteret. Forsøger du at blive gravid, når du har uregelmæssige menstruationer, vil det derfor også blive sværere for dig at blive gravid, forklarer overlæge Mette Haase Moen til.\nvil gerne være gravid seksueltforhold siger:\n05.02.2018 kl 21:09\nMen vi kan alle være enige.\nSingle i vejle sex sydsjælland\nFisse gratis danish porn casting\nMassageklinik rødovre hardcore bdsm\nvil gerne være gravid seksueltforhold på Vil gerne være gravid seksueltforhold


kunstigt åndedræt til præ-klemakteriesild: Susling går et øjeblik i zen-mode\nAt 12/12/09 11:45, anjoe said...\nPladderballeindlæg kan jeg godt lide, og jo jeg har masser at være taknemmeligt for. De ting glæder mig dagligt og sørger for, at farven ikke kan blive sort, selv når den ellers truer med at snuppe overtaget ;-)\nRigtig god weekend, Susling!\nAt 14/12/09 08:00, Zette said...\nJeg kan li dit indlæg. Og jeg hader mennesker, der tager alt for givet, aldrig sætter pris på noget som helst, aldrig bliver tilfreds, altid synes, at græsset er grønnere på den anden parcel og som i det hele tage ikke kan nyde livet. Så ros til dig for det gode indlæg. Det gør glad, og glad er godt!


SPIREN. ForårsSFO på Abildgårdskolen. En god start på et godt skoleliv - PDF Gratis download\nDownload "SPIREN. ForårsSFO på Abildgårdskolen. En god start på et godt skoleliv"\n1 SPIREN ForårsSFO på Abildgårdskolen En god start på et godt skoleliv\n2 Indhold Forord Børne- og læringssyn Etablering af nye fællesskaber Læring og motivation Tryghed og trivsel Eksempel på aktivitetsplan i Spiren Praktiske oplysninger Forord Abildgårdskolens ForårsSFO er et tilbud til alle kommende skolebørn. Det er hensigten at give børnene en god og tryg overgang fra børnehaven til skolen. ForårsSFO er hverken børnehave eller skole, men et tilbud midt imellem. ForårsSFO en på Abildgårdskolen hedder Spiren. Symbolikken i dette er at se børns læring som en spiringsproces. ForårsSFO en ligger i vores SFO, hvor vi har gode faciliteter til børnenes leg og læring. ForårsSFO en starter d. 1. marts, og pædagogikken målrettes de børn, som skal starte i skole til august. De pædagogiske målsætninger er: Etablering af nye fællesskaber Læring og motivation Tryghed og trivsel På de følgende sider kan du læse mere om, hvordan vi på Abildgårdskolen vil arbejde med målsætningerne i vores ForårsSFO.\n3 Børne- og læringssyn Med udgangspunkt i skolens værdigrundlag har vi beskrevet det børnesyn, der ligger til grund for vores pædagogiske arbejde i Spiren. Vi mener, at alle børn har ressourcer og potentiale til at udvikle sig, hvis de får den rette støtte og hjælp, herunder skabelsen af gode relationer. Børn udvikler sig socialt og personligt i samspil med andre børn og voksne. Vi ønsker, at børnene kan indgå i fællesskaber med respekt for hinanden og for forskellighed. Vi anerkender vigtigheden af legens og venskabers betydning for barnets udvikling, herunder motivationen til den faglige indlæring. Leg og læring hænger sammen og er hinandens forudsætninger. Derfor vil vi sikre, at børnene i Spiren får god tid til at lege og styrke deres venskaber på tværs af børnegruppen. Børnene skal lære demokratiske spilleregler, have medindflydelse og inddrages i beslutninger, der har betydning for deres hverdag.\n4 Etablering af nye fællesskaber På Abildgårdskolen modtager vi børn fra ca. 20 forskellige børnehaver. Der vil derfor i starten være et ekstra fokus på, at børnene skal lære hinanden at kende og blive trygge i gruppen. Børnene skal udvikle en forståelse af sig selv som en vigtig del af fællesskabet. De skal lære, at de alle har et medansvar for, at hele gruppen har det godt og at rumme forskelligheder. Børnenes sociale kompetencer udvikler sig i fællesskaber og gennem relationer til andre. Det er i det daglige fællesskab, i kommunikationen med andre børn og voksne, at børnene bliver socialt kompetente. Målsætninger At børnene tør kaste sig ud i nye udfordringer At børnene tør spørge andre børn om de vil lege At børnene selv igangsætter lege og aktiviteter At børnene udviser tryghed ved de andre børn\n5 Tryghed og trivsel Børn, der er trygge og som trives godt, lærer mest. ForårsSFO en giver os muligheden for, at de kommende skolebørn lærer skolen, kammeraterne og de voksne godt at kende, inden de rigtigt skal starte i skolen. Derfor bruger vi en masse tid på, at børnene skal lære skolen godt at kende. Det gælder både i forhold til de nye kammerater, voksne, skolens rammer og skolens rytme. Målsætninger: At børnene kan administrere fri leg At børnene leger med flere forskellige børn At børnene opsøger de voksne for at få hjælp\n6 Eksempel på aktivitetsplan i Spiren Aktiviteterne i Spiren vil være forskellige, efterhånden som børnene bliver mere trygge i gruppen. Vi vil bestræbe os på at have en plan, der som minimum rækker en uge frem i tiden, så både børn og forældre ved, hvad der arbejdes med. Herunder er et eksempel på en aktivitetsplan: Mandag Tirsdag Onsdag Torsdag Fredag Eleverne møder ind. Der tilbydes stille aktiviteter Børnemøder med frugt Eleverne møder ind. Der tilbydes stille aktiviteter Børnemøder med frugt Eleverne møder ind. Der tilbydes stille aktiviteter Samling med undervisningen Børnemøder med frugt Eleverne møder ind. Der tilbydes stille aktiviteter Børnemøder med frugt Eleverne møder ind. Der tilbydes stille aktiviteter Fælles børnemøde med frugt og den gode gerning Fælles madpakke tid Aktiviteter med Børnehaveklasselederne Fælles madpakke Fælles madpakke Fælles madpakke tid Fælles madpakke tid tid tid Udeliv for alle elevevever Udeliv for alle ele- Udeliv for alle ele- Kreativværksted Kreativværksted Kreativværksted Kreativværksted Kreativværksted Aktiviteter for ForårsSFO og elever der er tilmeldt SFO Aktiviteter for ForårsSFO og elever der er tilmeldt SFO Aktiviteter for ForårsSFO og elever der er tilmeldt SFO Aktiviteter for ForårsSFO og elever der er tilmeldt SFO Aktiviteter for ForårsSFO og elever der er tilmeldt SFO\n7 Praktiske oplysninger ForårsSFO starter: 1. marts 2015 Åbningstid: Forårs SFO aktiviteter i tidsrummet Pris: Prisen for at gå i ForårsSFO følger kommunens vejledende priser for institutionstilbud og er dermed uændret ift. betaling for børnehaven. Husk: Skiftetøj, inde sko, en stor madpakke Kontaktoplysninger: Telefonnummer til skolen: i tidsrummet og fredag Telefonnummer til Spiren : Skolens hjemmeside:\n8 Vi vil gøre alt, hvad vi kan for at sætte rammer for en god start for eleverne på Abildgårdskolen. Vi er sikre på, at hverdagens nye rytmer hurtigt vil give mening, både for elever og forældre. På gensyn!


Sådan Design en indkørsel på en skråning\nSådan Design en indkørsel på en skråning\nBane din egen indkørsel er et omkostningseffektivt alternativ til at ansætte entreprenører. Installation af indkørsel på en nedadgående skråning løber væk fra dit hus eller bygning er ideel til dræning formål. Du kan lave en weekend projekt ud af at designe og installere en dejlig indkørsel mønster , hvis du bruger bane blokke fra en lokal hjem forbedring retailer.Things du har brug\nRope , tape eller flag som markører\nBesøg din lokale home forbedring forhandler for at købe bane blokke, der stilmæssigt passer til dit hjem og indkørsel design. Tal med en salgsrepræsentant for rådgivning om hvilke blokke er omkostningseffektive og egner sig bedst til at designe en skrå indkørsel . Nogle bane blokke kommer i en påtænkt design mønster , men andre giver dig frihed til at skitsere dit eget layout .\nOvervej et design for Pave blokke, der passer til din indkørsel nedadgående hældning . Skitser et layout , hvis du er så kunstnerisk tilbøjelige . Ellers konsultere et hjem forbedring specialist til at sørge for din bestemt blok bane design er praktisk og vil fungere korrekt som pr indkørslen hældning . Undgå store mellemrum mellem blokke i dit design. Blokkene bør interlock , og kun give plads til en let dækning af sand til at falde mellem deres revner.\nMarkér det område, du ønsker at bane hvis det ikke allerede er angivet . Afsnit det med reb eller flag markører. Dette er ikke kun vigtigt at den faktiske mursten om proces , men du kan også bruge dette område til at få vist dit design.\nLay nogle af Pave blokke over påtænkte indkørsel område som praksis . Test dit design på denne måde , og beslutte, hvordan det bedst passer , når det er tid til at lægge Pave blokke. Sørg for, at blok mønster gælder formular langs en nedadgående hældning . Husk at tage bredde- dimensioner af din edge begrænsninger i betragtning under dit layout praksis .\nInstallationsvejledning til automatisk portåbner\nDen korrekte måde at bane en indkørsel\nHvordan man opbygger Lige og Curb & Gu…\nHvordan man kan anslå en asfalt indkø…\nEr der en fordel at Seglcoatingen en i…\nReparation Cracked Mørtel Mel…\nKan jeg bruge Blackout Cellula…\nHvordan man opbygger en Slidin…\nSådan fjernes rust fra et ark…\nSådan kører Conduit i Isoler…\nHvordan man opbygger Træ trin…\nKlukkende lyd fra en Steam Rad…\nSådan Hæld Beton på Sand\nSådan beregne omkostningerne …\nHvordan man opbygger et land I…\nSådan Forbered hælde beton i…\nHvordan man kan anslå grus ti…\nDekorative Beton Indkørsel Id…