Οδηγός κλάσης WildStar και παχέος εντέρου. Spellslinger DPS Build | Παιχνίδια | el.ll4ll.net\nΟδηγός κλάσης WildStar και παχέος εντέρου. Spellslinger DPS Build\nΤο Spellslinger είναι μια πολύ κινητή κατηγορία στο WildStar. Κάθε ικανότητά τους είναι χρήσιμη εν κινήσει με τα σωστά σημεία που τοποθετούνται. Όπως κάθε τάξη, δεν υπάρχει "τέλεια" κατασκευή, και αυτό είναι εντάξει. Θα πάω πάνω από το build που χρησιμοποιώ και γιατί. Ελπίζω να είστε έτοιμοι επειδή οι Spellslingers πυροβολούν πρώτα, στη συνέχεια πυροβολήστε ξανά αργότερα!\nΑν ψάχνετε για οτιδήποτε άλλο σχετίζεται με WildStar, ελέγξτε μας WildStar Οδηγοί.\nΑυτός ο οδηγός θα μεταβεί πάνω από το Spellslinger DPS που περιλαμβάνει:\nΠεριορισμένη δέσμη ενεργειών - Κάθε ικανότητα που χρησιμοποιώ και τι κάνουν.\nAMP Build - Κάθε AMP που χρησιμοποιώ, τι κάνουν και γιατί τους επέλεξα.\nΣυμβουλές περιστροφής - Βασική λίστα περιστροφής και προτεραιότητας για αυτήν την κατασκευή.\nΣύνθετο σύνολο ενεργειών\nΑν θέλετε να δείτε ακριβώς ποια είναι η κατασκευή, ανατρέξτε στο φόρτιστο DPS Build του Synzer στη διεύθυνση ws-base.com. Αυτός ο οδηγός θα εξηγήσει λεπτομερώς όλα όσα έχω επιλέξει. Ας ξεκινήσουμε εξηγώντας κάθε δυνατότητα σε αυτό το σετ.\nΑυτή η κατασκευή είναι για επίπεδο 50 PvE. Δεν χρησιμοποιεί την επιπλέον ικανότητα και τα σημεία AMP που μπορείτε να πάρετε. Έτσι χρησιμοποιεί αυτό 41 Πόντοι Ικανότητας και 45 σημεία AMP.\nΓρήγορη κλήρωση (Βαθμίδα 8) - Αυτή είναι η κύρια επίθεσή σας και το καθένα πρέπει να έχει εάν το DPS ως ξόρκι. Κάνει φυσική ζημιά.\nΔεν έχει cooldown και χρησιμοποιείται ως επί το πλείστον για downtime και για την επίδραση Tier 8.\nΣτην κατηγορία 8 αυτό αυξάνει την δύναμη προσβολής κατά 10% για 6 δευτερόλεπτα κάθε φορά που χτυπάς έναν εχθρό με την πλήρη διάρκεια της επίθεσης.\nΦορτισμένη βολή (Βαθμίδα 8) - Αυτή η δεξιοτεχνία προκαλεί μεγάλη ζημιά από τη μαγεία όταν τελειώνει.\nΣτην αρχή δεν αξίζει να πάρει κανείς, αφού δεν μπορείτε να το μετακινήσετε ενώ το χρησιμοποιείτε, αλλά μετά από να φτάσετε στο Tier 4 τουλάχιστον, μπορείτε να μετακινήσετε ενώ το ρίχνετε.\nΧρησιμοποιώντας τη ζημιά που προκαλείται από το ξόρκι μειώνεται ο χρόνος φόρτισης, ώστε να μπορείτε να το χρησιμοποιήσετε πολύ πιο γρήγορα.\nΒαθμίδα 8 σχεδόν Διπλασιάζει τη ζημιά η τελευταία χρέωση. Έχω δει έναν μεγάλο αριθμό όταν παίρνω ένα κρίσιμο χτύπημα.\nΆγριο φράγμα - Αυτή η ικανότητα διοχετεύεται σε φυσική ζημιά και πρέπει πάντα να χρησιμοποιείται με το Spell Surge.\nΑυτό κάνει μια καλή ζημιά, αλλά το θέλετε πραγματικά λόγω του αποτελέσματος Spell Surge. Κάνει περισσότερες ζημιές και διάτρηση 100% πανοπλία.\nFlame Burst - Μια μεγάλη μαγική επίθεση που επωφελείται από την υψηλή κρίσιμη επιτυχία.\nΑυτή η κίνηση είναι εφικτή μόνο μετά από ένα κρίσιμο χτύπημα, αλλά κάνει μεγάλες ζημιές.\nΔολοφονήστε - Ακριβώς ό, τι ακούγεται. Μια φυσική επίθεση σήμαινε να τελειώσει ο εχθρός.\nΚάνει πολύ περισσότερη ζημιά στους εχθρούς κάτω από το 30% της υγείας. Η έκδοση Spell Surge κάνει την ίδια ζημιά.\nΑληθινή λήψη (βαθμίδα 4) - Μακρά φυσική επίθεση που χτυπά 3 φορές συνολικά και τρυπώνει θωράκιση 35%.\nΑυτή η ικανότητα έχει ένα αρχικό χρονικό διάστημα 2 δευτερολέπτων και αγγίζετε την ικανότητα δύο φορές.\nΚάθε cast μετά το πρώτο μειώνεται κατά το ήμισυ.\nΗ βαθμίδα 4 αυξάνει τη θωράκιση θωράκισης στο 50%.\nΠύλη - Αυτή είναι η διακοπή σας.\nΑυτό είναι πιο αξιόπιστο από το Arcane Shock, αλλά βεβαιωθείτε ότι δεν πιέζετε τον εαυτό σας σε κίνδυνο.\nΆκυρο Slip - Η αγαπημένη μου ικανότητα Spellslinger. Αυτό σας εξοικονομεί τόσες φορές.\nΑυτό σας βάζει στο "The Void" για 3,5 δευτερόλεπτα. Δεν μπορείτε να υποστεί ζημιά ενώ βρίσκεστε εκεί.\nΌχι μόνο σπάει όλα τα CC, αυτό καταργεί κάθε απειλή. Μεγάλη για όταν παίρνετε πάρα πολλά.\nΕίναι επίσης χρήσιμο για την πλήρη αποφυγή επιθέσεων. Μόλις να γνωρίζετε το περιβάλλον σας οπότε δεν επιστρέφετε σε τηλεγράφημα εχθρού.\nΌπως όλα, αυτό εξαρτάται από αυτό που προσπαθείτε να κάνετε. Μερικές φορές μπορεί να χρειαστεί να καταστρέψετε περισσότερη θωράκιση διακοπής και στη συνέχεια να χρησιμοποιήσετε τη Βαθμίδα 4 και να πάρετε την Βαθμίδα 4 από True Shot.\nΜπορεί να χρειαστείτε παγίδα ή ρίζα και αν το κάνετε, θα έπαιρνα την True Shot και θα χρησιμοποιούσα είτε Chill είτε Flash Freeze. Όλα είναι περιστασιακά.\nΤα AMP είναι σαν τα σημεία ταλέντων σε άλλα MMOs. Είναι εξίσου σημαντικές για την κατασκευή σας επειδή αυξάνουν τη ζημιά και ξεκλειδώνουν περισσότερες δεξιότητες / εφέ.\nΔύναμη επίθεσης 1-3 - Συνδυασμένα, αυξάνουν την δύναμη επίθεσης σας 7.5%.\nArmor Pierce 1-3 - Συνδυασμένα, αυξάνουν την τσέπη σας 6%.\nΔιάλειμμα 1-3 - Συνδυασμένα, αυξάνουν τη διαγραφή 3%.\nΚρίσιμη επιτάχυνση - Δημιουργεί 6 εξουσίες ορθογραφίας όταν λάβετε ένα κρίσιμο χτύπημα. Μπορεί να εμφανιστεί μόνο κάθε 6 δευτερόλεπτα.\nΔάκτυλα σκανδάλης - Χρησιμοποιώντας το Quick Draw μειώνετε όλα τα cooldowns κατά 0,5 δευτερόλεπτα.\nDeadly Αλυσίδα - Η προσγείωση σε μια μαγική ή φυσική επίθεση παρέχει ένα Empower για αυτό το είδος βλάβης. Το Empower αυξάνει τη ζημιά αυτού του τύπου κατά 1,5% και στοιβάζει 3 φορές.\nΖημιά από υπερτάσεις - Χρησιμοποιώντας τη δυνατότητα Spell Surged αυξάνεται η ζημιά που έχει αντιμετωπιστεί κατά 10% για 4 δευτερόλεπτα.\nΔολοφονήστε - Ξεκλειδώστε την ικανότητα δολοφονίας.\nGunslinger - Χρησιμοποιώντας μια ικανότητα με cooldown αυξάνει την κρίσιμη πιθανότητα επιτυχίας κατά 2,5% και τις στοίβες 3 φορές.\nΥβριδικά A / S AMPs\nΚρίσιμη κρίση 1-3 - Συνδυασμένη, αυξάνει την πιθανότητα επιτυχούς επιτυχίας 6%.\nΚρίσιμη βαρύτητα Βαρύτητα 1-3 - Συνδυασμένη, αυξάνει την κρίσιμη σοβαρότητα χτυπημάτων κατά 12%.\nΚύμα δύναμης - Αυξάνει την δύναμη επίθεσης και υποστήριξης από 8.6% του τρέχοντος μέγιστου, ενώ υπό τις επιπτώσεις του Spell Surge.\nΟι βαθμίδες 1 AMP για τα δύο τμήματα είναι αυτονόητες, θέλετε αυτές τις ενισχύσεις stat.\nΚρίσιμη επιρροή είναι μεγάλη επειδή παίρνετε ξανά πίσω, που χρησιμοποιείται για Spell Surge, όταν παίρνετε κρίσιμες επιτυχίες.\nΔάκτυλα ενεργοποίησης αλλάζει τα πράγματα πολύ, δίνοντάς σας χαμηλότερα cooldowns κάθε φορά που χρησιμοποιείτε Quick Draw. Με το Tier 8 Quick Draw, θα πρέπει να το χρησιμοποιείτε συχνά συχνά.\nΘανάσιμη αλυσίδα βασικά σας δίνει δωρεάν ζημιές ενισχύει μόνο για το χτύπημα με τις επιθέσεις σας.\nΖημιές από κύμα σας δίνει μια μεγάλη ώθηση ώθηση για τη χρήση ξόρκι κύματα ικανότητες, το οποίο αυτό το κτίριο εκμεταλλεύεται πλήρως.\nGunslinger αυξάνει την πιθανότητα επιτυχούς επιτυχίας ακόμη περισσότερο, οπότε σίγουρα θέλετε αυτό.\nΚύμα δύναμης είναι μια άλλη μεγάλη ώθηση ώθηση μόνο για τη χρήση Spell Surge.\nΑυτή είναι η βασική περιστροφή / προτεραιότητα που χρησιμοποιώ. Για μια ευκολότερη προβολή, ελέγξτε την κατασκευή του ws-base.com.\nΣημείωση: Αυτό είναι χωρίς το Trigger Fingers Amp. Οι χρόνοι ψύξης ποικίλλουν.\nΑστέρι με Γρήγορη κλήρωση, (Spell Surge On), Φορτισμένη βολή, Άγριο φράγμα, (Spell Surge Off) Χρησιμοποιήστε το Flame Burst αν το procs αυτή τη φορά. Γρήγορη κλήρωση ξανά, (Spell Surge On), True Shot, (Spell Surge Off), γρήγορη κλήρωση.\nΣε αυτό το σημείο, εάν η φόρτιση είναι ενεργοποιημένη, χρησιμοποιήστε την. Θέλετε να χρησιμοποιήσετε το Spell Surge σίγουρα στο Wild Barrage. Συνήθως προσπαθήστε να μείνετε πάνω από 2 χρεώσεις εξουσίας Spell και αν έχετε αρκετό, χρησιμοποιήστε το για True Shot.\nΓια ζημιές λόγω έκρηξης, ξεκινήστε με Γρήγορη κλήρωση, (Spell Surge On), Άγριο φράγμα, τότε όλα Δολοφονώ φόρτισης (Spell Surge Off).\nΑκόμα κι αν θέλετε να αποθηκεύσετε το Assassinate όταν το αφεντικό είναι κάτω από 30%, εξακολουθεί να είναι μια αύξηση DPS για να το χρησιμοποιήσετε ανά πάσα στιγμή.\nΧρησιμοποιήστε το μεταξύ της κανονικής σας περιστροφής, απλά φροντίστε να το αποθηκεύσετε όταν το αφεντικό πλησιάσει το 30%.\nΟ λόγος που θέλετε να αλλάξετε και να απενεργοποιήσετε το Spell Surge είναι να εξοικονομήσετε Spell Power ενώ χρησιμοποιείτε το Tier 8 Quick Draw.\nΘα θελήσετε να χρησιμοποιήσετε αυτό μεταξύ κάθε ικανότητας ή 2, έτσι εξοικονομείτε τη δύναμή σας.\nΑυτό περιβάλλει αυτόν τον πλήρη οδηγό για το Spellslinger DPS που χτίστηκε για WildStar. Το guildmate μου, Tora, έχει άλλη κατασκευή αν προτιμάς τον Ignite, απλά δεν λειτουργεί για μένα τώρα. Για άλλες συμβουλές και οδηγούς, επισκεφθείτε την ιστοσελίδα μας WildStar Οδηγοί.\nΑν έχετε οποιεσδήποτε ερωτήσεις ή προτάσεις της δικής σας κατασκευής, επιτρέψτε μου να ξέρω στα σχόλια!


Κέφι, ενθουσιασμός και μεγάλη χαρά ήταν τα συναισθήματα που πλημμύρισαν όλους τους εργαζόμενους της MSD γιατί όταν αγωνίζεσαι για ένα σκοπό όπως το να βελτιώσεις ζωές παιδιών, η χαρά πολλαπλασιάζεται. Ο ενθουσιασμός κορυφώθηκε όταν στο χώρο βρέθηκε ο Παναγιώτης Γιαννάκης.\nΟ Έλληνας πρώην καλαθοσφαιριστής και νυν προπονητής εμψύχωσε κατά τη διάρκεια όλης της ημέρας τις ομάδες προκειμένου να πετύχουν τους στόχους τους. Οι ομάδες λειτούργησαν συντονισμένα, αναμετρήθηκαν κυρίως με τον καιρό και παρά το τσουχτερό κρύο, τα πήγαν περίφημα. Στο τέλος όλων των δραστηριοτήτων συγκέντρωσαν 8.000 πόντους τα οποία η εταιρία δώρισε σε ευρώ στην Κιβωτό του Κόσμου στον Βόλο.\n«Στην MSD πιστεύουμε ιδιαίτερα στην έννοια της Κοινωνικής Ευθύνης και του εθελοντισμού και το αποδεικνύουμε καθημερινά σε ότι κάνουμε. Έτσι λοιπόν και φέτος, στο πλαίσιο της ετήσιας συνάντησης της εταιρείας μας στο Βόλο, σκεφτήκαμε ότι πρέπει να αφήσουμε ένα σημαντικό αποτύπωμα στην τοπική κοινωνία.


ΟΦΗ: Κυπριακό σενάριο για ΑΠΟΕΛ και Σακόρ - Oficrete.gr - Ανάψαμε φωτιά...\nΟΦΗ: Κυπριακό σενάριο για ΑΠΟΕΛ και Σακόρ\nΕνδιαφέρον για τον παίκτη του ΟΦΗ;\nΑναλυτικά το δημοσίευμα κυπριακής ιστοσελίδας:\nΤις τελευταίες μέρες οι αναφορές στο ρεπορτάζ του ΑΠΟΕΛ για τον ΟΦΗ ήταν καθημερινές, αφού ήταν σε εξέλιξη διαπραγμάτευση για την παραχώρηση εκεί του Πραξιτέλη Βούρου. Όμως φαίνεται πως και ένα άλλο όνομα πιθανό να συνδέσει τις δυο ομάδες, αυτό του Βαγιέμπα Σακόρ.\nΠρόκειται για παίκτη που γεννήθηκε στη Λιβερία αλλά έχει υπηκοότητα Νορβηγίας, κάτι που συναντάς στο ρόστερ και με τον Ζαχίντ. Παίζει στον ΟΦΗ ενάμιση χρόνο ως κεντρικός μέσος ενώ έχει συμβόλαιο και για την επόμενη αγωνιστική περίοδο. Από πολύ μικρός, 17 ετών, είχε μετακομίσει στις ακαδημίες της Γιουβέντους και ήταν στο δυναμικό μέχρι το 2018 αλλά ποτέ δεν έγινε στέλεχος της πρώτης ομάδας. Ο ΟΦΗ τον απέκτησε από την Γκέτεμποργκ.\nΕίναι σε θέση που ο ΑΠΟΕΛ ψάχνει να ενισχυθεί και μένει να δούμε αν θα γίνει επίσημη κίνηση προς τον ΟΦΗ για να τον αποκτήσει. Σημειώνεται πως πληροφορίες στην Ελλάδα ήθελαν και τον Ολυμπιακό να ενδιαφέρεται.


Ζώδια ημέρας από τη Λίτσα Πατέρα - YourTipster.gr\nΖώδια ημέρας από τη Λίτσα Πατέρα\n18/09/2018 by YOURTIPSTER TEAM\nΣήμερα η Σελήνη είναι στον Αιγόκερω και δείχνει ότι θα θέλουμε να κάνουμε πράγματα σε επαγγελματικό και κοινωνικό επίπεδο.\nΟ Ουρανός είναι στον Ταύρο και κάνει τετράγωνο με τον πυροδότη Άρη και θα λέγαμε ότι πρέπει να προσέχετε γιατί μπορεί να δημιουργηθούν εντάσεις. Η ανάδρομη πορεία του Ουρανού, όμως, φέρνει και θέματα καλοκαιριού στην επιφάνεια πάλι.\nΚριός: Τα επαγγελματικά είναι σημαντικά για σας αλλά πρέπει και να ασχοληθείτε με αυτά. Ένα οικονομικό θέμα μπορεί να τακτοποιηθεί αλλά κάντε το γρήγορα, τρέξτε το τώρα, πριν τις 5 Οκτωβρίου. Μην μπλέξετε φίλους με οικονομικά.\nΤαύρος: Είναι πολύ σημαντική περίοδος για σας με τον Ουρανό, δε θα φύγει εύκολα. Μπορεί να έχετε μια ένταση σε επαγγελματικό επίπεδο αλλά θα βρείτε εξαιρετικές λύσεις στο τέλος. Αλλαγές που γίνονται τώρα, θα αποδώσουν αργότερα, μη βιάζεστε, δώστε χρόνο. Ο Κρόνος θα σας δείξει το δρόμο για νέες σταθερές καταστάσεις.\nΖώδια νέας σεζόν από τη Λίτσα Πατέρα\nΔίδυμοι: Σας απασχολεί πολύ η ακίνητη περιουσία. Εμπόδια προκύπτουν σε νομικά και διαδικαστικά θέματα. Όλα αυτά θα πάρουν τέλος από την άλλη εβδομάδα με τον Ήλιο στο Ζυγό και τότε τα πράγματα θα είναι καλύτερα.\nΚαρκίνος: Εσείς του Ιουνίου έχετε συναισθηματικά θέματα να σας απασχολούν. Από 5 Οκτωβρίου και μετά θα μετανιώσετε γι’αυτό κρατήστε μικρό καλάθι. Ενώ εσείς του τελευταίου 10ημέρου τώρα θα απολαύσετε τη ζωή σας μετά από ό,τι έχετε περάσει τον τελευταίο καιρό. Έχετε εξαιρετική τύχη σε επιχειρηματικό επίπεδο. Η Σελήνη σήμερα απέναντί σας δεν είναι και το καλύτερο αλλά μια μέρα είναι, θα περάσει.\nΛέων: Είστε καιρό σε ένταση, ειδικά οι γεννημένοι τον Ιούλιο, αλλά θα βρεθεί λύση. Με τα οικογενειακά έχετε θέματα που σας απασχολούν. Από μεθαύριο τα πράγματα καλύτερα για σας. Θυμηθείτε ότι εσείς των τελευταίων ημερών, ένα σχέδιο που δεν έχει τελειώσει, θα επανέλθει και θα πάρει το δρόμο του.\nΕρωτικά Φθινοπώρου από την Άση Μπήλιου\nΠαρθένος: Έρχονται μηνύματα και ειδήσεις για θέματα που σας απασχολούν. Κάποια εμπόδια που θα συναντήσετε αυτές τις μέρες είναι παροδικά, μη σας ανησυχούν. Προσοχή στην υγεία σας.\nΖυγός: Είστε λίγο μπερδεμένοι με άγχος, νιώθετε περίεργα. Θέματα παιδιών και ερωτικού συντρόφου σας απασχολούν. Ένα οικογενειακό θέμα επίσης έχει προτεραιότητα.\nΣκορπιός: Κάτι γίνεται με σας, σημαντικό. Η γοητεία σας ανεβαίνει. Μετά τις 5 Οκτωβρίου πράγματα θα καθυστερούν γι’ αυτό κάντε τώρα πράγματα, βιαστείτε. Με τα οικογενειακά σας έχετε ένα θέμα. Σήμερα θα δείτε φίλους, είναι καλή μέρα.\nTips για να μην φριζάρουν τα μαλλιά σου\nΤοξότης: Κάνετε μυστικά πράγματα τώρα που θα βγουν στην επιφάνεια από τον Νοέμβρη και μετά. Μην κάνετε υπερβολές, προετοιμαστείτε απλά για τα καλύτερα.\nΑιγόκερως: Εσείς των πρώτων ημερών, ναι μεν έχετε θέματα αλλά σιγά σιγά επιλύονται τώρα μέχρι αρχές Οκτώβρη. Τα οικονομικά τρέχουν και σήμερα με τη Σελήνη στο ζώδιό σας θα ασχοληθείτε με προσωπικά σας θέματα. Οι φίλοι σας στηρίζουν και σας δίνουν σημαντική βοήθεια.\nΥδροχόος: Δράση για σας. Δουλειές αλλά ακόμα και γυμναστική. Ο Άρης και ο Ουρανός δείχνουν ένταση σε οικογενειακό επίπεδο. Τα επαγγελματικά πάνε καλά αρκεί να μην υπεραισιοδοξείτε. Επαφές με εξωτερικό ευνοούνται.\nEstee Lauder: Online εκπτώσεις σε όλα τα προϊόντα!\nΙχθείς: Επαφές με το εξωτερικό που μπορεί να είναι και συναισθηματικές. Προσοχή γιατί από 5 Οκτωβρίου μπορεί να αρχίσετε να το μετανιώνετε. Μια αλλαγή που μπορεί να σας ενοχλήσει να ξέρετε ότι στο τέλος θα είναι πολύ καλή.\nΑναλυτικά οι προβλέψεις της Λίτσας Πατέρα:\nTags: toptip, αστρολογικές προβλέψεις, ζώδια, Λίτσα Πατέρα\nΑιμίλιος Χειλάκης: «Μια φαρυγγίτιδα στα 14 έβαλε τη μαεστρία της στη φωνή μου»\nΤο video που έγινε αμέσως viral εμπεριέχει ένα σημαντικό μήνυμα\nΠατέρας και κόρη πέθαναν αγκαλιά προσπαθώντας να περάσουν τα σύνορα\nΗ συγκλονιστική εικόνα που κάνει το γύρο του κόσμου\nΟ Νίκος Μουτσινάς τρώει καραμελωμένες ακρίδες


ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΜΕΛΕΤΗ. Σπουδαστής: Κλαυδιανός Νίκος. Επιβλέπων καθηγητής: Βελισσάριος Δημήτρης - PDF\nΠΤΥΧΙΑΚΗ ΜΕΛΕΤΗ. Σπουδαστής: Κλαυδιανός Νίκος. Επιβλέπων καθηγητής: Βελισσάριος Δημήτρης\nDownload "ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΜΕΛΕΤΗ. Σπουδαστής: Κλαυδιανός Νίκος. Επιβλέπων καθηγητής: Βελισσάριος Δημήτρης"\n1 ΤΕΙ ΚΑΛΑΜΑΤΑΣ ΣΧΟΛΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΘΕΡΜΟΚΗΠΙΑΚΩΝ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΜΕΛΕΤΗ Θέμα: «Μελέτη της δυνατότητας απομονώσεων του ιού Υ της πατάτας να προκαλέσουν συμπτώματα της νεκρωτικής δακτυλιωτής ασθένειας των κονδύλων της πατάτας». Σπουδαστής: Κλαυδιανός Νίκος Επιβλέπων καθηγητής: Βελισσάριος Δημήτρης ΑΘΗΝΑ 2004\n2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 1 Α. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1) Ο ΙΟΣ Υ ΤΗΣ ΠΑΤΑΤΑΣ 1.1 Εισαγωγή Μετάδοση Συμπτώματα και ασθένειες Χαρακτηριστικά και στελέχη του ιού 5 1Αα.Απομονώσεις ΝΤΝ του ιού Υ της πατάτας Προσδιορισμός - Διάγνωση Αντιμετώπιση 8 2) ΑΛΛΕΣ ΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΑΣΘΕΝΕΙΕΣ ΤΗΣ ΠΑΤΑΤΑΣ 2.1 Καρούλιασμα των φύλλων (ΡΙ_Ι3ν) Μωσαϊκό οφειλόμενο στον ιό Α της πατάτας (Ρ\_/Α) Απλό μωσαϊκό (Ρ\_/Χ) Τραχύ μωσαϊκό (Ρ\_/Χ + Ρ\_/Υ) Κυματοειδές μωσαϊκό (Ρ\_/Χ + Ρ\_/Α) Ιός 3 της πατάτας Ιός Μ της πατάτας 15 3) ΣΠΟΡΟΠΑΡΑΓΩΓΗ ΥΓΙΟΥΣ ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΠΑΤΑΤΑΣ 3.1 Εισαγωγή Παραγωγή πιστοποιημένου πατατοσπόρου 17\n3 4) ΙΟΛΟΓΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ - ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ 4.1 Ιολογικός έλεγχος γενικά Μέθοδοι IN VIVO Σπουδαιότεροι μέθοδοι IN VITRO Ορρολογικές μέθοδοι Μεθοδολογία ενζυμικής ανοσοπροσροφήσεως (ELISA) Άμεση ELISA Πολυκλωνικά αντισώματα Μονοκλωνικά αντισώματα Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) Αρχή της PCR Χαρακτηριστικά της PCR 31 Β. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 Φυτικό υλικό και στελέχη του ιού Πειραματικές συνθήκες και μηχανική μόλυνση Μέθοδος ELISA και έλεγχος φυτικού υλικού Ανοσοδέσμευση RT-PCR (IC-RT-PCR) Εκτίμηση δείκτη ασθένειας 49\n4 3) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1 Χαρακτηριστικά απομονώσεων Βιολογικός έλεγχος Μοριακός έλεγχος Εκδήλωση συμπτωμάτων του ιού Επί των φυτών πατάτας Επί των κονδύλων Διακύμανση Θερμοκρασίας Δείκτης Ασθένειας 62 4) ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 65 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 66\n5 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Η παρακάτω μελέτη αποτελεί μέρος ερευνητικού προγράμματος που πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Ιολογίας του Μπενάκειου Φυτοπαθολογικού Ινστιτούτου με σκοπό την διερεύνηση της ικανότητας απομονώσεων του ιού Υ της πατάτας να προκαλέσουν συμπτώματα της νεκρωτικής δακτυλιωτής κηλίδωσης των κονδύλων της πατάτας (PTNRD). Η εργασία αποτελείται από δυο τμήματα. Το πρώτο μέρος είναι το θεωρητικό στο οποίο γίνεται αναφορά στον ιό Υ της πατάτας κυρίως, αλλά και σε άλλες ιολογικές ασθένειες της πατάτας. Επίσης αναλύονται οι διαγνωστικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται και πως γίνεται ένας ιολογικός έλεγχος. Το δεύτερο μέρος είναι το πειραματικό, όπου περιγράφεται η διαδικασία, οι μέθοδοι και τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο της ικανότητας απομονώσεων του ιού Υ της πατάτας, να προκαλεί τα συμπτώματα της ασθένειας PTNRD σε διάφορες ποικιλίες πατάτας. Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται στο πειραματικό μέρος είναι η μέθοδος (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA), και η 1C - RT - PCR.(immunocapture reverse transcript polymerase chain reaction). H τελευταία είναι από τις πιο ευαίσθητες και σύγχρονες μεθόδους που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση και ταυτοποίηση ιων. Μέσω αυτής της μεθόδου ανιχνεύουμε αποκλειστικά απομονώσεις ΝΤΝ του ιού Υ της πατάτας, που μέχρι τώρα θεωρούνταν οι μόνες ικανές να προκαλέσουν τα νεκρωτικά συμπτώματα της ασθένειας PTNRD σε κονδύλους πατάτας.. ι\n6 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 2\n7 1. Ο ΙΟΣ Υ ΤΗΣ ΠΑΤΑΤΑΣ (POTATO VIRUS Υ) 1.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ο ιός Υ της πατάτας (Potato virus Υ, PVY) είναι ένας από τους σπουδαιότερους ιούς της πατάτας. Αυτό οφείλεται στη γρήγορη μετάδοση του ιού καθώς επίσης και στην μείωση της παραγωγής πού μπορεί να προκαλέσει, από 40% - 80% αναλόγως της ευπάθειας της ποικιλίας και του στελέχους του ιού. Μικτές μολύνσεις με τους ιούς PVA, PVX και PVS προκαλούν μεγάλες ζημιές και μερικές φορές καταστρέφουν τελείως την καλλιέργεια. Ο ιός είναι κυρίως διαδεδομένος σε όλες τις χώρες που καλλιεργούν πατάτα και εκτός αυτής προσβάλει την τομάτα, τον καπνό και την πιπεριά. 1.2 ΜΕΤΑΔΟΣΗ Ο ιός μπορεί να μεταδοθεί με μηχανικό τρόπο (με το χυμό ή την τριβή) και με εμβολιασμό. Στην φύση ο ιός μεταδίδεται από μολυσμένο πατατόσπορο και από τουλάχιστον 73 είδη αφίδων. Ο ιός μεταφέρεται από τις αφίδες στην άκρη του στιλέτου και παραμένει εκεί ενεργός για ένα μικρό χρονικό διάστημα (συνήθως για μερικές ώρες). Ο ιός Υ της πατάτας μπορεί να βοηθήσει στη μετάδοση ενός διαφορετικού ιού (PVX). Η ένταση της συνεργιστικής αυτής δράσης εξαρτάται από το συνδυασμό των ιών και της ποικιλίας αλλά συνήθως τα συμπτώματα είναι πολύ πιο σοβαρά αφού συνδυάζονται. 3\n8 1.3 ΣΥΜΠΤΩΜΑΤΑ ΚΑΙ ΑΣΘΕΝΕΙΕΣ Τα συμπτώματα που εμφανίζουν τα προσβεβλημένα φυτά διαφέρουν ανάλογα με την ποικιλία του φυτού, το στέλεχος του ιού και κυμαίνονται από ελαφρύ μωσαϊκό μέχρι έντονες νεκρώσεις. Διακρίνονται σε δυο κατηγορίες, στα πρωτογενή συμπτώματα (primary symptoms) που παρατηρούνται 3-4 εβδομάδες μετά την μόλυνση κυρίως στα νεαρά φύλλα της κορυφής και στα δευτερογενή συμπτώματα (secondary symptoms) σε φυτά που προέρχονται από μολυσμένους κονδύλους. Συμπτώματα πρωτογενούς μόλυνσης: Αφορούν στην εμφάνιση νεκρωτικών ραβδώσεων κατά μήκος των νευρώσεων της κάτω επιφάνειας των φύλλων. Στη συνέχεια τα φύλλα κυρίως της βάσης του φυτού νεκρώνονται ή πέφτουν ή παραμένουν κρεμασμένα ξηρά πάνω στο φυτό. Τα φύλλα της κορυφής παραμένουν μικρά, ελαφρώς χλωρωτικά και σχηματίζουν ροζέτα. Τα φυτά αυτά τελικά παραμένουν καχεκτικά. Σε άλλες ποικιλίες που καλλιεργούνται στη Βόρεια Ευρώπη τα συμπτώματα διαφέρουν και εμφανίζονται ως ελαφρύ μωσαϊκό των φύλλων ή ως μικροφυλλία με σκληρά, χλωρωτικά και τραχείας επιφάνειας φύλλα. Συμπτώματα δευτερογενούς μόλυνσης: Εμφανίζουν φυτά που προέρχονται από μολυσμένο σπόρο, αφορούν νανισμό, μικροφυλλία, κιτρινοπράσινο μωσαϊκό και τραχύτητα του ελάσματος των φύλλων. Σε χαμηλές θερμοκρασίες (10 C) και υψηλές θερμοκρασίες (25 C) έχουμε απόκρυψη των συμπτωμάτων αλλά η ασθένεια αναγνωρίζεται από την τραχύτητα που εμφανίζεται στα φύλλα. Τα φύλλα είναι εύθριπτα και σχηματίζουν ρόδακα στην κορυφή του βλαστού. Τα φυτά παραμένουν καχεκτικά και παράγουν μικρότερους κονδύλους οι οποίοι όταν φυτευτούν δίνουν φυτά με τα ίδια συμπτώματα. 4\n9 Το στέλεχος PVYN προκαλεί ασαφή ποικιλοχλώρωση τόσο την πρώτη όσο και την δεύτερη χρονιά. Γενικά υπάρχει μια σχέση ανάμεσα στα συμπτώματα που εμφανίζονται στα φύλλα και σε αυτά που εμφανίζονται στους κονδύλους. Ποικιλίες που αντιδρούν με νέκρωση στη φυλή PVY0, μερικές φορές εμφανίζουν καστανά δακτυλίδια στο φλοιό των κονδύλων. Επίσης η φυλή PVYC προκαλεί σε ορισμένες ποικιλίες εσωτερική και εξωτερική νέκρωση των κονδύλων. Λόγω της ποικιλομορφίας των συμπτωμάτων η διάγνωση της ασθένειας αυτής θα πρέπει να βασίζεται σε εργαστηριακές δοκιμές πάνω σε φυτά δείκτες με ανοσολογικές ή μοριακές μεθόδους. Ο ιός Υ προσβάλλει πολλά ζιζάνια καθώς και καλλιεργούμενα φυτά όπως την πιπεριά, την τομάτα, τον καπνό, τα οποία μπορούν να αποτελέσουν πηγές διατήρησης και μετάδοσης του ιού. 1.4 ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΚΑΙ ΣΤΕΛΕΧΗ ΤΟΥ ΙΟΥ Ο ιός Υ της πατάτας (PVY) είναι μέλος του γένους Potyvirus,της οικογένειας Potyviridae. Έχει μήκος 730 ηπι και πάχος 11nm. Σε χυμό καπνού το σημείο θερμικής αδρανοποίησης είναι μεταξύ 50 C και 62 C, η οριακή αραίωση 10'2-10'6και η διάρκεια ζωής in vitro είναι 7-50 ημέρες. Έχουν χαρακτηρισθεί τρεις ομάδες στελεχών του ιού ανάλογα με τα συμπτώματα που προκαλούν σε ορισμένα φυτά δείκτες, όπως είναι το Nicotians tabacum. Οι ομάδες στελεχών είναι Potato virus Υ (PVY ), Potato virus (PVYN) και Potato virus Y (PVYC). Από τις τρεις παραπάνω ομάδες η PVYN είναι η πιο επικίνδυνη γιατί στις περισσότερες ποικιλίες η επέκταση της είναι πιο γρήγορη και προκαλεί εντονότερες νεκρώσεις. Το στέλεχος PVY0 προκαλεί ήπιο ή έντονο μωσαϊκό και αλλού τοπική και διασυστηματική νέκρωση. Το στέλεχος PVYC φαίνεται σήμερα είναι αρκετά περιορισμένο γιατί οι περισσότερες ποικιλίες εμφανίζουν 5\n10 ανθεκτικότητα αγρού καθώς επίσης και στο γεγονός ότι τα περισσότερα μέλη του στελέχους δεν μεταδίδονται με αψίδες. Τα στελέχη μπορούν να διαφοροποιηθούν ορολογικά με εξειδικευμένα μονοκλωνικά αντισώματα που έχουν παρασκευασθεί σε διάφορα εργαστήρια. Σε μοριακό επίπεδο, διάφορες προσεγγίσεις έχουν γίνει για τον προσδιορισμό των σχέσεων των στελεχών του PVY μεταξύ τους: σύγκριση αλληλουχιών νουκλεοτιδίων του γονιδίου της καψιδιακής πρωτεΐνης και της 3' μη μεταφραζόμενης περιοχής (NTR) καθώς και της Ρ1 πρωτεΐνης and 5 NTR- χαρτογράφηση με ανάλυση πολυμορφισμού μήκους θραυσμάτων περιορισμού (RFLP) του γονιδίου της καψιδιακής πρωτεΐνης, της Ρ1 πρωτεΐνης and 5 NTR, όπως και ολοκλήρου του γονιδιώματος. Μια υποομάδα του PVYNστελέχους που τα τελευταία χρόνια απασχολεί έντονα διεθνώς τους πατατοκαλλιεργητές είναι οι ισχυρές παθογόνες απομονώσεις ΝΤΝ του ιού Υ. 1.4.α. ΑΠΟΜΟΝΏΣΕΙΣ ΝΤΝ ΤΟΥ ΙΟΥ Y ΤΗΣ ΠΑΤΑΤΑΣ Οι απομονώσεις PVYNTN προκαλούν την ασθένεια της δακτυλιωτής κηλίδωσης των κονδύλων της πατάτας ή PTNRD (Potato Tuber Necrotic Ringspot Disease).Η ασθένεια προκαλεί μεγάλα νεκρωτικά δαχτυλίδια στους κονδύλους της πατάτας. Ακριβής ανίχνευση των συγκεκριμένων αυτών απομονώσεων επιτεύχθηκε με την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) που αποτελεί και την μοναδική μέθοδο που επιτυγχάνει τη διάκριση των απομονώσεων ΝΤΝ από τις υπόλοιπες της ομάδας στελεχών Ν του ιού, όπου ανήκει και η ίδια. Ο διαχωρισμός των απομονώσεων PVYNTN από αυτές του PVYN με την βοήθεια μοριακών τεχνικών δεν είναι πάντα εύκολος εξαιτίας της μεγάλης ποικιλομορφίας που έχει αυτή η υποομάδα. Το χαρακτηριστικό προϊόν της PCR είναι αυτό 6\n11 των 835 ζευγών βάσεων. Η ασθένεια εμφανίστηκε τις αρχές τις δεκαετίας του '80 στην Ουγγαρία και έχει εξαπλωθεί σε όλο τον κόσμο. Πρωτοεμφανίστηκε στην Ελλάδα το 1994 σε μολυσμένους πατατόσπορους προερχόμενους από την Ολλανδία. Σε όλους τους κονδύλους οι οποίοι ελέγχθηκαν με την ορρολογική μέθοδο DAS-ELISA ανιχθεύθηκε ο ιός Υ της πατάτας. Τα μέτρα που πάρθηκαν τότε δεν επέτρεψαν την περαιτέρω διάδοσή της. Το 1998 όμως, η ασθένεια έκανε πάλι την εμφάνιση της με πιο επιδημική μορφή κυρίως σε φυτείες της ποικιλίας Hermes από εισαχθέντα πατατόσπορο Σκοτίας και δυστυχώς από τότε απομονώθηκε και σε πολλές άλλες περιοχές της χώρας.. Όλα τα παραπάνω δεδομένα δείχνουν ότι πρόκειται για μία επικίνδυνη φυλή που χαρακτηρίζεται από έντονο επιδημικό χαρακτήρα. 1.5 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ - ΔΙΑΓΝΩΣΗ Προσπάθειες γίνονται διεθνώς από πολλά εργαστήρια για την παραγωγή απαλλαγμένων από ιούς φυτικών υλικών, ένας στόχος ο οποίος για να επιτευχθεί απαιτεί την διαθεσιμότητα ακριβών και γρήγορων μεθόδων για την ανίχνευση σε πολύ μικρά επίπεδα, ιοσωμάτιων και ιικών RNA μορίων. Για αυτό το λόγο.εντατική έρευνα έχει ξεκινήσει για την ανίχνευση του PVY και τη διαφοροποίηση μεταξύ των στελεχών. Η ορρολογική μέθοδος ELISA παραμένει η μέθοδος επιλογής για μια ανίχνευση ρουτίνας. Παρόλα αυτά, η ευαισθησία της δεν ανιχνεύει μόλυνση σε κονδύλους σε λήθαργο ή στις αφίδες και η γενική ακτίνα ανίχνευσης δεν διαχωρίζει απομονώσεις όπως αυτά του PVYNTN. Για τους παραπάνω λόγους, μια σειρά από μοριακές μεθόδους αναπτύχθηκαν όπως ο μοριακός υβριδισμός, η αλυσιδωτή αντίδραση της 7\n12 πολυμεράσης (PCR),σε διάφορα πρωτόκολλα, IC - PCR (Immunocapture polymerase chain reaction), PCR - ELISA (PCR - microplate hybridization), και πιο πρόσφατα η RealTime PCR και η ισοθερμική NASBA. Η ανάπτυξη τόσο ευαίσθητων τεχνικών κάνει δυνατή την ανίχνευση ιών,όπως του PVY, εκεί όπου βρίσκονται σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις. 1.6 ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ Για την αντιμετώπιση του ΡνΥ και γενικότερα των ιώσεων στη γεωργική πράξη δεν υπάρχουν γνωστά θεραπευτικά μέτρα. Προληπτικά προτείνεται εφαρμογή των παρακάτω μέτρων: Χρησιμοποίηση πιστοποιημένου πατατόσπορου. Πιστοποιημένος πατατόσπορος, ο οποίος χρησιμοποιείται για παραγωγή πατάτας προς κατανάλωση, θεωρείται εκείνος στον οποίο ο αριθμός των μολυσμένων κονδύλων από τους ιούς δεν υπερβαίνει σε ποσοστό το 10% των κονδύλων αθροιστικά για τους σημαντικούς ιούς. Πλήρως απαλλαγμένος από ιώσεις πατατόσπορος δεν είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθεί για παραγωγή πατάτας προς κατανάλωση καθόσον τέτοιος πατατόσπορος έχει υπερβολικά υψηλή τιμή, ασύμφορη για τον παραπάνω σκοπό και επίσης βρίσκεται στο στάδιο των μικροκονδύλων οι οποίοι είναι κατάλληλοι μόνο για παραγωγή πατατόσπορου. Αποφυγή τεμαχισμού και ιδίως πολυτεμαχισμού του πατατόσπορου διότι με αυτό τον τρόπο αυξάνεται το αρχικό ποσοστό μολυσμένων κονδύλων οι οποίοι με τη σειρά τους θα δώσουν μεγαλύτερο αριθμό 8\n13 πηγών μόλυνσης μέσα στο χωράφι. [ΕΚΔΟΣΕΩΝ &ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΣ Απομάκρυνση και καταστροφή των ζιζανίων και των εθελοντών φυτών πατάτας που προέρχονται από προηγούμενη καλλιέργεια καθόσον αποτελούν σοβαρές πηγές μόλυνσης. Ανθεκτικές ποικιλίες. Αυτές λαμβάνονται είτε με μεθόδους κλασικής γενετικής (διασταυρώσεις) είτε με τις σύγχρονες μεθόδους γενετικής μηχανικής. Στην περίπτωση παραγωγής πατατόσπορου, συνιστάται απαραίτητα η καταστροφή (κάψιμο) του φυλλώματος μόλις η φυτεία φθάσει στην ωριμότητα και τα φυτά αρχίζουν να καταρρέουν (σπάσιμο φυτείας) ώστε να εμποδιστεί η κάθοδος των ιών από το φύλλωμα προς τους κονδύλους με το καθοδικό ρεύμα των φυτικών χυμών. 9\n14 2. ΑΛΛΕΣ ΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΑΣΘΕΝΕΙΕΣ ΤΗΣ ΠΑΤΑΤΑΣ 2.1 Καρούλιασμα των φύλλων της πατάτας (PLRV) Η ασθένεια αυτή προκαλείται από τον ιό του καρουλιάσματος των φύλλων της πατάτας (Potato leafroll virus, PLRV) ο οποίος μεταδίδεται με τους μολυσμένους κονδύλους και με τις αψίδες. Δεν μεταδίδεται όμως μηχανικά όπως όλοι οι άλλοι ιοί που προσβάλλουν την πατάτα. Έχει μεγάλη οικονομική σημασία καθόσον ο ιός αυτός μαζί με τον ιό Υ της πατάτας θεωρούνται οι κύριοι υπεύθυνοι για τον εκφυλισμό της πατάτας ο οποίος παρατηρείται όταν δεν χρησιμοποιείται για σπορά πιστοποιημένος πατατόσπορος. Η προσβολή στο χωράφι κυμαίνεται από 10% - 80% ανάλογα με την ευαισθησία της ποικιλίας, την ποιότητα του πατατόσπορου που φυτεύτηκε και τις καιρικές συνθήκες που επηρεάζουν τους πληθυσμούς και τις πτήσεις των αψίδων. Τα συμπτώματα που εμφανίζουν τα προσβεβλημένα φυτά ποικίλλουν ανάλογα με την ποικιλία του φυτού, τη φυλή του ιού και τις κλιματολογικές συνθήκες που επικρατούν. Γενικά, μπορούν να χωριστούν σε δύο κατηγορίες, συμπτώματα πρωτογενούς και δευτερογενούς μόλυνσης. - Συμπτώματα πρωτογενούς μόλυνσης: εμφανίζουν φυτά που μολύνθηκαν στο χωράφι κατά τη διάρκεια της καλλιεργητικής περιόδου. Τα συμπτώματα αυτά παρατηρούνται κυρίως στα νεαρά φύλλα της κορυφής, 3-4 εβδομάδες μετά τη μόλυνση με αψίδες και αφορούν ελαφρό καρούλιασμα, χλώρωση, ερυθρίαση και ανορθωμένη εμφάνιση των φύλλων της κορυφής. Όταν η μόλυνση γίνει σε νεαρό στάδιο του φυτού, τότε προς το τέλος της καλλιεργητικής περιόδου παρατηρείται επίσης ένα καρούλιασμα των φύλλων της βάσης του φυτού που είναι αρκετά 10\n15 χαρακτηριστικό για την ίωση αυτή. - Συμπτώματα δευτερογενούς μόλυνσης:εμφανίζουν φυτά που προέρχονται από μολυσμένους κονδύλους προηγούμενης καλλιέργειας. Τα συμπτώματα αυτά είναι σοβαρότερα και αφορούν έντονο νανισμό του φυτού, σκληρά εύθρυπτα και καρουλιασμένα φύλλα κυρίως στη βάση του φυτού και χλώρωση των φύλλων της κορυφής. Γενικά, το φυτό παρουσιάζει ανορθωμένη εμφάνιση. Τα καρουλιασμένα φύλλα της βάσης όταν αναταραχθούν παράγουν ένα χαρακτηριστικό μεταλλικό ήχο λόγω της μεγάλης συγκέντρωσης αμύλου σ' αυτά. Αργότερα παρουσιάζουν μια περιφερειακή ξήρανση του ελάσματος που μοιάζει με την τροφοπενία καλίου. Μολυσμένος σπόρος ευαίσθητων ποικιλιών συνήθως αργεί να βλαστήσει και δίνει νηματωμένα φύτρα. Μολυσμένοι κόνδυλοι ορισμένων ποικιλιών πατάτας εμφανίζουν στο εσωτερικό τους μια νέκρωση υπό μορφή δικτύου (δικτυωτή νέκρωση). Η μείωση της παραγωγής είναι σοβαρότερη σε φυτά που εμφανίζουν συμπτώματα δευτερογενούς μόλυνσης παρά σε εκείνα που εμφανίζουν πρωτογενή συμπτώματα. Πρέπει να σημειωθεί ότι τα παραπάνω συμπτώματα δεν είναι παθογνωμικά καθόσον παρόμοια συμπτώματα μπορούν να παρατηρηθούν και σε φυτά προσβεβλημένα από ριζοκτόνια ή με ζημιές στο ριζικό τους σύστημα. Για τους λόγους αυτούς η διάγνωση της ασθένειας θα πρέπει να βασίζεται σε εργαστηριακές δοκιμές εφαρμόζοντας ανοσολογικές ή άλλες μεθόδους. Πλην της πατάτας, ο ιός αυτός προσβάλλει μικρό αριθμό ζιζανίων που ανήκουν στα Σολανώδη και αποτελούν πηγές διατήρησης του ιού και μόλυνσης των νέων καλλιεργειών. 11\n16 2.2 Μωσαϊκό οφειλόμενο στον ιό Α της πατάτας (PVA) Η ασθένεια αυτή που προκαλείται από τον ιό Α της πατάτας (Potato virus A, PVA) μπορεί να οδηγήσει σε μείωση της παραγωγής κατά 15%. Μεταδίδεται με το μολυσμένο πατατόσπορο και με τις αφίδες. Τα προκαλούμενα από τον ιό Α συμπτώματα στο χωράφι μοιάζουν πολύ με εκείνα του PVX αν και ποικίλουν ανάλογα με την ποικιλία της πατάτας και τη φυλή του ιού. Ανθεκτικές ποικιλίες δεν εμφανίζουν συμπτώματα ενώ υπερευαίσθητες ποικιλίες παρουσιάζουν νεκρωτικές κηλίδες στα φύλλα της κορυφής ή και νέκρωση της κορυφής του φυτού. Πολλές υπερευαίσθητες ποικιλίες θεωρούνται ανθεκτικές στην προσβολή από τον ιό στο χωράφι. Τα συμπτώματα που εμφανίζουν οι υπόλοιπες ποικιλίες είναι ελαφρό μέχρι έντονο μωσαϊκό, διαφάνεια των νευρώσεων, κυματισμός και κατσάρωμα της περιφέρειας του ελάσματος. Τα συμπτώματα αυτά είναι δύσκολα ορατά σε θερμές ημέρες με μεγάλη ηλιοφάνεια. Ο ιός Α της πατάτας έχει 3-4 φυλές με διαφορετική μολυσματικότητα. Ο κύκλος ξενιστών είναι πολύ περιορισμένος, ώστε ως μόνες πηγές μόλυνσης στο χωράφι να θεωρούνται οι κόνδυλοι που παρέμειναν στο χωράφι από την προηγούμενη καλλιέργεια και δίνουν φυτά εθελοντές. Η διάγνωση επιτυγχάνεται μόνο με εργαστηριακές δοκιμές κυρίως ELISA καθόσον τα συμπτώματα μοιάζουν με εκείνα του PVX. 2.3 Απλό μωσαϊκό (PVX) Η ασθένεια αυτή προκαλείται από τον ιό X της πατάτας (Potato virus X, PVX) ο οποίος μεταδίδεται με το μολυσμένο σπόρο και μηχανικά με το χυμό μολυσμένων φυτών. Δεν μεταδίδεται με αφίδες. Μολονότι ο ιός X μόνος του προκαλεί πολύ ελαφρά συμπτώματα και η μείωση της 12\n17 παραγωγής των μολυσμένων φυτών δεν ξεπερνά το 10% σε μικτές μολύνσεις με τους ιούς Ρ\_/Α και Ρ\_/Υ ο ιός αυτός προκαλεί σημαντικές ζημιές λόγω της σοβαρότητας των συμπτωμάτων. Επομένως ο ιός X αποτελεί πάντοτε ένα πιθανό σοβαρό παθογόνο της πατάτας. Ο ιός είναι ευρέως διαδεδομένος σε όλες τις περιοχές όπου καλλιεργείται η πατάτα. Αυτό οφείλεται στα ήπια συμπτώματα που εμφανίζουν τα προσβεβλημένα φυτά και δεν γίνονται εύκολα αντιληπτά στο αγρό, αλλά και στον τρόπο μετάδοσης του με τον μολυσμένο φυτικό χυμό κυρίως στις περιοχές όπου εφαρμόζεται ο τεμαχισμός του πατατόσπορου. Τα συμπτώματα που εμφανίζουν τα προσβεβλημένα φυτά είναι ένα ήπιο μωσαϊκό των φύλλων το οποίο στις περισσότερες των περιπτώσεων δεν γίνεται αντιληπτό παρά μόνο στα κατώτερα σκιαζόμενα φύλλα. Ανάλογα με την ποικιλία της πατάτας ή τη φυλή του ιού μπορεί να παρατηρηθεί ένα μεσονεύριο μωσαϊκό ή μια τραχύτητα και κατσάρωμα του ελάσματος των φύλλων. Εκτός των παραπάνω ελαφρών συμπτωμάτων τα προσβεβλημένα φυτά αναπτύσσονται κανονικά και γι' αυτό είναι δύσκολη η επισήμανσή τους στο χωράφι. Οι ιός X της πατάτας έχει αρκετές φυλές οι οποίες ταξινομούνται σε 4 ορρότυπους (Χ-ι, Χ2, Χ3, Χ4) Οι 3 πρώτοι ορρότυποι προκαλούν νεκρωτικές κηλίδες σε ποικιλίες πατάτας με υπερευαισθησία γεγονός που τους προσδίδει ανθεκτικότητα στον ιό αυτό στον αγρό. Ο ιός X της πατάτας έχει ευρύ κύκλο ξενιστών κυρίως μεταξύ σολανωδών ζιζανίων τα οποία και αποτελούν πηγές μόλυνσης των καλλιεργειών. Η διάγνωση επιτυγχάνεται με εργαστηριακές δοκιμές πάνω σε φυτά - δείκτες με ανοσολογικές ή μοριακές μεθόδους. 2.4 Τραχύ μωσαϊκό (Ρνχ + ΡνΥ) Η ασθένεια αυτή οφείλεται στη μικτή μόλυνση των φυτών με τους ιούς Ρ\_/Υ και Ρ\_/Χ. Η περίπτωση αυτή παρουσιάζεται σε φυτά που προέρχονται 13\n18 από μολυσμένους με τον Ρ\_/Χ κονδύλους και τα οποία μολύνονται κατά τη διάρκεια της καλλιεργητικής περιόδου στο χωράφι με τον ΡνΥ μέσω αψίδων. Τα μολυσμένα φυτά παραμένουν νάνα και εμφανίζουν νεκρώσεις των νευρώσεων στα κατώτερα φύλλα όπως στην περίπτωση των δευτερογενών συμπτωμάτων που προκαλεί ο ΡνΥ, ενώ στα φύλλα της κορυφής εμφανίζεται έντονο μωσαϊκό ως και κατσάρωμα και τραχύτητα του ελάσματος. Τα φύλλα της κορυφής παρουσιάζουν έντονο τρίχωμα και σχηματίζουν ροζέτα. Οι κόνδυλοι των φυτών αυτών παραμένουν μικροί. Φυτά προερχόμενα από μολυσμένο πατατόσπορο, ή που μολύνθηκαν σε νεαρό στάδιο στο χωράφι, έχουν έντονο νανισμό και τελικά ξηραίνονται. Οι ζημιές από την ασθένεια αυτή μπορούν να φθάσουν και το 80% της παραγωγής. 2.5 Κυματοειδές μωσαϊκό (Ρνχ + ΡνΑ) Η ασθένεια αυτή οφείλεται στη μικτή μόλυνση των φυτών από τους ιούς Ρ νχ και ΡνΑ. Εμφανίζεται σε χαμηλότερη συχνότητα από ότι το τραχύ μωσαϊκό. Τα μολυσμένα φυτά εμφανίζουν ελαφρό μωσαϊκό και κυμάτισμά της περιφέρειας του ελάσματος. Στις περισσότερες των περιπτώσεων είναι δύσκολη έως αδύνατη η διάκριση της ασθένειας αυτής από το τραχύ μωσαϊκό. Τα μολυσμένα φυτά παραμένουν νάνα και οι παραγόμενοι κόνδυλοι είναι μικροί. 2.6 Ιός β της πατάτας Η ασθένεια αυτή που προκαλείται από τον ιό ε της πατάτας είναι διαδεδομένη σε όλες τις χώρες που καλλιεργείται πατάτα. Δεν υπάρχουν λεπτομερή στοιχεία για τις ζημιές που προκαλεί αλλά έχουν αναφερθεί ότι 14\n19 φθάνουν και το 10% - 20% της παραγωγής. Μεταδίδεται με μολυσμένο σπόρο και μηχανικά με το χυμό μολυσμένων φυτών. Ο ιός S συνήθως δεν προκαλεί συμπτώματα στις περισσότερες ποικιλίες και όταν εμφανισθούν είναι ελαφρά. Παρουσιάζει βάθυνση των νεύρων, τραχύτητα του ελάσματος των φύλλων και πιθανώς νανισμό. Μερικές φορές προκαλεί ποικιλόχρωση ή απόχρωση ορείχαλκου στο έλασμα των φύλλων. Επίσης εμφανίζονται νεκρωτικές κηλίδες στην επάνω επιφάνεια των φύλλων. Στην πατάτα ο ιός πολύ συχνά βρίσκεται σε μικτές μολύνσεις με τον ιό Μ. Για τη διάγνωση του ιού εκτός από εργαστηριακές δοκιμές χρησιμοποιούνται και φυτά - δείκτες. 2.7 Ο Ιός Μ της πατάτας Η ασθένεια αυτή προκαλείται από τον ιό Μ της πατάτας (Potato virus Μ, PVM). Είναι διαδεδομένη σ' όλες τις χώρες που καλλιεργείται η πατάτα αλλά είναι πιο σπουδαία στην Ανατολική Ευρώπη. Τα συμπτώματα που προκαλεί ο ιός Μ στα φύλλα της πατάτας ποικίλουν από πολύ ήπια μέχρι έντονα όπως ποικιλοχρώσεις, μωσαϊκό κατσάρωμα και καρούλιασμα των φύλλων της κορυφή. Τα φύλλα μπορεί να εμφανισθούν επίσης παραμορφωμένο. Τα μολυσμένα φυτά είναι συνήθως νάνα. Σε ορισμένες ποικιλίες ο ιός προκαλεί νέκρωση των στελεχών και των μίσχων. Η ένταση των συμπτωμάτων επηρεάζεται από το στέλεχος του ιού, την ποικιλία και τις συνθήκες του περιβάλλοντος. Ο ιός πολλαπλασιάζεται σε χαμηλές θερμοκρασίες γύρω στους 19 C ενώ σε θερμοκρασίες υψηλότερες από 24 C έχουμε απόκρυψη των συμπτωμάτων. 15\n20 3. ΣΠΟΡΟΠΑΡΑΓΩΓΗ ΥΓΙΟΥΣ ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΠΑΤΑΤΑΣ 3.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η πατάτα πολλαπλασιάζεται με πατατόσπορο, όχι δηλαδή με τον σπόρο που παράγουν τα άνθη της αλλά με τους κονδύλους που παράγουν τα ριζώματά της. Οι κόνδυλοι αυτοί προέρχονται από προηγούμενη παραγωγή και έχουν μείνει επί ένα χρονικό διάστημα σε κατάσταση ληθάργου (είτε στο έδαφος, είτε στην αποθήκη). Ο αγενής πολλαπλασιασμός της πατάτας δημιουργεί πολλά προβλήματα στην παραγωγή υγιούς και υψηλής ποιότητας πατατόσπορου. Οι διάφορες προσβολές και κυρίως οι ιολογικές προκαλούν υποβάθμιση της υγειονομικής του κατάστασης και έχουν σαν συνέπεια τη μείωση των αποδόσεων που πολλές φορές φτάνει σε πολύ υψηλά ποσοστά. Υπάρχουν ιστορικές μαρτυρίες ότι οι ιολογικές ασθένειες άρχισαν να προσβάλλουν την πατάτα αμέσως μετά την εισαγωγή της στην Ευρώπη. Σταδιακά η εμφάνιση των ιολογικών ασθενειών αυξανόταν καθώς κόνδυλοι από μολυσμένες καλλιέργειες χρησιμοποιούνταν ως σπόρος για την επόμενη καλλιέργεια. Το φαινόμενο αυτό το ονόμαζαν "εκφυλισμό της πατάτας" και το απέδιδαν είτε στην εξάντληση ή την χειροτέρευση της καλλιέργειας από τον συνεχή αγενή πολλαπλασιασμό είτε στις κακές εδαφικές ή κλιματικές συνθήκες. Ακόμη και τότε όμως οι καλλιεργητές αναγνώριζαν ότι ορισμένες περιοχές έδιναν καλύτερο σπόρο από άλλες. Συμπερασματικά πιστεύεται ότι στις περιοχές αυτές ο πληθυσμός των φορέων των ιών ήταν ιδιαίτερα μικρός. Όταν έγινε αντιληπτό ότι η υποβάθμιση της ποιότητας του σπόρου οφειλόταν σε παθογόνα καθιερώθηκε η καλλιέργεια της πατάτας που προορίζεται για σπόρο σε ξεχωριστές περιοχές από αυτή που προορίζεται για κατανάλωση. Από τότε 16\n21 η παραγωγή πατατόσπορου αναπτύχθηκε πολύ και σε ορισμένες χώρες αποτελεί πολύ κερδοφόρα βιομηχανία. Στις αναπτυγμένες χώρες, το ποσοστό του πιστοποιημένου πατατόσπορου που χρησιμοποιείται είναι πολύ μεγάλο και φθάνει στον Καναδά το 91%, στην Ολλανδία το 94% και στη Μεγάλη Βρετανία το 66%. Οι χώρες αυτές έχουν αντίστοιχα και τις υψηλότερες στρεμματικές αποδόσεις Αντίθετα στις αναπτυσσόμενες χώρες η μικρή στρεμματική απόδοση οφείλεται στην κακή φυτουγειονομική κατάσταση του χρησιμοποιούμενου σπόρου, γιατί οι χώρες αυτές δεν διαθέτουν κατάλληλα συστήματα παραγωγής του, ή οι περιβαντολογικές συνθήκες δεν ευνοούν την ανάπτυξη τέτοιων συστημάτων. Έτσι αναγκάζονται να προμηθεύονται πιστοποιημένο σπόρο από το εξωτερικό σε υψηλές τιμές που πολλές φορές κάνει την πατατοκαλλιέργεια ασύμφορη. Στις χώρες αυτές το ποσοστό χρήσης πιστοποιημένου πατατόσπορου είναι πολύ μικρό. 3.2 Παραγωγή πιστοποιημένου πατατόσπορου Στις καλλιέργειες που προορίζονται για παραγωγή πιστοποιημένου πατατόσπορου γίνονται δύο τουλάχιστον καλλιεργητικοί έλεγχοι, από τους οποίους ο πρώτος γίνεται σ'ένα μήνα από το φύτρωμα. Κατά τη διάρκεια των ελέγχων ή και ενδιάμεσα γίνεται επίσημη δειγματοληψία φύλλων στις σποροκαλλιέργειες (όταν χρειάζεται κατά την κρίση της αρμόδιας υπηρεσίας ελέγχου και πιστοποίησης) για ιολογικό εργαστηριακό έλεγχο. Μετά την αποφύλλωση ή τη συγκομιδή ή στη διάρκεια της συγκομιδής γίνεται επίσημη δειγματοληψία κονδύλων για ιολογικό έλεγχο και στις περιπτώσεις εκείνες που προσδιορίζονται από την αρμόδια υπηρεσία ελέγχου και πιστοποίησης. Εφόσον τα παραπάνω αποτελέσματα είναι ικανοποιητικά, η υπηρεσία εκδίδει για κάθε σπορομερίδα δελτίο καλλιεργητικού ελέγχου, που συνοδεύει τον ατυποποίητο πατατόσπορο 17\n22 μέχρι την αρχή της επεξεργασίας του. Τέλος, οι σπορομερίδες για τις οποίες έχει εκδοθεί το αυτό δελτίο ελέγχονται κατά τη συσκευασία και σφράγισή τους από την αρμόδια υπηρεσία ελέγχου και πιστοποίησης, προκειμένου να διαπιστωθεί αν πληρούν ή όχι τις οριζόμενες προδιαγραφές. Εάν τις πληρούν, τότε γίνεται συσκευασία του πιστοποιημένου πατατόσπορου σε σακιά γιούτινα, τα οποία φέρουν επίσημη ετικέτα της αρμόδιας υπηρεσίας ελέγχου και πιστοποίησης, χρώματος μπλε, με τις ακόλουθες ενδείξεις: τη χώρα προέλευσης μαζί με το σύμβολο Ε, το είδος την ποικιλία, την κατηγορία, τον αριθμό σπορομερίδας, την ημερομηνία που σφραγίστηκε το σακί και το δηλωμένο καθαρό βάρος Επιπλέον γίνεται και μετέλεγχος από το Ινστιτούτο Ελέγχου Ποικιλιών, για τον έλεγχο της ποικιλίας και της ποικιλιακής καθαρότητας κάθε σπορομερίδας. 4. ΙΟΛΟΓΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ-ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ 4.1 Ιολογικός έλεγχος γενικά Ιολογικός έλεγχος ενός φυτού είναι ο έλεγχος της μολύνσεως του από ιό ή ιοειδές δηλαδή η ανίχνευση συγκεκριμένης ή οποιοσδήποτε ιολογικής μολύνσεως. Διάγνωση είναι η εύρεση του παθογόνου αιτίου μιας ασθένειας. Ανίχνευση ενός μολυσματικού παθογόνου ονομάζεται η ανίχνευση της 18\n23 παρουσίας ενός συγκεκριμένου μολυσματικού παθογόνου στο φυτό. Ταυτοποίηση ενός οργανισμού ονομάζεται η εύρεση της ταυτότητάς του. Οι ιολογικές ασθένειες έχουν απαιτητικές διαγνωστικές μεθόδους. Οι μέθοδοι αυτές, ανήκουν σε δυο ομάδες τις in vivo και τις in vitro. 4.2 Μέθοδοι IN VIVO Οι μέθοδοι in vivo αφορούν στη μόλυνση φυτών-δεικτών. Η μόλυνση συνήθως γίνεται με εμβολιασμό, μηχανικά (με το χυμό ή με την τριβή) και με φορείς (έντομα, νηματώδεις, μύκητες ). Τα φυτά-δείκτες διατηρούνται καθ' όλη τη διάρκεια της ζωής τους υπό συνθήκες αποφυγής των τυχαίων μολύνσεων και καλής αναπτύξεως. Στις περισσότερες περιπτώσεις διατηρούνται εντός θερμοκηπίου, κλιματιζόμενου θαλάμου ή εντομοστεγούς κλωβού, ενώ σε λίγες περιπτώσεις (π.χ. σε μερικές ιώσεις μηλοειδών και πυρηνοκάρπων) είναι δυνατόν να διατηρούνται σε ειδικούς αγρούς στο ύπαιθρο. Οι αντιδράσεις των φυτών-δεικτών (συμπτώματα) αποδεικνύουν ότι το φυτό από το οποίο προήλθε το μόλυσμα φέρει πράγματι μόλυνση από ιό. Ο τύπος των αντιδράσεων είναι δυνατό να είναι εξειδικευμένος σε βαθμό ώστε να είναι δυνατή η ανίχνευση ενός συγκεκριμένου ιού. 4.3 Σπουδαιότεροι μέθοδοι IN VITRO Οι μέθοδοι αυτές αφορούν στην καθαρά εργαστηριακή ανίχνευση συγκεκριμένων ιών. Κυρίως αφορούν στην παρατήρηση των σωματιδίων και στην ανίχνευση των νουκλεϊνικών οξέων και των πρωτεϊνών των παθογόνων αυτών. Έτσι οι μέθοδοι αυτές αναλύονται παρακάτω. Πλεονεκτήματα των μεθόδων αυτών είναι: η ταχύτητα (σε ώρες) και η μαζικότητα (μεγάλος αριθμός συγχρόνων εξετάσεων) των αποτελεσμάτων. Μειονεκτήματα είναι οι απαιτήσεις σε ειδικά εργαστηριακά όργανα και 19\n24 εξειδικευμένο προσωπικό. Επίσης από τις μεθόδους αυτές, εκείνες που ανιχνεύουν πρωτεΐνες (ορρολογικές, ηλεκτροφόρηση) και νουκλεοξέα (ηλεκτροφόρηση, υβριδισμός νουκλεοξέων, αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) δεν μπορούν να εφαρμοσθούν εάν δεν έχει προηγουμένως απομονωθεί και γίνει γνωστό το παθογόνο Ορολογικές μέθοδοι Η σχετική μεθοδολογία ονομάζεται ορρολογική μεθοδολογία (λόγω της χρήσεως αντι-ορρού) ή ανοσολογική μεθοδολογία (επειδή βασίζεται στο ανοσολογικό σύστημα των ζώων για την παραγωγή αντιδραστηρίων, δηλαδή αντισωμάτων). Οι διάφορες ορρολογικές (ανοσολογικές) μέθοδοι διαφοροποιούνται μεταξύ τους από τον τρόπο που φέρονται σε επαφή το αντιγόνο (π.χ. ιός) με το αντίσωμα και γίνεται ορατή η αντίδραση αυτής της ενώσεως. Οι σπουδαιότερες ορρολογικές μέθοδοι είναι: 1) Οι πρώτες ορρολογικές μέθοδοι βασίζονταν στην ορατή αντίδραση γαλακτοχρόου κατακρημνίσεως που προκύπτει όταν έρχονται σε επαφή μόρια αντιγόνου με μόρια του ομολόγου αντισώματος, όταν αυτό γίνεται ύστερα από ανάμιξη αιωρημάτων των δύο αυτών αντιδραστηρίων (σε υγρή φάση). Οι μέθοδοι αυτές ήσαν κυρίως δύο, ή μία σε υγρή και η δεύτερη σε στερεή φάση: α) Η μέθοδος της μικροκατακρημνίσεως (microprecipitation) η οποία υπήρξε η πρώτη και η μόνη κατά την 10-ετία του Είναι μέθοδος μεγάλης ακρίβειας και σχετικά μεγάλης ευαισθησίας, αλλά δύσχρηστη. Μετά την 10-ετία του 1960 χρησιμοποιείται μόνο για την τιτλοποίηση του αντιορρού. β) Ακολούθησε η μέθοδος της διπλής διαχύσεως σε πήγμα άγαρ (double diffusion ή Ouchterlony gel diffusion). Αυτή περιλαμβάνει τη χρήση πήγματος αγαρόζης διαμέσου του οποίου διαχέονται, από αντίθετες κατευθύνσεις, το αντιγόνο και το αντίσωμα σχηματίζοντας γραμμές καθιζήσεως, όταν συναντηθούν σε άριστες 20\n25 συγκεντρώσεις. Αυτές οι δοκιμές επιτρέπουν τον διαχωρισμό διαφόρων αντιγόνων και αντισωμάτων από το μέγεθος τους, τον συντελεστή διαχύσεως και τις συγκεντρώσεις τους. Έτσι, είναι αρκετά χρήσιμες για την ταυτοποίηση ιών σε χυμό μολυσμένων φυτών, σε μερικώς καθαρό ή σε καθαρό παρασκεύασμα του ιού. Η δοκιμή αυτή που χρησιμοποιείται ευρέως στην ταυτοποίηση ιών και τον διαχωρισμό στελεχών ενός ιού, αποτελούσε την μέθοδο μαζικών διαγνώσεων από την 10-ετία του 1960 μέχρι την εφεύρεση της πολύ καλλίτερής της μεθόδου ELISA κατά τα τέλη της 10-ετίας του Μεθοδολογία ενζυμικής ανοσοπροσροφήσεως (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) (ELISA) Από τα μέσα περίπου της 10 ετίας του 1970, ο Voller εισήγαγε για πρώτη φορά την ενζυμική δοκιμή ανοσοπροσροφήσεως (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA), η οποία στη συνέχεια εφαρμόστηκε για την ανίχνευση μεγάλου αριθμού αντιγόνων. Αρχικά η ELISA χρησιμοποιήθηκε ευρέως για την ταυτοποίηση σοβαρών παθογόνων του ανθρώπου και των ζώων. Από το 1977 άρχισαν οι εφαρμογές της στην φυτοπαθολογία, (Clark και Adams, 1977) αρχικά για τη διάγνωση ιών, αργότερα και για τη διάγνωση βακτηρίων, μυκήτων και φυτοπλασμάτων. Συγκεκριμένα, το 1977 οι Clark και Adams έδειξαν ότι μπορούσαν να χρησιμοποιούν ELISA επίσης για τους ιούς των φυτών. Από τότε η μέθοδος αυτή γνώρισε εξαιρετική ανάπτυξη και διάδοση και σήμερα θεωρείται σαν η βασική διαγνωστική μέθοδος για την ανίχνευση των κυριοτέρων ιών των φυτών στα φύλλα, βλαστούς, ρίζες και σπόρους. Η ELISA είναι σήμερα η πιο διαδεδομένη ορρολογική μέθοδος για την διάγνωση φυτικών ιών. Χρησιμοποιείται για εξετάσεις μεγάλου αριθμού δειγμάτων (επισκοπήσεις, παραγωγή υγιούς πολλαπλαστικού υλικού κλπ.). 21\n26 Τα πλεονεκτήματα της μεθόδου αυτής είναι: 1) Ευαισθησία, με δυνατότητες ανιχνεύσεως πολύ μικρών ποσοτήτων (συνήθως 1-10 nglml) αντιγόνου (ιού). 2) Ταχύτητα. Τα αποτελέσματα είναι συνήθως διαθέσιμα μέσα σε 48 ώρες. 3) Δυνατότητα εφαρμογής σε μεγάλο αριθμό δειγμάτων (μαζικότητα εξετάσεων). 4)Μπορεί να εφαρμοσθεί τόσο σε εκχύλισμα φυτών (ορισμένοι ιοί, όπως οι ιοί των δένδρων, βρίσκονται στους ιστούς του ξενιστή σε μικρές συγκεντρώσεις) όσο και σε καθαρά παρασκευάσματα ιών. 5) Εξειδίκευση, για την διαφοροποίηση ορροτύπων. 6) Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση τεμαχισμένων αλλά και άθικτων ιοσωματίων. 7) Δυνατότητα ποσοτικού προσδιορισμού του αντιγόνου (ιού). 8) Δυνατότητα αυτοματοποιήσεως και παραγωγής εμπορικών συσκευασμάτων (kits). 9) Χαμηλό κόστος και διατήρηση των αντιδραστηρίων για μεγάλο χρονικό διάστημα. 10) Δεν απαιτείται ακριβός εργαστηριακός εξοπλισμός. 11) Χρήση μικρών ποσοτήτων αντισωμάτων και αντιορρού. Έχουν αναπτυχθεί διάφορες επί μέρους τεχνικές της ανοσοενζυμικής δοκιμής ELISA, οι οποίες ανήκουν σε δύο ομάδες, την άμεση ELISA και την έμμεση ELISA Άμεση ELISA Η πιο συνηθισμένη άμεση ELISA είναι η DAS-ELISA από τους Clark και Adams (1977) και μέχρι σήμερα είναι η πιο διαδεδομένη. Η ELISA γίνεται σε μικροπλάκες πολυστυρενίου, συνήθως 96 φρεατίων. Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται είναι α) αντισώματα που έχουν απομονωθεί από τον αντιορρό β) σύζευγμα (conjugate) που έχει παρασκευασθεί με χημική ένωση κάθε μορίου αντισώματος με ένα ένζυμο συνήθως αλκαλική φωσφατάση, γ) υπόστρωμα του ενζύμου (αλκαλική 22\n27 φωσφατάση). Τα φρεάτια της πλάκας πολυστυρενίου καλύπτονται αρχικά με τα αντισώματα που έχουν απομονωθεί. Ακολουθεί επώαση για 2-4 ώρες στους 37 C, ώστε τα αντισώματα να προσκολληθούν στην πλάκα. Ακολουθεί καλή έκπλυση με ειδικό ρυθμιστικό διάλυμα, ώστε να παραμείνουν στα φρεάτια μόνο τα προσκολλημένα αντισώματα. Στη συνέχεια προστίθεται το δείγμα (αραιωμένο 1/10 έως 1/100) και η πλάκα αφήνεται για επώαση όλη την νύχτα στους 4 C. Την επόμενη ημέρα, γίνεται πάλι καλή έκπλυση της μικροπλάκας, τοποθέτηση της συζευγμένης γ-σφαιρίνης και επώαση για 2-4 ώρες. Μετά το τέλος της επωάσεως, γίνεται καλή έκπλυση και προστίθεται το ανάλογο υπόστρωμα. Στα φρεάτια όπου έχουν τοποθετηθεί τα θετικά δείγματα εμφανίζεται χρώμα, λόγω υδρολύσεως του υποστρώματος από το συζευγμένο ένζυμο. Αυτή η αλλαγή του χρώματος, ανάλογα με την συγκέντρωση του ιού στον χυμό, μπορεί να είναι ορατή με γυμνό οφθαλμό, αλλά βασικά καταγράφεται με ειδικό φωτόμετρο στα 405 nm. Για τη σύζευξη της γ-σφαιρίνης χρησιμοποιείται συνήθως το ένζυμο αλκαλική φωσφατάση και η αναγνώριση του γίνεται με το υπόστρωμα φωσφορικό παρανιτροφαινύλιο (p-nitrophenylphosphate, ΡΡΝΡ). Η υδρόλυση του υποστρώματος συνήθως αναστέλλεται με προσθήκη υδροξειδίου του νατρίου ή θεϊκού οξέος στα φρεάτια της μικροπλάκας πριν από την μέτρηση της εντάσεως του χρώματος (απορροφήσεως). Με αυτό του τρόπο είναι δυνατή η διατήρηση των αντιδράσεων της πλάκας για μεταγενέστερη ανάγνωση. Η DAS- ELISA έχει δύο μειονεκτήματα: 1) Μπορεί να είναι τόσο εξειδικευμένη, ώστε αντισώματα έναντι μιας φυλής να μην αναγνωρίζουν άλλη φυλή του ιδίου ιού. 2) Για την εκτέλεσή της απαιτεί την προετοιμασία ειδικού για κάθε ιό συζεύγματος ενζύμου αντισώματος. 23\n28 3 Εικόνα 1:Τα 4 στάδια της διπλής άμεσης παρεμβολής σε διπλά αντισώματα Πολυκλωνικά αντισώματα Πολυκλωνικά αντισώματα έναντι ενός αντιγόνου είναι το κλάσμα του αντιορρού που περιέχει όλα τα αντισώματα έναντι αυτού του αντιγόνου. Ένας αντιορρός περιέχει διάφορα αντισώματα έναντι του αντιγόνου που προκάλεσε την παραγωγή του, τα οποία όλα αντιδρούν εξειδικευμένα με το αντιγόνο, με τις διάφορες δεσμευτικές του θέσεις (binding sites). Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι ένα αντιγόνο φέρει επί της επιφάνειας του διάφορες αντιγονικές θέσεις (επιτόπους), όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, έναντι κάθε μίας από τις οποίες παράγεται ένα είδος αντισώματος. Δηλαδή, ο αντιορρός είναι πολυκλωνικός. Έτσι, μία ορρολογική αντίδραση στην οποία χρησιμοποιείται αντιορρός είναι ουσιαστικά αντίδραση με πολυκλωνικά αντισώματα έναντι του συγκεκριμένου αντιγόνου. Αυτό συμβαίνει συνήθως με τις μεθόδους της μικροκατακρημνίσεως, της διπλής διαχύσεως σε άγαρ και της ορροηλεκτρονικής μικροσκοπίας. Στην μέθοδο ELISA,χρησιμοποιούνται 24\n29 καθαρισμένα αντισώματα από τον αντιορρό και όχι αντιορρός, τουλάχιστον για την παρασκευή του συζεύγματος. Τα πολυκλωνικά αντισώματα έχουν το πλεονέκτημα ότι παράγονται εύκολα και γρήγορα, με την παραγωγή του αντιορρού και τον καθαρισμό τους από αυτόν. Επίσης, έχουν την δυνατότητα να ανιχνεύουν πολλά στελέχη του ιού (αντιγόνου). Έχουν όμως το μειονέκτημα ότι είναι λιγότερο ευαίσθητα από τα μονοκλωνικά αντισώματα Μονοκλωνικά αντισώματα Όπως είπαμε, κάθε Β-λεμφοκύτταρο παράγει αντισώματα ενός μόνο μοριακού είδους. Εάν το συγκεκριμένο Β-λεμφοκύτταρο αποκτήσει την ιδιότητα να πολλαπλασιάζεται, δηλαδή να παράγει κλώνο του σε μία κυτταροκαλλιέργεια, τότε όλα αυτά τα πανομοιότυπα μεταξύ τους κύτταρα παράγουν, αθροιστικά, μεγάλες ποσότητες αντισώματος του αυτού μοριακού είδους, δηλαδή τεράστιο αριθμό ομοίων μεταξύ τους μορίων (κλώνος μορίων), τα οποία ονομάζονται μονοκλωνικά αντισώματα (monoclonal antibodies, MAbs). Ποσότητες αρκετές να χρησιμοποιηθούν ως αντιδραστήρια. Εκρηκτική ήταν η ανάπτυξη του ενδιαφέροντος για χρησιμοποίηση μονοκλωνικών αντισωμάτων κατά την 10-ετία του 1980 για διάφορα θέματα της ιολογικής έρευνας και κυρίως για διαγνωστικούς και ανιχνευτικούς σκοπούς. Η φύση της εξειδικεύσεως των αντισωμάτων σε σχέση με τα μονοκλωνικά αντισώματα έχει ως εξής: Η θέση συνδέσεως (binding site) ενός MAb ή κάθε ατομικού αντισώματος σε ένα πολυκλωνικό αντιορρό, είναι ικανή να συνδέεται με πολλούς αντιγονικούς προσδιοριστές (antigenic determinants) με διαφορετικό βαθμό χημικής συγγένειας. Δηλαδή, μία ατομική θέση συνδέσεως ενός αντισώματος είναι πολυλειτουργική 25\n30 (polyfunctional). Περαιτέρω, αντισώματα έναντι μίας απλής αντιγονικής θέσεως ή επίτοπου (antigenic determinant, epitope) μπορεί να ποικίλλουν ως προς την χημική τους συγγένεια από μόλις μετρήσιμη με βασικές τεχνικές μέχρι χημική συγγένεια φορές μεγαλύτερη (Matthews, 1992). Έτσι, είναι δυνατόν ένα αντίσωμα να ενώνεται πιο ισχυρά με ένα αντιγονικό προσδιοριστή διαφορετικό από εκείνον που προκάλεσε την παραγωγή του. Ένα τέτοιο φαινόμενο εύκολα περνάει απαρατήρητο από τα πολλά διαφορετικά αντισώματα σε ένα πολυκλωνικό αντιορρό, αλλά με τα MAbs εκδηλώνεται σαφώς. Για διαγνωστικούς και ανιχνευτικούς σκοπούς, τα MAbs χρησιμοποιούνται συνήθως σε δοκιμές ELISA. Για πολλές εφαρμογές είναι ασφαλές να χρησιμοποιείται το ίδιο πρωτόκολλο ELISA που χρησιμοποιήθηκε για τον διαχωρισμό και την επιλογή του συγκεκριμένου Mab, διότι, ανάλογα με το πρωτόκολλο της ELISA, μπορεί να επιλεγούν διάφορα MAbs. Τα μονοκλωνικά αντισώματα έχουν πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα. Τα πλεονεκτήματα είναι: α) Μικρές μόνο ποσότητες αντιγόνου (π.χ. ιικού παρασκευάσματος) είναι απαραίτητες για την παραγωγή τους (<100 pg) και δεν είναι απαραίτητη ή απόλυτη καθαρότητα του αντιγόνου από τις φυτικές πρωτεΐνες, αφού υπάρχει η δυνατότητα επιλογής υβριδώματος που παράγει αντιικά MAbs, β) Εξασφαλίζουν ομοιογενές αντιδραστήριο, το οποίο μπορεί να αποκτάται από διάφορα εργαστήρια, ώστε αυτά να έχουν συγκρίσιμα μεταξύ τους αποτελέσματα (υπό κατάλληλες συνθήκες μπορούν να λαμβάνονται απεριόριστες ποσότητες ενός MAb), γ) Έχουν απόλυτη εξειδίκευση, αφού ένα είδος MAb συνδέεται με μία μόνο αντιγονική θέση ενός αντιγόνου. Έτσι, αποτελούν ένα λεπτό εργαλείο, που μπορεί να χρησιμοποιείται για την διάκριση μεταξύ στελεχών ενός ιού ή για την ανίχνευση ενός γένους ιών. δ) Έχουν υψηλή χημική συγγένεια (affinity) για το αντιγόνο, αφού με αυτό μπορεί να επιλέγεται το αντίστοιχο υβρίδωμα. ε) Μπορούν να διατηρούνται σε υγρό άζωτο ώστε να υπάρχει 26\n31 πηγή παραγωγής του αντίστοιχου ΜΑό για μεγάλο χρόνο. Τα μειονεκτήματά τους είναι: α) Δυσκολία παραγωγής τους, β)ανεπιθύμητα υψηλή εξειδίκευση για μερικές εφαρμογές, γ) Μεγάλη ευαισθησία σε αλλαγές της τριτοταγούς ή τεταρτοταγούς δομής του αντιγόνου. Έτσι, αν και τα μονοκλωνικά αντισώματα αποτελούν εξαιρετικό εργαλείο για πολλά θέματα της ιολογικής έρευνας, δεν φαίνεται να μπορούν να αντικαταστήσουν τα πολυκλωνικά σε όλες τις εφαρμογές. 4.4 Αλυσιδωτή Αντίδραση της Πολυμεράσης (PCR) Αρχή της PCR Με την PCR επιτυγχάνεται η σύνθεση ενός τμήματος DNA, ανεξαρτήτου προελεύσεως, in vitro. Σε χρονικό διάστημα λίγων ωρών, η συγκεκριμένη περιοχή του DNA που επεκτείνεται (DNA στόχος), πολλαπλασιάζεται σε ένα μεγάλο αριθμό αντιγράφων. Ο αριθμός των αντιγράφων εξαρτάται από τον αριθμό των κύκλων της αντίδρασης. Η αρχή της μεθόδου βασίζεται στην κινητική επανασύνδεσης των αποδιαταγμένων συμπληρωματικών αλυσίδων δίκλωνου νουκλείκού οξέος, που ανέπτυξαν οι Britten και Kohne στα τέλη της δεκαετίας του 60. To DNA στόχος, επεκτείνεται μετά από πολλαπλές αντιγραφές, σε σημείο που να είναι ανιχνεύσιμο. Εκεί όπου τεχνικές υψηλής ευαισθησίας, όπως διάφορες τεχνικές μοριακού υβριδισμού (Southern, Nothern) αποδεικνύονται ανεπαρκείς την PCR επιτυγχάνεται επέκταση του DNA στόχου, σε σημείο που να γίνεται ευχερώς ανιχνεύσιμο. To DNA στόχος αποτελεί το πρότυπο DNA στην αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης και ως αφετηρίες χρησιμοποιούνται 2 συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια (15-25 βάσεων) που έχουν δομή συμπληρωματική προς τις πλευρικές 27\n32 αλληλουχίες του DNA στόχου, το καθένα αντίστοιχα προς τον ένα κλώνο του στόχου και με αντίθετη κατεύθυνση. Το πρώτο στάδιο της PCR είναι η μετουσίωση του DNA στόχου κατά την οποία το δίκλωνο DNA μετατρέπεται σε μονόκλωνο. Εν συνεχεία συνδέονται «υβριδίζονται» τα δυο συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια τα οποία καλούνται εκκινητικά μόρια ή και "primers" στις δυο πλευρές του DNA στόχου, στους αντίστοιχους κλώνους DNA (2ο στάδιο). Με τη δράση του ενζύμου Taq DNA πολυμεράσης προστίθενται συμπληρωματικές βάσεις δεοξυριβονουκλεοτιδίων στο 3' άκρο κάθε εκκινητικού μορίου (primer) και η άλυσος επεκτείνεται (3ο στάδιο).. Έτσι σχηματίζονται δυο καινούργιες άλυσοι ή κλώνοι DNA συμπληρωματικές προς αυτές των δυο κλώνων του προτύπου DNA με αποτέλεσμα το διπλασιασμό του DNA στόχου. Η σειρά των τριών σταδίων, μετουσίωση (dénaturation) υβριδισμού των εκκινητικών μορίων (primers annealing) και επέκτασης των εκκινητικών μορίων με τη σύνθεση καινούργιου κλώνου (extension) αποτελούν 1 κύκλο της αντίδρασης PCR. Όλη η αντίδραση PCR ολοκληρώνεται στο ίδιο μείγμα αντιδραστηρίων, για το οποίο απαιτούνται: DNA στόχος, εκκινητικά μόρια "primers", τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια, ένζυμο Taq DNA πολυμεράση, ιόντα Mg++ απαραίτητα για την ενζυμική δράση και κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα ph 8.2 για τη δράση τον ενζύμου. Το ένζυμο Taq DNA είναι μια θερμοάντοχη DNA πολυμεράση η οποία απομονώθηκε από το βακτηρίδιο Thermus aquatiqus (Taq) και έχει την ιδιότητα να είναι ενεργό ακόμη και στους + 95 C, θερμοκρασία η οποία απαιτείται για τη μετουσίωση του DNA στόχου, επί 40 τουλάχιστον λεπτά. Στο τέλος του πρώτου κύκλου της αντίδρασης οι κλώνοι του DNA στόχου είναι πλέον 4 και αποτελούν τα πρότυπα για τη σύνθεση νέων κλώνων DNA στο 2ο κύκλο. Στο τέλος του 2ου κύκλου οι κλώνοι θα είναι 8 και αυξάνοντας τον αριθμό των κύκλων, αυξάνει εκθετικά και ο αριθμός των ανατύπων του στόχου DNA, διότι οι κλώνοι που σχηματίζονται 28\n33 χρησιμοποιούνται ως πρότυπο στον επόμενο κύκλο. Με αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται μεγέθυνση του DNA στόχου, 2Π όπου η ο αριθμός των κύκλων. Κάθε κύκλος PCR περιλαμβάνει τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες για τα 3 στάδια, μετουσίωσης, υβριδισμού και επέκτασης. Η μετουσίωση του DNA επιτυγχάνεται συνήθως σε θερμοκρασία C για 30 sec περίπου, ο υβριδισμός ανάλογα με τη σύνθεση των βάσεων Α/Τ, G/C σε θερμοκρασία C επί 1-2 min και τέλος η επέκταση των εκκινητικών μορίων (primers) σε θερμοκρασία C επί 1-2 min. Οι εναλλαγές της θερμοκρασίας ανάμεσα σε κάθε κύκλο επιτυγχάνονται με αυτοματοποιημένες συσκευές, τους θερμοκυκλοποιητές, οι οποίοι έχουν την ικανότητα ν ανεβοκατεβάζουν τη θερμοκρασία μεταξύ των τριών προαναφερομένων θερμοκρασιών, σε λιγότερο από I min για αυξομείωση θερμοκρασίας 40 C. To DNA στόχος είναι δυνατόν να προέρχεται από ποικιλία δειγμάτων και μάλιστα σε μη καθαρή μορφή. Συνήθως 100 ng ολικού DNA είναι αρκετά για να επιτευχθεί η γονιδιακή επέκταση του DNA στόχου. Προϋπόθεση για την επέκταση του DNA στόχου είναι η ακεραιότητα του. Κατά συνέπεια ακόμα και θραύσματα γενετικού υλικού ιού, βιολογικά αδρανή, είναι δυνατόν να ανιχνευθούν με την PCR. Η αλληλουχία βάσεων του DNA στόχου είναι δυνατόν να είναι άγνωστη θα πρέπει όμως η αλληλουχία βάσεων των πλευρικών περιοχών του DNA στόχου να είναι γνωστή ώστε να κατασκευασθούν τα συνθετικά ολιγονονουκλεοτίδια (primers). Η PCR μπορεί επίσης να εφαρμοσθεί και για την γονιδιακή επέκταση RNA, αφού πρώτα το RNA μετατραπεί με τη δράση του ενζύμου αντίστροφη μεταγραφάση σε συμπληρωματικό DNA (cdna) και εν συνεχεία εφαρμοσθεί η τεχνική PCR. Με την αντίστροφη μεταγραφάση PCR (RT-PCR) είναι δυνατή η γονιδιακή επέκταση RNA ιών. Η επιλογή των εκκινητικών μορίων (primers) είναι μεγάλης σημασίας. Τα εκκινητικά 29\n34 μόρια Θα επιλεχθούν πάνω σε μεταβλητές περιοχές του DNA στόχου, το οποίο θα μεγεθυνθεί μεταξύ των 2 εκκινητικών μορίων. Το προϊόν της αντίδρασης PCR θα είναι το μεγεθυμένο τμήμα DNA το οποίο θα καθορίζεται από τα 2 εκκινητικά μόρια, τα οποία Θα αποτελούν και τα άκρα του. Τα εκκινητικά μόρια, (συνήθως νουκλεοτίδια) θα πρέπει να έχουν παραπλήσιο αριθμό βάσεων G/C, να μην παρουσιάζουν συμπληρωματικότητα στο 3 ή 5 άκρο τους ώστε να αποφεύγεται ο σχηματισμός διμερών και η απόστασή τους να είναι μεγαλύτερη των 100 βάσεων ώστε να επιτρέπεται ο σχηματισμός του νέου κλώνου DNA. Τα εκκινητικά μόρια θα πρέπει επίσης να έχουν παραπλήσια θερμοκρασία αποδιατάξεως ή τήξεως (Tm, melting temperature). Η θερμοκρασία τήξεως υπολογίζεται σύμφωνα με τον τύπο των Thein και Wallace: Tm=(4x αριθμός των βάσεων G+C) + (2χ αριθμός των βάσεων A + Τ) Ένα επιθυμητό Tm θα πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ C.H ειδικότητα της αντίδρασης οφείλεται κατά μεγάλο ποσοστό στη θερμοκρασία υβριδισμού (Ta,annealing temperature) των εκκινητικών μορίων. Συνήθως η θερμοκρασία υβριδισμού Ta,επιλέγεται να είναι κατά 5 έως 10 C μικρότερη του Tm. Η παρασκευή των συνθετικών ολιγονουκλεοτιδίων γίνεται σε αυτόματες συσκευές, τους DNA συνθετητές. Η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης συνήθως πραγματοποιείται επί κύκλους οπότε το τμήμα του DNA στόχου μεγεθύνεται 2Π(όπου η ο αριθμός των κύκλων). Αν υποθέσουμε ότι η απόδοση του συστήματος είναι 100% για κάθε κύκλο, τότε μετά από 25 κύκλους έχουμε την παραγωγή 225 ( ) αντιγράφων ενώ μετά από 40 κύκλους έχουμε την παραγωγή 240 ( ) αντιγράφων του εν λόγω DNA στόχου. Για την επιτυχή μεγέθυνση ο αριθμός των κύκλων εξαρτάται από τη συγκέντρωση 30\n35 του DNA στόχου και την απόδοση της PCR σε κάθε κύκλο μεγέθυνσης. Υπερβολικός αριθμός κύκλων οδηγεί σε αύξηση μη ειδικών προϊόντων της γονιδιακής επέκτασης, ενώ μικρότερος από τον απαιτούμενο στην μη ανίχνευση του DNA στόχου. Ενδεικτικά αναφέρεται ότι όταν ο αριθμός των μορίων του στόχου σε ένα βιολογικό υλικό είναι 105 απαιτούνται 30 κύκλοι, όταν είναι 104 απαιτούνται 35 κύκλοι ενώ όταν είναι 103 ή μικρότερος απαιτούνται κύκλοι. Το κύριο προϊόν της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης είναι δίκλωνο DNA το οποίο περιβάλλεται από τα primers των οποίων τα 5' άκρα είναι και τα άκρα του προϊόντος της PCR. Το μέγεθος του σε ζεύγη βάσεων (bp) είναι ίσο με το άθροισμα των βάσεων των εκκινητικών μορίων και της παρεμβαλόμενης αλληλουχίας του DNA στόχου. Είναι δυνατόν κατά τους πρώτους κύκλους της PCR να σχηματισθούν μακρύτερα μονόκλωνα μόρια DNA, τα οποία αποτελούν ένα ελάχιστο ποσοστό στο συνολικό προϊόν της PCR και συνεπώς δεν είναι ανιχνεύσιμα ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΗΣ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ Η ειδικότητα της PCR εξαρτάται από την ειδική σύνδεση των εκκινητικών μορίων στο DNA στόχο η οποία εξαρτάται κυρίως από την θερμοκρασία υβριδισμού (Ta). Όσο πιο κοντά είναι η Ta προς την Tm τόσο πιο πολύ η ειδικότητα αυξάνει. Η ειδικότητα εξαρτάται επίσης από τη συγκέντρωση ιόντων Mg++, τον αριθμό των κύκλων, τη συγκέντρωση του ενζύμου Taq πολυμεράση καθώς και από τη συγκέντρωση των εκκινητικών μορίων και του DNA στόχου. Η ειδικότητα του προϊόντος της αντίδρασης PCR σε βέλτιστες συνθήκες επιβεβαιώνεται σαν ένα ομοιογενές προϊόν σε ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης, το μέγεθος του 31\n36 οποίου ταυτίζεται με το μέγεθος του DNA στόχου. Το ομοιογενές προϊόν της PCR συνήθως προσδιορίζεται με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζη, παρουσία βρωμιούχου εθίδιου (1pg/ml). Το βρωμιούχο εθίδιο παρεμβάλλεται μεταξύ των βάσεων νουκλεοτιδίων και φθορίζει παρουσία υπεριώδους ακτινοβολίας αποκαλύπτοντας το προϊόν της PCR. 32\n37 ΙΙΧ Γ ΚΝΑ ιού υβριδισμός (εκκινητής I ) I αντίστροφη μεταγραφή υ,ιτγ ΠΤΓΠΤί ΠΤΓΠΤΓ οονα I I αποδιάχαςη υβριδισμός (εκκινητής 2) Ώ ΊΠ σύνθεση ϋν Α ΤΤΤΤΊ ΓΓ 1 Ί 1 αποδιάταξη I υβριδισμός (εκ κ η η τές 1 + 2) I Γ Π I I Γ Γ Π ΓΓΠ σύνθεση Ο Ν Α ΓΓΊΠ'Μ..ΓΓΊ Εικόνα 2 : Τα στάδια της αντίστροφης μεταγραφής (ί*τ) και των κύκλων της αλυσιδωτής αντίδρασης της ττολυμεράσης. 33\n38 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 34\n39 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η εργασία που περιγράφεται στο πειραματικό μέρος της πτυχιακής μελέτης αποτελεί μέρος του ερευνητικού Προγράμματος που πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Ιολογίας του Μπενάκειου Φυτοπαθολογικού Ινστιτούτου. Σκοπός του προγράμματος ήταν η μελέτη της ικανότητας διαφόρων απομονώσεων του ιού Υ της πατάτας να προκαλέσουν συμπτώματα της ασθένειας, της νεκρωτικής δακτυλιωτής κηλίδωσης των κονδύλων της πατάτας. Μέχρι τώρα οι απομονώσεις που θεωρούνταν ικανές να προκαλέσουν τα συμπτώματα της ασθένειας ΡΤΝΡϋ ήταν οι ΝΤΝ του Ρ\_/Υ.Όμως κάποιες απομονώσεις Ν του ΡνΥ μπορούν να προκαλέσουν τα ίδια συμπτώματα σε κάποιες ευαίσθητες κυρίως ποικιλίες πατάτας και όταν βρεθούν σε συνθήκες εντομοστεγούς κλωβού. Έτσι κρίθηκε αναγκαίο να βρεθεί ένας τρόπος, μεταξύ των απομονώσεων, για το πόσο είναι ικανές να εκδηλώσουν τα συμπτώματα της ΡΤΝΡϋ. Για αυτό χρησιμοποιήθηκαν τρεις ευαίσθητες ποικιλίες πατάτας όπου από το ποσοστό των συμπτωμάτων στους κονδύλους έγινε μία κατάταξη των απομονώσεων. 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 Φυτικό υλικό και απομονώσεις του ιού Για την εκτέλεση του πειράματος χρησιμοποιήθηκαν διάφορες απομονώσεις του ΡνΥ.Οι απομονώσεις βρίσκονταν σε αποξηραμένο φυτικό υλικό και όλα,εκτός της ελληνικής ΡνΥ24 είχαν σταλθεί από το εξωτερικό. Η απομόνωση Ρ\_/Υ24 υπήρχε διατηρημένη σε φυτά καπνού Νίοοΐίθηθ ίθόβουηι στο θερμοκήπιο του Μπενάκειου Φυτοπαθολογικού Ινστιτούτου. Συνολικά οι απομονώσεις του ιού Υ που χρησιμοποιήθηκαν 35\n40 ήταν 9 και είναι οι PVY Sc, PV Y, PVY" -W - P, PVY" -605, PVY" -154, PVY" -Η, PVY" -NZ, PVY" - F r-o rl, PVY24- Gr. Οι απομονώσεις PVY Sc, PVVe, PVY" -154 προέρχονται από την Σκωτία, η PVY" -605 από Σουηδία, η PVY"-W i - Ρ από Πολωνία, η PVY" -Η από Ουγγαρία, η PVY" -Ν Ζ από Νέα Ζηλανδία, η PVY" - F r-o rl από την Γαλλία και η P V Y24- Gr είναι η ελληνική. Οι απομονώσεις μεταφέρθηκαν σε φυτά καπνού Nicotiana tabacum από όπου και πήραμε το αρχικό μόλυσμα για την μεταφορά στα φυτά πατάτας. Το φυτικό υλικό στο πείραμα για την εκδήλωση των συμπτωμάτων της ασθένειας της νεκρωτικής δακτυλιωτής κηλίδωσης των κονδύλων της πατάτας (PTNRD) ήταν φυτά Solanum tuberosum. Χρησιμοποιήθηκε πιστοποιημένος πατατόσπορος από τρεις ευαίσθητες ποικιλίες cv.hermes,cv. Nadine και cv. Nicola. 2.2 Πειραματικές συνθήκες και μηχανική μόλυνση Η φύτευση έγινε σε γλάστρες οι οποίες διατηρήθηκαν σε συνθήκες εντομοστεγούς κλωβού. (Εικ.3). Για την μηχανική μετάδοση πραγματοποιήθηκε ομογενοποίηση των φύλλων καπνού με τη βοήθεια φωσφορικού διαλύματος. Η αντιστοιχία ήταν 5 φυτά από κάθε ποικιλία με κάθε απομόνωση. Υπήρχε και ο υγιής μάρτυρας στον οποίο έγιναν μηχανικές μολύνσεις με ιστό από υγιή φυτά καπνού. Έτσι συνολικά ο αριθμός των φυτών ήταν 150. Η φύτευση έγινε στις αρχές του Απρίλη 2003 και μετά από ένα χρονικό διάστημα 20 ημερών έγιναν οι μηχανικές μολύνσεις. Μετά από διάρκεια 3,5 μηνών, αφού τα περισσότερα φυτά είχαν καταρρεύσει από τα συμπτώματα της ασθένειας, έγινε η συλλογή των κονδύλων και η καταγραφή - παρατήρηση των νεκρωτικών συμπτωμάτων. 36\n41 Εικόνα 3: Υγιή φυτά πριν την μόλυνση 37\n42 2.3 Μέθοδος ELISA και έλεγχος φυτικού υλικού Εκτέλεση της μεθόδου Αρχικά για τον έλεγχο της φυτουγείας του φυτικού υλικού της πατάτας εφαρμόσθηκε η τεχνική της διπλής παρεμβολής (DAS-ELISA). Για την πραγματοποίηση της δοκιμής ELISA χρειάζονται ένα πλαστικό υποστήριγμα (πλάκα πολυστυρενίου), τα εξειδικευμένα αντισώματα των ιών που αναζητούμε (ανοσοσφαιρίνες IgG), τα ίδια τα αντισώματα συζευγμένα με ένα ένζυμο και ένα υπόστρωμα του ενζύμου Συνθήκες πραγματοποίησης της δοκιμής ELISA Σε αυτή την εφαρμογή της ELISA εξετάστηκε όλο το φυτικό υλικό με την χρήση πολυκλωνικών αντισωμάτων. Και τα 150 δείγματα εξετάστηκαν με την ορρολογική μέθοδο DAS -ELISA για τους ιούς PVA, PVX, PLRV (Potato leafroll virus), PVM, P V S, P W, TBRV, PMTV και PVY. Η πλειοψηφία των χειρισμών πραγματοποιείται σε ένα φωσφορικό διάλυμα 0,02Μ στο οποίο έχει προστεθεί NaCI με ph ουδέτερο (PBS). Με την προσθήκη Tween (απορρυπαντικό με αμμωνία) μέσα στο διάλυμα, αποφεύγεται κάθε απορρόφηση πάνω στα τοιχώματα της πλάκας. Στο διάλυμα ομογενοποίησης προστίθεται polyvinyl - pyrrolidone (PVP) που έχει σαν σκοπό τη σταθεροποίηση του ιού. Η ομογενοποίηση των δειγμάτων έγινε σε αναλογία 1/10 (w/v), με το σύνηθες ρυθμιστικό διάλυμα (PBS -Tween - PVP). Το ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης των αντισωμάτων είναι ένα ανθρακικό διάλυμα (χωρίς Tween) με ph βασικό 9,6 που επιτρέπει την προσκόλληση των αντισωμάτων πάνω στην πλάκα. Κατά τον ίδιο τρόπο το διάλυμα του υποστρώματος έχει ένα ΡΗ σχετικά 38\n43 υψηλό 9,8 για να επιτρέψει τη δράση του ενζύμου (αλκαλική φωσφατάση). Η συντήρηση και οι συνθήκες χρησιμοποίησης των αντιδραστηρίων παρουσιάζεται στον Πίνακα 1 και η σύνθεση των χρησιμοποιούμενων ρυθμιστικών διαλυμάτων στον Πίνακα 2. 39\n44 Συντήρηση Ρυθμιστικά Διαλύματα (Συντήρηση στους 4 C) Συγκέντρωσ η Βιολογικά αντιδραστήρια Στο PBS Σύζευγμα 4 C PBS + Tween 0,05%+PVP 2% 1/500-1/2000 Ανοσοσφαιρίνες IgG -20 C Ανθρακικό διάλυμα PH 9,6 PBS+Tween 1pg-5pg/ml Χημική αντίδραση υπόστρωμα αλκαλικής φωσφατάσης Ρ- -20 C Διαιθανολαμίνη 10% PH 9,8 1mg/ml nitrophenyl phosphate Φυτικό υλικό 4 C PBS-Tween 0.05% + PVP 2% Πίνακας 1:Συνθήκες χρησιμοποίησης των αντιδραστηρίων ELISA 40\n45 Διάλυυα PBS x10(qr) NaCI 80 KH2P 04 2 Na2H P 04 12H20 29 KCI 2 NaN3 2 Προσθήκη αττεσταγμένου H20 έως τελικό όγκο 1000ml+NaOH ΡΗ=7,4 Διάλυμα PBS-Tween:5iàAuua PBS+Tween % Διάλυμα PBS-Tween-PVP:5iàAuua PBS+Tween %+PVP 2% Ανθρακικό διάλυμα fqr) Na2C 0 3 1,59 NaHC03 2,93 NaNH3 0,2 Προσθήκη αττεσταγμένου H20 έως τελικό όγκο 1000ml + HCl PH=9,6 Διάλυμα διαιθανολαμίνης Διαιθανολαμίνη 97ml Η20 800ml NaN3 0,2gr Προσθήκη αττεσταγμένου H20 έως τελικό όγκο 1000ml + HCl ΡΗ=9,6 Πίνακας 2:Σύνθεση χρησιμοποιούμενων ρυθμιστικών διαλυμάτων 41\n46 2.3.3 Περιγραφή της δοκιμής Η δοκιμή περιλαμβάνει τέσσερα διαδοχικά στάδια τα οποία μπορούν να πραγματοποιηθούν σε 48 ώρες. 1 Στάδιο: Προσρόφηση των αντισωμάτων (IgG) πάνω στην πλάκα Πλύσιμο της πλάκας Δημιουργία του συμπλόκου α ντι γό νου/αντίσω μ α 200μΙ (ανθρακικό ρυθμιστικό διάλυμα).χρόνος επώασης 3-6h στους 37 C. 3 φορές από 5 min με PBS- Tween Προσθήκη 200μΙ φυτικού δείγματος/κυψελίδα (διάλυμα ομογενοποίησης PBS-Tween- PVP). Χρόνος επώασης 18h στους Στάδιο: Πλύσιμο της πλάκας Σταθεροποίηση του συζεύγματος πάνω στο σύμπλοκο Πλύσιμο της πλάκας 3 φορές από 5 min με PBS-Tween Προσθήκη συζεύγματος (conjugate) 200μΙ (διάλυμα PBS- Tween ).Χρόνος επώασης 3-4h στους 37 C 3 φορές από 5 min με PBS-Tween 42\n47 3 Στάδιο: Αποκάλυψη Προσθήκη υποστρώματος 200μΙ (διάλυμα διαιθανολαμίνης). Χρόνος επώασης 5ηιίη-2ΐΊ σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. 4 Στάδιο: Οπτική εκτίμηση ή ανάγνωση της οπτικής πυκνότητας με την χρησιμοποίηση ειδικού φωτομέτρου για την δοκιμή ELISA Ανάλυση αποτελεσμάτων Η οπτική εκτίμηση γίνεται με μια απλή ματιά όπου μπορούμε να διαπιστώσουμε πάνω στην πλάκα τα μολυσμένα δείγματα (αλλαγή χρώματος). (Εικ.4) Εικόνα 4. Πλάκες ELISA με τις κίτρινες περιοχές να αντιπροσωπεύουν τα μολυσμένα δείγματα. 43\n48 Για περισσότερη ακρίβεια ο προσδιορισμός της οπτικής πυκνότητας σε κάθε φρεάτιο πραγματοποιείται με την βοήθεια ενός φωτομέτρου ELISA.Η οπτική πυκνότητα των τυφλών ρυθμίζεται στο 0 (μηδέν). Η ανάγνωση γίνεται σε μήκος κύματος 405ηπι. Όσο μεγαλύτερη είναι η οπτική πυκνότητα (πιο έντονος χρωματισμός) τόσο η συγκέντρωση σε αντιγόνα είναι πιο σημαντική. Θετικά θεωρούνται όσα δείγματα έδωσαν οπτική απορρόφηση τουλάχιστον 2 φορές μεγαλύτερη από τον μέσο όρο των απορροφήσεων των 2 μαρτύρων. Ο προληπτικός έλεγχος για τις αναφερόμενες ασθένειες, όπως ήταν αναμενόμενο, παρουσίασε αρνητικά αποτελέσματα. 2.4 Ανοσοδέσμευση RT-PCR (IC-PCR) Στην εργασία μας για την ενίσχυση του τμήματος του γονιδίου της του PVY χρησιμοποιήθηκαν οι εκκινητές των Weidemann και Maiss με την μέθοδο IC-RT-PCR οι οποίοι έχουν σχεδιαστεί για να αναγνωρίζουν απομονώσεις του PVYNTN. Ο καθοδικός και ανοδικός εκκινητής παράγουν ένα προϊόν το οποίο αντιστοιχεί σε 835 ζεύγη βάσεων από την νουκλεοτιδική θέση Έγινε και δεύτερη PCR στους κονδύλους (συμπτωματικούς και μη), για την ενίσχυση του τμήματος του γονιδίου της καψιδιακής πρωτεΐνης του PVY, κάτι το οποίο μας ενδιέφερε αφού κόνδυλοι οι οποίοι δεν είχαν συμπτώματα, κατά την διάρκεια της αποθήκευσης τους πιθανόν να εμφανίζουν. Χρησιμοποιήθηκαν 10ΟμΙ ομογενοποιημένου δείγματος από φύλλα πατάτας μετά από φυγοκέντριση σε 10.OOOrpm για 10min. Τα δείγματα στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε σωληνίσκους της PCR (Perkin Elmer) όπου είχαν προηγουμένως προσροφηθεί ανοσοσφαιρίνες (IgG) 44\n49 έναντι του ιού Y σε συγκέντρωση 2pg/ml. Στη συνέχεια ακολουθούν δύο πλυσίματα με PBS-Tween και ένα με αποσταγμένο νερό. Ακολούθως, προστίθεται μείγμα 33.5μΙ (6.3 mm Tris-HCI ph 8.3, 9.5 πιμ KCL, 0.38 mm MgCI2, 0.35 jg primerl) σε κάθε σωληνίσκο. Έγινε ανάδευση στο Vortex και στη συνέχεια το μείγμα θερμαίνεται για 5 min στους 65 C, για την αποδιάταξη της έλικας DNA,15 min στους 45 C και τοποθετείται στον πάγο 4 C, ώστε να διατηρηθεί σε αυτή την κατάσταση και μην έχουμε συσπείρωση. Ένα μείγμα cdna 17,5μΙ [143 mm Tris-HCI ph 8,3, 214 mm KCL, 8,5 mm MgCI2, 29 mm DTT, 0,5 mm από κάθε dntp, 20 U RNAse Inhibitor (Life Technologies, Paisley, Scotland, UK), 200 U M-MLV RT (Life Technologies)] προστέθηκε και η αντίδραση της RT παρέμεινε στους 37 C για 1h. Στη συνέχεια έγινε η αντίδραση της PCR-Σε ποσότητα 5μΙ από την πρώτη αντίδραση προστίθενται σε 45μΙ PCR mix [22 mm Tris-Cl, ph 8,4, 2.2 mm MgC!2, 55 mm KCl, 222 μμ dntps, 1mg primer 2, 2 U Taq DNA polymerase (Life Technologies)]. Στη συνέχεια οι σωληνίσκοι τοποθετήθηκαν σε θερμοκυκλοποιητή (MJ Research Inc.USA) και επωάστηκαν για 5 min στους 94 C,ακολούθησαν 30κύκλοι 40 sec στους 94 C,45 sec στους 51 C, 60 sec στους 72 C και ένας τελευταίος κύκλος 10 min στους 72 C. Τα προϊόντα, 10μΙ από το καθένα, ανιχνεύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1,5% σε ρυθμιστικό διάλυμα 1χΤΒΕ (89mM tris-ßopik0,89mm βορικό οξύ,2ιημ EDTA). Στην πηκτή αγαρόζης προστέθηκε 0,2pg/ml βρωμιούχο αιθύδιο. Το μέγεθος των ζωνών DNA εκτιμήθηκε βάση μάρτυρα μοριακού βάρους DNA (1 kb, Gibro-BRL), έτσι ώστε τα μόρια DNA να γίνονται ορατά κάτω από υπεριώδες φως. Κατά την αντίδραση της RT-PCR γίνονται τα εξής: Πρώτα γίνεται ο υβριδισμός μεταξύ του εκκινητή 1 που είναι συνθετικό ολιγονουκλεοτίδιο, συμπληρωματικό μιάς αλληλουχίας του RNA του ιού. Τη δομή αυτή αναγνωρίζει το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση και 45\n50 συνθέτει το συμπληρωματικό DNA.N/Ιετά από θέρμανση του μείγματος και αποδιάταξη των μορίων λαμβάνεται το μονόκλωνο DNA που αφού υβριδισθεί με τον εκκινητή 2 σε μια άλλη θέση, θα χρησιμοποιηθεί από την Taq πολυμεράση σαν μήτρα για την σύνθεση της συμπληρωματικής ως προς αυτό αλυσίδας. Ένας δεύτερος κύκλος αποδιάταξης των αλυσίδων με θέρμανση,υβριδισμού με τους εκκινητές 1 και 2 στις αντίστοιχες συμπληρωματικές θέσεις και σύνθεσης DNA, θα οδηγήσει στην παραγωγή δυο μορίων DNA-Σε κάθε κύκλο δηλαδή της PCR διπλασιάζονται τα μόρια DNA έτσι ώστε θεωρητικά μετά από ν κύκλους παίρνουμε 2ν μόρια. 46\n51 Διάλυμα PBS χ10 (qr) NaCI 80 KH2PO4 2 Na2H P04 12 H20 29 KCI 2 Προσθήκη αποσταγμένου H20 έως τελικό όγκο 1000ml+NaOH ρη=7,4 Διάλυμα PBS1x-Tween: διάλυμα PBS1x-Tween 20 0,05% Διάλυμα PBS-Tween-PVP-DIECA: διάλυμα PBS1x-Tween +2% PVP+0,2% DIECA Ανθρακικό διάλυμα (qr) Na2C 0 3 0,318 NaHCOs 0,586 Προσθήκη H20 Millipore έως τελικό όγκο 200ml+HCI ρη=9,6 TBE 10χ gr/mt Tris 108 Boric Acid 55 EDTA 9.3 STOC GEL 1.5%: 200 ml TBE 1x + 3 gr Agarose Πίνακας 3:Σύνθεση χρησιμοποιούμενων ρυθμιστικών διαλυμάτων της PCR 47\n52 Π ροσρόφηση αντισώ ματος Επώαση Πλύσιμο Προσθήκη δείγματος Αντίσωμα (~) Ιϊκό σωμάτιο 113:1:1 Νεοσυνθετιμένο ϋνα Ανίχνευση με ηλεκτροφόρηση Εικόνα 5:ΤΑ ΣΤΑΔΙΑ ΤΗΣ 10 - ΡΟΗ 48\n53 2.5 Εκτίμηση δείκτη ασθένειας (Τύπος) Για τον διαχωρισμό μεταξύ των νεκρωτικών κονδύλων δημιουργήθηκε ένας δείκτης ασθένειας με κλίμακα από 1 έως 9. Οι συμπτωματικοί κόνδυλοι διαχωρίζονται ως εξής: Αν η νεκρωτική επιφάνεια είναι μικρότερη από 25% της συνολικής τότε ανήκει στην Α κατηγορία, αν είναι 25-75% στην Β ενώ πάνω από 75% στην Ο. Ο δείκτης ασθένειας υπολογίζεται από τον τύπο: Δ.Α.=1,14χ κατηγορία χ αριθμό συμπτωματικών κονδύλων / συνολικό αριθμό κονδύλων. Για την κατηγορία Α αντιστοιχεί ο αριθμός 0,125 για την κατηγορία Β 0,500 και για την Ο 0,875 49\n54 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜ ΑΤΑ 3.1. Χαρακτηριστικά απομονώσεων Βιολογικός έλεγχος Οι βιολογικοί χαρακτήρες αφορούν τη συμπτωματολογία φυτών δεικτών όπως ο καπνός που επιτρέπει την κατάταξη των στελεχών του ιού σε νεκρωτικά, Ν ή κοινά Ο. Τα νεκρωτικά στελέχη προκαλούν νέκρωση των νεύρων στα φύλλα καπνού, ενώ τα κοινά μια απλή διαφάνεια των νευρώσεων. Η νεκρωτική υποομάδα PVYNTN προκαλεί πολύ έντονα νεκρωτικά συμπτώματα που οδηγούν στην παραμόρφωση των φύλλων της κορυφής και στη νέκρωση των φύλλων της βάσης. Έγιναν μηχανικές μολύνσεις σε φυτά καπνού Nicotiana tabacum. Τα συμπτώματα στους καπνούς εμφανίστηκαν μετά από 7 ημέρες και ανάλογα με την απομόνωση είχαμε ήπιο ή τραχύ μωσαϊκό και αλλού τοπική ή διασυστηματική νέκτωση.οι παρακάτω απομονώσεις, PVY24 - Gr, PVYΝ-Wi - Ρ, PVYΝ - 605, P V Y 1-154, PVYΝΤΝ -Η, PVYΝΤΝ -ΝΖ, PVΥΝΤΝ - Fr -O rí έδωσαν νεκρωτικά συμπτώματα.(εικ.6) 50\n55 Εικόνα 6:Συμπτώματα των διαφόρων απομονώσεων του ιού Υ της πατάτας σε φυτά καπνού\n56 Μοριακός έλεγχος Οι εκκινητές των Weidemann και Maiss σχεδιασμένοι για τα στελέχη PVYNTN έδωσαν σε πέντε από τα εννιά στελέχη το χαρακτηριστικό προϊόν των 835 ζευγών βάσεων. Και οι πέντε απομονώσεις εμφάνισαν την ασθένεια της δακτυλιωτής κηλίδωσης των κονδύλων της πατάτας (PTNRD) στο θερμοκήπιο. Τα στελέχη PVY και PVYCστον έλεγχο με την μέθοδο PCR δεν έδωσαν το αντίστοιχο προϊόν καθώς επίσης δεν εμφάνισαν και συμπτωματικούς κονδύλους. Η μέθοδος της IC-PCR εφαρμόσθηκε για όλες τις απομονώσεις του ιού Υ της πατάτας που εξετάστηκαν. Στην Εικόνα 7 εμφανίζονται τα αποτελέσματα της IC-PCR.0 υγιής μάρτυρας δεν έδωσε κανένα προϊόν ενίσχυσης του DNA όπως ήταν αναμενόμενο. IC - (PCR. lkb PVY PVY PVY PVY ΡΥΎ ΡΥΎ ΡΥΎ ΡΥΎ ΡΥΎ ΝΤΝ Ν ΝΤΝ ΝΤΝ Ο GR C Ν 154 Ν 605 ΝΖ Wi-PFr-Orl Η Sc 24 # -*-«1000 bp Εικόνα 7:Αποτελέσματα της ΙΟ-ΡΟί*.Ο Υγιής μάρτυρας όπως ήταν αναμενόμενο δεν έχει δείξει κανένα προϊόν ενώ πέντε από τις εννιά απομονώσεις έχουν δώσει το χαρακτηριστικό προϊόν των 835 ζ.β. Οι απομονώσεις που ανήκουν στην υποομάδα του ρ νυ Ν έδωσαν το χαρακτηριστικό προϊόν των 835 ζευγών βάσεων. Το ίδιο προϊόν έδωσε και η απομόνωση Ρ\_/ΥΝ-154. Παρατηρούμε ότι οι απομονώσεις που ανήκαν 52\n57 στην ομάδα Ο, C δεν έχουν δώσει το προϊόν ενίσχυσης του DNA κάτι το οποίο ήταν αναμενόμενο. Η απομόνωση PVYN-Wi-P δίνει νεκρωτικά συμπτώματα σε φυτά καπνού ενώ σε φυτά πατάτας αντιδρά με πιο ήπια συμπτώματα Εκδήλωση συμπτω μάτω ν του ιού Εκδήλωση επί των φυτών πατάτας Τα πρώτα συμπτώματα εμφανίστηκαν στο διάστημα των 10 ημερών μετά τις μολύνσεις και ήταν μόνο στα φύλλα όπου είχε γίνει μηχανική μόλυνση. Τα συμπτώματα αυτά χαρακτηρίζονταν από μαύρες κηλίδες στην κάτω επιφάνεια των φύλλων στα φυτά της πατάτας.(εικ.8) Οι ποικιλίες όπως έχουμε προαναφέρει που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτό το πείραμα ήταν η cv.nadine,hermes και Nicola. Πιο ευαίσθητη από τις τρεις αποδείχθηκε η Nadine μετά ακολούθησε η Hermes και τέλος η Nicola. Μετά το πέρας του πρώτου μήνα τα συμπτώματα είχαν γίνει πολύ έντονα και σε όλο το φυτό. Το έντονο μωσαϊκό στις ποικιλίες με νεκρωτικά στελέχη ήταν ορατό.(εικ.9). Στον δεύτερο μήνα τα συμπτώματα εξελίχθηκαν σε νεκρωτικά και είχαμε παραμόρφωση των φύλλων της κορυφής και νέκρωση στις νευρώσεις των φύλλων της βάσης, κιτρίνισμα των φύλλων τα οποία και παρέμεναν πάνω στο φυτό ή έπεφταν από αυτό.(εικ.ιο) Η εξέλιξη των συμπτωμάτων και ο χαρακτήρας τους, στις ποικιλίες που είχαν μολυνθεί με τα στελέχη PVY0 και PVYC, ήταν τόσο έντονος όσο και στα νεκρωτικά στελέχη. Στον τρίτο μήνα τα περισσότερα φυτά είχαν καταρρεύσει με τα παραμορφωμένα φύλλα να έχουν παραμείνει πάνω σε αυτά. (Εικ.11) 53\n58 Εικόνα 8:Αρχικά συμπτώματα στην πάνω και κάτω επιφάνεια των φύλλων 54\n59 Εικόνα 9:Έντονο μωσαϊκό μετά από διάστημα 3 εβδομάδων από την μόλυνση 55\n60 Εικόνα 10:Έντονα συμπτώματα με νεκρωτικά δαχτυλίδια και νέκρωση των νευρώσεων 56\n61 Εικόνα 11: Κατάρρευση των φυτών μετά από διάστημα 2,5 μηνών 57\n62 Εκδήλωση επί των κονδύλων Μετά το τέλος του τρίτου μήνα και αφού σχεδόν όλα τα φυτά είχαν καταρρεύσει,εκτός από τα υγιή, έγινε η συλλογή των κονδύλων από κάθε φυτό και η καταμέτρησή τους. Όλοι οι κόνδυλοι καθαρίστηκαν και τοποθετήθηκαν σε πλαστικά κυπελλάκια όπου είχε σημειωθεί ο αριθμός της γλάστρας, η ποικιλία και η απομόνωση του ιού Y με το οποίο είχε μολυνθεί.(εικ. 12). Στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε σκοτεινό μέρος και διατηρήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου.(22 C). Η πρώτη παρατήρηση έγινε μετά από τέσσερις εβδομάδες όπου και είχαμε νεκρωτικά συμπτώματα σε κονδύλους. (Εικ. 13). Η συχνότητα των επόμενων παρατηρήσεων ήταν ανά δυο εβδομάδες. Μετά το τέλος των 2.5 μηνών μετά την συλλογή δεν υπήρχε εμφάνιση καινούργιων κονδύλων με νεκρωτικά συμπτώματα. Από τις εννιά απομονώσεις του Y στις πέντε είχαμε συμπτώματα νεκρωτικά στους κονδύλους. Από την μοριακή ανάλυση φαίνεται ότι το στέλεχος PVYN-154 διαθέτει ΝΤΝ χαρακτήρα όπως και το στέλεχος PVY24 -GR.Ta στελέχη PVY Sc, PVY, PVY" -Wi - P και P W " -605, δεν έδωσαν νεκρωτικά συμπτώματα στους κονδύλους. Το μεγαλύτερο αριθμό σε κονδύλους με νεκρωτικά συμπτώματα από τις ποικιλίες έδωσε η Nadine.ακολούθησε η Hermes και τέλος η Nicola.Οι κόνδυλοι οι οποίοι δεν εμφάνιζαν συμπτώματα ελέγχθηκαν με την μέθοδο ELISA και εμφανίστηκαν θετικοί. 58\n63 Εικόνα 12:Συλλογή και καταμέτρηση των κονδύλων σε πλαστικά κυπελλάκια 59\n64 Εικόνα 13: Συμπτώματα της ασθένειας ΡΤΝΚϋ σε κονδύλους πατάτας 60\n65 3.3 Διακύμανση Θερμοκρασίας Σε όλη την διάρκεια του πειράματος οι διακυμάνσεις της υγρασίας και κυρίως της θερμοκρασίας καταγράφονταν (Εικ. 14) αφού παίζουν σημαντικό ρόλο στον τρόπο εκδήλωσης και διαμόρφωσης των συμπτωμάτων. Από το διάγραμμα φαίνεται πώς η διακύμανση της θερμοκρασίας στην διάρκεια του πειράματος ήταν ομαλή. Εικόνα 14: Διακύμανση της μέσης θερμοκρασίας ( 0) 61\n66 3.4 Δείκτης ασθένειας Για την πιο εύκολη κατάταξη της ποικιλίας η τιμή του δείκτη ασθένειας αντιστοιχούσε σε ένα συγκεκριμένο επίπεδο το οποίο χαρακτήριζε κατά πόσο η συγκεκριμένη ποικιλία είναι ευπαθής στην συγκεκριμένη απομόνωση.(πινακ.4) ΕΠΙΠΕΔΟ ΔΕΙΚΤΗΣ ΑΣΘΕΝΕΙΑΣ Ε Υ Π Α Θ Ε ΙΑ 9 0 Κ Α Θ Ο Λ Ο Υ Ε Υ Π Α Θ Η Σ 8 0-0,125 Π Ο Λ Υ Λ ΙΓ Ο Ε Υ Π Α Θ Η Σ 7 0,125-0,25 Π Ο Λ Υ Λ ΙΓ Ο Ε Υ Π Α Θ Η Σ 6 0,25-0,375 Λ ΙΓ Ο Ε Υ Π Α Θ Η Σ 5 0,375-0,50 Λ ΙΓ Ο Ε Υ Π Α Θ Η Σ 4 0,50-0,625 Σ Χ Ε Τ ΙΚ Α Ε Υ Π Α Θ Η Σ 3 0,625-0,75 Σ Χ Ε Τ ΙΚ Α Ε Υ Π Α Θ Η Σ 2 0,75-0,875 Π Ο Λ Υ Ε Υ Π Α Θ Η Σ 1 0,875-1 Π Ο Λ Υ Ε Υ Π Α Θ Η Σ Πίνακας 4: Χαρακτηρισμός των κονδύλων της κάθε ποικιλίας ανάλογα με τον δείκτη ασθένειας. 62\n67 Στον παρακάτω πίνακα 5 φαίνεται η κατάταξη της κάθε ποικιλίας ανάλογα με την ευαισθησία που εμφανίζει σε κάθε απομόνωση. Απομονώσεις του ΡνΥ ΝΑϋΙΝΕ (ΕΠΙΠΕΔΟ) ΗΕΡΜΕε (ΕΠΙΠΕΔΟ) ΝΙΟΟΙ_Α (ΕΠΙΠΕΔΟ) ρ νγ-ο βε ρνγ-ο Ρ ν Υ ΝΛΛ/ί-Ρ Ρ ν Υ -Ν ΡνΥ-Ν Ρ ν Υ -Ν Τ Ν FI - Ο γι Ρ ν Υ -Ν Τ Ν Η Ρ ν Υ -Ν Τ Ν ΝΖ Ρ ν Υ ϋ Ρ Πίνακας 5: Κατάταξη της κάθε ποικιλίας ανάλογα με την ευπάθεια που εμφάνισε σε κάθε απομόνωση 63\n68 NADINE D.L ENICOLA D.L HERMES D.I. ISOLATES Εικόνα 12:Δείκτης ασθένειας για κάθε ποικιλία και απομόνωση Από την εικόνα 12 παρατηρούμε ότι το υψηλότερο ποσοστό συμπτωματικών κονδύλων είχε η ποικιλία Nadine στην απομόνωση PVYntn-NZ και μετά να ακολουθεί η απομόνωση του PVY 24-GR. Επίσης βλέπουμε ότι στην απομόνωση PVYN-605 έχουμε συμπτωματικούς κονδύλους στην ποικιλία Hermes. Πιο ευαίσθητη από τις ποικιλίες εμφανίζεται η Nadine μετά η Hermes και τέλος η Nicola. Η απομόνωση PVYn-154 εμφάνισε συμπτωματικούς κονδύλους στην ποικιλία Nadine κάτι το οποίο όμως δεν συνέβαινε σε συνθήκες αγρού. 64\n69 4.ΣΥΖΗΤΗΣΗ - ΣΥΜ ΠΕΡΑΣΜ ΑΤΑ Στην εργασία που πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Ιολογίας του Μπενάκειου Φυτοπαθολογικού Ινστιτούτου έγινε επιτυχής η μελέτη της δυνατότητας 9 στελεχών του ιού Y της πατάτας να εμφανίσουν την ασθένεια της νεκρωτικής δακτυλιωτής κηλίδωσης των κονδύλων της πατάτας. Εφαρμόσθηκε η μέθοδος IC-PCR για την ανίχνευση της εμφάνισης των διαφόρων στελεχών χαρακτήρα ΝΤΝ. Οι πέντε απομονώσεις έδωσαν το χαρακτηριστικό προϊόν της PCR το οποίο βρίσκεται στο μέγεθος περίπου 835 ζευγών βάσεων. Ο υπολογισμός του δείκτη ασθένειας ήταν απαραίτητος για την δημιουργία 10 επιπέδων, από το 1 για ποικιλίες υψηλής ευπάθειας (όλοι οι κόνδυλοι παρουσιάζουν μια εκτεταμένη νέκρωση) μέχρι το 9 για ποικιλίες καθόλου ευπαθείς (καμία εμφάνιση νέκρωσης στους κονδύλους κατά την διάρκεια αποθήκευσης τους). Πιο ευπαθής ποικιλία ήταν η Nadine αφού έδωσε και τους περισσότερους συμπτωματικούς κονδύλους, ακολούθως η Hermes και τέλος η Nicola. Η απομόνωση PVYN-154 ενώ στον αγρό δεν εμφανίζει σε καμία από τις ποικιλίες νεκρωτικά συμπτώματα στους κονδύλους, σε συνθήκες θερμοκηπίου είδαμε να εμφανίζει την ασθένεια PTNRD στην ποικιλία Nadine. Η απομόνωση PVYN-Wip-P στον καπνό δίνει νεκρωτικά συμπτώματα, αλλά στους κονδύλους δεν εμφανίστηκε ποσοστό συμπτωματικών κονδύλων ικανό για να το κατατάξει σε απομόνωση που προκαλεί την ασθένεια PTNRD. Οι πέντε απομονώσεις οι οποίες έδωσαν στην IC-RT-PCR το χαρακτηριστικό προϊόν της ΝΤΝ απομόνωσης εκδήλωσαν και στις τρεις ποικιλίες τα συμπτώματα της ασθένειας PTNRD κάτι το οποίο ήταν αναμενόμενο. 65 *\n70 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. BEM, F., VARVERI, C., ELEFTHERIADIS, I. and KARAFYLLIDIS, D First report of occurrence of potato tuber necrotic ringspot disease in Greece. P la n t D is., 83: BLANCO-URGOITI, B., TRIBOLET, M, LECLERE, S., PONZ, F., PEREZ DE SAN ROMAN, C., LEGORBURU, F.J. and KERLAN, C. 1998b. Characterization of potato potyvirus Y (PVY) isolates from seed potato batches. Situation of The NTN, Wilga and Z isolates. E ur. J. P la n t P a th o l., 104: ΚΥΡΙΑΚΟΠΟΥΛΟΥ, Παραγωγή υγιούς πολλαπλασιαστικού υλικού. Διαγνωστικές μέθοδοι. Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών. Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας. 4. ΒΟΟΝΗΑΜ, Ν., WALSH, Κ., PRESTON, S., NORTH, J., SMITH, P., BARKER, I. 2002: Journal of Virological Methods 102: ΧΟΥΛΙΑΡΑ, Ι.Γ Σημειώσεις Ειδικής Γεωργίας IV. Τεχνολογικό Εκπαιδευτικό Ίδρυμα, Σχολή Τεχνολόγων Γεωπονίας Τμήμα Φυτικής Παραγωγής, : DE ΒΟΚΧ, J.A. and HUTTINGA, Η Potato virus Υ. CMI/AAB descriptions of Plant Viruses No ΜΠΟΥΤΣΙΚΑ, K Ενζυμο-ανοσοδοκιμή (Enzyme Linked- Immunosorbent Assay). Μπενάκειο Φυτοπαθολογικό Ινστιτούτο 8. LE ROMANCER, M., and NEDELLEC, M., (1997) Effect of plant genotype, virus isolate and temperature on the expression of the potato tuber necrotic ringspot disease (PTNRD).Plant Pathol. 46: ΚΑΤΤΗΣ, Ν. Ορολογικές Δοκιμές. Ταυτοποίηση ιών 4.6. Σημειώσεις από Τμήμα Γεωπονίας Α.Π.Θ. 10. ΜΠΕΜ, Φ Ίολογικές Ασθένειες ΓΕΩΡΓΙΑ - Κτηνοτροφία 5:\n71 11. ΑΥΓΕΛΗΣ, Α.Δ. ΡΟΔΙΤΑΚΉΣ, Ν. ΓΡΑΜΜΑΤΙΚΑΚΗ, Γ. και ΠΑΤΕΡΑΚΗΣ, Ν ΚΗΠΕΥΤΙΚΑ, Ίολογικά Προβλήματα της καλλιέργειας πατάτας στο οροπέδιο Λασηθίου Κρήτης ΓΕΩΡΓΙΑ - ΚΤΗΝΟΤΡΟΦΙΑ 8: SMITH, Ι.Μ.,DUNEZ, J., European Handbook of Plant Dioseases. 1997: ΖΑΧΟΣ, Δ.Γ Ασθένειες των Γεωμήλων (Ιολογικές Ασθένειες) Μπενάκειο Φυτοπαθολογικό Ινστιτούτο: ΜΑΡΚΟΥΛΑΤΟΣ, Π., ΣΑΜΑΡΑ, Β. ΜΑΡΙΝΑΚΗΣ, Γ., ΚΑΠΑΡΟΣ, Κ, ΦΟΥΝΤ Ο ΥΚΙΔΟ Υ, Π, ΚΡΙΚΕΛΗΣ, Β., ΣΠΥΡΟΥ, Ν., και ΒΑΜΑΒΑΚΟΠΟΥΛΟΣ, Ν. Η Αλυσιδωτή αντίδραση της Πολυμεράσης (PCR) στη διάγνωση των ιώσεων ΕΛΛΗΝΙΚΉ ΙΟΛΟΓΙΑ 1996, 1(1): VARVERI, C Potato Y potyvirus detection by immunological and molecular techniques in plants and aphids. P h y to p a r a s itic a 28 (2): ROSNER, A. and MASLENIN, L. 1999a. Differentiating PVYN by unique single restriction cleavage of PCR products. P o ta to R e s., 42: ΠΑΤΑΚΙΟΥΤΑΣ, Γ., Πιστοποιημένος πατατόσπορος Σποροπαραγωγή στην Ελλάδα. Εκδόσεις Γεωργική Τεχνολογία Νοέμβριος 1996: VARVERI, C. and BEM, F TheNTN strain of Potato virus Y (PVYNTN): a new threat for potato cultivations in Greece. P h y to p a th o l. M e d ite r r., 40 (2): (Abstract). 20. ΒΕΖΥΡΟΓΛΟΥ, Ν. και KAP ΑΦ Y ΛΑΙΔΗ, Δ., Άνοσο Πολλαπλασιαστικό υλικό. Εκδόσεις Γεωργική Τεχνολογία Νοέμβριος 1996: Χ.Βαρβέρη, Φ.Μπεμ. Η φυλή του ιού Y της πατάτας (PVYNTN):véoç σοβαρός κίνδυνος για τις πατατοφυτείες της χώρας. 10 Πανελλαδικό Φυτοπαθολογικό Συνέδριο WEIDEMANN, H.L. and MAISS, Ε Detection of the potato tuber necrotic ringspot strain of potato virus Y (PVYNTN) by reverse transcription and immunocapture polymerase chain reaction. Zeitsch. Plantzenkrank. Pflanzenschutz, 103 (4):


##### Δώρο gay πορνό – Ιαπωνικά πορνό αστέρια βίντεο online πορνό ματιά.\nΑπλά στείλε Pride στο 1339 και πάρε το δώρο σου. Ben gay salve. Πορνό με κόκκινη μαμά. Η Ιλιάδα σε gay πορνό. Περισσότερα απο την ενότητα Blogs. Φωτογραφία των πιο skinniest γυναικών χωρίς πορνό.\nΑυτό το χαριτωμένο μικρό κοστούμι είναι το Χριστουγεννιάτικο δώρο σας. Κόμπος hd και. Xxx για πρώτη φορά twink ταινία και δωρεάν gay πορνό μόνο πιπίλισμα μεγάλο πουλί. Teen και milf δώρο gay πορνό μουνί ως δώρο στο αγόρι bday. Η μαμά έκανε ένα δώρο στο πορνό του. Βίντεο σεξ δώρο tokiviston. Πορνό όπου ορκίζομαι βίντεο.\nΒυζιά pussy παρτούζα facesitting μεγάλο, Ευρετήριο πορνό βίντεο κλιπ, Η λίντσεϊ lohen sex. Η κοκκινομάλλης λαμβάνει μαύρο κοτσάνι ως δώρο Χριστουγέννων. Νεοπλασία του αιδοίου, γλυκό σεξ και ερωτικές ιστορίες, μεγάλη αυτοκινήτου θέση στο. Δύο κορίτσια πορνό gay fuck fuck. Hd porno 720 σε απευθείας σύνδεση σπέρμα. Σέξι ιδέα για δώρο για τον άντρα σου. Ο απογυμνωτής Hawt παίρνει. Αγόρι gay emo βίντεο πορνό Aj Monroe Fucks Ethan Travis.\nΠουλί ο κόρπελα. Δωρεάν δώρο gay πορνό σεξ πάρτι πινακοθήκη. Plushenko δώρο gay πορνό βόμβες σεξ επιδείξεις. Διασημότητα παρτούζα πορνό πορνό βίντεο ιαπωνικό μασάζ σεξ νέος. Το πρόβλημα.\nGay ποιήματα καλύτερος φίλος. Πορνό ήρθε και αποπλανήθηκε. Ομοφυλόφιλοι ποδοσφαιριστές. Θεωρείται το τελευταίο μεγάλο ταμπού της σύγχρονης κοινωνίας. Αν το σπέρμα hiv πήρε στον κόλπο. Ρομαντικό ζεστό θεωρεί το αισθησιακό σεξ είναι ένα μεγάλο δώρο. Τι φύλο είναι ένα δώρο για να δώσω 3 κορίτσια 1 πίπα σύζυγό μου. Πορνό όπως πατήσαμε με το georgian.\nΓυμνά κορίτσια από πίσω πορνό φωτογραφία. Οι ταινίες από το gay sex club Evan Darling έρχονται στο σπίτι με δώρο gay πορνό μεγάλο δώρο. Georgia gay bar albany. Πολύ όμορφο. Jumbo για τη διαφήμιση με το gay ζευγάρι: Μαγαρίζετε τα παιδιά μας (Video). Πορνό πρωκτικές γυναίκες στη φύση. Κοντά μαλλιά ασίας πορνό, εντελώς δωρεάν το tiny έφηβος πορνό, πώς να δέρνετε ένα παιδί χωρίς να έχει τον όρθια, φλέβες νεύρα του αιδοίου.\nΝεκρή γυναίκα στο εσωρούχων λήψη. Δωρεάν λήψη ισχύος σεξ κλιπ video. Σεξ και ζευγάρι στην δώρο gay πορνό. Δωρεάν πορνό έφηβες gay ταινίες και γκέι μαλλιά μεξικάνικο πορνό. Η πόλη που φιλοξενεί εδώ και χρόνια το δώρο gay πορνό δημοφιλές Gay Pride Parade. Σεξ σε. Cherry twinks gay Αυτό το δίδυμο εβδομάδων παρατηρεί τον κατώτερο τύπο του Andrew.\nGay mormon βίντεο. Αγόρια πέος sex gay sex fuck και ώριμη ξιφολόγχες Aaron. Straight άντρας ρωτάει τους δώρο gay πορνό το λόγο που έγιναν ομοφυλόφιλοι (video) - Έβαλε τα κλάματα από τις απαντήσεις που έλαβε. Φυσική φωτογραφία πορνό στήθος. Ένα δώρο για τις ιστορίες κεφαλόπορτ. Και γι αυτό, οι μέχρι τώρα ιστορίες.\nPrevious Article Ebony κόμμα πορνό βίντεο\nΑσιάτης/ισσα, γατούλα, πορνό, αστέρι\nKen, Ράικερ, γκέι, πορνό\nμαύρο, μουνί, στάζει\nλεσβίες, πλήρες, σεξ, ταινίες\nπιο, σέξι, Ebony, κορίτσια\nWeman όλοι πλάτη herington κάνσας ψάχνει για σεξ. Re: Δώρο valentine για εραστή gay. Φύλο Moloi Zinokor Δώρο Τοχικίστον. Πορνό βίντεο των νέων δωρεάν. Τα αγόρια που αυνανίζουν το gay πορνό και οι έφηβες ερωτικές ιστορίες για πρώτη φορά..\nTorri μαύρο πορνό Shaktilkree Torri, μαύρο, πορνό\nΔωρεάν Πορνό Γκέι Βίντεο Xvideos, Pornhub, xnxx - Heinz Δώρο Gay - Δωρεάν Download Gay Πορνό - Gay Porn Κινητό - Ελληνικά Ομοφυλόφιλοι Πορνό Βίντεο. Μπανιέρα gay μπανιέρα. Περιστατικά γυρίσματα πορνό. Πορνό ταινίες για τα παιχνίδια των ανδρών. Ο Σκαραμούτσι ακολουθεί έναν γκέι πορνοστάρ.\nΤαξί πορνό creampie Kegami ταξί, πορνό, creampie\nπιο, hot, γυναικείος, οργασμός, πορνό, αστέρια(5)\nΑφρικανική, μουνί, φωτογραφίες(4)\nσπασίκλας, Ασίας, πορνό(1)\nΠώς, να, κόλπος, squirt(0)


##### Δωρεάν καλύτερες ιστοσελίδες γνωριμιών στον κόσμο – Πλήρης λίστα ιστοσελίδων γνωριμιών - Datingwebsites.gr.\nΔωρεάν Sites Γνωριμιών Περιστασιακή Dating Τζέντα\nΥπηρεσίες ανάγνωσης γνωριμιών\nΣυν μέγεθος κορίτσι ραντεβού ιστοσελίδα\nΑστρονομικό πρακτορείο γνωριμιών\nLucy Χέιλ ραντεβού ιστορία Zimbio\nΣεξ εφαρμογές εκτός από tinder\nΠώς να βρείτε το σύντροφό σας σε ιστότοπους γνωριμιών\nΝότια Αφρικανική single σε απευθείας σύνδεση dating\nΒγαίνουμε ακόμα ώρες συνεδρίας\nΔωρεάν ιστοσελίδες γνωριμιών δωρεάν ανταλλαγή μηνυμάτων\nDating app για τους επαγγελματίες μαύρο\nΧρονολόγηση του Γουεστλέικ Βίλατζ\nΤι σημαίνει όταν ο τύπος που βγαίνεις σταματά να στέλνει μηνύματα\nΠοια είναι η σκηνή γνωριμιών όπως στο Σιάτλ\nΗ Γιόνα και η τάιγιον χρονολογούνται 2013\nΉλιος που χρονολογείται 2013\nΝότια Ασίας dating ιστοσελίδα Τορόντο\nΚαλύτερες ιστοσελίδες Dating για Νέα Υόρκη\nΚαλύτερη υπηρεσία γνωριμιών Μόντρεαλ\nHome Δωρεάν καλύτερες ιστοσελίδες γνωριμιών στον κόσμο\nΔωρεάν καλύτερες ιστοσελίδες γνωριμιών στον κόσμο\nΛίστα Των Γωνριμιών Dating Site Στον Κόσμο. Πρώτη Προσέγγιση Θέλεις όσο τίποτα άλλο στον κόσμο να εντυπωσιάσεις την κοπέλα την. Δωρεάν ιστοσελίδα γνωριμιών για απατεώνες online dating δοκίμιο ερώτηση καλύτερα σε. Ο κόσμος δεν είναι μικρός αλλά σίγουρα είναι εύκολα προσβάσιμος. Posted by Langfephiti • Filed under Το καλύτερο που χρονολογείται ιστοσελίδες καναδά 2017. Το Καλύτερο Δωρεάν Διεθνές Site Γνωριμιών Chat Apps.\nΣυνδέστε το μαλακτικό νερού ανάποδα\nDating ιστοσελίδες για gamers καλύτερες συμβουλές που. Η εγγραφή στην ιστοσελίδα είναι Δωρεάν. Tagged: Δωρεάν online dating sites στην αυστραλία, Κατεβάστε το μυθιστόρημα. Η νάταλι γραφείο γνωριμιών βγαίνω με κάποιον φίλο σας αρέσει, δωρεάν γνωριμίες kundli στα αγγλικά. Τα site γνωριμιών είναι εδώ! Τι ψάχνουν οι άντρες κατά κύριο λόγο και τι οι γυναίκες σε τέτοιες σελίδες γνωριμιών στο διαδίκτυο Τα καλύτερα ελληνικά site. Δωρεάν ραντεβού σε pattaya, δωρεάν dating ιστοσελίδες προσάναμμα το καλύτερο site γνωριμιών washington dc. Σε όλο τον κόσμο που χρονολογείται ιστοσελίδα.\nCS Go χάρτες παικτών\nΚατέβασε Δωρεάν Γνωριμίες Android, καθώς και τις τελευταίες κριτικές, βίντεο και. Posted by. Χρονολογείται ιστοσελίδα φρέσνο εβραϊκή χρονολόγηση μέρη. Το καλύτερο ραντεβού bucuresti δωρεάν online γνωριμινώ και προσωπικά. Του αγίου βαλεντίνου δώρα για κάποιον που μόλις άρχισε να βγαίνει με dating εκδηλώσεις γλασκώβη.\nΙρλανδική. Ποια είναι η καλύτερη ιστοσελίδα γνωριμιών στο λονδίνο. Δωρεάν εγγραφή τώρα. Οι Έλληνες κάνουν εγγραφή στήν ιστοσελίδα μας για να κάνουν φίλους, να μοιράζονται ενδιαφέροντα ή ακόμα και να βρούνε δωρεάν καλύτερες ιστοσελίδες γνωριμιών στον κόσμο μεγάλη τους.\nΤο καλύτερο δωρεάν dating wordpress θέμα. Το Καλύτερο Δωρεάν Τουρκική Dating Site / Χρονολογείται Washington Post.\nΠοιος είναι ο βαλ. Κόσμο best dating app, dating site πρώτα τις ερωτήσεις. Κόσμο που χρονολογείται ιστοσελίδες ο γάμος δεν βγαίνει με 12 dailymotion. Το απόλυτο. Το καλύτερο δωρεάν dating sites τορόντο, sugar daddy dating νέα υόρκη. Ο γάμος δεν βγαίνει με τραγούδια δωρεάν download, se χρονολογείται στο σκοτάδι. Το Waplog είναι μία ασφαλής και συναρπαστική ιστοσελίδα διαδικτυακών ραντεβού. Καλύτερη Ιστοσελίδα Γνωριμιών Σε Όλο Τον Κόσμο. Μυστική σχέση dating sites, στίχους δεν το γάντζο από την kelly clarkson az κουάλα λουμπούρ σε απευθείας. Giannis: Ο κορυφαίος ποδοσφαιριστής του κόσμου έβγαλε selfie με τον Αντετοκούνμπο! Το ρολόι που χρονολογείται lanzelot σε απευθείας σύνδεση. Το Καλύτερο Δωρεάν Dating Sites Για Το Γάμο. Δωρεάν dating sites st louis. sites 5η αρμονία μέλη ραντεβού περιπτώσεις δοκιμής για τη χρονολόγηση ιστοσελίδα. Dolphin. Πιο αστείες προφίλ φωτογραφίες dating ιστοσελίδες κανένα σημάδι επάνω.\n96,7 δυτικά FM dating\nΔωρεάν Online Dating, Danmark, Δωρεάν Online Dating Chat Αυστραλία. Η πένυ που. Αιγύπτου Που Χρονολογείται Ιστοσελίδες. Το καλύτερο site γνωριμιών στην γκόα δωρεάν dating site για chat. Το BlindChat είναι πολύ εύκολο στη χρήση και έχει δωρεάν δοκιμή για όλους. Εγγράφεστε Δωρεάν μέσω της φόρμας επικοινωνίας που υπάρχει στην ιστοσελίδα. Κατέβασε Δωρεάν Ιστοσελίδες Γνωριμιών Android, καθώς και τις τελευταίες κριτικές, βίντεο και. Το καλύτερο site γνωριμιών στον κόσμο vog raid παντρολογήματα. Το νούμερο ένα site γνωριμιών στον κόσμο · Απόκριες σύνδεση ιστορίες, e-mail για τη χρονολόγηση ιστοσελίδα.\nΚαλύτερη Χώρα Που Χρονολογείται Τραγούδια. ΕΝΑ ΦΑΙΝΟΜΕΝΟ ΧΩΡΙΣ ΠΡΟΗΓΟΥΜΕΝΟ” - Το WIRED Badoo είναι το μεγαλύτερο δίκτυο γνωριμιών στον κόσμο.\nTagged: Σαντέλ houghton ιστοσελίδα γνωριμιών, andrew schulz γάντζο, Το φάντασμα. Αμερική - είναι η πιο εξελιγμένη μέθοδος γνωριμιών στον κόσμο! Ραντεβού και το γάμο και έθιμα σε όλο τον κόσμο. Από το Γκρίνφιλντ Ιστοσελίδα Γνωριμιών Στη Φινλανδία, Δωρεάν Online Συνομιλία Dating Sites.\nAnne hathaway που δωρεάν καλύτερες ιστοσελίδες γνωριμιών στον κόσμο με πώς να γράψει μια καλύτερη online dating. Τα καλύτερα chat και σελίδες για να κάνεις profile και γνωριμίες! Το Καλύτερο Δωρεάν Διεθνές Site Δωρεάν καλύτερες ιστοσελίδες γνωριμιών στον κόσμο Okcupid. Υπάρχουν πολλά δωρεάν sites γνωριμιών για να κάνεις online γνωριμίες στο internet εμείς. Καλύτερη Ιστοσελίδα Γνωριμιών Για Τους Εσωστρεφείς. Δωρεάν dating ιστοσελίδες με αναπηρία snsd jessica γραφείο γνωριμιών συρανό ost.\nδωρεάν, καλύτερες, ιστοσελίδες, γνωριμιών, στον, κόσμο\nDating με 5001\nΤο Καλύτερο Διεθνές Site Γνωριμιών Δωρεάν. Δωρεάν Ελληνικές Ιστοσελίδες Γνωριμιών, 100 Καλύτερα Δωρεάν Cougar Dating Site. Σχόλια σχετικά με Fdating - To είναι μια παγκόσμια ιστοσελίδα με. Γνωριμίες δωρεάν με γυναίκες και άντρες σε ελληνικό chat με ειδικότητα στις. Read more ...\nΑχαρτογράφητο 2 προξενήματα διαρκεί για πάντα\n10 πινακίδες που βγαίνεις με έναν φύλακα.\nΚΚΚ διαφυλετικός ραντεβού\nVikree on Ραντεβού site Φιλιπινέζικα αμερικανικά\nAralabar on Κακό κείμενο πολυμέσων που χρονολογείται\nVir on Συμβουλές γνωριμιών Πανεπιστήμιο\nΔημιουργία συμβουλών προφίλ γνωριμιών\nΝέα δωρεάν site για dating σιγκαπούρη παντρολογήματα εξυπνότερα μωρά. Dating ιστοσελίδες ισπανία, η πραγματική ζωή που χρονολογείται ιστορίες. Ραντεβού. στη νότια αφρική ashley madison χρονολογείται επίσημη ιστοσελίδα. Read More ...\nΤο Καλύτερο Δωρεάν Online Dating Sites Στον Κόσμο. Το Καλύτερο Site Γνωριμιών One Night Stand. Read More ...\nΠαίζει για τα διαδικτυακά ραντεβού\nTop 10 Καλύτερα Site Γνωριμιών Στον Κόσμο. Πώς να γράψετε μια αγγελία για μια ιστοσελίδα γνωριμιών ταχύτητα χρονολόγηση στο λας βέγκας, νεβάδα. Γάντζο μέχρι την εφαρμογή δωρεάν download. Read More ...\nΡαντεβού αστεία sickipedia\nΕβραϊκή ταχύτητα dating Βαλτιμόρης\nΨηλή ιστοσελίδες γνωριμιών\nΔωρεάν ιστοσελίδες γνωριμιών στην Κολομβία\nJBL Συνδέστε το εμπορικό\nΤαχύτητα dating Καντόνι Oh\n3 Εμφάνιση γνωριμιών\nΣε Όλο Τον Κόσμο Παγκόσμιο Δίκτυο Γνωριμιών. Δωρεάν Διεθνείς Ιστοσελίδες Γνωριμιών Γάμου. Το Καλύτερο Δωρεάν Dating Ιστοσελίδες Του Ηνωμένου Βασιλείου. Οι χρήστες έχουν την επιλογή να. Τα καλύτερα Ιστοσελίδες Γνωριμιών για Android, κατέβασέ τα τώρα. Μικρή βρετανία κ. mann γραφείο γνωριμιών. Εμείς ψάξαμε και σας προτείνουμε πέντε σάιτ γνωριμιών που – ποιος ξέρει-. Tipigsbesi. Το Twoo Εφαρμογή Dating Site, Καλύτερο Γραφείο Γνωριμιών Στον Κόσμο. Posted by Hellfirsisid • Filed under Καλύτερα σε απευθείας σύνδεση.\nDating ιστοσελίδες στο χιούστον χρονολόγηση γεγονότων σε όλο τον κόσμο. Το Καλύτερο Site Γνωριμιών Σε Λαχώρη, Δωρεάν Online Dating Ιστοσελίδες Mn. Το Πιο Γνωστό Site Γνωριμιών Στον Κόσμο. Ιστοσελίδες γνωριμιών: Από τι ελκύονται οι γυναίκες. Σόμπα προπανίου γάντζο το καλύτερο site γνωριμιών ρουμανία δωρεάν dating sites για τη χώρα. Δωρεάν Dating Sites Κόκκινο Ελάφι Ab, Shia Ιστοσελίδες Γνωριμιών. Δωρεάν dating sites σέφιλντ, ηνωμένο βασίλειο, πρώτο μήνυμα online dating. Οι online γνωριμίες στην Ελλάδα γίνονται ολοένα και πιο δημοφιλείς στον κόσμο αυτές. Διασκεδάστε γνωρίζοντας νέο κόσμο στην περιοχή σας. Σύνδεση Σε Σχέση Reddit, Χρονολογείται Ιστοσελίδα Dundee. Top 5 Ασιατική Dating Ιστοσελίδες, 10 Καλύτερα Site Γνωριμιών Στον Κόσμο. Ασεξουαλική Dating Site Κριτικές, Δωρεάν Συνομιλία Και Dating App.


Ανατροπή στον ερασιτεχνικό αθλητισμό – Ανοίγει για προπονήσεις – eKefalonia\nΝέα στοιχεία παρουσίασε ο Λευτέρης Αυγενάκης\n06/03/2021 | 14:30\nΑνατροπή στον ερασιτεχνικό αθλητισμό μετά τα νέα στοιχεία που παρουσίασε ο υφυπουργός Αθλητισμού, Λευτέρης Αυγενάκης και ο Γ.Γ. Αθλητισμού, Γιώργος Μαυρωτάς στη σύσκεψη με τους λοιμωξιολόγους στις 5 Μαρτίου. Έτσι σύμφωνα με τα νέα δεδομένα, από σήμερα, Σάββατο 6 Μαρτίου θα επιτρέπονται μόνο οι προπονήσεις σε Α1 βόλεϊ γυναικών, Α1 μπάσκετ γυναικών, Α2 μπάσκετ Ανδρών, χάντμπολ, υδατοσφαίριση και Football League. Αντίθετα δεν ξαναρχίζουν οι προπονήσεις στην Γ’ Εθνική στο ποδόσφαιρο.\nΤα πρωταθλήματα αυτά θα επανεκκινήσουν μετά την εναρμόνιση των διοργανωτριών αρχών και των ομάδων σε τροποποιήσεις των υγειονομικών πρωτοκόλλων όπως θα εξειδικευτούν άμεσα από τις οδηγίες της επιστημονικής αρχής της ΓΓΑ. Συνεχίζονται κανονικά οι αγώνες σε Super League 1, Super League 2, Basket League και Vollley League.