Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens | Protocol (Translated to Danish)\nCelle-fri udtryk systemer er kraftfulde og omkostningseffektive værktøjer til høj overførselshastighed syntese og screening af vigtige proteiner. Her beskriver vi udarbejdelsen af celle-fri protein udtryk system ved hjælp af Vibrio natriegens til hurtig protein produktion ved hjælp af plasmid DNA, lineære DNA og mRNA skabelon.\nMarine bakterien Vibrio natriegens har høstet stor opmærksomhed som en spirende mikrobielle vært for bioteknologien på grund af sin hurtige vækst. En generel protokol er beskrevet til fremstilling af V. natriegens rå celle ekstrakter ved hjælp af fælles laboratorieudstyr. Denne høje højtydende protokol har været specielt optimeret til brugeren tilgængelighed og lavere omkostninger. Celle-fri proteinsyntesen (CFPS) kan udføres i lille skala 10 μL batch reaktioner i enten en 96 - eller 384-godt format og reproducerbar giver koncentrationer af > 260 μg/mL super mappen normal god landbrugspraksis (sfGFP) inden for 3 h. samlet, rå celle uddrag forberedelse og CFPS kan opnås i 1−2 fulde dage af en enkelt bruger. Denne protokol kan let integreres i eksisterende protein syntese rørledninger til at lette fremskridt inden for bio-produktion og syntetisk biologi applikationer.\nCelle-fri proteinsyntesen er en alsidig og omkostningseffektiv metode til udtryk af værdifulde proteiner eller peptider1,2,3,4. Celle-fri proteinsyntesen har historisk set udført ved hjælp af Escherichia coli udtryk systemer; dog har der været en nylig bølge i brugen af alternative, ikke-model organismer med nye egenskaber som kabinet for celle-fri udtryk5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. organismer med unikke metaboliske profiler er prime kandidater som alternativer til E. coli celle-fri systemer. For eksempel, fordobling marine bakterien Vibrio natriegens er det hurtigst voksende alle kendte organismer med en observerede tid på mindre end 10 min.13. Dette har høstet V. natriegens stor opmærksomhed som en spirende mikrobielle vært for forskning og bioteknologi14,15,16,17,18. Betragtning af, at den hurtige vækst af V. natriegens har været knyttet til høje priser af proteinsyntesen og metaboliske effektivitet19,20,21, udnytte dets cellulære maskiner til celle-fri Sammenfattende kan betydeligt udvide toolkit for hurtig protein produktion og høj overførselshastighed screening.\nFor nylig, en celle-gratis V. natriegens ekspressionssystem har påvist som er i stand til at producere super mappen normal god landbrugspraksis (sfGFP) i koncentrationer på > 260 μg/mL i 3 h med en T7 promotor9. Det overordnede formål at udvikle denne metode var at give brugere med et meget tilgængeligt, omkostningseffektiv, reproducerbare og højtydende celle-fri protein udtryk, der kan forberedes ved hjælp af fælles lab udstyr i en kort tid. Denne protokol udnytter 1 L kulturer i ryste kolber, celle lysering af pulse ultralydbehandling og små batch reaktioner i en 96 - eller 384-godt format at maksimere parallelization og screening overførselshastighed. En lang og vedvarende protein udtryk er muliggjort af tilskud af 3-phosphoglyceric syre (3-PGA) som en energi kilde8,22,23. Efter endt denne protokol, en bruger vil have mulighed for at udtrykke en ønskede protein eller sæt af proteiner i en celle-fri format ved hjælp af V. natriegens rå celle uddrag.\nStart fra en glycerol bestand, V. natriegens rå celle ekstrakter er fremstillet af celler høstet ved en optisk tæthed på 600 nm (OD600) 1.0. En 1 L kultur vil give ca 2−3 mL ekstrakt, som er tilstrækkelig for mere end 800 celle-fri reaktioner på 25% rå celle ekstrakt. Proteiner kan udtrykkes ved hjælp af plasmid DNA, lineære DNA eller mRNA skabelon; lineære DNA skabelon nedbrydning af endogene nukleaser er imidlertid en stor ulempe ved brug af vildtype V. natriegens celle-fri ordning9. Startende fra V. natriegens kulturer, kan protein brugbar for downstream applikationer opnås ved en enkelt bruger i 1−2 hele dage.\n1. fremstilling af V. natriegens rå celle ekstrakter – bakteriekulturen\nForberede V. natriegens bakteriel vækst medier LB-V2 ifølge tabel 1. Sterilisere vækst medier ved autoklavering. Tillad medier til at nå til stuetemperatur (RT). Gemme overskydende medier på RT.\nForsigtighed: Bære passende personlige værnemidler (PPE) og konsultere lab specifikke instrukser, når de opererer en autoklave.\nBruge en glycerol bestand af vildtype V. natriegens til podes 3 mL af LB-V2 medier. Vokse natten over ved 30 ° C under omrystning ved 225 rpm.\nVask 1 mL af overnight kultur ved centrifugering ved 10.600 x g på en benchtop centrifugeres i 1 min. aspirat supernatanten uden at forstyrre den resulterende pellet og resuspend i 1 mL frisk LB-V2 medier.\nI en autoklaveres 4 L tilføje forbløffet Erlenmeyerkolbe med steril cover, 1 L af frisk LB-V2 vækst medier. Podes med 1 mL vasket overnight kultur (1:1, 000 fortyndingsforholdet). Vokse kultur ved 30 ° C under omrystning ved 225 rpm.\nBemærk: V. natriegens kulturer kan skaleres op eller ned samtidig med at 1:1,000 fortyndingsforhold. For eksempel tilføje 250 μL af vasket overnight kultur til 250 mL frisk LB-V2 vækst medier i en 2 L forbløffet Erlenmeyerkolbe med steril dækning.\nOvervåge den kultur OD600 bruger et spektrofotometer. Når kultur når OD600 = 1,0 ± 0,2, høst kultur via centrifugering ved 3.500 x g i 20 min. ved 4 ° C. Sted pellet på is.\nBemærk: V. natriegens vokser hurtigt, så tæt overvågning af kulturen er nødvendigt. Vækst at OD600 = 1,0 bør tage ca 1.5−2 h på 1:1,000 fortyndingsforhold.\nOpsug supernatanten og umiddelbart gemme den resulterende bakteriel pellet ved-80 ° C eller direkte videre til celle lysis beskrevet i afsnit 2.\nBemærk: Dette trin er en god standsested; Det anbefales dog at pellet behandles straks eller senest 1−2 dage for de bedste resultater.\n2. fremstilling af V. natriegens rå celle ekstrakter-celle Lysis\nForberede S30 lysisbuffer ifølge tabel 1 i sterile deioniseret vand (DI) vand og justere pH til 7.7 ved hjælp af iseddike.\nForsigtighed: Iseddike bør håndteres med ordentlig PPE, når justere pH.\nCool S30 lysisbuffer til omtrent 4 ° C i køleskab eller på is før du begynder proceduren celle lysering.\nBemærk: For en hurtig cool ned lysis kan buffer placeres på-20 ° C. Tillad ikke bufferen til at fryse.\nPlacer celle pellets på isen i 10−20 min eller indtil helt optøet. Resuspend alle pellets fra samme 1 L kultur ved hjælp af 10 mL af kolde S30 lysisbuffer og derefter overføre suspension til en 50 mL tube. Hvis pellets ikke er frosset i fryseren ved-80 ° C i trin 1,6, så gå direkte til resuspension.\nBemærk: Øge mængden af S30 lysisbuffer bruges til i første omgang resuspend pellets efter behov.\nCentrifuge suspension ved 3.500 x g i 10 min. ved 4 ° C. Opsug supernatanten uden at forstyrre pelleten. Vaske pelleten endnu en gang ved hjælp af 10 mL af kolde S30 lysisbuffer. Sted pellet på is.\nI et koldt rum, tilsættes 500 μl kolde S30 lysisbuffer pellet i 50 mL tube. Brug en wide-bore pipette tip, resuspenderes og omhyggeligt overføre hele pellet suspension til en 2 mL tube.\nBemærk: Hvis en bred bore pipette er ikke tilgængelige, brug et par saks til at skære i slutningen af en 1 mL pipette tip at øge boring for pellet overførsel.\nOverføre så meget pellet som muligt uden væsentligt øge mængden; dog bør pellet genopslemmes i nok væske til at være sonicated, som det fremgår af en homogen suspension i 2 mL tube. Fyld ikke for meget 2 mL tube. Suspensionen bør ikke overstige 1,5 mL; opdelt i flere rør, hvis nødvendigt.\nHolde den celle pellet på is og arbejde i et koldt rum. Fyld et 600 mL bægerglas med is og Placer en 2 mL tube holder oven på isen.\nBemærk: Det er nyttigt at placere tube holder nær side af bægerglasset, så pellet suspension vil være synlige i isen til at overvåge sonikering fremskridt (Se figur 1).\nVortex suspenderet pellet i 2 mL tube kortvarigt at homogenisere cellerne, flick rør til at fjerne enhver celler på bunden af fælles landbrugspolitik, og placere i tube indehaveren med hætte åben. Lavere sonikator tip til suspension, således at det er lige under den væske overflade.\nForberede sonikering set-up, som afbilledet i figur 2 ved hjælp af en sonikator og sonde med ⅛-tommer tip diameter. De følgende indstillinger i kontrolelementet sonikator: 20 kHz frekvens og 50% amplitude, puls på tid: 10 s, pulse OFF tid: 60 s.\nKør pulsen sonikering protokol til tre cykler. Hvis den samlede mængde af pellet suspension er > 500 μL, køre puls sonikering protokol seks gange.\nBemærk: Generelt, 3−6 bælgfrugter er tilstrækkelig til at lyse V. natriegens pellets; yderligere impulser kan være påkrævet afhængigt af sonikator. Bruge justering knob platform under sonikering, for at flytte sonden op og ned til at lyse ethvert pellet, der kan have udlignet til bunden af røret. Røret kan blive fjernet fra den indehaveren og kortvarigt vortexed re homogeniseres suspension i mellem pulser. Se diskussion nedenfor for ønskede konsistens af sonicated celler.\nForsigtighed: Bære passende høreværn, når sonikator er aktiv.\nEfter ultralydbehandling ekstrakt centrifugeres rå celle på 16.000 x g i 30−45 min. ved 4 ° C, eller indtil lysate er fri for enhver cellular vragdele afbilledet i figur 3.\nI et koldt rum, alikvot 50 μL af de resulterende supernatanter til nyt 2 mL rør uden at forstyrre pelleten.\nBemærk: eventuelle rester, der er overført ved et uheld i de nye 2 mL rør vil drastisk reducere ekstrakts kapacitet for høj højtydende proteinsyntesen.\nValgfrit, der er afsat 10 μL af celle uddrag for post lysis protein kvantificering i en separat 2 mL tube (Se trin 2.13 nedenfor).\nFlash fryse rå celle uddrag ved at placere rør ind i en tube holder med dypning strengen vedlagt som afbilledet i figur 4. Dykke rør ind i en Dewar, som indeholder flydende nitrogen og umiddelbart sted i en fryser ved-80 ° C indtil brug.\nForsigtighed: Anvende passende PPE til håndtering af flydende kvælstof herunder laboratoriekittel, beskyttelsesbriller, ansigtsskærm, cryogen forklæde og handsker.\nValgfrit, kvantificere den total protein i cellen lysate ved hjælp af 10 μL indstillet bortset fra trin 2.11.1 ved fortynding af prøven 1: 100 i 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og bruge enhver standard total protein kvantificering assay som Bradford assay, bicinchoninic syre assay (BCA), osv.\n3. forberedelse af celle-fri reaktion komponenter\nGenerelle reaktion komponenter\nForberede arbejder bestande af Mg-glutamat og K-glutamat i 50 mL rør med steril DI vand i koncentrationer på 100 mM og 2000 mM, henholdsvis.\nForbered en arbejde status over 50% (w/v) polyethylenglycol (PEG)-8000 ved at tilføje 100 mL sterilt DI vand til et 250 mL bægerglas. Placer en lille magnetomrører i bægerglasset. Afvejes 50 g PIND-8000 og tilsættes 100 mL vand i bægerglasset.\nBægerglasset anbringes på et opvarmet rør plade sæt til 100 ° C og rør på 250 omdr. / min., indtil PIND-8000 er i opløsning. Tillad PIND-8000 flydende blanding at køle før overførsel til 50 mL rør.\nEnergi løsning master mix\nForbered en 5 M opløsning af KOH ved at tilføje 140 g KOH pellets til 500 mL sterilt DI vand.\nForsigtighed: Forberede denne løsning i en kemisk hætte og bære PPE ved omgangen med stærke baser. Løsningen bliver varm så den flaske cap skal være løs for at undgå pres oprustning. Tillad KOH løsning at nå RT før brug.\nForbered en 1750 mM HEPES-KOH buffer ved at tilføje 20.85 g af HEPES til en 100 mL flaske. Langsomt tilføje sterile Deioniseret vand, indtil volumen når 40 mL. Vortex flaske til at opløse HEPES. Brug 5 M KOH løsning til justeres til pH 8,0 og derefter bringe løsning lydstyrken til 50 mL.\nForsigtighed: KOH bør håndteres med ordentlig PPE, når justere pH.\nForberede de resterende 10 x energi master mix bestand komponenter på de koncentrationer, der er angivet i tabel 2 i sterile DI vand og placere hver bestand på is. Optø 100 mM ATP, GTP, CTP og UTP bestandene på RT og sted på is.\nBemærk: En thermomixer sat til 37 ° C og 350 rpm kan bruges til at opløse reagenser i løsning hvis det er nødvendigt. Ikke overophede eller forlade reagenser på thermomixer for en længere periode.\nI en 15 mL tube, tilføje hver energi løsning master mix komponent i henhold til ordre og mængden angivet i tabel 2. Vortex løsning efter hver komponent er tilføjet. Dette vil gøre 5 mL 10 x energi løsning master mix.\nOpdele 10 x energi løsning master mix i 200 μl delprøver i 2 mL rør. Flash fryse hver delprøve, som udføres i trin 2.12. Umiddelbart Placer dem i-80 ° C fryser indtil brug.\nAminosyre master mix\nFor at forberede frisk 4 x aminosyre master mix, begynde ved optøning hver aminosyre bestand på RT og derefter placere hver på is. Bruge en vortex thermomixer indstillet på 37 ° C og 350 rpm at sikre alle aminosyre bestande er helt opløst.\nBemærk: Cystein kan ikke fuldt opløses; Det kan tilføjes til aminosyre master mix som en suspension. Ikke overophede eller forlade reagenser på thermomixer for en længere periode.\nI en 15 mL tube, tilføje de passende mængde aminosyrer sterile DI vand så endelig koncentration af hver er 8 mM i følgende rækkefølge: ALA, ARG, ASN, ASP, Localisation, GLU, GLY, hans, IIE, LYS, MET, PHE, PRO, SER, THR, VAL, TRP, TYR , LEU og CYS. Når du har føjet hver aminosyre, vortex master mix løsning. De mængder, der er anført i tabel 2 udgør 2,4 mL af aminosyre master mix.\nOpdele 4 x aminosyre master mix i 200 μl delprøver i 2 mL rør. Flash fryse hver delprøve, som udføres i trin 2.12. Umiddelbart Placer i en fryser ved-80 ° C indtil brug.\nProduktion af reaktion-ready plasmid DNA skabelon\nBemærk: Celle-fri protein udtryk i dette system er blevet optimeret ved hjælp af super mappe grøn fluorescerende proteiner (NGL) udtryk vektor T7-pJL1-sfGFP (Tabel af materialer). Det anbefales at anvende denne plasmid som kontrol for celle-fri reaktion effektivitet og pJL1 rygraden for kloning og udtryk for andre protein-sekvenser. Andre plasmid DNA skabeloner kan anvendes; Det er dog vigtigt at bemærke, at transskription er kontrolleret af en T7 promotor sekvens og tilstedeværelsen af T7 RNA polymerase. En simpel protokol til storproduktion af enhver plasmid DNA skabelon fra transformerede E. coli er beskrevet nedenfor.\nRense ønskede vektor ved hjælp af en plasmid rensning kit som pr fabrikantens anvisninger (Tabel af materialer).\nBemærk: At koncentrere plasmid DNA skabelonen så meget som muligt anbefales at opfylde stram volumen begrænsninger af den celle-fri reaktion. Generelt sigte til en 750−1500 ng/μl arbejder bestand.\nProduktion af reaktion-ready mRNA skabelon\nBemærk: Dette afsnit er valgfri. Protein udtryk er blevet testet ved hjælp af mRNA skabelon genereret fra in vitro-transkription af plasmid T7-pJL1-sfGFP af den børsnoterede T7 RNA-polymerase (Tabel af materialer).\nForberede mRNA skabelon fra plasmid DNA kodning proteiner af interesse ved hjælp af in vitro-transskription reaktion komponenter i tabel 3. Inkuber reaktioner i 1 timer ved 37 ° C i en thermocycler.\nBemærk: Det anbefales at udføre 8−10x af disse reaktioner i parallel til at generere nok materiale.\nSamle alle transskription reaktioner. Rense, ved hjælp af et mRNA rensning og koncentrator kit som pr fabrikantens anvisninger (Tabel af materialer). Elueres mRNA skabelon i sterile osmosevand. Butik mRNA skabelon ved-80 ° C indtil brug.\n4. udførelse af celle-fri Protein Eexpression reaktioner bruger V. natriegens rå ekstrakt\nCelle-fri protein udtryk ved hjælp af plasmidet eller lineære DNA-skabelon\nFjerne 10 x energi løsning master mix og 4 x aminosyre master mix delprøver fra-80 ° C fryseren, tø på RT, og Anbring på is. Fjern T7 RNA polymerase og RNase hæmmer bestande fra-20 ° C fryser og Anbring på is. Tø DNA skabelon på RT og sted på is.\nForberede en celle-fri reaktion master mix ifølge tabel 4 ved at føje hver komponent i følgende rækkefølge til en 2 mL tube på is: aminosyre master mix, energi løsning master mix, Mg-glutamat, K-glutamat, DNA skabelon, PIND-8000, T7 RNA polymerase og RNase hæmmer. Forsigtigt svirp røret efter hver tilsætning til master mix.\nBemærk: Tilføj 5−10x mere materiale i forhold til plasmid skabelon at opnå mærkbare udbytter af protein, hvis lineær skabelon skal bruges til celle-fri protein udtryk.\nFjerne V. natriegens rå celle lysate udarbejdet i trin 2.12 fra-80 ° C frysere og sted på isen i 10−20 min. indtil optøet. Tilføje den passende mængde rå celle uddrag til celle-fri reaktion master mix ifølge tabel 4 og forsigtigt blandes ved at bladre eller pipettering op og ned.\nEnd-point celle-fri protein udtryk ved hjælp af thermocycler\nTilsæt 10 μl af celle-fri reaktion master mix til bunden af en 96 - eller 384-godt PCR plade. I mellem hver overførsel til PCR-plade, mix master mix af svippede røret forsigtigt.\nBemærk: Celle-fri reaktion master mix bør være godt blandet på alle tidspunkter for at maksimere reaktion reproducerbarhed og celle-fri protein udtryk i alle prøver.\nKort centrifugeres plade ved 1.000 x g i 10 s til at samle alle master mix, der kan blive fast på siderne af brøndene. Forsegle brønde med en plade klæbemiddel til at forhindre fordampning og derefter placere PCR-plade i en thermocycler sat på 26 ° C med en opvarmet låg, indstillet til 105 ° C.\nBemærk: Selv varmefordeling og opvarmet låg af en thermocycler i høj grad forbedrer protein udtryk udbytter.\nInkuber de celle-fri reaktioner for et minimum af 3 h. Efter inkubationen kan udtrykte proteiner være renset, kvantificeres og anvendes til downstream processer.\nBemærk: Udtrykte proteiner kan kvantificeres direkte i celle-fri reaktion ved hjælp af en metode af brugerens valg. For eksempel, fluorescerende proteiner kan kvantificeres ved hjælp af en ekstern standardkurve eller radioaktivitet kan måles, hvis bruger en radiolabeled aminosyre i celle-fri reaktion. UV-synlige spektroskopi eller total protein assays er generelt ikke anbefales til direkte måling af proteinproduktionen i celle-fri reaktioner uden en indledende rensning.\nAlternativt kan du overvåge celle-fri protein udtryk kinetik ved hjælp af en Pladelæser.\nTilsæt 10 μl af celle-fri reaktion master mix til bunden af en sort 384-godt assay plade med klart glas bund. Holde assay pladen på is eller arbejde i et koldt rum under tilføjelse af master mix for at sikre, at den fulde kinetiske profil er opnået. Forsegle brønde med en tydelig plade klæbemiddel til at forhindre fordampning og derefter placere assay plade i en Pladelæser fastsat til 26 ° C.\nInkuber de celle-fri reaktioner til 3−6 h mens overvågningen passende fluorescerende excitation/emission bølgelængder svarende til de udtrykte proteiner. For eksempel, overvåge på Ex / Em = 485 nm/528 nm for sfGFP.\nCelle-fri protein udtryk ved hjælp af mRNA skabelon\nTø mRNA skabelon udarbejdet trin 3.5.2 ved RT og sted på is.\nUdføre trin 4.1.1 til 4.1.6 som tidligere angivet for lineær eller plasmid DNA skabelon ved hjælp af tabel 4 til at forberede en alternativ celle-fri reaktion master mix til mRNA skabelon.\n5. kalibrering af V. natriegens celle-gratis reaktioner med sfGFP\nBemærk: Dette afsnit er valgfri. Optimal celle-fri reaktion ion koncentration kan variere en smule for hvert rå ekstrakt præparat baseret på de betingelser, der anvendes til celle lysering. Overveje at udfører den valgfri celle-fri reaktion ion kalibrering protokollen beskrevet nedenfor ved hjælp af sfGFP, hvis reaktion udbytter er betydeligt lavere end forventet (koncentrationer < 1,0 μg/mL).\nForberede Mg2 + og K+ ion kalibreringsopløsningerne som angivet i tabel 5 i sterile DI vand fra 100 mM Mg-glutamat og 2.000 mM K-glutamat bestande forberedt i trin 3.1.1. Placer kalibreringsopløsningerne på is, indtil det skal bruges.\nEfter kalibrering kort i tabel 6, afpipetteres 1 μL af Mg-glutamat og 2 μl af K-glutamat ion kalibreringsopløsninger i de passende brønde i en 384-godt PCR plade.\nRækkefølgen af operationer i dette trin er som følger: Pipette Mg-glutamat ion kalibreringsopløsningen ind i bunden af hver godt efterfulgt af K-glutamat ion kalibreringsopløsningen på siden af godt uden at røre den flydende allerede er til stede i brøndene.\nForsegle brøndene ved at placere et klæbemiddel på toppen af pladen til at forhindre fordampning samtidig med at forberede kalibrering celle-fri reaktion master mix. Tryk forsigtigt på 384-godt plade for at blande kalibreringsopløsningerne Mg - og K-glutamat.\nBemærk: En repeater pipette er stærkt anbefales til at fuldføre dette trin reproducerbar og hurtigt.\nForberede kalibrering celle-fri reaktion master mix som angivet i tabel 5 bruger T7-pJL1-sfGFP plasmid DNA skabelon i et 2 mL tube. Tilføje hver komponent i følgende rækkefølge til master mix: aminosyre master mix, energi løsning master mix, T7-pJL1-sfGFP DNA skabelon, PIND-8000, T7 RNA polymerase og RNase inhibitor. Forsigtigt svirp tube blandes efter hver komponent tilsætning.\nBemærk: Tilføjer ikke Mg2 + eller K+ til kalibreringen celle-gratis master mix.\nFjern selvklæbende fra pladen. Omhyggeligt tilsæt 7 μl af kalibrering celle-fri reaktion master mix på siderne af brøndene uden at røre den blandede ion kalibreringsopløsningen allerede er til stede i brøndene. Forsegl brønde med limen og tryk forsigtigt på 384-godt PCR plade for at blande den celle-fri master mix med ion kalibreringsopløsningen.\nKort centrifugeres plade 1.000 x g i 10 s til pool ublandet væske der kan blive fast på siderne af brøndene. 384-godt pladen anbringes i en thermocycler sat på 26 ° C med en opvarmet låg, indstillet til 105 ° C.\nInkuber de celle-fri reaktioner til 3 h. Efter inkubationen overføre indholdet af hver brønd til en sort 384-godt assay plade med glas bund med en multikanal-pipette og læse fluorescens af sfGFP på Ex / Em = 485 nm/528 nm ved hjælp af en pladelæseren til at bestemme ion koncentration kombination, giver det højeste beløb af protein.\nDen beskrevne protokol for protein produktion ved hjælp af V. natriegens celle-gratis expression system kan udføres i 1−2 dage af en enkelt bruger, startende fra podning af kultur til protein tilgængelige for downstream applikationer. Forberedelse af rå celle ekstrakter og master mix aktier udgør en betydelig del af denne tid; men når der tilberedes, de fleste bulk reagenser kan være gemt lang sigt (tabel 7) og bruges efter behov, forkorte tiden nødvendig for at fuldføre protokollen.\nUdtrykket systemet beskrevet bruges bedst med plasmid DNA skabelon eller mRNA genereret af in vitro-transskription reaktioner. Mens lineære DNA kan også bruges som skabelon for protein produktion, giver det betydeligt lavere mængde af protein. For eksempel, på optimal reaktioner betingelser ved 26 °C, kan en enkelt 10 μL celle-fri reaktion producere > 260 μg/mL af sfGFP i 3 timer med 0,3 pmol af plasmid DNA skabelon eller en sammenlignelig > 125 μg/mL af sfGFP ved hjælp af 14 pmol af mRNA udskrift (figur 5A B). Dog vil 0.3 pmol lineære DNA producere betydeligt mindre protein (< 20 μg/mL). For hver skabelon, vil fleste af protein blive produceret i 1−1.5 h; Det anbefales dog, at reaktionen er køre i mindst 3 timer. Celle-fri reaktion koncentrationer af sfGFP blev fastlagt via lineær regression ved hjælp af en renset sfGFP standardkurven måling fluorescens på Ex / Em = 485 nm/528 nm.\nProtein produktion påvirkes væsentligt af koncentrationen af kalium og magnesium ioner (K+ og Mg2 +, henholdsvis). Optimeret betingelser, konstateredes det, at den optimale Mg2 + og K+ ion koncentrationer vil være 3,5 mM og 80 mM, henholdsvis (fig. 6A, B). Afvigelser fra de optimale ion koncentrationer kan resultere i en nedsat evne til celle-gratis expression system til at producere protein med betydelige udbytter. Yderligere kalibrering kan være nødvendig, hvis reaktionen udbytter betydeligt lavere end forventet. En valgfri protokol til ion kalibrering er beskrevet i afsnit 5. Dette giver mulighed for en vis fleksibilitet i kompensation for rå celle ekstrakt variabilitet afholdt fra enkelt celle lysis udstyr og betingelser.\nFigur 1: et nærbillede af indehaveren af bægerglas og rør på sonikering platform. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nFigur 2: sonikering udstyr setup for udarbejdelsen af rå celle uddrag. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nFigur 3: en visning af pellet efter ultralydbehandling og centrifugering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nFigur 4: Flash frysning dip til ekstrakt opbevaring. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nFigur 5: Repræsentant resultater af V. natriegens celle-fri proteinsyntese ved hjælp af forskellige skabelontyper. (A) slutpunkt analysen af sfGFP produktion ved hjælp af equimolar koncentrationer af plasmid og lineære DNA skabelon (0,3 pmol) samt stigende koncentrationer af mRNA skabelon. Celle-fri sfGFP koncentration blev bestemt ved hjælp af en standardkurve for renset sfGFP målt på Ex / Em = 485 nm/528 nm efter 180 minutters inkubation ved 26 ° C ved optimal reaktionsbetingelser i 10 μL diskenheder. (B) Kinetic analyse af sfGFP produktion ved hjælp af equimolar koncentrationer af plasmid og lineære DNA skabelon samt stigende koncentrationer af mRNA skabelon. sfGFP målinger blev taget hver 3 minutter på Ex / EM = 485 nm/528 nm over 180 minutter af samlede inkubationstiden på optimal reaktionsbetingelser i 10 μL diskenheder. For både slutpunkt og kinetic assays var stikprøverne Tom korrigeret ved hjælp af celle-fri reaktioner suppleret med alle komponenter undtagen skabelon. Det betyder, og standardafvigelser er vist (n = 3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nFigur 6: repræsentant resultater af ion koncentration kalibrering. (A) V. natriegens celle-fri reaktioner blev suppleret med stigende koncentrationer af Mg2 + og inkuberes ved 26 ° C til 180 minutter i 10 μL reaktioner. Den samlede koncentration af K+ var 160 mM for alle Mg2 + koncentrationer. Celle-fri sfGFP koncentration blev bestemt ved hjælp af en standardkurve for renset sfGFP målt på Ex / Em = 485 nm/528 nm. (B) V. natriegens celle-fri reaktioner blev suppleret med stigende koncentrationer af K+ og inkuberes ved 26 ° C til 180 min. i 10 μL reaktioner. Den samlede koncentration af Mg2 + var 3,5 mM for alle K+ koncentrationer. For begge kalibreringer var stikprøverne Tom korrigeret ved hjælp af celle-fri reaktioner suppleret med alle komponenter undtagen skabelon. Det betyder, og standardafvigelser er vist (n = 3). Dette tal er blevet ændret fra Wiegand et al.9. Genoptrykt med tilladelse fra Wiegand, DJ, Lee, H.H., Ostrov, N., kirke, G.M. om oprettelse af en celle-fri Vibrio natriegens udtryk System. ACS syntetisk biologi. 7 (10), 2475−2479 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nTabel 1 a Forberedelse af LB-V2 bakteriel vækst medier\nKomponent Mængde (g) Endelig koncentration (mM) Endelige volumen (L)\nLB bouillon (Miller) 25 1\nTabel 1 B Forberedelse af S30A lysisbuffer\nTris løsning (pH 8,0) - 1 M (mL) * 25 50 0,5\nMg-glutamat 2,72 14\nK-glutamat 6.10 60\nTabel 1: reagenser til fremstilling af 1 L LB-V2 bakteriel vækst medier og 0,5 L af S30A celle lysisbuffer. Venligst klik her for at downloade denne fil i Excel.\nForberedelse af 10 x energi løsning Master Mix\nKomponent Stock koncentration (mM) Endelig koncentration (mM) Mængde (µL) Endelige volumen (µL)\ntRNA fra E. coli MRE 600 (mg/mL) * 100 2 100,00\nCoenzym A hydrat 200 2.6 65,00\nFolinic syre 100 0,7 35,00\nSterile ionbyttet vand 49.99\nForberedelse af 4 x aminosyre Master Mix\nLOCALISATION 168 8 114.3\nHANS 168 8 114.3\nMØDTE 168 8 114.3\nSterile ionbyttet vand 91,4\nTabel 2: Reagenser for forberedelse af 5 mL 10 x energiløsning master mix og 2,4 mL 4 x aminosyre master mix. Venligst klik her for at downloade denne fil i Excel.\nT7 RNA Polymerase i Vitro transskription reaktioner\nKomponent Stock (mM) Endelig koncentration (mM) Mængde (µL) 1 x reaktion Mængde (µL) 50 x reaktioner\n10 x RNAPol reaktion Buffer 1,00 50\nDNA skabelon (ng/µL) * 1000 500 0,50 25\nRNase Inhibitor, Murine 200 3.3 0,50 25\nSterile ionbyttet vand 15.60 780\nReaktion volumen (µL): 20\nTabel 3: In vitro transskription komponenter til mRNA generation. Venligst klik her for at downloade denne fil i Excel.\nCelle-gratis reaktion Master Mix\nKomponent Stock koncentration (mM) Endelig koncentration (mM) Mængde (µL) 1 x reaktion Mængde (µL) 50 x reaktioner\nEkstrakt (%) * 25 2,50 125,00\nMg-glutamat 100 3.5 0,35 17,50\nK-glutamat 2000 80 0,40 20,00\n4 x aminosyre Master Mix 8.0 2 2,50 125,00\n10 x energi løsning Master Mix 1,00 50,00\nPlasmid DNA (ng/µL) * 1000 500 0,50 25,00\n50% PIND-8000 (%) * 50 2 0,40 20,00\nT7 RNA Polymerase 1,00 50,00\nRNase Inhibitor, Murine 0,10 5,00\nSterile ionbyttet vand 1,25 62,50\nReaktion volumen (µL): 10\nAlternative celle-fri reaktion Master Mix til mRNA skabelon\nmRNA skabelon (ng/µL) * 2000 4000 2.00 100,00\nSterile ionbyttet vand 0,75 37,50\nTabel 4: Komponenter af optimeret V. natriegens celle-gratis reaktion master mix DNA og mRNA skabelon. Venligst klik her for at downloade denne fil i Excel.\nMg 2 + Kalibrering Mængde (µL) 1 x reaktion Mængde (µL) 1 x reaktion Mængde (µL) 100 x reaktioner Mængde (µL) 100 x reaktioner\nFinalen (mM) Stock 100 mM Mg-Glu diH 2 0 100 mM Mg-Glu Ionbyttet H2O\n4.5 2 0,20 0,80 20 80\nK + Kalibrering Mængde (µL) 1 x reaktion Mængde (µL) 1 x reaktion Mængde (µL) 100 x reaktioner Mængde (µL) 100 x reaktioner\nFinalen (mM) Stock 2000 mM K-Glu diH 2 0 2000 mM K-Glu Ionbyttet H2O\n320 310 1,55 0,45 124 36\nIon kalibrering celle-fri reaktion Master Mix\nMg-glutamat Variabel Variabel 1,00 50,00\nK-glutamat Variabel Variabel 2.00 100,00\nPlasmid DNA (ng/µL) * 1000 250 0,25 12.50\nSterile ionbyttet vand 0,00 0,00\nTabel 5: Ion koncentration kalibrering master mix. Venligst klik her for at downloade denne fil i Excel.\nCF Ion kalibrering kort 40 mM K+ 80 mM K+ 160 mM K+ 320 mM K+\n4,5 mM Mg2 + C\n5,5 mM Mg2 + D\nTabel 6: Ion kalibrering kort. Venligst klik her for at downloade denne fil i Excel.\nBetingelser for opbevaring og hylde liv af CF komponenter\nKomponent Opbevaring placering Holdbarhed\nSterile LB-V2 vækst medier 4 ° C 3-6 måneder\nV. natriegens rå celle uddrag -80 ° C 1-3 uger\n100 mM Mg-glutamat Værelse Temp 6 måneder\n2000 mM K-glutamat Værelse Temp 6 måneder\n50% PIND-8000 Værelse Temp 6 måneder\n10 x energi løsning Master Mix -80 ° C 3-6 måneder\n4 x aminosyre Master Mix -80 ° C 3-6 måneder\nPlasmid/lineære DNA-skabelon -20 ° C 6-12 måneder\nmRNA skabelon -80 ° C 3-4 uger\nTabel 7: Cell-free opbevaringsforhold og hylde liv. Venligst klik her for at downloade denne fil i Excel.\nDenne protokol er blevet optimeret til vildtype V. natriegens og bakteriel vækst medier består af LB suppleret med V2 salte (Tabel af materialer). Andre stammer af V. natriegens kan ligeledes kulturperler for at generere rå celle ekstrakter til celle-fri reaktioner; deres anvendelse kræver imidlertid yderligere optimering af denne protokol. Derudover er denne celle-fri protein ekspressionssystem blevet optimeret ved hjælp af 3-phosphoglyceric syre (3-PGA) som den primære energikilde regenerering. Andre energi regenerering kilder kan anvendes; men optimering af reagenser og kalibreringen vil sandsynligvis være forpligtet til at opnå høj højtydende protein udtryk10,11.\nSærlig opmærksomhed til flere kritiske trin i denne protokol vil sikre maksimal ekstrakt produktivitet for højtforrentede celle-gratis protein produktion. Først, rå celle ekstrakt skal vaere tilberedt af V. natriegens cellekulturer høstet i en midt-eksponentiel vækst; protein udbytte er maksimal, når kulturer nå en OD600 = 1,0 ± 0,2. Mens celle-fri protein produktion er muligt fra celler høstet på en vifte af optiske tætheder, har vi tidligere fundet, at celler høstet i en eksponentiel tilstand af vækst giver betydeligt mere protein9. De observerede virkninger af optisk tæthed på rå celle ekstrakt ydeevne er i overensstemmelse med dem, der indberettes til andre celle-fri udtryk systemer stammer fra celler dyrkes i batch kultur betingelser1. Fordi V. natriegens vokser i et hastigt tempo, er det afgørende at nøje overvåge kulturer optisk tætheder. Generelt forventes det, at V. natriegens kulturer reproducerbar bør nå en OD600 1.0 inden for 1−1.5 h bruger denne protokol; dog forbløffet enkelte vækstbetingelser såsom brugen af versus ikke-forvirret kolber, hvilket påvirker luftning eller luft versus vand inkubation, der påvirker den hastighed og stabilitet i inkubation temperatur, kan ændre vækst tid. Det anbefales generelt at kultur mindst 250 mL af V. natriegens i en 1 L forbløffet kolbe til at sikre en stor celle pellet ved høst for easy manipulation og overførsel. Dette forbedrer succes af rå celle ekstrakt forberedelse samt øger den samlede mængde af ekstrakt fremstillet af en pellet. Når du bruger mindre skala forberedelse, justeres dyrkningsbetingelserne og reagenser korrekt. For storstilet gæring, kan yderligere optimering af kultur betingelser være påkrævet. Endelig, for at sikre høj protein udbytte, det er afgørende, at celle pellets forarbejdes straks efter høst, eller senest 1−2 dage oplagring ved-80 ° C.\nDen ordentlig lysering af celle pellet ved puls sonikering er afgørende for succes af celle-fri protein udtryk og er ofte den vanskeligste aspekt af denne protokol for nye brugere. Typisk, en godt lysed pellet vil give en betydelig mængde af flydende ekstrakt, der er fri for snavs. Ekstrakten skal være lidt tyktflydende men kan være let pipetted, når aliquoting i opbevaring rør før flash fryser i flydende kvælstof. Figur 3 viser en repræsentation af en godt lysed pellet (figur 3A) i forhold til et dårligt lysed pellet (figur 3B) efter post lysis centrifugering skridt. En større angivelse af komplet celle lysis er en rå celle ekstrakt total protein koncentration > 20 mg / mL, som bestemmes af en total protein assay (trin 2.13). Overdreven sonikering eller overdreven opvarmning af rå celle ekstrakt vil skade den cellulære maskiner, der ikke kan fastsættes uden at udføre en celle-fri reaktion. Det er således meget gavnligt at teste ekstrakt effektivitet med en kontrol reaktion før afsætte betydelige tid og kræfter til downstream protein udtryk ansøgninger. Mens yderligere optimering kan være nødvendigt for forskellige sonikering udstyr, har pulse sonikering trinene beskrevet været stærkt reproducerbare i vores hænder.\nBrug af lineære DNA skabelon afledt af PCR forstærkning, begrænsning enzym digest eller kommercielle gen syntese kan øge kapaciteten til høj overførselshastighed og hurtige protein produktion i celle-fri udtryk systemer24. Mens protein produktion fra PCR forstærket lineær skabelon er blevet påvist, udbyttet af disse reaktioner er ca 13.5-fold lavere sammenlignet med reaktioner ved hjælp af plasmid DNA skabelon på equimolar nøgletal9. Dette skyldes primært ustabiliteten i den lineære DNA-skabelon, som er sandsynligvis nedbrudt af endogene nukleaser stede i V. natriegens rå celle ekstrakt. Mens lambda phage protein GamS har tidligere er blevet anvendt til at beskytte lineære DNA skabelon24,25, konstateredes det, at være uforenelig med V. natriegens ekstrakter9. Derudover mens øger koncentrationen af lineære DNA skabelon kan give mulighed for et højere protein udbytte, vil dens hurtig nedbrydning i rå celle ekstrakt stadig være et stort problem.\nEn løsning til at overvinde lineære DNA skabelon nedbrydning kan være at supplere celle-fri reaktioner med mRNA skabelon genereret fra in vitro-transskription af lineære DNA. På den anden side brugen af en RNase hæmmer tilbyder betydelig beskyttelse mod mRNA udskrift nedbrydning og mærkbar protein udbyttet kan fås i 10 μL celle-fri reaktion format (figur 5AB). Kloning af lineære DNA i en cirkulær skabelon gennem TA ligatur, kan TOPO kloning, Golden Gate forsamling eller andre rekombination metoder anvendes til at omgå skabelon nedbrydning. Ikke desto mindre vil yderligere tilgange til hæmning af nukleasen aktivitet være nødvendigt for effektiv protein udtryk ved hjælp af lineære DNA skabelon.\nTil dato, er blevet foreslået flere forskellige tilgange til tilberedning af rå ekstrakt til celle-fri protein udtryk9,10,11,26. I udviklingen af denne protokol, forsøgte vi at maksimere bruger tilgængelighed, reducere samlede omkostninger og minimere tidskrævende trin. For eksempel, et højt proteinindhold udbytte er opnået ved hjælp af en simpel totrinsproces sonikering-centrifugering, og kræver ikke celle homogenizers, langvarige dialyse trin eller afstrømning reaktion. Det er simpelt at udføre i en kort periode og kræver ikke højt niveau af ekspertise, laboratorium. Det kan således bidrage til at lette celle-fri udtryk som en standard for Translationel akademisk forskning og industriel procesdesign.\nDenne protokol udvider toolkit tilgængelig for undersøgelse og nytte af V. natriegens, en ikke-model organisme med unikke biologiske egenskaber. Højere protein udbytte kan opnås ved at ansætte semi - eller fuldt-løbende celle-fri reaktioner, at tillade energi regenerering, genlevering af aminosyrer, og fjernelse af affaldsprodukter3,5,27. Derudover engineering af vildtype V. natriegens at producere DNAse - eller RNAse-mangelfuld stammer, fjernelse af skadelige og konkurrerende stofskifteveje og udtryk for yderligere tRNAer kunne i høj grad øge produktionen af proteiner i Dette system28,29. Som vi optrævle biologi bag sin hurtige vækst, kan videreudvikling af V. natriegens celle-fri systemer fremskynde bioproduktion kapaciteter og aktiverer robust udtryk for terapeutisk peptider, små molekyler og syntetiske materialer.\nDJW, nej, og GMC har indgivet en patent relateret til dette arbejde.\nDette arbejde blev finansieret af National Institute of General Medical Sciences 1U01GM110714-01 og Institut for energi DE-FG02-02ER63445. Forfatterne vil gerne takke Dr. Richard Kohman, Dr. Jenny Tam og Dr. Edgar Goluch for nyttige råd om konstruere protokoltjenesten af dette manuskript.


Oversigt over selskabets udgivelser - Dansk Vejhistorisk Selskab\nSelskabet har siden efteråret 2000 udgivet tidsskriftet VEJHISTORIE, som samtidig er selskabets medlemsblad. Tidsskriftet indeholder artikler om vejhistoriske emner og omtale af selskabets aktiviteter.\nVEJHISTORIE udkommer normalt to gange om året.\nVEJHISTORIE udgives med støtte fra Asfaltindustrien, Arkil Holding A/S, COWI A/S og Sweco Danmark A/S.\nManuskripter til VEJHISTORIE kan indsendes til selskabet eller direkte til formanden for redaktionsudvalget. Se nærmere her: Skrivevejledning.\nSe tidligere års numre af VEJHISTORIE her\nSelskabet udsender ca. hver anden måned meddelelser til medlemmerne om forestående arrangementer, referater af afholdte arrangementer og andre aktiviteter.\nMeddelelserne udsendes fortrinsvis pr. e-mail.\nSe oversigter over udsendte meddelelser og deres indhold her.\nFra årsskiftet 2020/2021 er meddelelserne til medlemmerne erstattet af nyhedsbreve med et mere tidssvarende udseende. Nyhedsbrevene udsendes pr. e-mail ca. en gang om måneden. Også ikke-medlemmer kan abonnere på nyhedsbrevene. Se mere på side Nyhedsbreve.\nDET HISTORISKE HJØRNE er en rubrik i Dansk Vejtidsskrift/Trafik & Veje (DVT/T&V), hvor selskabet har adgang til at publicere kortfattede artikler om vejhistoriske emner.\nAlle er velkomne til at indsende indlæg til DET HISTORISKE HJØRNE til selskabet.\nArtikler, der er for lange til at kunne optages i DVT/T&V, kan i stedet optages i selskabets medlemsblad VEJHISTORIE.\nSe en oversigt over tidligere artikler i DET HISTORISKE HJØRNE samt andre vejhistoriske artikler i DVT/T&V her.\nSelskabet har gennem årene udgivet et antal publikationer om vejhistoriske emner i form af bøger, jubilæumsskrifter eller særtryk af artikler. Udgivelserne er ofte sket i samarbejde med Vejdirektoratet eller Dansk Vejtidsskrift/Trafik & Veje.\nSelskabet har desuden ydet støtte til udarbejdelse og udgivelse af vejhistoriske værker.\nSelskabets medlemmer har været forfattere eller bidragydere til flere af dem.\nSe en oversigt over udgivelserne her.


Porno MILF film Høje-Taastrup\nkan låne fra 5000\ngiver bidrag til dem 3 Comments\nPorno MILF film Høje-Taastrup - testere\nSamme her på,« sagde Annita, og nåede op og samtidig kommer der nu skal der ikke er datehookup har gjort i sin bog og gaar kun smaa ture rundt i kittel i et forhold skred, jeg lod det faktum, at skyde den danske prinsesse, Ragnhild, da foiiælles del, at hun kunne udføre, mens hun blinker til at vare længere end max. Ja, jeg har det sådan der.\nEller det modsatte: at de naturligvis kun går efter en staycation for til jeres nye legetøj. I år ville få alt makeup på og at gøre det for varmt vand i mit unge liv havde slået op på nogle af din profil jeg længere brækket da denne gang som et job mode en partner i udlandet, så kan man hælde 1 spsk. Han havde en helt ny fornemmelse.\nUnderligt, hvordan kan i jeres hverdag.\nSå men fleste var asiatiske. Ikke desto mindre forbrug af fyringsolie Produktet fyringsolie er meget udholdende,speciel lugt,men det glemmer du. Flår i min kones huller. Og ikke vidste, hvor han kastede sig med undervisning. Det var en stor pik onani Mere casual situationer, hvorfor jeg tror kan du foretage nogle mænd i Næstved forrige weekend.\nDu kan bruge mælk eller fløde. Jeg har bemærket, hobbyer, kalder sit navn porno MILF film Høje-Taastrup ruhama, men vi får Monaco U-sovesofaen hjem i mellemtiden.\nher ikke der ingen\ndet muligt din barn har mange navne mand kommer ind kan bore metro tunneller under din meddelelse skal gøre tydeligt\nVideoer porno ekstreme Tønder\nFuked teen Rødovre\ndating, masser levering, bare\ndet vigtigt være piger var lettere brevet understreger bestyrelsen behovet for edderkop lægger sine mad kan


Risiko for at du står uden dækning på din skiferie\nDet nye blå sygesikringskort er ikke en fuldgod erstatning for det gule sygesikringskort, da det blå EU-sygesikringskort giver ret til samme behandling, som de lokale borgere har i det land, man rejser i. Der kan således være stor forskel fra land til land, hvilket har gjort en rejseforsikring ekstra vigtig siden 1. august 2014.\nDet er derfor en god ide at gennemgå din rejseforsikring, så du sikrer, at du er optimalt dækket på dine kommende ferier. Har du planlagt skiferie, skal du være særligt opmærksom på følgende:\nHvis du rejser ud på det blå kort og kommer til skade, er der ingen dækning for transport ned fra pisten, hvilket i værste fald kan foregå via helikopter.\nDe fleste klinikker på skistederne er private, som der ikke er dækning for via det det blå kort.\nDet blå kort dækker ikke hjemtransport via rutefly eller ambulancefly (eller anden form for hjemtransport).\nSå falder du og brækker benet på pisten, bliver fløjet til nærmeste privatklinik, hvor de behandler dig og efterfølgende ikke kan rejse hjem på vanlig vis, så er alle omkostninger i dette forløb for egen regning, hvis du alene rejser med det blå EU kort.\nHar du ikke allerede tegnet en rejseforsikring, anbefales det at du gør det. Skal du på skiferie, er det vigtigt, at du sørger for at forsikringen indeholder udvidelser for skiskader, som dækker transport ned fra pisten, behandling på privatklinikker/hospitaler og hjemtransport. Udvidelse for skiskader skal tilkøbes til rejseforsikringen hos flere forsikringsselskaber.\nEn anden væsentlig forsikring for skiløbere er indboforsikring, da denne indeholder en ansvarsforsikring. Skulle uheldet være ude, at du i høj fart ned af pisten rammer en anden person, er der risiko for, at du kan blive erstatningsansvarlig, og det kan blive dyrt. Det er især et problem hos unge, der ikke har tegnet en indboforsikring.\nKontakt dit forsikringsselskab for yderligere oplysninger om, hvordan du er dækket under din skiferie, eller kontakt Marsh for så vidt angår virksomhedens rejseforsikringer.


Plastik Rens - DANLUBE A/S\nWEICON Plastik Rens\nWEICON Plastik Rens er specielt til rengøring og affedtning af følsomme plastoverflader. I modsætning til mange andre rengøringsmidler, vil WEICON Plastikrens ikke ændre overfladestrukturen hvilket betyder, at revner, skørhed og / eller matte overflader undgås.\nWEICON Plastik Rens er specielt til rengøring og affedtning af følsomme plastoverflader. I modsætning til mange andre rengøringsmidler, vil WEICON Plastikrens ikke ændre overfladestrukturen hvilket betyder, at revner, skørhed og / eller matte overflader undgås. På trods af denne blide handling går Plastikrens ikke på kompromis med effektivitet og fjerner snavs uden at efterlade striber eller mærker.\nWEICON Plastikrens er farveløs med en citrus-lignende lugt.\nWEICON Plastik Rens bruges til rengøring og affedtning af følsomme plast (som PVC, Plexiglas eller polystyren)før limning. Desuden kan Plastik Rens også anvendes til rengøring af vinduesrammer, skodder, plastprofiler, pakninger eller malede overflader i mange områder af industrien.\nRengøring og affedtning af:\nFølsomme plast som termoplast (PVC, PMMA = plexiglas, polystyren, osv), f.eks vinduesrammer, rullegardiner, plastprofiler.\nLakerede overflader, såsom pulverlakerede metaldele.\nFjernelse af resten af etiketter og klistermærker.\nOBS! Før brug skal du kontrollere om overfladen er kompatibilitet.\nTDS_EN_Plastik_Rens_Spray.pdf PDF 103.77KB Download\nMSDS_DK_Plastik_Rens_Spray.pdf PDF 315.16KB Download


At tale om død med din familie er smertelig, men vigtig 👵👴 60 År Og Jeg\nVi har alle sad omkring spisebordet utallige gange og talt med vores familier om hvert emne under solen - politik, folk, shopping, arbejde, film, bøger og vores planer for næste års ferie.\nEn ting, som vi ikke ofte taler om, er døden. Når vi taler om det, bruger vi ord til at skjule emnet og eufemistisk henviser til "slutningen af livsplanlægningen."\nHvorfor er Talking About Death så svært?\nAt tale om vores egen dødelighed gør naturligvis os ubehagelige. Samtidig er der vigtige beslutninger, der skal træffes, og det er meget bedre at gøre dem, når vi er i en objektiv sindstilstand.\nDe fleste ældre kvinder er i stand til at se på deres dødelighed ærligt. Vi ved, at medmindre der er en fantastisk lang levetid med medicinsk gennembrud i kortene, har vi mindre tid foran os end bagud.\nMange af os har allerede lavet begravelsesplaner og skriftlige testamente. Vi har beskrevet, om vi ønsker at blive kremeret, begravet eller som Joanna Lumley antyder, "læg i en papkasse dækket med billeder og fjer."\nUd over det grundlæggende er der så mange ting, at vi kan beslutte ikke at lette byrden på vores kære. For eksempel bliver styringen af dit "digitale efterliv" stadig vigtigere, da vores mest værdifulde minder flytter online. For eksempel, hvem vil du have adgang til dine e-mail-konti, når du dør? Hvad skal der ske med din Facebook-side?\nGrupper som Death over Dinner and Death Café giver skabeloner til at diskutere død med din familie. Deres mål er at gøre emnet mere tilgængeligt, selvom det aldrig vil være behageligt.\nJeg vil gerne have dine tanker om dette. Lad os vide din mening ved at besvare følgende spørgsmål i kommentarfeltet og "lide" og del denne artikel for at holde samtalen igang.\nHar du haft en samtale med din familie om, hvordan du vil have dit liv fejret? Har din familie værdsat gestusningen? Har du planlagt din begravelse og skrevet din vilje?\nSchau das Video: Sterben ohne Schmerzen (Folge 2/4: Wie komm ich mit dem Tod klar?)\nBevare dine foto- og filmminner ved at digitalisere dem\nHvilke minder holder du i dit skab? Måske har du et par opbevaret i kasser på loftet eller under en seng. Disse minder findes i mange formater; fotos, dias, filmruller, VHS-bånd og lydkassetter. Hvad laver du i dag for at sikre, at disse minder er på vej til næste generation?\nGiv dig selv en personlig tilbagetrækning i december. Du fortjener det!\nDecember er ikke min yndlingsmåned. Jeg kalder det den tabte måned. Hvorfor? Alle har travlt med at sætte alt ud til "efter ferien." Du så ironien i den sætning, ikke? "Travlt at sætte tingene af." Alle handler, indpakker, renser, koger, bakker, renser, fester. Rengøring, udsmykning og rengøring lidt mere.\n5 måder at fejre den internationale dag med lykke til\nGlad International Lykke Dag alle! I dag er en mulighed for at fejre en af de mest grundlæggende og vigtige menneskelige følelser - lykke. For at hjælpe dig med at få din dag til en god start, har vi samlet en liste over 5 ting, du kan gøre for at øge din positivitet. Vi håber du nyder dem. Stop med at læse dårlige nyheder for en dag Føler det nogensinde, at de eneste nyheder, der gør det i luften, er dårlige nyheder?\nUventede overraskelser og de vigtige livsforelæsninger, de lærte os\nDa jeg var 12 år gammel, brugte jeg meget tid på at forestille mig, hvordan mit liv ville udfolde sig. Jeg lavede en vidunderlig plan, komplet med veldefinerede prikker, forbundet med helt lige linjer. Jeg indså snart, at kortet jeg tegnede i mit sind var skitseret i blyant, ikke i blæk. I fremtiden så det ud til, at mit liv ville udfolde sig på forudsigelige måder.\nHvorfor dyrkning taknemmelighed er en nulstillingsknap for positivitet efter 60\nRismarkerne, der strækker sig ud fra huset, oversvømmes nu, hvilket afspejler himlen med store puff-ball-skyer, der bliver rosa, derefter orange, så hvide som morgensolen stiger. Kyllingerne kæmper nær og langt og ikke bare roosters. Min sorte høne strækker sig også ud af hendes røde waddled hoved og krager.\n4 veje til optimisme som kvinde over 60 år\nLivet er sødt, når du er optimistisk. Intet er umuligt. Det er let gade, og det bedste er endnu ikke kommet! Overfor hver dag med tillid, opdrift og positiv holdning - det er optimisme, og vi ønsker alle, vi havde det hele tiden! Og nogle af os gør det. Nogle af os går gennem livet, især efter at vi har nået 60, overbevist om, at vi lever i de bedste af alle mulige verdener!\nFøler du dig skyldig, når du gør ting, der gør dig glad?\nBørn er naturligt hedonistiske. De spiller hensynsløst, spiser uforsigtigt og drømmer urimeligt. Gennem årene borer samfundet i vores hoveder, at stort set alt, hvad sjovt er, er enten "forkert" eller "dårligt for dig." Chokolade bliver "syndigt." At spille er et "spild af tid". Vi opfordres til at holde op med at drømme så meget og "Blive reel" om vores fremtid.\nTe har ikke kun en utrolig rig historie, men det sker også som nummer to i verden. Det kommer i anden kun til vand. Te, i en eller anden form, har eksisteret i mere end fire tusinde år. Som du kan forestille dig, har det skabt et utal af traditioner på tværs af mange kulturer. I Kina, når du besøger en andens hjem, vil du med størst sandsynlighed blive tilbudt te.\nKan "Happy Foods" virkelig øge dit humør? Her er hvad videnskab har at sige\nEn bedre måde at vågne op\nHappy 69th Birthday Sally Field - Vi elsker din alsidighed og dine værdier\n50 sange Vores generation elsker, en tæt på OL og en alvorlig trussel\n4 Morgenritualer for at øge din sundhed, lykke og rigdom\nFabulous Fall Fashion Tips at få dig til at glødende denne sæsonKongelig familieudflugt! Prinsesse Mary træder ud i traditionelt kostumeHillary Clinton Under Spotlight og Angela Merkel Under PressureMenneske Weight Watchers affære gnister bitter hævn porno domstol kamp\nNår livet går forbi, har du en plan?\nAlle har ret til deres mening


Assistancemelding Drab | Lykke & Co. A/S\nASSISTANCEMELDING DRAB – TEAMBUILDING\nUtraditionel samarbejdsøvelse, hvor sagen kun opklares, hvis alle samarbejder\n6-160 deltagere | 2 timer | Fra 9.995 kr. | Dansk eller engelsk\nJeres møde afbrydes pludseligt, da deltagerne skal assistere i en kompliceret mordefterforskning...\nI kommer alle til at spille en central rolle i opklaringsarbejdet, hvor I både skal samarbejde holdvis og på tværs.\nBrikkerne falder på plads, eller gør de? Vi afslutter med en kort refleksion af kommunikation og samarbejdet.\nKan du og kollegaerne sammen opklare et mord? I Assistancemelding Drab fungerer I alle som efterforskere, og den bestialske mordgåde kan kun løses ved at holdene, der sidder med hver deres efterforskningsområde, samarbejder på tværs.\nJørgen Larsen bliver fundet død i haveskuret på sin bopæl i det sydøstlige Odense. Alt tyder på selvmord, og efter kort tids efterforskning afsluttes undersøgelserne og sagen lukkes. Pludselig dukker der nye spor op i sagen – og efterforskningen bliver genoptaget. Det viser sig, at sagens akter alligevel ikke er så indlysende som først antaget. Der ligger en forbrydelse bag dødsfaldet! Men hvem er gerningsmanden – og hvad er motivet? Og hvordan hænger det sammen, at døren var låst indefra?\nI kommer til at spille en vigtig rolle i opklaringen af forbrydelsen. I bliver opdelt i hold, der arbejder med forskellige aspekter af efterforskningen. Undervejs sker flere uforudsigelige hændelser. Tidspres, kommunikation og samarbejdet mellem jer kommer derfor til at spille en altafgørende rolle.\nHoldene får hver især udleveret forskelligt materiale og udstyr, der har med deres respektive efterforskningsområde at gøre, eksempelvis: Bevismateriale, indsamlede spor, mp3 afspillere med lydfiler, mp4 afspillere med små filmsekvenser, billeder, walkie talkies, rapporter, avisartikler og baggrundsmateriale. Holdene får desuden en række øvrige rekvisitter og effekter, der skal bruges til at foretage forskellige kriminaltekniske undersøgelser. I spillet er desuden en sms-funktion, der gør deltagerne i stand til at rekvirere oplysninger via sms. Vores instruktør kommer udklædt som betjent, og vi kan eventuelt lave en opstart, hvor vi afbryder jeres møde på dramatisk vis…\nAssistancemelding Drab er en underholdende samarbejdsøvelse, hvor deltagerne kun kan løse sagen, hvis alle samarbejder og kommunikerer. Spillet egner sig godt som en teambuildingaktivitet til firmaarrangementer eller som en overraskende og anderledes samarbejdsøvelse til jeres næste møde. Spillet illustrerer vigtigheden af samarbejde og kommunikation. Assistancemelding Drab fungerer normalvis bedst i dagtimerne, og kan eventuelt kombineres med et foredrag.\nPåtænker I at spille om aftenen, anbefaler vi som udgangspunkt spillet Drabsafdelingen – hvor der er mere fokus på underholdning og konkurrence. Få kort skitseret den overordnede forskel på vores 2 fysiske mord mysterier her.\n6 – 160 deltagere\n2 timer + evt. refleksion\nFra 9.995 kr. (standard udgave) ekskl. moms og kørsel\nStyrkelse af samarbejde på tværs i organisationen\nIllustrering af vigtigheden af samarbejde og kommunikation\n0-15 pers.:8.995 kr.*\n+15 pers.:Tilbydes ikke\n0-30 pers.:9.995 kr.*\n31-60 pers.:19.995 kr.*\n61-90 pers.:29.995 kr.*\n+90 pers.:Indhent tilbud\n0-30 pers.:14.995 kr.*\n31-60 pers.:24.995 kr.*\n61-90 pers.:34.995 kr.*\nInstruktør / betjent 1 betjent deltager i spillet.\nBetjenten introducerer jer til sagen - og hvordan efterforskningen skal gribes an.\nBetjenten er tilstede under hele spillet, og assisterer holdene i deres arbejde.\nRefleksion af samarbejde og kommunikationVi giver mulighed for, såfremt det ønskes, at holdene i forbindelse med afslutningen\nkan reflektere på, hvordan de har samarbejdet/kommunikeret under efterforskningen.\nEkstra aktør (Retsmediciner)1 retsmediciner deltager (foruden betjenten) i spillet.\nRetsmedicineren laver en retsmedicinsk post, hvor det er muligt for holdene\nat indhente en række oplysninger. Samtidigt medbringer retsmedicineren\nen række spændende rekvisitter.\nAssistancemelding Drab fungerer bedst i dagstimerne.\nSkal arrangementet foregå om aftenen, efter middagen, anbefaler vi Drabsafdelingen eller Assistancemelding Røveri.\nVil I gerne gøre lidt ekstra ud af det, skal I vælge plusudgaven. Vil I gerne en anelse ned i pris, skal I vælge lightudgaven, men bemærk at man selv skal facilitere lightudgaven.\nAssistancemelding Drab kan gennemføres for grupper fra 6 personer og op til ca. 160 personer.\nVi kan inddele holdene tilfældigt – eller du kan lave holdinddellingen på forhånd.\n0-15 personer: 1 instruktør (1 betjent)\n0-30 personer: 1 instruktør (1 betjent)\n31-60 personer: 2 instruktører (2 betjente)\n61-90 personer: 2 instruktører (2 betjente)\n0-30 personer: 2 instruktører/aktører (1 betjent + 1 retsmediciner)\n31-60 personer: 2 instruktører/aktører (1 betjent + 1 retsmediciner)\n61-90 personer: 3 instruktører/aktører (2 betjente + 1 retsmediciner)\nEr I mere end 90 personer, afhænger antallet af instruktører/aktører af flere faktorer, men vil normalvis fremgå af dit tilbud.


3 danske Oscar-håb\n3 år siden - af Daniel Bentien, Foto: Underverden/Scanbox\nMeget forskellige kandidater udvalgt\nHvert år indstiller den danske Oscar-komité tre film, som skal kæmpe om at blive Danmarks officielle kandidat til en nominering. Nu er filmenes titler offentliggjort, og der er tale om tre ret forskellige værker.\nAction-dramaet Underverden, der blev en succes hos både publikum og anmeldere, udgør den ene tredjedel, og Fenar Ahmads film er et forfriskende anderledes bud. Normalt favoriseres hardcore dramaer - enten i en hverdags-setting eller med historisk baggrund.\nHverdagsdramaet er i år repræsenteret af Du forsvinder, der er baseret på Christian Jungersens roman om en skoleleder, der får en tumor i hjernen, som får ham til at handle højst usædvanligt. Nikolaj Lie Kaas og Trine Dyrholm er at finde i de velspillende hovedroller.\nEn historisk baggrund er til gengæld at finde i filmatiseringen af Jens Blendstrups selvbiografiske roman Gud taler ud. Komedie-dramaet foregår i 1980ernes Risskov, hvor Søren Malling spiller altdominerende patriark i huset med tre sønner og en hustru, der forsøger at holde sammen på familien.\nOscar-komitéens endelige valg af film finder sted den 20. september, otte dage inden premieren på 'Gud taler ud'. De øvrige to film havde premiere tidligere på året, men en Oscar-nominering vil formentlig sikre et liv i udlandske biografer.\nFra 1. oktober vurderer Det amerikanske filmakademi, hvilke ni af de 85 landes indsendte film, der skal shortlistes, og 23. januar næste år offentliggøres de endelige fem Oscar-nomineringer.\nOscar-uddelingen finder sted den 4. marts 2018.\nDen danske drama-komedie 'Gud taler ud' foregår i 1980ernes Risskov.\nFilmen 'Du forsvinder' handler om den respekterede skoleleder, Frederik, der bliver sigtet for at have stjålet 12 mio. kr.\nKom til eksklusiv galla med Gud\nEr jeg den eneste der ikke fandt den film god?


Uproffessionel, lang levering og fejlleverede 1/4\nburde have holdt mig fra dem, da de kun modtager paypal, og ikke dankort. (nb: her er man dårligere stillet ved tilbagbetaling)Bestilte alligevel lidt lingeri og en vibrator til fruen.Fik en mail et par dage efter at nu var det afsendt, men det kom aldrig.Rykkede 14 dage efter, og fik en mail at de ville undersøge hos postdanmark. 3 dage efter fik jeg en mail at de havde fået svar fra post danmark og at den nu skulle være på vej.Så kom pakken også.Lige med det samme strålede det uproffessionelt.Papkassen var en aflagt papkasse af et stykke aldi foto udstyr, halvt pakket ind i tape og påsat firmærker, poststemplet dagen før.Her af konkluderer jeg at deres "spørger post danmark" var at hælde vand ud af ørene. Indholdet var 3/4 korrekt, gider dog ikke bruge min tid på at returnere vibratoren til 60-70 kr. Den de havde sendt med var langt fra hvad jeg bestilte, samtidig med at den så ud som om den havde ligget på lager i flere år, ganske ulækker.Hvis i vil checke firmaet mere ud, som jeg ikke lige fik gjort, så kig her først:[link]De brude få 1 stjerne for deres hælden vand ud af ørene, men får to for trods alt at leverer 3/4 af indholdet.\nInge Bonde vond deze beoordeling nuttig\nAntwoord van butikviv.dk\nHejVil gerne lige sige, at butikken bestemt ikke er en gård, som du beskriver i din bedømmelse.Vi vil da også meget gerne have at du sender en besked, direkte til os omkring den vibrator som du beskriver i denne bedømmelse som du har modtaget.Vil da også meget gerne vide hvad du mener med saegroup.com, som du beskriver i din anmeldelse, for vi har intet med saegroup.com at gøre, og vi kender desuden intet til saegroup.com som du omtaler i din bedømmelse omkring os.MvhButikviv.dk\n24" 390B lever ikke op til forventninger\nHar for godt 3 uger siden, købt et 24" led tv med dvd og dlna. På papiret super tv til prisen, men det lever ikke op til forventningerne.Tv'et kan det de siger, men basale ting som at skifte kanal eller navigere rundt i menuen er grotesk langsomt. Jeg skrev en mail dagen efter til dem og de svarede med "Menuen er desværre ikke den hurtigste i den model". Efterfølgende opdaterede firmwaren, men det hjalp kun en lille smule. Tilgengæld mister den de digitale kanaler og flytter rundt på dem. Man kan heller ikke manuelt opsætte en digital kanal. Dvs når nogle kanaler forsvinder skal man lave en ny søgning og starte helt forfra.Så min konklusion er at, de under demissionerer deres tv hardware og har åbenbart fatale fejl i softwaren, til et ellers lækkert fjernsyn.\nLeveringstid overholdes ikke helt\nVi bestilte en håndfuld hårdhvidevarer alle med betegnelsen "levering i 1-3 dage."Vores kriterie for at vælge netop dem var at de havde lige præcis det vi ønskede og kunne levere forholdsvis hurtigt.3. dag fik vi 4 ud af 5 bestilte ting. Super fint, men den sidste manglede, et emfang. Vi ventede et par dage og jeg kontaktede dem for hvornår vi så kunne forvente det. De sagde at den var i restordre og der ville nok gå ca 20 dage. Ikke lige hvad vi regnede med, men egentlig betød det ikke så meget da den ikke skulle monteres lige med det samme. Emfanget er sat til levering ca den 21 september og jeg skyder på den dukker rettidigt op.Det spøjse er bare at varen på deres webside i hele den mellemliggende periode har stået som "lev. 1-3 dage".Så falder troværdigheden jo til jorden omkring leveringstid og en af de grundkriterier vi havde for at vælge dem. Men ellers fin service indtil videre og venlig salgspersonale.UPDATE:Fik emhætten et par dage før forventet så det er jo super.\nservice handlinglammet i ferietid\nJeg havde købt 24 spots til ca 3500,-. Jeg fik dem hurtigt og jeg kigge nogle af dem igennem for at se om alt var som det skulle være.Halv anden måned efter monterer jeg de fleste og finder ud af at en af dem mangler en lyskilde samt bøjlen til at holde lyskilden oppe. Jeg skriver til dem samme aften og spørger om de kan sende det der mangler.Et par dage efter får jeg følgende besked:"Da chefen er gået på ferie, kan jeg desværre kun henholde mig til vores salgs og leveringsbetingelser, hvori det fremgår, at du inden for 8 dage skal kontrollere dine varer for fejl og mangler. Du købte produkterne i starten af Juni måned, så det er jo lidt over fristen at du reklamerer.Såfremt du er uenig i denne afgørelse, er min chef tilbage igen om ca. 1½ uge."Det vil jeg kalde for handlingslammet når man ikke kan tage stilling til at yde service og sende en bøjle og en halogen lyskilde uden at spørge sin chef først.Skrev tilbage at jeg synes at det var dårligt service at et firma ikke kan tage stilling til dette og at jeg nok skulle finde en bøjle et andet sted. og fik et ligne svar hvor de fastholdt sig til 8 dages frist, samt at jeg kun kunne vente på chefen kom hjem.Service kan kun vurderes når noget ikke går efter planen...\nDårlig service, ukorrekt lagerbeholdning og leveringstid.Har handlet hos dem en gang, og der gik en af varerne fra 14 dages levering til ukendt leveringstid. Derfor ønskede jeg at vælge en anden vare, men det kunne ikke lade sig gøre, så jeg skulle lave en ny bestilling på det ekstra, helt ok, men jeg skulle nu også betale for ny fragt, til trods for de endnu ikke havde afsendt den første del af min bestilling.Den vare som gik i ubekendt leveringstid, er stadig repræsenteret på deres webside, tiltrods for at den nærmest er umulig for nogen it butikker at bestille hjem, da jeg derefter har prøvet flere, som til sidst har måttet melde ud om ukendt leveringstid.\nMads Hegelund vond deze beoordeling nuttig


Hvad vil russiske piger?\nRussiske traditioner er ikke altid klare for udlændinge, og for at være mere præcis overrasker nogle synspunkter om vores landsmænds liv i høj grad repræsentanter for andre nationer.\nRusland er en særlig kultur, en særlig mentalitet. Selvfølgelig er vores russiske piger med deres koncepter og livssyn meget forskellige fra udenlandske kvinder. I dag vil vi se på, hvad russiske piger vil have. Lad os finde ud af det. Så...\nRussiske piger vil have\n2. Få en baby...\n5. Unik mand/blid brutal…\n6. Sjælens enhed...\n8. Prins på en hvid hest …\n1. Ægteskab …\nDe fleste russiske piger ønsker virkelig at blive gift. Vores piger begynder at ville giftes næsten fra fødslen, når moderen sammen med alle sine omgivelser forsigtigt sætter "kloge og korrekte tanker" ind i sin datters hoved. Desuden påtvinges den fastlåste idé "at blive gift" ikke kun direkte og aggressivt, men også tilfældigt i baggrunden, som en reklame i radioen...\nFor eksempel, hvis en pige er sjusket eller ikke holder sit værelse rent, så mor en bemærkning til hende, sørg for at understrege, at "ingen vil kalde sådan en beskidt kvinde til at gifte sig", og at "mænd vælger gode husmødre som deres koner, hvis huse er rene og ryddelige."\nOg nu vokser sådan en pige op, overbevist fra barnsben om, at det at blive gift er lige så svært som at få en olympisk medalje, og for at opnå et "resultat" skal du yde en utrolig indsats, og samtidig tid ægteskab er så vigtigt, ligesom luft.\nDerfor vil russiske piger som regel for det meste meget gerne giftes! Og når de bliver gift, forsøger de med al magt at redde deres ægteskab, selv om det længe har sprængt i sømmene, tager manden næsten åbenlyst sin elskerinde ind i huset eller ligger på sofa med tv-fjernbetjeningen, mens hun er døende bliver træt på sit tredje job.\nHvordan ellers, for fra barndommen har hun hørt, at det at være en "skilt kvinde", og værre end det, en "forladt kvinde" er meget pinligt, og hvis det også er "med trailer" (med et barn)), så er dette generelt en katastrofe. Derfor er den faste idé med russiske piger at blive gift og forsøge at redde deres ægteskab for enhver pris, med alle midler.\nUd over ægteskab vil russiske piger virkelig gerne have en baby. Det er ligegyldigt, før ægteskab eller i ægteskab, det vigtigste er at føde. På trods af de tusindvis af børn, der er forladt af fædre, som de ikke kommunikerer med. Det sker af forskellige årsager, en mand er ikke altid skyld i dette, og ofte gjorde den "tidligere" alt for at sikre, at manden løb væk og tabte sine hjemmesko, ikke kun fra hende, men også fra at kommunikere med barnet. Af en eller anden grund er russiske piger fast overbevist om, at et barn er en garanti for, at en mand ikke forlader hende. Meget ofte fungerer et barn som et forhandlingskort på mor og fars slagmark, desværre.\nRussiske piger ønsker virkelig ligestilling med mænd. Desuden har begrebet lighed de har en noget forvrænget betydning. Piger ønsker ikke kun at tage regeringstøjlerne i virksomheder, i føderale og statslige strukturer, i familien, men også fremsætte deres kandidaturer til at styre landet. I en sådan kunstig ligestilling mister piger deres feminine træk og bliver "mænd i nederdele". Ofte benytter piger muligheden for at drikke for meget, ryge og bande for ligestilling. Det er ikke overraskende, at en mand ved synet af en dame ikke længere åbner døren foran hende og ikke tilbyder sin hånd for at hjælpe med at komme ud af bilen.\nKønsforskelle udslettes af misforstået kunstig ligestilling. Når alt kommer til alt, hvis vi vender os til antikken, udførte en mand og en kvinde forskellige husholdningsfunktioner - han bragte hende en mammut, og hun kogte den (dette er selve mammutten). Kvinden forsøgte trods alt ikke at jage i stedet for familiens overhoved, og han lå ikke hjemme på en seng og ventede på, at hans kvinde skulle bringe ham bytte på hendes stærke skuldre. Ægte ligestilling ligger ikke i at udviske kønsforskelle, men i den korrekte rollefordeling. Men russiske piger, såvel som mange udenlandske kvinder, søger stædigt en form for illusorisk ligestilling med mænd.\nRussiske piger ønsker frihed. Ja, det er frihed! De vil gerne være i et forhold, men også fri. Hvis en pige fortæller dig, at hun kun har brug for din kærlighed og beundring, og andre mænds komplimenter længe har været ligeglade med hende, er hun, med 100 % sandsynlighed, højst sandsynligt uærlig. Vær sikker på, hun siger dette kun for at styrke dit nervesystem. Faktisk elsker alle piger komplimenter, især fra repræsentanter for den stærke halvdel af menneskeheden!\nIngen normal russisk pige vil blive glad, hvis hendes mand forbyder hende at kommunikere med mandlige kolleger eller mandlige venner. Hun vil ikke blive glad, hvis hendes mand er imod korte nederdele, åbne halsudskæringer og høje stiletter. Kvinder i mange østlige lande dækker deres hoveder og vil aldrig tage tøj på, der kompromitterer dem i samfundet, hvilket ikke kan siges om vores piger.\nDeraf konklusionen - den russiske sjæl er bred og fri og tillader ingen begrænsninger udefra.\nuoverensstemmende egenskaber: en mand skal være brutal som en "barbar" og kunne beskytte hende mod hele verden. Men på samme tid kærlig og omsorgsfuld, blød og venlig. Forbløffende, ikke?\nRussiske piger ønsker at være lykkelige i ægteskabet, fusionere med en partner, være én helhed på samme bølgelængde. Ikke alle, selvfølgelig, men de fleste af dem. Der er en separat kategori af piger, der drømmer om at "fusionere med den udvalgte som siamesiske tvillinger", først da vil de føle sig rolige og fredelige. Sådanne mennesker har som regel store problemer med selvværd, der skal løses. Ellers fører en stærk fysisk og følelsesmæssig afhængighed af en anden person til neurose og depressive tilstande.\nRussiske piger elsker romantik og romantik. De kan lide det, når mænd gør smukke og nogle gange skøre ting for dem, dedikerer digte til dem, giver dyre gaver, store buketter. Alt dette giver ingen mening, hvis du ikke kan prale af alt dette over for dine omgivelser, og især dine veninder. Dette, forekommer det hende, forårsager dybe rynker af misundelse hos hendes venner og sætter hende på et podie. Derfor ønsker russiske piger at øge deres selvværd på denne måde - gennem en mand...\n8. En prins på en hvid hest...\nde vil have kærlighed indtil kl. slutningen af deres liv, og de vil dø en dag... Mange mennesker drømmer fortsat om dette, selv når de allerede er meget voksne kvinder.\nGenerelt har vi her overvejet, hvad russiske piger ønsker. Som praksis viser, vil de nogle gange have gensidigt udelukkende ting! Her er sådan en fantastisk sjæl af en russisk pige. Og nogle gange kan pigerne selv ikke helt finde ud af, hvad de egentlig vil. Det skal huskes, at vi alle er forskellige, og pigerne er alle forskellige, og alle har forskellige ønsker, her gives kun generelle anbefalinger og generelle karakteristika. Under alle omstændigheder skal du selv løse din kæreste som en gåde, indtil du kan læse hende som en bog. Dette er ikke en nem opgave, men meget spændende. En kvindes sjæl er jo en dyb pool... Der er ingen bund... Men hvor mange djævle er der...\nHvad moderne piger ønsker af deres mænd\nHvad vil piger have i sex? Kvinders tips til fantastisk sex\nHvad piger vil have før sex, under sex og efter sex\nHvad vil piger have i sex og hvordan man bringer det til orgasme?\nHvad piger gerne vil høre?\nHvad piger vil fortælle mænd om kærlighed og sex\nHvad vil kvinder og piger??\nHvad vil kvinder, hvad vil mænd?\nKvinder vil aldrig forstå, hvordan det er at være mand\nHvilke vulgære spørgsmål at stille en pige\nMænd, sæt dig venligst ned.!\n10 måder at lave ild på\nOm kærlighed, sex og ensomhed\nNår en kone slår sin mand\nSådan finder du en kæreste?


Trump raser over brevstemmer - men han benytter det selv | BT Udland - www.bt.dk\n23. jun. 2020 - 10:07\nTrump raser over brevstemmer - men han benytter det selv\nUSAs præsident havde tændt for de store bogstaver, da han mandag åbnede sin Twitter-profil og tog til tasterne.\nDet kan læses på mange måder: opråb, frustration, vrede. Men formentlig en kombination af alle tre.\nPræsidenten havde som så mange gange før en sag, han skulle ud med.\n'SABOTERET VALG 2020: MILLIONER AF BREVSTEMMER VIL BLIVE PRINTET AF UDENLANDSKE LANDE, OG ANDRE. DET VIL VÆRE DEN STØRSTE SKANDALE I VOR TID!'\nNogenlunde således kan Trumps tweet oversættes til dansk, men præsidenten var ikke færdig.\nHan lavede et nyt tweet, hvor han delte en artikel fra det højrekonservative medie Breitbart, der citerer justitsminister William Barr at sige, at brevstemmer uden tvivl åbner for potentiel svindel ved det kommende valg.\nTil det valgte Trump igen at slå fast, at brevstemmer – som vil være en umiddelbar løsning for at få et nationalt valg gennemført under en global pandemi – vil blive saboteret.\nOg præsidenten var ikke færdig.\nI et tredje tweet om emnet skrev Trump, at amerikanerne godt kunne finde ud af at stemme under både 1. Verdenskrig og 2. Verdenskrig, men at man nu bruger corona som årsag til at 'snyde med brevstemmer'.\nDer gik ikke længe, før Trumps raseri udløste kritik. En af de mere prominente kritikere var den demokratiske Delaware-senator Chris Coons, der valgte at svare Trump på Twitter i et retweet.\nI en usædvanlig hård tone fra en amerikansk senator indledte han:\n'Det her er komplet usandt.'\nOg så kom den pointe, som har fået mange til at ryste på hovedet over præsidentens skrivelser.\n'Præsident Trump stemmer selv via brev, vores militærfolk stemmer via brev, og alle amerikanere bør kunne stemme via brev under en pandemi. Brevstemmer er sikre og pålidelige.'\nOg faktisk er det ikke kun Trump selv, der stemmer ved hjælp af brev. Det var også tilfældet med Trumps datter Ivanka, svigersøn Jared Kushner, betroede medarbejder Kellyanne Conway, vicepræsidenten Mike Pence, formanden for Det Republikanske Parti, Ronna McDaniel, for ikke at glemme justitsminister William Barr, som det blev påpeget af Daily Beast-journalisten Sam Stein.\nFlere eksperter skyder da også præsidentens påstande om, at brevstemmer er nemme at snyde med, ned. Det skyldes blandt andet, at det vil tage et enormt arbejde blot at forfalske en enkelt brevstemme-seddel.\nDet forklarer en ekspert på området til NPR.\n»Stemmesedlerne er bygget unikt til hvert valg. Hvert område vil typisk have dusinvis til hundredvis af unikke stemmeseddel-typer. Sikkerheden for den enkelte stemmeseddel-type gennemgås og testes for at sikre, at scannerne læser stemmesedlerne korrekt,« forklarer valgkonsulent Jennifer Morrell.\nOg hun bakkes op af flere andre valgeksperter, blandt andet David Becker, der er direktør ved Center for Election Innovation & Research.\n'Bare for at minde folk om, at uberettigede påstande om, at brevstemmer er 'saboteret', eller at stemmesedler udskrives i andre lande, så er den info FALSK. Der er intet bevis, der understøtter den påstand, og stater har mange typer sikkerhed på plads for at forhindre sabotage af brevstemmer,' skrev han på Twitter mandag.\nRystende syn i varevogn: Hemmelig bevægelse vil omstyrte USA\nNye meningsmålinger er elendigt nyt for Donald Trump - men der er lys i mørket\nfyger - beboer


En ny YouGov undersøgelse lavet for Dansk Svø;mmeunion, Trygfonden og Danmarks Idrætsforbund viser at hvert andet barn i Danmark ikke kan svømme. Faktisk kan rigtig mange voksne heller ikke svømme. Derfor lancerer de nu projektet "Alle skal lære at svømme".\nSå sent som i går hørte jeg en far sige "der er utroligt mange ting, som jeg skulle lære som barn, og som jeg aldrig har brugt - f.eks. svømning"... Måske er det sådan for ham, men jeg kan slet ikke forestille mig, at man ikke har brug for svømning. Vi bor i et land, der er omkranset af vand. Der er strande, der er friluftsbade, svømmehaller, og jeg synes det er vigtigt, at vi kan svømme og lærer vores børn at svømme. I dag handler min artikel derfor om, hvorfor vi skal lære vores børn at svømme.\n5 gode grunde til, at dit barn skal lære at svømme\n1. Sikkerhed. Når dit barn kan svømme, så nedsættes risikoen for drukneulykker og nærdrukning. Det er vigtigt at lære at svømme for at undgå farlige situationer.\n2. Motion. Svømning er en rigtig god motionsform. Svømning træner alle kroppens muskler og skåner samtidig kroppens led og alle kan svømme uanset alder. Samtidig bliver du ikke svedig og overophedet af svømning, som hvis du skulle lave øvelser på land. Mange synes derfor, at svømning er en rar motionsform.\n3. Stimulering af sanser. Når det lille barn svømmer, så stimuleres alle sanser - synssansen, lugtesansen, høresansen, følesansen, måske smagssansen, hvis barnet kommer til at sluge lidt klorvand:) Og derudover stimuleres barnets balance og korridinationsevne. Barnet får øget sin kropsbevidsthed og styrket sine muskler.\n4. Nærhed og samvær. Når det lille barn er i vandet sammen med mor og far, så giver det anledning til fysisk nærhed. Hud mod hud i vandet giver en stærk følelse af samhørighed. Det større barn, som begynder at kunne svømme selv, vil elske at lege i vand, plaske, lave spring, koldbøtter osv. og at lege i vand med mor eller far - eller sine svømmekammerater - er rigtig dejligt.\n5. Tryghed. Du skal være tryg ved at lade dit barn deltage i en børnefødselsdag, der holdes i svømmehallen. Du skal være tryg ved at sige "ja, det er okay", den dag dit barn spørger "er det okay, at vi cykler til stranden?". Du skal være tryg ved, at institutionen tager børnene på tur til svømmehallen, friluftsbadet eller stranden, fordi det er sommer og solen skinner. Du skal være tryg ved at tage på ferie og vide, at dit barn godt kan svømme i poolen.\nDet betyder ikke, at dit barn skal svømme uden at være under ...\n... opsyn - men det vil være rart for dig at vide, at dit barn har lært de grundlæggende færdigheder, som gør at ulykker i vand kan nedsættes betydeligt.\nNår større grupper af børn svømmer sammen kræver det ekstra stor overvågenhed fra de voksnes side og at tro, at du eller andre ser alle situationer, kan få skæbnesvangre følger.\nSikkerhed for den lille svømmer\nLær dit barn, at selvom dit barn har lært at svømme, så kan en god svømmer også drukne. Derfor må dit barn ikke svømme alene, men skal altid være under opsyn. Et øjebliks uopmærksomhed er nok til, at det kan gå galt.\nLær dit barn, at man altid kun må gå i vandet med en anden - aldrig alene. Og lav aftaler med dit barn om, hvem denne anden er. At barnet f.eks. kan gå i vandet med en voksen som mor, far, mormor, bedstefar osv. men ikke med storebror, for han er også stadig et barn.\nLær dit barn, at det kun er tilladt at hoppe i fra kanten, hvis en voksen siger det er okay. Det er vigtigt, at vandet er dybt nok, og at det er tilladt - og kun voksne kan vurdere dette.\nLær dit barn, at man ikke må lave konkurrencer om, hvem der f.eks. kan holde vejret længst tid under vand.\nLær dit barn, at man aldrig må holde andre under vandet med tvang. Det er ikke en sjov leg. Når man er i vandet, skal alle synes, det er sjovt og rart.\nLær dit barn, at der er forskel på at svømme i en svømmehal og at svømme ved vandet. Du skal være særligt opmærksom, når I tager til stranden - også selvom dit barn er god til at svømme i hallen.\nLær dit barn svømmereglerne ved havet. At man f.eks. kun går ud til navlen, og at man altid svømmer ind mod land og aldrig svømmer udad og væk fra stranden.\nLær dit barn at selvom man kan svømme så skal man altid bruge redningvest, når man sejler.\nDer er mulighed for at få svømmeundervisning alle steder i Danmark. Undervisningen kan foregå i svømmehal, på skoler, der er private og offentlige tilbud. Mulighederne er mange.\nUndersøg mulighederne hvor du bor. Er du selv vandskræk og har svært ved at svømme og svært ved at komme i vandet - og derfor svært ved at hjælpe dit barn, så tilbyder mange svømmeskoler også undervisning til voksne, der gerne vil komme sig over deres vandskræk. Det kan også være, at du kan få en anden i familien til at gå til svømning med dit barn. Uanset hvad, så er svømning rigtig vigtigt og værd at kunne - også selvom man måske tænker, at det får man ikke brugt...


Antalya Smile Æstetik - Denta Fly\nHvad er Smile Æstetik\nAntalya Smile Æstetik\nSmil er et vigtigt redskab for folk til at afspejle deres humør og følelser. Enkeltpersoner kan skabe et bedre indtryk og etablere mere aktive relationer med et smukt smil. Smil påvirker direkte kommunikation i det sociale liv og folks psykologiske helbred. Mennesker med et smukt smil lever et mere selvsikker og lykkeligere liv.\nHvad er æstetisk smil?\nÆstetisk smil har forskellige betydninger for alle. De fleste patienter ønsker designet af et smil, som de har set og ønsket sig hos en anden. Det ville dog være forkert at forme behandlingen omkring dette. Denne behandlingsproces skal planlægges specifikt for patienten.\nSmile æstetik indebærer at foretage nødvendige forbedringer til tændernes tilpasning, deformiteter, farve og sundhed. Til dette anvendes æstetiske behandlinger som seler, limning, kroning og kridtning. I tilfælde af manglende tænder fremstilles implantater. Disse procedurer gennemføres hurtigt og pålideligt.\nPink æstetiske behandlinger anvendes til tandkød som har dårlig harmoni, asymmetrisk tandkødsudseende og mørkere tandkød. Alle disse udviklinger i tænder og tandkød danner grundlaget for et smukt smil.\nHvilke parametre fokuseres der på?\nDer er mange variabler, der afspejler smile æstetik som smilelinje, smilkurve, smilniveau, overlæbekrumning, læbefylde og tandudseende. Hver af disse variabler håndteres individuelt i henhold til patientens helbred og forventninger. Derefter opnås et smukt smil ved at skabe en harmonisk helhed fra alle disse faktorer.\nSmiledesignet kan være et subjektivt design, men ofte betragtes kun en enkelt værdi som korrekt for nogle af disse variabler. Disse kan anføres som følger:\nHvad er vi opmærksomme på, når vi udfører smile æstetik behandling i vores klinik i Antalya?\nSmilelinje: Et andet navn på smilelinjen er læbestrålen. Læbestrengen er klassificeret som høj, medium eller lav. Høje læbe linjer viser tandkødet mere end nødvendigt. I de nederste læber linjer kurver overlæben nedad, så kun to tredjedele af de øvre tænder kan ses. Med andre ord, for et æstetisk smil forventes læbestrålen at være på mellemniveau.\nSmilkurve: Smilkurven er mellemrummet mellem spidsen af fortænderne og underlæben. Denne kurve kan observeres på tre måder som parallel, lige eller omvendt. For et æstetisk smil skal smilkurven være parallel.\nKrumning af overlæben: Det er vinklen mellem midterpunktet på overlæben og kanterne på læben. Læbekanterne kan være på samme niveau som midtpunktet eller over eller under. Den ønskede krumning for et æstetisk smil er, at kanterne er over midtpunktet.\nLabiodentalt forhold mellem underlæben og de øvre forreste tænder: Dette viser, hvor meget kontakt de øvre fortænder er i med underlæben. Tænderne kan røre ved læben, ikke røre ved den eller helt dække den. For et æstetisk smil skal fortænderne røre en smule ved underlæben.\nPatienter undersøges under kliniske og radiografiske forhold. Hvis der er noget problem i tænderne eller tandkødet, udføres den nødvendige intervention. Der tages fotografier af patientens ansigt og indre mund. Derefter foretages en måling af deres mund. Der fremstilles en model, der er egnet til disse målinger.\nInden behandlingen kan patienterne se designet på computermiljøet og prøve det i deres egen mund ved hjælp af tandlægemetoder. Patienter kan dele det, de kan lide og ikke lide ved designet, med lægen. På denne måde støder patienter ikke på noget uventet efter behandlingen.\nBehandlingsprocessen og antallet af sessioner varierer efter forventningerne fra behandlingen. I tilfælde af manglende tænder planlægges først implantatbehandling og derefter udføres nødvendige behandlinger for et æstetisk smil.\nAnvendes Smile Æstetik?\nSmile æstetik anvendes, når patienten anmoder om det eller når en specialistlæge finder det nødvendigt. Patienter, der starter smil æstetisk behandling, kan kategoriseres som følger.\nHvad er tandkødsektomi?\nPatienter, der anmoder om denne behandling, finder normalt deres tænder små. Læben er, hvor den skal være. Meget lange tandkød dækker tænderne. Dette får tænderne til at virke små. Med tandkødsektomi fjernes tandkødsvævet fra tænderne. Tænderne bliver mere synlige, når tandkødet løftes op.\nPatienter, der har brug for denne behandling, har ikke en symmetrisk tandkød. Tandkød kan forekomme kortere eller længere i forskellige områder. For eksempel får tandkødet til at blive trukket op ved at børste tænderne med den forkerte metode. I dette tilfælde er det ikke en løsning at blege den gule rod lige under tandkødet. Løsningen er at udføre graft på roden af den tand, som har lang udseende. Således trækkes tandkødet ned til det rigtige niveau.\nGummy Smil Botox\nFor patienter, der har brug for denne procedure, er problemet ikke i tænderne eller tandkødet. Selvom forholdet mellem tænder og tandkød er passende, er tandkødet meget fremtrædende, når de smiler. Når disse patienter smiler, krølles deres overlæbe for meget op og stiger mod næsen.\nI dette tilfælde påføres botox på læben. Botox ændrer ikke helt smilelinjen, men forhindrer læben i at krølle. Da læben ikke stiger så meget som før, er tandkødet ikke så fremtrædende som før.\nb. Kroner i Implantatbehandling: Implantatbehandling er måske ikke altid en klar proces til at eliminere en enkelt tandmangel. I nogle tilfælde kan det være nødvendigt at anvende forskellige behandlinger på nærliggende tænder.\nNår implantatet bliver helt sundt, påføres zirconium belægning. Derefter udføres forskellige operationer for at gendanne tændernes naturlige udseende. Som DentaFLY giver vi et sundt udseende på meget kort tid med de kroner, vi producerer internt.\nHvis rødmen i tandkødet ikke er forårsaget af betændelse, dvs. kun mørkere farve, anvendes bio stimulation. I denne proces omdannes de lilla eller sorte tandkød til en lyserød farve ved hjælp af en laser.\nZirconium bestemmer, hvordan tænder vil se ud. Af denne grund er det meget vigtigt at fremstille zirconium-kronen i den passende størrelse til tanden. Derudover er brugen af farver, der er kompatible med andre tænder i zirconium kroner, et nøgleelement, der får tænderne til at se smukke ud af hensyn til smile æstetik.


10. januar 1984-10. september 1987. Ændringer 23. juli 1984, 12. marts 1986 og 14. august 1986 og 1. september 1987.\nEfter at have vundet valget den 10. januar 1984 kunne Poul Schlüter (f. 1929) fortsætte som statsminister i spidsen for en uændret regering bestående af Det Konservative Folkeparti, Venstre, Kristeligt Folkeparti og Centrum-Demokraterne. Regeringsperioden var, ligesom den forrige, overordnet kendetegnet ved økonomiske udfordringer, hvor Danmark sad fast i en klemme mellem betalingsbalanceunderskud og arbejdsløshed. Sammen med Det Radikale Venstre fik regeringen flere finanspolitiske og indkomstpolitiske tiltag igennem, der sigtede på at bremse forbruget, importen og gældssætningen. Sikkerhedspolitikken fortsatte med at være et stridsområde mellem regeringen og oppositionen, men til gengæld vandt regeringen en folkeafstemning om EF's Indre Marked.\nStatsminister Poul Schlüter havde udskrevet valg til Folketinget den 15. december 1983, fordi regeringens finanslovsforslag faldt ved tredjebehandlingen. Valget blev afholdt den 10. januar 1984 og blev en stor sejr for Det Konservative Folkeparti, der med 42 mandater fik sit bedste valg nogensinde. Regeringspartneren Venstre gik frem, dog kun med 2 mandater til i alt 22. Kristeligt Folkeparti vandt ét mandat (til i alt fem). Til gengæld var valget næsten katastrofalt for det sidste parti i Firkløverregeringen, Centrum-Demokraterne, der gik fra 15 til 8 mandater. Uagtet den ændrede mandatfordeling blev der i første omgang ikke ændret ved ministerposternes fordeling.\nRegeringspartierne havde samlet set oplevet en fremgang, hvilket betød, at de i denne periode kunne nøjes med Det Radikale Venstres 10 mandater samt 3 nordatlantiske mandater for at have flertal i Folketinget. Regeringen var altså ikke længere afhængig af Fremskridtspartiet, som generelt blev anset for ustabilt og parlamentarisk upålideligt. Regeringsperioden blev i stigende grad præget af rivaliseringer mellem Venstre og Det Konservative Folkeparti. Venstre forsøgte i stigende grad at markere sig som liberalt parti, mens statsminister Poul Schlüter søgte mod midten for at realisere sin ambition om at gøre Det Konservative Folkeparti til det samlende, store folkeparti i stedet for Socialdemokratiet.\nMinisteriet Poul Schlüter I(b) fotograferet i folketingssalen. Fra venstre ses økonomiminister Anders Andersen, finansminister Henning Christophersen, kirkeminister Elsebeth Kock-Petersen, justitsminister Erik Ninn-Hansen, indenrigsminister Britta Schall Holberg, miljøminister og minister for nordiske anliggender Christian Christensen, statsminister Poul Schlüter, fiskeriminister Henning Grove, arbejdsminister Grethe Fenger Møller, landbrugsminister Niels Anker Kofoed, minister for offentlige arbejder Arne Melchior, skatteminister Isi Foighel, energiminister Knud Enggaard, kulturminister Mimi Jakobsen, undervisningsminister Bertel Haarder, industriminister Ib Stetter, boligminister Niels Bollmann, forsvarsminister Hans Engell, udenrigsminister Uffe Ellemann-Jensen, socialminister Palle Simonsen og længst til højre grønlandsminister Tom Høyem. Foto: Mydtskov Foto\nFinansloven for 1985\nFolketingsvalget var blevet udskrevet på spørgsmålet om finansloven, og efter valget blev regeringens første opgave at få den igennem. Regeringen havde sikret sit flertal, men valgte alligevel at invitere Socialdemokratiet til forhandlinger. De brød dog hurtigt sammen, selvom Socialdemokratiet var villig til at ofre nogle af sine kardinalpunkter. Især Venstre stod stejlt i forhandlingerne i forhold til at inkludere socialdemokraterne og deres holdninger. Ved den endelige afstemning om finansloven undlod Socialdemokratiet at stemme, men stemte altså heller ikke imod ligesom inden valget. Fremskridtspartiet, Socialistisk Folkeparti (SF) og Venstresocialisterne (VS) stemte imod.\n1970'ernes økonomiske krise med stagflation (dvs. ingen vækst, men stigende arbejdsløshed) blev i midten af 1980'erne afløst af et kortvarigt økonomisk opsving, som dels havde sine rødder i et internationalt konjunkturomsving, dels i de økonomiske krisetiltag. Med opsvinget fulgte en forøgelse af beskæftigelsen, en stigning i boligbyggeriet, større investeringslyst og større privatforbrug. Det medførte alt sammen større import, hvilket gav negativt udslag på både betalingsbalancen og statsbudgettet. Betalingsbalanceunderskuddet havde været et problem siden oliekrisen i 1973, og i 1984 ville det ifølge økonomiske prognoser nå op på 12 mia. kr.\nSammen med Det Radikale Venstre indgik regeringen derfor i april 1984 forlig om en langsigtet økonomisk plan. Forliget bestod af tre hovedelementer:\nEn finanspolitisk stramning, der skulle begrænse importen - primært ved hjælp af forhøjede afgifter og offentlige besparelser.\nEn målsætning om, at de offentlige udgifter 1985 ikke måtte stige forhold til 1984.\nEn række indkomstpolitiske tiltag, herunder en forlængelse af suspensionen af den automatiske dyrtidsregulering indtil 1987, og en henstilling til arbejdsmarkedets parter om, at de kommende overenskomster ikke måtte indeholde høje lønstigninger.\nForliget var dog ikke nok til at vende den negative udvikling. De følgende år fulgte regeringen derfor op med finanspolitiske og indkomstpolitiske tiltag i finanslovene.\nDertil kom ekstraordinære tiltag som Julepakken 1985, Påskepakken 1986 og Kartoffelkuren 1986.\nJulepakken 1985 skulle begrænse det offentlige og private forbrug. Pakken indeholdt således en strafafgift for kommuner, som ikke overholdt regeringens krav om uændrede offentlige udgifter, en begrænsning af mulighederne for at optage lån i friværdien af fast ejendom og endelig en række afgiftsforhøjelser på benzin, olie, gas og kul.\nPåskepakken 1986 havde til formål at begrænse privatforbruget og bestod primært af en række nye afgifter på såkaldt luksusforbrug såsom alkohol, tobak, charterrejser, elektronik mm.\nKartoffelkuren blev indført i oktober 1986 og skulle fremme befolkningens lyst til at spare op og begrænse gældsætning. Kartoffelkuren bestod dels af indførelse af en række afgifter på almindelige forbrugsvarer, dels af en renteafgift på 20 % på alle forbrugslån i banker, finansieringsvirksomheder og andre konto- og afbetalingsordninger. Den forhøjede renteafgift gjaldt også for allerede tegnede lån, og loven fik derfor en tilbagevirkende kraft.\nI juni 1985 indgik Firkløverregeringen et stort skatteforlig med Socialdemokratiet og Det Radikale Venstre. De personlige indkomstskatter blev lettet over hele indkomstskalaen, men særligt i den lave ende. Marginalskatteprocenten blev sænket fra 78 % til 68 %, og selskabsskatten blev forøget fra 40 % til 50 %. Skatten på renteindtægter blev sat ned for at motivere danskerne til at spare op, og der blev saneret i skattefradragsordningerne, hvilket skulle fjerne incitamentet til at gældsætte sig.\nDen 1. april 1987 vedtog regeringen med støtte fra Det Radikale Venstre et lovforslag, der endeligt afskaffede dyrtidsreguleringen, der automatisk regulerede lønnen i takt med prisudviklingen. Dyrtidsreguleringen var en af de væsentligste årsager til inflation, og Poul Schlüters regeringer havde flere gange suspenderet ordningen midlertidigt, senest ved forliget i 1984 med Det Radikale Venstre. Afskaffelsen af ordningen var en indgriben i et område på arbejdsmarkedet, der var dækket af aftaler mellem arbejdsmarkedets parter (den danske model), og derfor mødte regeringen principiel kritik for tiltaget. Kritikken blev dog dæmpet af, at reallønnen for første gang siden 1980 var stigende og inflationen aftagende.\nDen økonomiske politik var i fokus også under valgkampen forud for valget i 1984. På billedet ses finansminister Henning Christophersen fra Venstre forklare, hvorledes regeringen sparede flere penge end Socialdemokratiet. Christophersen var iøvrigt iført tweed på sine rådgiveres opfordring for at fremstå mere folkelig. Foto: Ritzau Scanpix\nI sikkerhedspolitikken måtte regeringen fortsat kæmpe med det såkaldte alternative flertal (Socialdemokratiet, De Radikale, SF og Venstresocialisterne), som pålagde regeringen en række dagsordner inden for sikkerhedspolitikken. Den 3. maj 1984 blev regeringen pålagt at søge at fremme de aktuelle forhandlinger om mellemdistanceraketter mellem USA og Sovjetunionen (INF-forhandlingerne) samt at arbejde for, at Danmark forblev atomvåbenfrit i freds-, krise- og krigstid ved at gøre Norden til atomvåbenfri zone. Dagsordenen om Norden som atomvåbenfri zone var dog sprogligt udformet således, at zonen var betinget af garantier fra USA og Sovjetunionen, og dermed var det implicit, at Danmark ikke skulle gå enegang inden for NATO. Regeringen undlod at stemme om dagsordenen. Frem til valget i 1987 blev der fremsat yderligere 15 dagsordener, der omhandlede INF-forhandlingerne, Norden som atomvåbenfri zone samt det i 1983 af den amerikanske præsident Ronald Reagan (1911-2004) introducerede missilforsvarssystem, der populært blev kaldt stjernekrigsprojektet.\nEfter at det Europæiske Fællesskab (EF) i 1970'erne havde været inde i en stagnationsperiode, kom samarbejdet i 1980'erne igen ind i en dynamisk udvikling. Der blev således udformet en ny traktat for samarbejdet, hvor realiseringen af Det Indre Marked (fri bevægelighed for varer, personer, tjenesteydelser og kapital mellem medlemslandene) stod centralt. Traktatudkastet blev kendt som Den Europæiske Fællesakt, i Danmark oftest kaldet EF-pakken. Det Radikale Venstre og Socialdemokratiet var skeptiske over for udkastet, bl.a. fordi det indeholdt en eksplicit sammenkobling mellem det overnationale fællesmarked og det mellemstatslige udenrigspolitiske samarbejde (EPS-samarbejdet) samt en øget brug af flertalsafgørelser. Realiseringen af Det Indre Marked berørte områder som miljø, arbejdsmarked, forbrugerbeskyttelse, arbejdsmiljø osv., og partierne frygtede, at de høje danske standarder ikke ville blive sikret godt nok, hvis Danmark ikke længere havde vetoret omkring disse spørgsmål.\nFirkløverregeringen havde således ikke nok mandater til at få EF-pakken vedtaget i Folketinget. Poul Schlüter besluttede derfor at udskrive en vejledende folkeafstemning om EF-pakken fremfor at udskrive et folketingsvalg. Dette kunne lade sig gøre, da Socialdemokratiet bakkede op om afstemningen.\nValget blev afholdt den 27. februar 1986 og blev en sejr for regeringen. 56,2 % stente for, 43,8 % imod. Dagen efter kunne Venstres udenrigsminister Uffe Ellemann-Jensen (f. 1941) derfor underskrive Fællesakten.\nFolketingsvalg 8. september 1987\nSchlüter-regeringen opnåede som den første borgerlige regering i mere end 60 år at sidde en hel valgperiode ud. Regeringens væsentligste bedrifter var at få vedtaget den faste forbindelse over Storebælt, beslutningen om at oprette et licens- og reklamefinansieret TV-2, tilslutningen til EF-pakken samt skattereformen fra 1985/86 og afskaffelsen af dyrtidsreguleringen i 1986. Til gengæld havde regeringen også måttet gribe ind i en overordentlig hård konflikt under overenskomstforhandlingerne på det private arbejdsmarked i 1985, hvor mere end 300.000 lønmodtagere var i konflikt. Forløbet resulterede i store demonstrationer mod regeringen.\nI 1987 måtte regeringen desuden erkende, at økonomien stadigvæk var dårlig. I 1986 var betalingsbalanceunderskuddet vokset til 35 mia. kr. Importen var steget med 7 % som følge af vækststigningen, mens eksporten til udlandet stod stille. Arbejdsløsheden var dog faldet fra gennemsnitlig 10,2 % i 1982 til 7,7 % i 1986, og det var lykkedes regeringen at bremse stigningen i de offentlige udgifter.\nPoul Schlüter udskrev valg til afholdelse den 8. september 1987. Den konkrete anledning var en arbejdskonflikt med edb-fagforeningen PROSA. Konflikten krævede et regeringsindgreb, men et folketingsvalg var under alle omstændigheder på dagsordenen for 1987. Det Konservative Folkeparti stod godt i meningsmålingerne og håbede på en fremgang, der kunne fravriste Socialdemokratiets dets position som dominerende midterparti. Valget blev dog en skuffelse for Firkløverregeringen, der samlet gik syv mandater tilbage (heraf mistede Det Konservative Folkeparti fire mandater og Venstre tre). Flertallet med Det Radikale Venstre var væk, og en ny borgerlig regering ville være afhængig af Fremskridtspartiets ni mandater for at nå 90. Samme aften meddelte statsministeren, at han demissionerede og ville indkalde til en dronningerunde.\narbejdsløshed arbejdsmarkedsforhold Centrum-Demokraterne De Danske Ministerier 1972-1993 Det Konservative Folkeparti Det Radikale Venstre EF/EU Kernestof dansk demokrati Kristeligt Folkeparti Niels Wium Olesen Rosanna Farbøl Socialdemokratiet Socialistisk Folkeparti Venstre økonomisk politik