Léto, Zima, Červenec | Artplus.cz\nLéto, Zima, Červenec\nAdolf Loos Apartment and Gallery 28. 4. 2019\nText Skřivánek Jan Date 25.04.2019\nJednou z milionových položek nedělní aukce společnosti Adolf Loos Apartment and Gallery je akvarel Jindřicha Štyrského Červenec. V rozmezí dvanácti měsíců jde už o třetí Štyrského akvarel z přelomu 20. a 30. let. Dvě loni dražené práce se prodaly za 1,56 milionu a 1,86 milionu korun.\nJindřich Štyrský: Červenec, 1930, akvarel na papíře, 29,5 x 38,8 cm,\nvyvolávací cena: 1 500 000 Kč (+ 21% provize), Adolf Loos Apartment and Gallery 28. 4. 2019\nJedná se o jednu z prací z cyklu Měsíce, který Jindřich Štyrský poprvé představil spolu s několika dalšími kresebnými soubory na společné výstavě s Toyen v březnu 1930 v Aventinské mansardě. Karel Srp tyto akvarely a kresby považuje z přelomová díla na pomezí mezi artificialismem a surrealismem. "Tyto práce zřetelně ukázaly nápadný posun v autorově díle. Jejich význam pak ještě umocnil následující vývoj, neboť Štyrský z nich výrazně čerpal na začátku 30. let v početné skupině obrazů," píše Srp v malířově monografii z roku 2007 a dodává: "Je pravděpodobné, že v cyklu dvanácti akvarelů Měsíce (1929–30) zkoušel Štyrský uzpůsobit svou 'třetí cestu', artificialismu, novým potřebám odpovídajícím změněnému životnímu pocitu."\nCyklus dnes nejde v plném rozsahu rekonstruovat, podle Srpa je problém i v různém značení dobových reprodukcí ("akvarel označený v monografii z roku 1938 jako Červen byl v katalogu výstavy ve Vaňkově galerii v Brně v roku 1932 otištěn jako Březen"). "Přesto je možné podle zachovaných prací určit formální a obsahové rozpětí celého souboru, v němž jsou do vzdušného prostoru, vytvořeného stříkanou barvou, vsazeny rozmanité samostatné prvky. (…) Červenec dokonce již obsahuje zřetelně sexuální symboly, které Štyrský se vší pádností zopakoval roku 1934 v surrealistickém obraze Muž a žena," konstatuje Karel Srp.\nJindřich Štyrský: Zima, 1933, akvarel na papíře, 24,8 x 35 cm,\ncena: 1 860 000 Kč, European Arts 8. 11. 2018\nText do katalogu zmíněné výstavy v Aventinské mansardě napsal Vítězslav Nezval. Cyklus Měsíce přirovnává k nové květeně a varuje před hledáním přímé vazby mezi obrazem a konkrétním měsícem: "Jsa přímým nástrojem přírody, stal se prostředníkem nové květeny, pro kterou země před ním nenašla nového klimatu. Jindřich Štyrský je prvním divákem této květeny. Snaží-li se nám ji přiblížiti, nazývaje své akvarely jménem měsíců, je to patrně velmi ohleduplná galantnost, ale čím je smysl měsíců vzhledem k těmto obrazům? Je to plastické slovo pro počet dvanáct."\nNyní nabízený akvarel Červenec je v Srpově monografii reprodukován na str. 180 s poznámkou "soukromá sbírka v Paříži". Aukční katalog Adolf Loos Apartment and Gallery nyní doplňuje, že dílo původně patřilo Toyen a na trh dostalo až v souvislosti s rozprodejem její pozůstalosti v roce 1982. Akvarel malířka dostala od Štyrského darem, jak prozrazuje umělcův vlastnoruční přípis v pravém dolním rohu: "Toyen, Jindřich Štyrský září 1930"\nJindřich Štyrský: Srdeční krajinka, 1933, akvarel na papíře, 28,5 x 41 cm,\ncena: 1 560 000 Kč, Galerie Kodl 27. 5. 2018\nVyvolávací cena je stanovena na 1,5 milionu korun (+ 21% provize), což odpovídá ceně, za kterou byl v listopadu na aukci společnosti European Arts vydražen o něco menší akvarel Zima ze sbírky architekta Víta Obrtela. V tomto případě nicméně nešlo o práci z cyklu Měsíce, ale z o tři roky mladšího souboru ročních dob. Ten Štyrský vytvořil v několika variantách, jeden celý soubor je i ve sbírce Národní galerie.\nLoni v květnu Galerie Kodl za 1,56 milionu korun vydražila akvarel Srdeční krajinka, který je jednou z variant Léta. Akvarel pocházel ze sbírky malířova lékaře, jak prozrazuje umělcova dedikace: "Panu docentovi Dr. J. Brumlíkovi nakreslil tuto Srdeční krajinku jako upomínku na vánoce 1933 jeho vděčný pacient Jindřich Štyrský 24. 12. 1933."\nJindřich Štyrský: varianta Léta, 1933, akvarel na papíře, 24 x 35 cm,\ncena: 531 000 Kč, 1. Art Consulting 28. 4. 2010\nJiná varianta Léta prošla trhem již v roce 2010. Na aukci společnosti 1. Art Consulting se prodala po dvou příhozech za 531 tisíc korun. Aukce se shodou okolností konala ve stejný den, 28. dubna, jako nynější aukce Adolf Loos Apartment and Gallery. S jistým zjednodušením tak jde říct, že za devět let ceny Štyrského akvarelů vzrostly minimálně trojnásobně.\nZima podle Schikanedera\nK výstavě Adolf Loos Apartment and Gallery


Vyhlídky nejsou dobré. Pomeje si ale chce ještě užívat života | Sedmička.cz\n08.01.2019 11:30, Autor: - gab - |\nPoté, co se Jiřímu Pomeje (54) vrátila rakovina hrtanu a začala se šířit dál do těla, zaplatil mu jeho kamarád, producent Pavel Pásek (51), léčbu v soukromém sanatoriu na Pleši uprostřed brdských lesů. Herec se snaží nabrat sílu. Má ještě velké plány!\n"Dělá mi to tady dobře. Pomalu se zase dávám do formy. Dali mi činky, ať prý posiluju ruce. Připravuju se na nepřítele. Musím bejt silnej. Spokojenej ale budu, až zvednu stokilovky! Ke cvičení taky piju proteinový koktejly. Chci bejt fit, pojedu do Thajska," řekl Pomeje deníku Blesk.\nNa exotickou dovolenou by se chtěl vydat s kamarádem Páskem. "Myslím, že za dva měsíce by to už šlo. Budeme tam honit baby!" pokračoval Pomeje, který prý sršel dobrou náladou a na zákeřnou nemoc nemyslel, ačkoli jeho vyhlídky nejsou dobré.\n"Já o tom nechci vůbec přemýšlet. Neptám se, nechci nic vědět. Chci ještě chvilku žít a být se svou dcerou, kterou už k maturitě asi nedoprovodím. A to jsem moc chtěl. Ale dost už těhle blbejch keců..." uzavřel Pomeje.


Auta, ženy, zpěv aneb nový auto motor a sport Pro ženy v prodeji - Autohit\nAutohit > Novinky > Auta, ženy, zpěv aneb nový auto motor a sport Pro ženy v prodeji\nAuta, ženy, zpěv aneb nový auto motor a sport Pro ženy v prodeji\nLetí to! Právě jsme pro vás připravili jubilejní desáté vydání unikátního automobilového speciálu pro ženy za volantem. Ano, tak dlouho je auto motor a sport Pro ženy s vámi.\n„Žena by k autu měla přistupovat jako k muži. Pokud mu chce porozumět, měla by o něm vědět co nejvíc, nejlépe všechno,“ prohlásila prý kdysi slavná česká automobilová závodnice Eliška Junková. A je třeba říci, že žena, která dokázala ve třicátých letech své mužské protivníky porážet, věděla, o čem mluví.\nPsychologové říkají, že vztah dvou lidí je jako auto, vyžaduje pravidelnou údržbu a neustálou péči. A platí to i obráceně. Času není nikdy dost, ale udělat si ho na svůj automobil je vždy výhodné. Vyplatí se to.\nZ nedávných průzkumů vyplývá, že život bez auta si dovedou ženy představit hůř než muži. Kdo by to býval řekl? A co víc – třetina žen dává svým čtyřkolým miláčkům jména, a dokonce s nimi i „mluví“. Po běžné cestě do práce ty citlivější svého plechového partnera dokonce i pochválí. Není divu, společné zážitky vytvářejí silné pouto.\nA ještě jednu věc jedna z anket prozradila. Že si za volantem ženy stále více zpívají. A to je v dnešní hektické a vystresované době skvělá zpráva. Tak ať vám je do zpěvu i nadále. Třeba s právě vydaným speciálem auto motor a sportu.\nTagy: auto motor a sport, Pro ženy\nLetní auto motor a sport Pro ženy v prodeji od 28.4.


Parkety - drevene-podlahy-parkety.cz\nCo se vám jako první vybaví, když se řekne parkety? Zámecké pokoje a historické domy? Parkety ale rozhodně nepatří jen doby minulé. Své uplatnění díky svým vlastnostem i estetičnosti najdou i v moderních bytech a domech. Pokud se chcete o tomto typu podlahových krytin dozvědět více, směle se pusťte do čtení.\nPo stopách parket\nNejvětšího rozmachu se podlahy dočkaly v 19. století díky technickému pokroku, novým pilám a strojům. Z původních širokých dřevěných prken, která se začaly zužovat se staly i v dnešní době velice oblíbené parkety.\nParkety se pokládaly pomocí tenkých ocelových hřebíků a lepidel, časem se začalo s výrobou parket s drážkou a perem, aby podlahy lépe držely. Nejoblíbenějším vzorem konce 19. století a začátku 20. století se stal rybí vzor.\nŘemeslníci, kteří byli speciálně vyškoleni pro tvorbu parket, se nazývali parketáři. V padesátých letech se toto řemeslo objevovalo zcela běžně, protože byl o parkety veliký zájem. Jedním z důvodů byl jejich estetický vzhled a skutečnost, že byly parkety lehce udržovatelné. Parkety se tak staly jednou z nejoblíbenějších a ceněných podlahových krytin.\nŘekněte ANO parketám\nDůvodů, proč do své domácnosti zvolit parkety je opravdu nespočet, jednou z předností tohoto typu podlahové krytiny je vysoká životnost, s parketami získáte podlahu na celý život. Parkety nabízejí možnost mnohonásobné renovace i lokálních oprav, možnost změny vzhledu tónování i povrchové úpravy, variabilitu pokládky, snadnou údržbu podlahy i kvalitu, která je prověřena generacemi. Parkety také přináší tepelnou a zvukovou izolaci, své místo najdou v bytových i nebytových prostorech.\nÚdržba parket je velice jednoduchá, musí se ale dodržovat správný postup, aby vaše podlaha byla stále jako nová. Pro běžné čištění je na parkety vhodný prachový vysavač, pokud chcete podlahu vyčistit důkladně, použijte vlhký, ale dobře vyždímaný hadr. Dřevo by se nemělo dostat do kontaktu s větším množstvím vody.\nZhruba každých 6 měsíců byste měli použít poliš na zapečetěné podlahy nebo speciální olej pro olejové podlahy. Podlaha použitím speciálních přípravků získá oživený, zářivý vzhled a prodloužíte jí také životnost. Na parkety používejte pouze přípravky, které jsou na tento typ podlahové krytiny určené.


Drzak na grilovani kurat | Sleviste.cz\nDrzak na grilovani kurat\nFackelmann Stojan na grilování kuřat non-stick\nStojan na grilování kuřat je vyroben z uhlíkové oceli s teflonovým povlakem. Díky stojánku budete mít kuře dozlatova ugrilované ze všech stran a miska vám zachytí tu nejlepší šťávičku na polévání.\n- materiál: kov - průměr: 30 cm - dvě rukojeti - barva: černá Stojan je ideální pro grilovaní kuřat a další drůbeže bez ztráty štávy, která zůstane na dnu pánve. Střed stojanu lze naplnit například pivem nebo vínem, které se bude v průběhu grilovaní odpařovat a dodá tak masu lepší chuť.\nProGarden Stojan na grilování drůbeže KO-C80210490 najdte na Digiboss.cz. ProGarden Stojan na grilování drůbeže KO-C80210490 nabízíme i na splátky. Stojan je ideální pro grilovaní kuřat a další drůbeže bez ztráty štávy, která zůstane na dnu pánve. Střed stojanu lze naplnit například pivem nebo vínem, které se bude v průběhu grilovaní odpařovat a dodá tak masu lepší chuť. Specifikace: materiál: kovprůměr: 30 cmdvě rukojetibarva: černá. Poplatky : 0.000000...\nOUTDOORCHEF Držák víka (18.291.25)\nDržák Jak grilovat jednou rukou a druhou přidržovat víko od grilu? Vyzkoušejte OUTDOORCHEF Držák víka, protože u grilování se hodí mít volné obě ruce. U grilů, které nemají víko připojené kloubem je řešením odkládání víka na tento jednoduchý a funkční úchyt. Vlastnosi OUTDOORCHEF Držák víkavyroben z pochromované ocelibarva: stříbrnáRozměry:24,5 × 12,5 × 35,2 cmHmotnost:0,55 kg...\nXavax odkládací držák pro gril, výškově nastavitelný (60-72 cm), černý\n- praktický kompaktní držák pro různé příslušenství potřebné při grilování; - vhodný také jako přídavná odkládací plocha během grilování; - prodloužená tyč pro zavěšení utěrky; - košík na grilovací koření, mlýnek na sůl a koření, zapalovač apod.; - tyč s\nAdžika - Dobré koření směs\nAdžika je kavkazské, aromatické, ne příliš ostré koření, vhodné na dušená a pečená masa, grilování kuřat a do masových směsí.Složení: paprika, česnek, koriandr, kopr, sůl (max. 12 %), směs koření a zeleniny v proměnlivých hmotnostních podílech (bazalka, majoránka, máta, bobkový list, petržel, celer, saturejka), chilliTato série se vyznačuje mimořádnou kvalitou jednotlivých koření a velmi příznivou cenou v poměru k hmotnosti. Všechno k\nAdžika je kavkazské, aromatické, ne příliš ostré koření, vhodné na dušená a pečená masa, grilování kuřat a do masových směsí. Složení: paprika, kopr, koriandr, česnek, sůl 10 %, směs koření a zeleniny v proměnlivých hmotnostních podílechTato série se vyznačuje mimořádnou kvalitou jednotlivých koření a velmi příznivou cenou v poměru k hmotnosti. Všechno koření je bez glutamanu sodného....\nKoření Adžika 30g Adžika je kavkazské, aromatické, ne příliš ostré koření, vhodné na dušená a pečená masa, grilování kuřat a do masových směsí. Složení: paprika, česnek, koriandr, kopr, sůl (max. 12 %), směs koření a zeleniny v proměnlivých hmotnostních podílech (bazalka, majoránka, máta, bobkový list, petržel, celer, saturejka), chilli Série Dobré koření se vyznačuje mimořádnou kvalitou jednotlivých koření a velmi příznivou cenou v poměru k hmotnosti. Neobsahuje glutaman sodný. Balení: 30g...\nGrilovací pánev Carbone Plus Ø 26 - 30 cm Průměr: 30 cm, Výška: 4,5 cm\nOcelová pánev – nejlepší volba pro přípravu steaků. Maso se díky bleskovému rozvodu tepla zatáhne a udrží v sobě šťávu. Ta z Francie od de Buyer je držák. Špičkové provedení, robustní ocel a s narůstajícím počtem grilování se předvede v plné síle. Díky vroubkování můžete použít méně tuku, maso se vám nepřichytí a navíc se na něm vytvoří lákavá mřížka. V Kotlíku je máme s průměrem 26 a 30 cm.\nGrilovací pánev Carbone Plus Ø 26 - 30 cm Průměr: 26 cm, Výška: 4,3 cm\ndrzak na grilovani kurat  •  drzaky na grilovani kurat  •  sada na grilovani kurat  •  motorek na grilovani kurat  •  jehlice na grilovani kurat  •  stribrny privesek krizek s kristem  •  detske sandaly adidas  •  nike tenisky detske air force 1 mid bila  •  iphone se 64gb rose gold  •  nastenne hodiny kocka  •  drzak na grilovaci jehly a motorku  •  drzak na grilovaci motorek  •  drzak na grilovane kure  •  drzak na grilovani  •  drzak na grilovani drubeze  •  drzak na grilovani kurete  •  drzak na hadice  •  drzak na hadice 1 2 40m  •  drzak na hadice kaxl  •  drzak na hadice kxl  •\njehly na grilovani kurat  •  vidlice na grilovani kurat  •  souprava na grilovani kurat  •  stojan na grilovani kurat weber  •  stojanek na grilovani kurat  •


Bakterie ve vodách a jejich rozdělení - UV-Sterilight\n› Články › Bakterie ve vodách a jejich rozdělení\nBakterie ve vodách a jejich rozdělení\n1.1 Bakterie ve vodách a jejich rozdělení\nVoda je jedním z přirozených prostředí výskytu mikroorganismů, z nichž bakterie jsou považovány za nejvýznamnější a nejpočetnější skupinu. Nicméně rozdělení bakterií vyskytujících se ve vodním prostředí a jejich zařazení do taxonomických skupin je komplikované. Důvodem jsou především - nejasná definice taxonomických skupin, vysoká variabilita mezi členy jedné taxonomické skupiny a nejasný vztah mezi taxony a jejich ekologickou úlohou (Straškrabová a kol., 1996).\nV mikrobiologii vody se běžně využívá rozdělení bakterií podle následujících hledisek: tvaru (koky, tyčky), složení buněčné stěny (grampozitivní, gramnegativní), způsobu získávání živin (autotrofní, heterotrofní) a energie (chemotrofní, fototrofní), vztahu ke kyslíku (aerobní, fakultativně anaerobní, anaerobní, mikroaerofilní), původu v prostředí (autochtonní, alochtonní), jejich hygienického významu (patogenní, potenciálně patogenní, nepatogenní), indikačních schopností (indikátory fekálního znečištění, indikátory organického znečištění), schopnosti degradovat a transformovat chemické sloučeniny (bakterie degradující a transformující sloučeniny uhlíku, dusíku, síry apod. – fyziologické skupiny) či genetické a fylogenetické příbuznosti (fylogenetické skupiny).\nKlasické studium bakterií vodního prostředí spočívá v měření jejich aktivit (metabolický potenciál, úroveň chemické transformace, kinetická měření apod.), odhadu množství mikrobiální biomasy (pomocí stanovení množství organické hmoty, proteinů, ATP, lipidů apod.), mikroskopickém pozorování (zejména pomocí fluorescenční mikroskopie) a kultivačním stanovení (Brenner a kol., 2005a; Delahaye a kol., 2003).\nBěžné postupy používané k izolaci bakterií z vodního prostředí jsou založeny na kultivačních metodách. Ty mají nezastupitelnou úlohu zejména při mikrobiologickém rozboru pitných, povrchových a odpadních vod. Nicméně nejsou schopny postihnout rozmanité životní podmínky vodního prostředí a proto neumožňují detekci všech přítomných bakterií, ale jen asi 0,01–0,1 % (Straškrabová a kol., 1996). Použití těchto metod navíc komplikuje fakt, že některé bakterie, které lze jinak běžně vykultivovat, za stresových podmínek (hladovění, neoptimální teplota růstu, zvýšený osmotický tlak, nevhodné světelné podmínky apod.) omezují svoji metabolickou aktivitu a stávají se nekultivovatelnými (viable but nonculturable, VBNC); za příznivých podmínek jsou tyto bakterie schopné opět svoji metabolickou aktivitu obnovit. Tento stav byl zjištěn např. u bakterií podrobených chloraci odpadních vod (Oliver, 2005).\nNové přístupy studia bakterií ve vodním prostředí vycházejí z informací uložených přímo v genomu bakterií, který je odlišný od genomu eukaryotických organismů. Bakteriální genom se skládá z jádra a plazmidů. Prokaryotické jádro (nukleoid) je obvykle tvořeno jednou kružnicovou molekulou dvouřetězcové DNA (dsDNA), na které jsou umístěny všechny pro život nepostradatelné geny. Jádro není ohraničeno od cytoplazmy jadernou membránou a nedělí se mitoticky. Kromě jádra mohou prokaryotické buňky obsahovat i plazmidy, malé kružnicové molekuly dsDNA, nesoucí geny, které nejsou pro život nezbytné, ale mohou být důležité (např. geny rezistence k antibiotikům) (Rosypal,\n2 1998). Metody molekulární biologie, které v současné době nacházejí uplatnění v mikrobiologii vody, vycházejí především z primární struktury jaderné DNA a ribozomální RNA (16S rRNA). Jde např. o polymerázovou řetězovou reakci (PCR) a fluorescenční in situ hybridizaci (FISH) (Daubner a kol., 1967; Häusler, 1995; Štěpánek a kol., 1979; Amann a kol., 1997; Brenner a kol., 2005a).\nV této práci byla největší pozornost věnována skupině indikátorových a hygienicky významných bakterií a možnostem jejich izolace a identifikace z vodního prostředí.\n1.1.1 Indikátorové bakterie\nPři rutinním mikrobiologickém rozboru vod není možné stanovovat všechny potenciálně přítomné patogeny, proto byla zavedena koncepce indikátorových organismů, jejichž výskyt ve vodách je odrazem mikrobiologické kvality vod (Tortorello, 2003; WHO, 2004; Štěpánek a kol., 1979; Häusler, 1995). Existují 2 skupiny běžně stanovovaných indikátorů: indikátory organického (obecného) znečištění a indikátory fekálního znečištění.\n1.1.1.1 Indikátory organického znečištění\nJedná se o uměle vytvořenou skupinu organotrofních mikroorganismů, zahrnující bakterie, kvasinky a plísně, které jsou schopné růst při definované teplotě na obohacených neselektivních médiích bez inhibičního účinku selektivních činidel. Vzhledem k tomu, že nelze zajistit vhodné kultivační podmínky pro všechny přítomné mikroorganismy, lze detekovat pouze jejich malý podíl. Z hygienického hlediska se jedná o skupinu méně významnou, kde jsou zahrnuty zejména autochtonní vodní mikroorganismy a mikroorganismy pocházející z půdy a kořenových systémů rostlin. Průkaz těchto mikroorganismů ve vodách je odrazem celkového mikrobiálního oživení, jejich množství je známkou míry znečištění vodního zdroje snadno rozložitelnými organickými látkami. Stanovení životaschopných mikroorganismů je účelné i z hlediska posouzení účinnosti procesů úpravy vody. Do této skupiny se zařazují mikroorganismy s růstovým optimem kolem 20 a 37 °C schopné růstu na definovaných neselektivních médiích (Häusler, 1995; Bartram a kol., 2003; Maier a kol., 2000). V cizojazyčné literatuře bývají označeny jako HPC (heterotrophic plate counts). Nejčastěji se jedná o zástupce rodu Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Flavobacterium a zástupce enterobakterií a vibrií (Baudišová, 2007).\nPodle české legislativy jsou do této skupiny zařazeny:\nPsychrofilní bakterie - jedná se o organotrofní bakterie s růstovým optimem kolem 20 °C, které vytvářejí kolonie na neselektivním živném médiu (masopeptonový agar) po 72 h inkubace (ČSN 75 7842). Jejich stanovení bylo v ČR standardně vyžadováno pro pitné a koupací vody do roku 2004, v současné době není českou legislativou vyžadováno\nv žádném typu vod.\nMezofilní bakterie - jsou organotrofní bakterie, které mají optimum růstu na definovaném neselektivním živném médiu 37 °C a tvoří kolonie po 48 h (ČSN 75 7841). Jejich stanovení bylo rovněž standardně vyžadováno pro pitné a koupací vody do roku 2004, v současné době nejsou stanovovány v žádném typu vod.\nKultivovatelné mikroorganismy (stanovované při 22 °C a 36 °C) - do této skupiny se řadí bakterie, kvasinky a plísně, které se množí nejlépe při teplotě 22±2 °C a 36±2 °C. Na definovaném kultivačním médiu (tryptonový agar s kvasničným extraktem) tvoří kolonie po 72 h, respektive po 48 h (Häusler, 1995; ČSN EN ISO 6222). Jejich detekce je vyžadována pro stanovení jakosti pitných vod (Vyhl. 252/2004 Sb., 187/2005 Sb., 293/2006 Sb.), balených vod (Vyhl. 275/2004 Sb.) a koupališť (Vyhl. 135/2004 Sb., 292/2006 Sb.).\n1.1.1.2 Indikátory fekálního znečištění\nOrganismy, používané jako fekální indikátory by měly splňovat následující požadavky: nebýt patogenní, být přítomny ve vysokém počtu v exkrementech teplokrevných živočichů, nemnožit se ve vodě, být snadno stanovitelné, přetrvávat ve vodě minimálně stejně dlouhou dobu jako patogeny a být rezistentní k dezinfekčním činidlům a vlivům okolního prostředí podobně jako střevní patogeny (WHO, 2004; Tortorello, 2003). Mezi indikátory fekálního znečištění se řadí bakterie, jejichž přítomnost ve vodě může indikovat kontaminaci střevními patogeny, jako jsou např. salmonely, shigely, patogenní sérovary Escherichia coli, kampylobaktery apod. (Häusler, 1995). Za nejvhodnější bakteriální indikátory fekálního znečištění jsou považovány E. coli, termotolerantní koliformní bakterie a intestinální enterokoky, ačkoli žádný z nich nesplňuje zcela zmíněná kritéria pro fekální indikátory. Mezi další používané fekální indikátory patří koliformní bakterie a Clostridium perfringens, které jsou používány především jako indikátory účinnosti dezinfekčních procesů při úpravě pitné vody (Payment a kol., 1993).\nVhodnost a spolehlivost používání fekálních indikátorů je dlouhodobě předmětem odborných diskusí. Noble (2003) zjistil, že stanovení počtu intestinálních enterokoků při testování kvality mořské vody pro rekreaci by mohlo vést k častějším omezením a uzavírkám rekreačních oblastí, jelikož počty intestinálních enterokoků přesahovaly hygienické limity mnohem častěji než počty koliformních a termotolerantních koliformních bakterií. V pitné vodě studoval bakteriální indikátory Collin a kol. (1988), který uvedl, že nejvhodnějším indikátorem pro pitné vody jsou intestinální enterokoky. Atherholt a kol. (2003) hodnotil použití fekálních indikátorů v podzemních vodách a zjistil, že nejspolehlivějším indikátorem fekálního kontaminace podzemních vod jsou koliformní bakterie. Vzhledem ke skutečnosti, že ne všechny koliformní bakterie jsou fekálního původu, navrhnul připojit stanovení termotolerantních koliformních bakterií, E. coli nebo intestinálních enterokoků. Stuart a kol. (1976) ve své studii popsal nízký výskyt bakteriálních indikátorů ve vysokohorských vodách, které indikovaly výskyt přirozených populací hlodavců a losů v dané oblasti.\nPodle české legislativy jsou mezi fekální indikátory zařazeny:\nKoliformní bakterie - gramnegativní tyčky, které netvoří spóry, mají negativní cytochromoxidázový test a za aerobních podmínek tvoří kolonie během 24 h kultivace při 36±2 °C na selektivním diferenciačním médiu s laktózou za současné tvorby kyselin nebo aldehydu (TNV 75 7837). Definice koliformních bakterií podle ČSN EN ISO 9308–1 je velmi podobná. Za koliformní bakterie byli původně považováni pouze příslušníci rodu Escherichia, Citrobacter, Klebsiella a Enterobacter, ale ukázalo se, že tato skupina je mnohem více heterogenní a zahrnuje i další bakteriální rody, např. Serratia, Hafnia či Rahnella. Je to způsobeno změnami v definicích koliformních bakterií. Do roku 1994 byli za koliformní bakterie považováni zástupci čeledi Enterobacteriaceae, kteří produkují kyselinu a plyn z laktózy během 24–48 hod při 37 °C. Od roku 1994 jsou koliformní bakterie definovány jako gramnegativní bakterie s negativním cytochromoxidázovým testem, které tvoří kyselinu z laktózy během 24–48 hod při 37 °C. V poslední době se uvažuje o další změně definice koliformních bakterií na základě přítomnosti enzymu b-Dgalaktosidázy (Stevens, 2003). Nové metody používané ke stanovení koliformních bakterií založené na stanovení aktivity b-D-galaktosidázy (ONPG test), prvního enzymu účastnícího se štěpení laktózy, mají za následek vznik skupiny koliformních bakterií, která je ovšem mnohem širší než v případě sledování konečných produktů utilizace laktózy. Kmeny fermentující laktózu na kyselinu, příp. plyn musí mít enzym b-D-galaktosidázu, kdežto kmeny s aktivní b-D-galaktosidázou (ONPG pozitivní) nemusí fermentovat laktózu na konečné produkty (Baudišová, 2007). Skupina koliformních bakterií navíc obsahuje jak druhy fekální tak environmentální (Serratia fonticola, Rahnella aquatilis, Buttiauxella agrestis apod.), což poněkud zpochybňuje její použití jako indikátoru fekálního znečištění (Häusler, 1995; WHO, 2004; Veger a kol., 1996; Tortorello, 2003). Používá se ale stále jako indikátor účinnosti úpravy pitné vody v distribuční síti (McFeters a kol., 1986). Stanovení je nadále vyžadováno pro povrchové vody (Nařízení vlády [NV] 229/2007), pro pitné vody (Vyhl. 252/2004 Sb., 187/2005 Sb., 293/2006 Sb.), balené vody (Vyhl. 275/2004 Sb.) i koupaliště (Vyhl. 135/2004 Sb., 292/2006 Sb.).\nTermotolerantní (fekální) koliformní bakterie - jde o gramnegativní tyčky netvořící spóry, s negativním cytochromoxidázovým testem, které tvoří za aerobních podmínek kolonie během 24 h kultivace při 44 °C na selektivním diferenciačním médiu s laktózou za současné tvorby kyselin nebo aldehydu (TNV 75 7835). Bylo zjištěno, že původem těchto mikroorganismů nemusí být vždy trávicí trakt, ale např. průmyslové vody, rozkládající se rostlinný materiál, půda apod. Z této skupiny převládají ve vodách bakterie rodu Escherichia, Citrobacter, Klebsiella a Enterobacter. Termotolerantní koliformní bakterie se používají pro zhodnocení kvality pitné vody a jako indikátor účinnosti dezinfekce\n(WHO, 2004; Häusler, 1995; Cloete a kol., 2004). Jejich stanovení je českou legislativou vyžadováno v povrchových vodách (NV 229/2007, normou ČSN 75 7221/98) a koupalištích (Vyhl. 135/2004 Sb., 292/2006 Sb.).\nEscherichia coli - podle normy ČSN EN ISO 9308–1 jsou bakterie rodu E. coli definovány jako koliformní bakterie, které produkují indol z tryptofanu. Norma TNV 75 7835 je popisuje jako termotolerantní koliformní bakterie, které mají schopnost hydrolyzovat specifickým enzymem b-D-glukuronidázou 4-methyl-umbelliferyl-b-D-glukuronid (MUG) za vzniku 4-methyl-umbelliferonu; ten vykazuje modrou fluorescenci v UV světle (WHO, 2004; Tortorello, 2003; Veger a kol., 1996; Häusler, 1995; Cloete a kol., 2004). E. coli je považována za nejvhodnější indikátor čerstvého fekálního znečištění, a to i přesto, že bylo prokázáno, že se může pomnožovat ve vodě a v tropických půdách (Solo-Gabriele a kol., 2000; Desmarais a kol., 2002). Její stanovení je českou legislativou vyžadováno v v povrchových vodách (NV 229/2007), pitných vodách (Vyhl. 252/2004 Sb., 187/2005 Sb., 293/2006 Sb.), balených vodách (Vyhl. 275/2004 Sb.) a koupalištích (Vyhl. 135/2004 Sb., 292/2006 Sb.).\nIntestinální enterokoky - jsou bakterie, které mají schopnost redukovat 2,3,5- trifenyltetrazoliumchlorid na formazan a hydrolyzovat eskulin při 44 °C na definovaných médiích (ČSN EN ISO 7899–2). Jedná se o grampozitivní fakultativně anaerobní koky s negativní katalázou, které rostou i při zvýšené teplotě (45 °C), zvýšené koncentraci solí (6,5 %) a žluči (40 %) a vysokém pH (9,6) (Maier a kol., 2000). Jsou odolnější vůči vysušení a dezinfekci, ale ve vodách jsou citlivější vůči vlivům okolního prostředí než koliformy a málokdy se zde pomnožují (Tree a kol., 2003; Baudišová, 2007). Intestinální enterokoky se obdobně jako E. coli používají k indikaci čerstvého fekálního znečištění a indikaci nedostatečné dezinfekce pitné vody (Cloete a kol., 2004; WHO, 2004; Häusler, 1995; Štěpánek a kol., 1979). Jejich stanovení je českou legislativou vyžadováno v povrchových vodách (NV 229/2007, normou ČSN 75 7221/98), pitných vodách (Vyhl. 252/2004 Sb., 187/2005 Sb., 293/2006 Sb.), balených vodách (Vyhl. 275/2004 Sb.) a koupalištích (Vyhl. 135/2004 Sb., 292/2006 Sb.). Udává se, že poměr počtů termotolerantních koliformních bakterií a enterokoků odráží původ fekálního znečištění (Baudišová, 2007).\nClostridium perfringens - klostridia jsou grampozitivní, anaerobní, sporulující, siřičitany redukující bakterie, běžně se vyskytující v trávicím traktu teplokrevných živočichů. Lze je také nalézt v půdě či odpadní vodě. Díky extrémně dlouhému přežívání spór v prostředí, které je výrazně delší než přežívání střevních patogenů, se od rutinního stanovení ve vodách upouští (WHO, 2004; Häusler, 1995; Cloete a kol., 2004). Průkaz klostridií bývá považován za indikaci možného výskytu parazitických prvoků a střevních virů. Stanovují se na základě požadavku vyhlášek pro pitnou vodu (Vyhl. 252/2004 Sb., 187/2005 Sb., 293/2006 Sb.).\n1.1.2 Hygienicky významné bakterie ve vodách\nVe vodách se kromě autochtonních a saprofytických bakterií splavených ze svrchních vrstev půdy mohou vyskytovat i bakterie potenciálně patogenní a patogenní (Macler a kol., 2000; Mendoza a kol., 2004; Bifulco a kol., 1989; Lamka a kol., 1980).\nPrvní a z hygienického hlediska nejvýznamnější skupinou jsou patogenní bakterie pocházející z trávicího traktu člověka a teplokrevných živočichů. Jedná se především o zástupce čeledi Enterobacteriaceae (salmonely, shigely, patogenní sérovary E. coli aj.). Ty mohou snadno kontaminovat vodní zdroje, přežívat zde až několik měsíců, šířit se a sloužit tak jako potenciální zdroj nákazy pro člověka i zvířata. Fekální znečištění vod pochází především z komunálních odpadů (žumpy, septiky, městské kanalizace), odpadů ze zemědělství (kejda, hnůj) či potravinářského průmyslu (jatky), které nejsou dostatečně ošetřeny a zabezpečeny proti průniku do povrchových i podzemních vod. Největší rizika jsou spojena s kontaminací zdrojů pitných vod a povrchových zdrojů využívaných pro rekreaci. Výskyt nejčastějších patogenů v hnoji popsala Pell (1997). Hrudey a kol. (2003) sledoval kontaminaci pitné vody E. coli v Ontariu, která byla způsobena splavením kontaminovaného dobytčího hnoje do komunálního zdroje pitné vody. Dále uvedl i několik dalších případů epidemií, jejichž příčinou byla střevními patogeny kontaminovaná pitná voda. Solomon a kol. (2002) naznačil možný přenos E. coli O157:H7 z kontaminované půdy nebo závlahové vody na listy salátu transportem patogenů kořenovým systémem. Islam a kol. (2004) testoval přežívání salmonel v půdě a na zelenině. Bylo dokumentováno, že salmonely přežívaly v půdě po dobu několika měsíců a byly detekovány i na zelenině rostoucí v takto kontaminované půdě. Výskyt E. coli O157:H7 u býků od odstavení až do porážky na jatkách (asi v 16. měsíci věku) sledovala Lahti a kol. (2003). E. coli O157:H7 byla detekována v 16 % vzorků výkalů. Omisakin a kol. (2003) nalezl ve fekáliích u 7,5 % kusů dobytka určeného na porážku patogenní E. coli O157:H7. Přežívání střevních patogenů prasat a skotu (Escherichia coli O157:H7, Salmonella, Campylobacter, Yersinia, Cryptosporidium, Giardia) ve výkalech, půdě a vodě a jejich možný přenos na člověka popsal ve své práci Guan a kol. (2003). Zjistil, že ve výkalech nejdéle přetrvává E. coli O157:H7, a to při teplotě kolem 8 °C; podobná byla situace i s přežíváním ve vodě a půdě. U ostatních patogenů se také prokázala schopnost dlouho přetrvávat v uvedených prostředích. Přežívání patogenní E. coli O157:H7 v sedimentech vodního žlabu zkoumal LeJeune a kol. (2001). Prokázal, že studovaný kmen E. coli zůstává virulentní pro telata i po 6 měsících.\nDruhou skupinu tvoří gramnegativní nefermentující bakterie, které se běžně nalézají ve vodním prostředí (např. Pseudomonas, Legionella), ale mohou se chovat jako potenciální patogeny, zejména u osob s oslabeným imunitním systémem, jako jsou děti, staří lidé, nemocní a imunosuprimovaní jedinci. Barbeau a kol. (1998) popsal význam sladkovodních bakterií při vzniku oportunních a nozokomiálních infekcí ze zubařských nástrojů. Van Asperen a kol. (1995) zjistil, že bakterie Pseudomonas aeruginosa byla původcem zánětu vnějšího ucha po plavání ve sladkovodním jezeře. Ve vířivkách našel P. aeruginosa Price a kol. (1988). Ratnam a kol. (1986) shrnul poznatky o 13 případech folikulitid, které byly vyvolány přítomností P. aeruginosa ve vířivkách. Nejnovější informace o legionelách, jejich výskytu, patogenezi, diagnostice i epidemiologii shromáždili Atlas (1999), Fields a kol. (2002) a Cloete a kol. (2004).\nTřetí skupinou je skupina grampozitivních koků s nejznámějším zástupcem Staphylococcus aureus, jenž je původcem většiny pyogenních infekcí. Proto se jeho výskyt sleduje ve vodách určených k rekreaci a relaxaci (bazény, koupaliště, sauny), kde dochází ke styku celého povrchu kůže s vodou (Štěpánek a kol., 1979; WHO, 2004; Freiman a kol., 2004).\nDalší skupinou hygienicky významných bakterií, které je potřeba věnovat pozornost, je skupina potenciálně patogenních atypických (=oportunních, podmíněně patogenních, netuberkulózních, environmentálních) mykobakterií (M. kansasii, M. avium komplex, M. xenopi, M. chelonae apod.), pro které je voda jedním z přirozených prostředí výskytu. Mykobakteria lze nalézt v pitné, povrchové i odpadní vodě, byla izolována i ze vzorků vod z bazénů, koupališť a koupelí. Byl popsán jejich výskyt v biofilmech a spojení s volně žijícími amébami (Vaerewijck a kol., 2005). Výskyt potenciálně patogenních mykobakterií ve vzorcích povrchových, odpadních a koupacích vod, lesní, orné půdy, půdy\nluk a pastvin, prachu, ovoce a zeleniny, obilí a jeho produktů, trusu zvířat, sena a slámy, trávy, siláže, pilin a hoblin shromáždila ve své práci popisuje Horváthová a kol. (1997). Vaerewijck a kol. (2005) shrnul dostupné informace o výskytu mykobakterií v distribučních systémech pitné vody. Uvádí, že z cca 100 popsaných druhů mykobakterií bylo z pitné vody izolováno více než 30 %, obecně se ovšem předpokládá výskyt mnohem vyšší. Falkinham III a kol. (2001) se zabýval vyhodnocením faktorů ovlivňujících počet bakterií M. intracellulare a M. avium v distribuční síti pitné vody. Zjistil, že přítomnost M. intracellulare je spojena s výskytem biofilmu a přítomnost M. avium se snadno rozložitelnými organickými uhlíkatými sloučeninami. Lumb a kol. (2004) našel spojení mezi výskytem plicních onemocnění a lázeňskými bazény. Dailloux a kol. (2003) sledoval M. xenopi a biofilmy v pitné vodě.\nZ širokého spektra výše popsaných hygienicky významných bakterií vyskytujících se ve vodách budou dále blíže popsáni nejvýznamnější zástupci s častým výskytem v našich povrchových vodách.\n1.1.2.1 Escherichia coli\nEscherichie jsou gramnegativní fakultativně anaerobní rovné tyčky čeledi Enterobacteriaceae, optimálně rostoucí při 37 °C. Pro E. coli je charakteristická fermentace řady cukrů, např. laktózy za tvorby kyselin a plynu, produkce indolu z tryptofanu a neschopnost tvorby sirovodíku. Metabolicky inaktivní kmeny E. coli jsou zaměnitelné se shigelami. Patogenní sérovar E. coli O157:H7 většinou nefermentuje sorbitol (Brenner a kol., 2005b).\nE. coli je součástí běžné mikroflóry střev lidí a jiných teplokrevných živočichů, a proto je používána jako indikátor fekální kontaminace vod. Jako potenciální patogen může být původcem infekcí močových cest, průjmových onemocnění, bakteriémií a meningitid.\nPodle virulentních faktorů se rozdělují kmeny E. coli způsobující průjmová onemocnění do několika skupin na kmeny: enteropatogenní (EPEC), enterotoxinogenní (ETEC), enteroinvazivní (EIEC), enteroagregativní (EAEC) a enterohemoragické (EHEC) (Nataro a kol., 1998). Z EHEC je nejvýznamnější sérovar O157:H7, jenž je původcem hemoragické kolitidy a hemolyticko-uremického syndromu (akutní selhání ledvin, hemolytická anémie a trombocytopenie). Za patogenitu těchto kmenů je zodpovědná produkce shiga-like toxinů (verotoxinů), které jsou podobné toxinům shigelovým. Ty inhibují proteosyntézu střevních buněk depurinací adeninu v 28S rRNA, způsobují jejich odumírání a uvolňování vody do lumen střeva (Cloete a kol., 2004; Greenwood a kol., 1999; Paton a Paton, 1998a; Brenner a kol., 2005b).\nZdrojem EHEC jsou především výkaly skotu a ovcí, méně pak prasat, koz a kuřat. Infekce se přenáší kontaminovanými potravinami (maso, zelenina, džusy), vodou, kontaktem s nemocnými lidmi a zvířaty (WHO, 2004; Cotruvo a kol., 2004). Rozsáhlá epidemie vyvolaná E. coli O157:H7 z pitné vody kontaminované výkaly byla zaznamenána v roce 2001 v Kanadě v Ontariu, kde onemocnělo přes 2 300 obyvatel a 7 zemřelo (Hrudey a kol., 2003).\n1.1.2.2 Salmonella sp.\nJde o pohyblivé (kromě Salmonella sérovar Gallinarum) gramnegativní fakultativně anaerobní tyčkovité bakterie čeledi Enterobacteriaceae, které rostou při teplotě od 7 do 48 °C, při pH 4–8. Mohou se ale množit i při teplotě nižší než 4 °C a extrémním pH (Cotruvo a kol., 2004). Jejich charakteristickou vlastností je produkce sirovodíku, neschopnost fermentace laktózy, fermentace glukózy, maltózy a manitolu. Na základě jejich antigenní struktury (somatického O-antigenu, kapsulárního Vi-antigenu a bičíkového H-antigenu) jsou rozděleny do více než 2 000 sérovarů (Kauffmann-Whiteova klasifikace). Všechny sérovary jsou zařazeny do 2 druhů – Salmonella enterica a Salmonella bongori (Brenner a kol., 2005b).\nSalmonely jsou patogeny v přírodě velmi rozšířené, vyskytují se ve střevech obratlovců, ale i hmyzu a klíšťat. Některé salmonely (S. Typhi, S. Paratyphi) mají úzké hostitelské spektrum a vyvolávají onemocnění pouze u několika druhů živočichů. Naproti tomu např. Salmonella Typhimurium se vyznačuje širokou hostitelskou specifičností a postihuje nejen člověka, ale i drůbež, prasata, krávy, ovce a plazy (Cotruvo a kol., 2004; WHO, 2004).\nSalmonelové infekce probíhají pod obrazem čtyř hlavních klinických projevů: jako gastroenteritida a alimentární intoxikace, bakteriémie nebo septikémie, tyfus a paratyfus a asymptomatické nosičství. Gastroenteritidy způsobené požitím potravy kontaminované salmonelami a jejich toxiny patří mezi nejčastěji se vyskytující onemocnění na celém světě (Cotruvo a kol., 2004). Jen v České republice bylo zaznamenáno během roku 2006 25 102 případů salmonelóz (EPIDAT, SZÚ).\nŠíření salmonel probíhá fekálně-orální cestou. K infekci může dojít po kontaktu s nemocným jedincem, po požití kontaminované potravy (vejce, maso, mléko) nebo vody (Štěpánek a kol., 1979; Greenwood a kol., 1999; WHO, 2004).\n1.1.2.3 Legionella pneumophila\nZástupci rodu Legionella jsou gramnegativní aerobní pohyblivé tyčky, které ke svému růstu potřebují L-cystein a ionty železa, neoxidují ani nefermentují cukry, udává se, že nepřežívají teplotu nad 60 °C a nerostou při teplotě nižší než 20 °C. V buněčné stěně obsahují větvené mastné kyseliny, díky kterým jsou špatně barvitelné Gramovým barvením. V přirozeném prostředí legionely vyžadují přítomnost prvoků (zejména rody Naegleria, Acantamoeba, Hartmannella, Tetrahymena), kteří jsou považováni za jejich přirozené hostitele. Je známo 50 druhů legionel (Stølhaug a Bergh, 2006), jejichž nejvýznamnějším zástupcem je L. pneumophila s třemi poddruhy – L. pneumophila ssp. pneumophila, L. pneumophila ssp. fraseri, L. pneumophila ssp. pascullei (Brenner a kol., 1988; Brenner a kol., 2005b).\nPřirozeným prostředím výskytu L. pneumophila jsou sladkovodní systémy (Fliermans a kol., 1981; Fields a kol., 2002). Nalezneme ji v teplovodních systémech (Wellinghausen a kol., 2001), lázních (Nagai a kol., 2003), bazénech (Leoni a kol., 2001), chladících věžích (Pascal a kol., 2001; Ishimatsu a kol., 2001) apod. Legionely přežívají v biofilmech a sedimentech, kde je lze detekovat snadněji než v tekoucí vodě (WHO, 2004; Greenwood a kol., 1999). Bylo pozorováno, že legionely procházejí technologiemi čistíren odpadních vod a přežívají i v mořské vodě (Palmer a kol., 2003).\nLegionely jsou potenciálně patogenní bakterie, které napadají především nemocné a imunosuprimované jedince. Legionelové infekce probíhají jako legionelóza (legionářská nemoc) nebo pontiacká horečka. Legionelóza je charakterizována jako horečnaté onemocnění s těžkým zápalem plic a s mortalitou kolem 15 %. Pontiacká horečka je\nmírnější onemocnění podobné chřipce (Grenwood a kol., 1999). Ročně je u nás diagnostikováno cca 10-15 případů legionelózy (EPIDAT, SZÚ).\nCestou přenosu je inhalace aerosolu s bakteriemi a aspirace kontaminované vody. Přenos kontaktem s nemocnými pozorován nebyl (WHO, 2004).\n1.1.2.4 Staphylococcus aureus\nStafylokoky jsou grampozitivní fakultativně anaerobní nepohyblivé koky, které jsou kataláza pozitivní a oxidáza negativní. Nejlépe rostou při 37 °C, rostou i v přítomnosti 10 % NaCl. Je popsáno 27 druhů stafylokoků, které spadají do 2 skupin podle schopnosti koagulovat plazmu. Staphylococcus aureus je nejvýznamnějším zástupcem koagulázapozitivních stafylokoků (Holt a kol., 1994).\nS. aureus se běžně vyskytuje na kůži a sliznicích teplokrevných živočichů včetně člověka, až 30 % zdravých jedinců je jeho nosičem. Je ale i původcem řady hnisavých infekcí, např. folikulitid, furunklů, karbunklů, abscesů, impetig, mastitid, osteomyelitid apod. Byla popsána i produkce stafylokokových toxinů, které zapříčiňují vznik alimentárních intoxikací, syndrom toxického šoku či syndrom opařené kůže (Greenwood a kol., 1999; Rogolsky, 1979; Dinges a kol., 2000).\nStafylokoky se šíří kontaktem s jedinci s kožními infekcemi a kontaminovanými potravinami, které jim poskytují ideální prostředí pro množení a produkci toxinů (WHO, 2004; Štěpánek a kol., 1979).\n1.1.2.5 Pseudomonas aeruginosa\nJedná se o gramnegativní aerobní rovné nebo mírně zakřivené tyčky pohyblivé pomocí jednoho nebo dvou polárních flagel. Většina kmenů P. aeruginosa produkuje na vhodných kultivačních půdách pigmenty: zelenomodrý pyocyanin a fluorescentní žlutozelený pyoverdin, alternativně i červený pyorubin a hnědý melanin. Jsou kataláza a oxidáza pozitivní a tvoří amoniak z argininu. Některé kmeny tvoří extracelulární polysacharidovou matrix zvanou alginát, který je jedním z faktorů virulence. Pseudomonády jsou přirozeně vysoce odolné vůči dezinfekčním a antimikrobiálním látkám (Holt a kol., 1994; WHO, 2004; Greenwood a kol., 1999; Brenner a kol., 2005b).\nP. aeruginosa je v prostředí široce rozšířena, lze ji nalézt v půdě, vodě (i odpadní) a vlhkém prostředí, ale i ve výkalech zdravých lidí (asi u 10 % jedinců). Za určitých podmínek vystupuje jako patogen – je původcem nozokomiálních nákaz, infikuje popáleniny, rohovku, bércové vředy či plíce pacientů s cystickou fibrózou. U imunosuprimovaných jedinců často způsobuje generalizované infekce, které mohou končit až úmrtím (Greenwood a kol., 1999). Po plavání v bazénech se může objevit folikulitida a zánět zevního ucha (Asperen a kol., 1995; WHO, 2004).\nPseudomonády se šíří kontaktem poraněné tkáně s kontaminovanou vodou, vzduchem nebo roztoky používanými v nemocničních zařízeních. Infekce oka souvisejí s používáním kontaminovaných kontaktních čoček (Greenwood a kol., 1999; WHO, 2004).\n1.2 Metody izolace a identifikace bakterií ve vodách\nK izolaci a identifikaci bakterií z vodního prostředí byla vyvinuta řada fenotypových i genotypových metod.\nIdentifikace bakterií pomocí fenotypových metod je založena na využití vlastností bakterií, které jsou určeny spolupůsobením genotypu a prostředí. Z mikrobiologie vody jsou pro izolaci a rodovou a druhovou identifikaci popsány především metody kultivační, biochemické a fyziologické (např. stanovení metabolické aktivity či intenzity chemických transformací). Metody imunologické, chemotaxonomické, biotypizační, fagotypizační aj. lze aplikovat k typizaci izolátů (Stead a kol., 1998; Rompré a kol., 2002). Jejich použití v mikrobiologii vody je omezené.\nGenotypové metody (molekulárně-biologické), které využívají genetickou informaci uloženou v buňce, jsou k identifikaci stále více používané. Aplikace amplifikačních a hybridizačních technik bývá popisována nejčastěji. Těmito technikami lze detekovat bakteriální rody, druhy i kmeny (Cloete a kol., 2004; Ambrožová, 2004). K typizaci izolátů byly popsány metody jako náhodná amplifikace polymorfních úseků DNA (RAPD), multilokusová sekvenční typizace (MLST) či ribotypizace.\nPodrobnějšímu popisu kultivačních a vybraných molekulárně-biologických metod využívaných k izolaci a identifikaci bakterií z vod jsou věnovány následující kapitoly.\n1.2.1 Kultivační metody\nKultivační metody mají v současné době při mikrobiologickém rozboru vod nezastupitelnou úlohu. Jedná se o metody nepřímé, jejichž principem je pomnožení bakterií na nebo v uměle připravených médiích za vhodných podmínek za účelem zisku kolonií čistých kultur, které mohou být poté podrobeny dalším testům. Existuje velké množství kultivačních médií, která svým složením vyhovují nárokům některých druhů bakterií přítomných ve vodách, avšak převážná většina druhů se stále řadí mezi nekultivovatelné mikroorganismy, tj. nerostoucí na kultivačních médiích. Vzhledem k rozdílným fyziologickým vlastnostem bakterií je nemožné vyvinout jedno univerzální kultivační médium, které by zachytilo veškeré bakteriální druhy vyskytující se ve vodách (Austin a kol., 1988; Maier a kol., 2000; Häusler, 1994a, b; Daubner a kol., 1967; Štěpánek a kol., 1979). Kultivační média lze rozdělit podle různých hledisek do několika skupin. Nejvýznamnější členění vychází z účelu a použití těchto médií na média základní, obohacená, resuscitační, diagnostická, selektivní, selektivně diagnostická, pro anaerobní kultivaci, ke stanovení citlivosti na antimikrobiální látky, ke stanovení vitamínů a dalších účinných látek, média k testování sterility a stanovení účinnosti dezinfekčních látek, média transportní či média k uchování kultur (Votava, 1999).\nMikrobiologický rozbor vod vychází z národních norem a je založen na stanovení základních ukazatelů kultivačními metodami. Kultivace se provádí v tekutých médiích nebo na pevných půdách. K identifikaci presumptivních bakterií se používají konfirmační testy.\n1.2.1.1 Kultivace v tekutých médiích\nVýhodou tekutých půd je snadný přístup vody a živin ke kultivovanému mikroorganismu. Tekuté půdy se používají ke kultivaci poškozených nebo stresovaných mikroorganismů (Häusler, 1994b), k pomnožení mikroorganismů před dalšími testy, k průkazu biochemických vlastností (kvasná zkouška, „pestré řady“, mikrotesty; Štěpánek a kol., 1982), stanovení fyziologických skupin bakterií metodou MPN (metoda nejvíce pravděpodobných počtů, most probable number) aj.\nPrincipem biochemických identifikačních testů je kultivace bakterií v tekutých půdách s přídavkem substrátu a sledování schopnosti bakterií příslušné biochemické přeměny (např. fermentace cukrů s následnou změnou pH produkcí kyseliny, změnou barvy média rozkladem definovaného chromogenního substrátu, apod.). Biochemické mikrotesty určené k identifikaci bakterií jsou vyráběny komerčně, např. ENTEROTUBE, API-systém, mikrotesty firmy Pliva-Lachema, aj.\nKvantifikace bakterií při použití tekutých půd je možná pomocí metody MPN, jejíž podstatou je určení pozitivní reakce (přítomnosti mikroorganismů) v určitém objemu vody nebo zředěného vzorku. MPN je statistický odhad průměrného počtu mikroorganismů ve vzorku, jehož přesnost závisí na počtu zkumavek ředící řady použitých pro analýzu (Häusler, 1994b; Rompré a kol., 2002; Tortorello, 2003; Maier a kol., 2000). Variantou těchto metod jsou miniaturizované metody definovaného substrátu, které k detekci bakterií využívají přítomnost fluorogenního nebo chromogenního substrátu v médiu, nejčastěji onitrophenyl- b-D-galaktopyranosidu (ONPG) a 4-methylumbelliferyl-b-D-glukuronidu (MUG) pro stanovení koliformních bakterií a E coli a 4-methylumbelliferyl-b-D-glukosidu (MUD) pro stanovení intestinálních enterokoků (Rompré a kol., 2002; Manafi, 1991).\n1.2.1.2 Kultivace na pevných médiích\nTato metoda umožňuje kvantifikovat stanovované mikroorganismy v testovaném objemu vody. Objem a ředění inokulovaného vzorku vody se volí tak, aby po inkubaci na pevné půdě vyrostly samostatné kolonie, tedy klony jednotlivých buněk. Výsledný počet narostlých kolonií se uvádí jako počet KTJ (kolonie tvořící jednotka, CFU, colony forming unit), který se přepočítává na objem původního vzorku (Häusler, 1994b; Maier a kol., 2000; Rompré a kol., 2002). V posledních letech dochází k rozvoji aplikace chromogenních a fluorogenních substrátů, které umožňují detekovat aktivitu specifických enzymů. Ve srovnání s kultivacemi na běžných médiích jsou kultivace na těchto substrátech rychlejší a přesnější (Manafi, 1991; Manafi, 2000; González a kol., 2003; Feng a kol., 1982; Augoustinos a kol., 1993).\nV současné době se používají dva postupy inokulace vzorku na pevné půdy. Metoda přímého výsevu je založena na inokulaci zvoleného objemu vzorku do nebo na povrch kultivačního média. Inokulace do kultivačního média je vhodná při stanovení fakultativně anaerobních nebo mikroaerofilních bakterií, které normálně žijí při vyšší teplotě, takže teplota 45 °C roztopeného agaru jim nezpůsobí teplotní šok. Metoda přímého výsevu na povrch kultivačního média je vhodná pro kultivaci aerobů, jež se přirozeně vyskytují v chladnějších vodách (Häusler, 1994b; Maier a kol., 2000). Při zpracování větších objemů vzorku se používá metoda membránových filtrů, která je založena na zakoncentrování potřebného množství vzorku filtrací (10–1 000 ml). Metoda je vhodná pro vody obsahující malý počet bakterií a malé množství nerozpuštěných látek (Häusler, 1994b; Maier a kol., 2000).\n1.2.1.3 Konfirmační testy\nPro bližší taxonomické zařazení bakterií vykultivovaných na nebo v selektivních médiích je nutné provést tzv. konfirmační (potvrzující) testy. Tyto testy jsou na bázi biochemických, imunologických a chemotaxonomických metod. Kmeny, které splňují podmínky testů, jsou označovány za presumptivní (Häusler, 1994b; Rompré a kol., 2002).\nIdentifikace biochemickými testy - v současné době patří mezi nejčastěji používané konfirmační techniky. Využívá se stanovení snadno detekovatelných a stálých biochemických vlastností. Např. konfirmace presumptivních kolonií E .coli se provádí cytochromoxidázovým testem (průkaz cytochromoxidázy c), průkazem tvorby indolu z tryptofanu (dekarboxylace peptidů tryptofanázou), stanovením aktivity b-Dglukuronidázy (štěpení 4-methylumbelliferyl-b-D-glukuronidu [MUG]). K rychlé identifikaci bakterií byly vyvinuty diagnostické soupravy (mikrotesty). Soupravy jsou vytvořeny např. jako mikrotitrační destičky, jejichž jamky obsahují dehydratovaná kultivační média. Příkladem mohou být MIKRO-LA-TESTY fy Pliva-Lachema, a.s. (Häusler, 1994b). Často se využívají také fluorogenní a chromogenní substráty. Tyto postupy nejčastěji využívají enzymy ze skupiny glykosidáz. Mezi nejznámější patří b Dglukuronidáza (enzym z 94–96 % specifický pro E. coli, nalézá se i u některých kmenů shigel, salmonel, yersinií, stafylokoků, klostridií apod.) a b-D-galaktosidáza (enzym katalyzující štěpení laktózy, využívá se ke stanovení koliformních bakterií). K detekci b- D-glukuronidázy se nejčastěji využívají tyto substráty: fenolftalein-mono-b-Dglukuronidový komplex (PHEGLR), p-nitrofenol-b-D-glukuronid (PNPGLR), 5-bromo-4- chloro-3-indolyl-b-D-glukuronid (XGLR) a 4-methylumbelliferyl-b-D-glukuronid (MUG). Aktivita b-D-galaktosidázy se zjišťuje pomocí následujících substrátů: o-nitrophenyl-b-Dgalaktopyranosid (ONPG), p nitrophenyl-b-D-galaktopyranosid (PNPGAL), 6-bromo-3- indolyl-b-D-galaktopyranosid (salmon-Gal), 6-bromo-2-naphthyl-b-D-galaktopyranosid (BNGAL), 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galaktopyranosid (XGAL) a 4- methylumbelliferyl-b-D-galaktopyranosid (MUGAL) (Manafi, 1991; Manafi, 2000).\nIdentifikace imunologickými metodami - je založena na identifikaci bakteriálních antigenů pomocí specifických protilátek. Imunologické metody umožňují detekci antigenů čeledě, rodů druhů či sérovarů. Své místo v mikrobiologii vod mají: latexová aglutinace, enzymatická imunoanalýza (ELISA) a přímá a nepřímá imunofluorescence (IFA). Jejich výhodou je rychlost, jednoduchost a citlivost. Omezením těchto metod je specifičnost a koncentrace protilátky, koncentrace antigenu a typ reakčního roztoku. Navíc může docházet ke zkříženým reakcím. Používají se např. při identifikaci patogenních sérovarů E. coli či salmonel (Häusler, 1994b; Bartie a kol., 2003; Austin a kol., 1988; Rompré a kol., 2002).\nIdentifikace chemotaxonomickými metodami - jsou založené na studiu chemického složení buněčné stěny lze využít pro typizaci bakterií. Z používaných metod lze uvést analýzu profilů proteinů a mastných kyselin (Stead a kol., 1998; Häusler, 1994b; Austin a kol., 1988). Při rutinních mikrobiologických analýzách se nevyužívají.\n1.2.2 Molekulárně-biologické metody\nBěhem posledního desetiletí došlo k mohutnému rozvoji molekulárně-biologických věd, pro které je charakteristická menší časová náročnost (není nutná kultivace a konfirmace), vyšší citlivost (detekce i 1 molekuly DNA) a specifičnost (založená na detekci skupinově-, rodově-, druhově-, poddruhově-specifických sekvencí DNA či RNA, které jsou v čase neměnné a nejsou ovlivněny podmínkami okolního prostředí) (Cloete a kol., 2004; Rompré a kol., 2002).\nMezi základní techniky běžně používané k identifikaci druhů, příp. i kmenů bakterií se řadí polymerázová řetězová reakce (PCR) a fluorescenční in situ hybridizace (FISH). Jejich princip a podrobnější popis je uveden v následujících kapitolách. V rámci epidemiologických a fylogenetických studií je mnohdy nedostačující detekce bakteriálního druhu, ale je důležité odlišit jednotlivé kmeny (Versalovic a Lupski, 2002). Za tímto účelem byla vyvinuta řada genotypizačních metod. Např. pulzní gelová elektroforéza (PFGE), spočívající v separaci velkých fragmentů DNA vzniklých restrikčním štěpením, je využívána nejčastěji (Versalovic a Lupski, 2002; Olive a Bean, 1999). Dále se uvádí použití metody stanovení polymorfizmu délky restrikčních fragmentů (RFLP), kdy po amplifikaci konzervativní oblasti DNA dochází k jejímu restrikčnímu štěpení a separaci gelovou elektroforézou (Stead a kol., 1998). Metoda stanovení polymorfizmu délky amplifikovaných fragmentů (AFLP) je naopak založena na selektivní amplifikaci restrikčních fragmentů genomové DNA (Vos a kol., 1995). Z dalších typizačních metod lze zmínit náhodnou amplifikaci polymorfních úseků DNA (RAPD), multilokusovou sekvenční typizaci (MLST), ribotypizaci, analýzu plazmidů či sekvenaci (Olive a Bean, 1999).\n1.2.2.1 Polymerázová řetězová reakce (PCR)\nZákladem pro rozvoj molekulárně-biologických metod bylo vyvinutí metody PCR v 80. letech 20. století (Mullis a kol., 1987). Během krátké doby se PCR stala nejpoužívanější amplifikační metodou. Její aplikace jsou známy z mnoha odvětví a v posledních letech se začíná využívat i v environmentální mikrobiologii.\nPrincipem je opakující se enzymová syntéza nových řetězců vybraných úseků DNA, ke které dochází po připojení dvou primerů vážících se na protilehlé řetězce DNA tak, že jejich 3´OH-konce směřují proti sobě (Rosypal a kol., 2002). Jako primery se bvykle používají oligonukleotidy o délce kolem 20 párů bazí (bp), které jsou komplementární ke koncům amplifikovaného úseku. Pro provedení amplifikace musí PCR směs kromě templátové DNA a primerů obsahovat deoxyribonukleotidtrifosfáty (dNTP) a termostabilní DNA polymerázu, která katalyzuje vlastní syntézu nových řetězců.\nPostup PCR spočívá v opakování tří kroků: denaturace, při které dochází k rozvolnění řetězců templátové DNA (92-96 °C), anelace, kdy dochází k připojení primerů k rozvolněným řetězcům (anelační teplota se odvíjí od struktury primerů), a extenze (=polymerace), kdy dochází k prodlužování nových řetězců (72 °C) (Rompré a kol., 2002; Cloete a kol., 2004) (viz obr. 1.1). PCR obvykle probíhá po 30–40 cyklů, během nichž se geometricky zvyšuje počet cílových sekvencí DNA. Amplifikované úseky (amplikony) se detekují gelovou elektroforézou, hybridizací se značenou sondou či sekvenováním (Rosypal a kol., 2002).\nObr. 1.1: Princip polymerázové řetězové reakce\nKromě základní metody PCR byla vyvinuta řada modifikací, z nichž některé jsou uvedeny níže:\nNáhodně amplifikovaná polymorfní DNA (RAPD, AP-PCR) - vychází z klasické metody PCR, ale na rozdíl od ní využívá pouze jeden krátký primer o velikosti 9-10 bp s náhodnou sekvencí, který hybridizuje s DNA matricí za nízké anelační teploty. Vzhledem k použití nespecifických primerů není nutné znát sekvenci DNA matrice. Amplifikační produkty o neznámé sekvenci, které vznikají v případě, že RAPD primery nasedají na protilehlé řetězce DNA proti sobě a ve vzájemné vzdálenosti do několika málo kbp, jsou separovány gelovou elektroforézou a obarveny ethidium bromidem. Délka amplifikačních produktů odpovídá vzdálenosti mezi dvěma protilehlými primery (Williams a kol., 1990;\nWelsh a McCleeland, 1990; Olive a Bean, 1999). Jelikož se počet a umístění míst přisednutí RAPD primerů liší mezi kmeny téhož druhu, je výsledkem spektrum amplifikačních produktů (fingerprint), které by mělo být charakteristické pro zkoumaný kmen. Nicméně je známo, že nepatrné změny koncentrace solí, anelační teploty, koncentrace templátové DNA, délky primerů a jejich sekvence mají zásadní vliv na počet, intenzitu a reprodukovatelnost fingerprintu (Welsh a McCleeland, 1990).\nMultiplex PCR - při jejím provedení se využívá více párů primerů současně, které se vyznačují podobnou teplotou tání. To umožňuje paralelní identifikaci více genových úseků jednoho mikroorganismu (např. genů virulence) nebo identifikaci více mikroorganismů (Mazura a kol.; Campbell a kol., 2001; Bej a kol., 1991b).\nNested PCR - probíhá jako dvě po sobě následující amplifikace s cílem zisku dostatečného množství DNA fragmentu. Metoda se používá zejména v případech, kdy je amplifikováno malé množství DNA (Juck a kol., 1996). Oba páry primerů používané při nested PCR musí specificky reagovat v očekávané oblasti a musí mít odlišný bod tání (Mazura a kol., 2001).\nReverzně transkripční PCR (RT-PCR) - je určená k amplifikaci molekul RNA (včetně mRNA a rRNA). RNA je nejdříve přepsána pomocí reverzní transkriptázy do cDNA (komplementární DNA) a teprve potom amplifikována (Rosypal a kol., 2002).\nKvantitativní PCR (Q-PCR) - umožňuje průběžné sledování tvorby PCR produktů již během jednotlivých amplifikačních cyklů a tedy jejich kvantifikaci (Ibekwe a kol., 2003).\nKlíčovou úlohu pro úspěšné provedení a vyhodnocení PCR mají zejména: výběr vhodné sekvence k amplifikaci, čistota a množství DNA matrice, typ DNA polymerázy a amplifikační podmínky, přítomnost inhibitorů, detekce produktů amplifikace a kontroly amplifikace (Rådström a kol., 2004; Altwegg, 1995; Wilson, 1997).\nVýběr oligonukleotidové sekvence - je zásadním krokem při použití amplifikačních metod. Cílová sekvence musí být specifická pro příslušný organismus či organismy. Podle typu aplikace je možné hledat sekvenci specifickou pro celou taxonomickou skupinu (tj. geny kódující 16S rRNA) nebo sekvenci specifickou pro daný organismus (geny pro funkční molekuly). Pro dosažení vyšší citlivosti je vhodné zaměřit se na sekvence vyskytující se v buňkách ve více kopiích. To však neplatí pro genové sekvence na plazmidech, které mohou z buňky vymizet (Altwegg, 1995; Johnson, 2000).\nČistota a množství templátové DNA - získání DNA matrice o vhodné čistotě a dostatečném množství je klíčovým krokem pro úspěch amplifikačních metod. Postupy pro izolaci bakteriální DNA by měly být časově a finančně nenáročné, jednoduché, reprodukovatelné a bezpečné pro obsluhu (Rantakokko-Jalava a Jalava, 2002). Jejich cílem je odstranění inhibičních látek a zakoncentrování cílových molekul DNA ze vzorku (Rådström a kol., 2004). Existuje řada izolačních metod, ale pouze některé jsou aplikovatelné na příslušný druh vzorku (Horáková a kol., 2008). Vzhledem k vysoké citlivosti amplifikačních technik je možné pro zisk DNA z čistých kultur použít i metody poskytující horší kvalitu DNA matrice, např. povaření, alkalická lyze apod., které poskytují jen hrubý lyzát. U vzorků z přírodního prostředí je situace odlišná, tj.: malý počet cílových molekul DNA, extrémně vysoká doprovodná flóra a množství inhibičních látek. Proto je zde nezbytné zařadit po lyzi buněk extrakční krok následovaný krokem purifikačním. K tomuto účelu bylo popsáno použití např. imunomagnetických částic, gradientové centrifugace, filtrace či dvoufázových systémů. Často používané extrakční postupy využívající organická rozpouštědla však nejsou příliš vhodné, a to z následujících důvodů: (i) tyto postupy zahrnují mnoho dílčích kroků, kdy časté otvírání zkumavek vede ke zvýšení pravděpodobnosti vzniku kontaminace, (ii) etanolová precipitace následovaná fenol/chloroformovou extrakcí vede ke snížení výtěžku, který je zásadní zejména při práci s malým množstvím DNA, (iii) stopy fenolu mohou inhibovat amplifikační reakci. Nejvyšší výtěžek, koncentraci a čistotu poskytují komerčně dostupné izolační kity. Jejich nevýhodou je ale finanční nákladnost (Altwegg, 1995; Rådström a kol., 2004).\nVhodně zvolené složení PCR směsi a amplifikační podmínky - jsou nezbytné pro správný průběh amplifikační reakce. Významná je volba termostabilní DNA polymerázy. Existuje množství DNA polymeráz, každá se vyznačuje jinými vlastnostmi a odolností vůči různým složkám biologických vzorků. Bylo zjištěno, že např. polymerázy Tth si udržují svoji polymerázovou aktivitu i v přítomnosti stopových množství fenolu, ale na nejčastěji používanou Taq polymerázu působí fenol inhibičně. Správnou volbou termostabilní DNA polymerázy je možné se do jisté míry vyhnout náročným purifikačním krokům při přípravě DNA templátu. Zásadní je také správná volba primerů, časů a dob jednotlivých kroků amplifikační reakce a koncentrace iontů hořčíku nezbytných pro správnou funkci DNA polymeráz (Rådström a kol., 2004; Wilson, 1997). U metody RAPD byl pozorován zásadní vliv nepatrných změn koncentrace solí, anelační teploty, délky primerů a jejich sekvence na počet, intenzitu a reprodukovatelnost fingerprintu (Welsh a McCleeland, 1990).\nInhibitory PCR - inhibice amplifikační reakce může být způsobena mnoha vlivy. Přítomnost inhibitorů je častá zejména ve vzorcích z potravin, prostředí a klinického materiálu. Mechanismus inhibice spočívá v (i) interferenci při lyzi buněk, jež je nezbytná pro extrakci DNA, (ii) degradaci a precipitaci nukleových kyselin a (iii) inhibici DNA polymeráz; což ve výsledku vede ke snížení citlivosti PCR nebo k celkovému zablokování reakce (Wilson, 1997). Inhibitory lze rozdělit do dvou skupin: 1) endogenní (obsaženy přímo ve zpracovávaném vzorku, používaných enzymech nebo materiálu); 2) exogenní (pocházející z okolního prostředí, např. bakterie, prach, pyl, celulóza nebo pudr z rukavic). Z endogenních inhibitorů z klinického materiálu jsou známy např. hemoglobin, bilirubin, heparin, žlučové kyseliny, sérové proteiny, močovina. Mezi inhibitory z potravin patří mléčné proteiny, ionty vápníku, termostabilní nukleázy, proteázy, tuk, sacharóza, či glykogen. Ve vzorcích z prostředí se často nacházejí inhibující huminové a fulvové kyseliny, fenolické sloučeniny, těžké kovy, rostlinné polysacharidy, bakteriální zbytky apod. (Wilson, 1997). Omezení výskytu exogenních inhibitorů je možné při dodržování čistoty a sterilních podmínek práce v laboratoři. Zamezit přítomnosti endogenních inhibitorů ve vzorcích je proces náročnější, spočívá např. v aplikaci vhodných purifikačních technik vedoucích k zisku dostatečně čisté DNA (Wilson, 1997). Bylo popsáno, že zvýšení účinnosti amplifikace je možné dosáhnout přídavkem specifických sloučenin - enhancerů (aditiv) do amplifikační směsi. Enhancery působí v různých krocích amplifikace, např. ovlivňují stabilitu templátové DNA nebo působí na správnou funkci DNA polymerázy. Jsou to: proteiny (BSA=bovinní sérový albumin, gp32=DNA vazebný protein kódovaný genem gp32 bakteriofága T4), organická rozpouštědla (dimetylsulfoxid, formamid), detergenty (Tween 20, Triton X), biologicky kompatibilní rozpuštěné látky (betain, glycerol) a polymery (polyetylenglykol, dextran) (Rådström a kol., 2004; Henke a kol., 1997; Back a kol., 1979; Pomp a Medrano, 1991).\nDetekce PCR produktů - metody detekce amplifikovaných úseků mají různou citlivost. Nejjednodušší, ale současně málo citlivou metodou, je elektroforéza v agarózovém gelu. Principem této metody je obarvení amplikonů rozdělených podle své relativní molekulové hmotnosti a velikosti náboje fluorescenčním barvivem. Nejčastěji se používá ethidiumbromid, který interkaluje mezi nukleotidy. K vizualizaci obarvených amplikonů dochází pomocí UV transiluminátoru (Maniatis a kol., 1982). Vysokou citlivostí (20 – 100krát vyšší než u agarózové elektroforézy) a specifičností se vyznačuje metoda Southern blot kombinovaná s hybridizací (Altwegg, 1995). Tato technika spočívá v přenosu a následné imobilizaci amplifikonů na membráně, kde jsou podrobeny hybridizaci se specifickou sondou.\nKontroly - správný průběh reakce je u amplifikačních metod zajištěn použitím pozitivní a negativní kontroly při každé analýze (Altwegg, 1995). Kontrola správné velikosti amplifikovaného produktu se provádí srovnáním s velikostním markerem. Pro kontrolu specifičnosti PCR produktu lze využít sekvenaci.\n1.2.2.3 Fluorescenční in situ hybridizace (FISH)\nK vyhledání specifických sekvencí lze použít i metody hybridizační, jejich principem je schopnost hybridizace dvou navzájem komplementárních jednořetězcových DNA či RNA molekul (Rosypal a kol., 2002). Příkladem může být metoda fluorescenční in situ hybridizace (FISH).\nPrincipem FISH je hybridizace fluorescenčně značené DNA sondy se specifickým úsekem 16S nebo 23S rRNA. Tato metoda umožňuje detekovat specifické genové sekvence v cytologických preparátech, v biofilmech, sedimentech, kalech a vzorcích vod. Zhybridizované sondy se poté kvantifikují pomocí fluorescenčního mikroskopu (Brehm- Stecher a kol., 2004; Rosypal a kol., 2002; Grimm a kol., 1998; Daims a kol., 2001; Ravenschlag a kol., 2001; Sekar a kol., 2003; DeLong a kol., 1999; Glöckner a kol., 1999; Declerck a kol., 2003a; Rompré a kol., 2003; Brenner a kol., 2005). Běžně se používají oligonukleotidové sondy (méně než 20 nukleotidů), aplikace sond polynukleotidových (více než 50 nukleotidů) či proteinnukleotidových (PNA-protein nucleic acid) se provádí za účelem zvýšení specifičnosti a citlivosti analýzy, výhodné je jejich použití k detekci grampozitivních bakterií (Stender a kol 2002; Brehm-Stecher a kol., 2004) a bylo popsáno i k detekci legionel přímo v nárostech ve vodovodním potrubí (Wilks a kol., 2005). Značení sond je provedeno obvykle jedním fluorescenčním barvivem na 5´-konci sondy přes linker, v některých případech lze použít i více sond značených různými fluorescenčními barvivy najednou. Obyčejně se jako fluorescenční barviva používají: fluorescein, tetramethylrhodamin, texaská červeň, kyselina 7-amino-4-methykumarin-3- octová a indokarbocyaninová barviva Cy3, Cy5 a Cy7 (Amann a kol., 1995).\nPostup FISH spočívá ve fixaci buněk ve vzorku, jejich zakoncentrování a vlastní hybridizaci. Před pozorováním ve fluorescenčním mikroskopu, za použití vhodných filtrů, které zachytí emitované záření, je nutné vymýt nezhybridizovanou sondu.\nFISH je rychlou, citlivou a specifickou metodou, lze ji aplikovat tam, kde nedostačují klasické kultivační metody. Tato metoda má ale také několik nevýhod. Je omezena pouze na pozorování metabolicky aktivních buněk s dostatečným množstvím rRNA. Pozorované buňky musí být zakoncentrovány tak, aby bylo dosaženo koncentrace alespoň 103 buněk/cm2 membrány či filtru, jinak není možné fluorescenční signál pozorovat. Nevhodná sonda, špatné pronikání sondy do buňky nebo malé množství cílových rRNA molekul vedou ke slabému signálu. Ten je možné zintenzívnit použitím nepřímé vazby fluorescenční značky, použitím citlivějších sond (sonda s křenovou peroxidázou v metodě CARD FISH [CARD=catalyzed reporter deposition], na kterou se pro zesílení signálu posthybridizačně naváže tyramid značený fluorochromem) nebo vícečetným fluorescenčním značením (Amann a kol., 1995). FISH je využívána nejen k detekci fylogenetických a fyziologických skupin bakterií, ale i k detekci bakterií patogenních a potenciálně patogenních, např. E. coli, S. aureus, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium a legionel (Szewzyk a kol., 1994; Oliveira a kol., 2002; Declerck a kol., 2003a; Grimm a kol., 1998; Manz a kol., 1995; Beimfohr a kol., 1993).\n1.3 Mikrobiologický rozbor vod v ČR podle současně platné legislativy\nRozsah stanovovaných mikrobiologických ukazatelů v jednotlivých typech vod se řídí platnými vyhláškami 252/2004 Sb. (Vyhláška, kterou se stanoví hygienické požadavky na pitnou a teplou vodu a četnost a rozsah kontroly pitné vody), 187/2005 Sb. a 293/2006 Sb. (Vyhlášky, kterými se mění Vyhl. 252/2004 Sb.), 275/2004 Sb. (Vyhláška o požadavcích na jakost a zdravotní nezávadnost balených vod a o způsobu jejich úpravy), NV 61/2003 Sb. (Nařízení vlády o ukazatelích a hodnotách přípustného znečištění povrchových vod a odpadních vod, náležitostech povolení k vypouštění odpadních vod do vod povrchových a do kanalizací a o citlivých oblastech), NV 61/2003 Sb. ve znění NV 229/2007 Sb., ČSN 75 7221/1998 Sb. (Klasifikace jakosti povrchových vod) a 135/2004 (Vyhláška, kterou se stanoví hygienické požadavky na koupaliště, sauny a hygienické limity písku v pískovištích venkovních hracích ploch) a 292/2006 Sb. (Vyhláška, kterou se mění Vyhl. 135/2004 Sb.).\nProváděcí normy, které obsahují postupy stanovení požadovaných mikrobiologických ukazatelů, jsou uvedeny v tabulce 1.1.\nTab.1.1: Přehled platných norem pro stanovení mikrobiologických ukazatelů ve vodách označení normy název normy\n1.4 Možnosti izolace a identifikace vybraných hygienicky významných a indikátorových bakterií ve vodách\nVelké množství bakterií vyskytující se ve vodním prostředí lze považovat za hygienicky významné buď přímo pro jejich patogenitu, potenciální patogenitu nebo pro jejich indikátorový význam. V této práci byly pro detailní studium vybrány indikátorové bakterie – E. coli, intestinální enterokoky a Clostridium perfringens a patogenní a podmíněně patogenní bakterie – salmonely, legionely, Pseudomonas aeruginosa a Staphylococcus aureus.\n1.4.1 Izolace a identifikace E. coli\nIzolace a identifikace E. coli ve vzorcích vod je standardně založena na kultivačním stanovení. V ČR je stanovována 2 principy (tab. 1.1): 1) podle ČSN EN ISO 9308–1 kultivací na laktóza-TTC půdě s průkazem b-D-galaktozidázy, cytochromoxidázy c a produkce indolu z tryptofanu; 2) podle TNV 75 7835 kultivací na m-FC agaru při 44 °C s následným průkazem b-D-glukuronidázy. Pro stanovení E.coli lze obecně použít poměrně velké spektrum kultivačních půd a konfirmačních postupů, které však mají významně odlišnou záchytnost a selektivitu. Augoustinos a kol. (1993) zhodnotila použití m-FC agaru pro kultivaci fekálních koliformů a E. coli a následnou konfirmaci pomocí testu na produkci enzymu b-D-glukuronidázy jako vysoce účinnou metodu jejich stanovení. Srovnání dvou metod definovaného substrátu (Colilert, ColiQuick) pro stanovení E. coli z chlorovaných vod s kultivační metodou využívající EC médium s MUG (fluorogenní médium pro stanovení E. coli) popsal Covert a kol. (1992). Colilert poskytl výsledky srovnatelné s kultivací na EC médiu. Eckner (1998) se také zabýval srovnáním metody definovaného substrátu (Colilert) s metodou MPN a membránovou filtrací pro pitné a koupací vody, přičemž výsledky všech použitých metod byly srovnatelné. Účinnost analýzy b-D-glukuronidázy pro identifikaci fekálních E. coli pomocí definovaného substrátu (Colilert) sledoval Rice a kol. (1990). Zjistil, že po 24 h kultivace bylo pozitivních 95,5 % izolátů a po 28 h 99,5 %. Francy a kol. (2000) porovnávala 4 metody stanovení E. coli ve vodách určených k rekreaci. Testované metody poskytly rozdílné výsledky. K monitoringu fekálního znečištění pobřežních vod použil Fiksdal a kol. (1994) rychlé enzymatické metody, jejichž detekční limit pro fekální koliformy byl 100-1 000 KTJ/100 ml a pro E. coli 10-100 KTJ/100 ml. George a kol. (2002) sledovala účinnost eliminace fekálních koliformů ve 12 čistírnách odpadních vod (ČOV) klasickými plotnovými metodami a metodami enzymatickými. Zjistila, že účinnost odstranění fekálních bakterií je závislá na procesech čištění ČOV. UV záření používané k dezinfekci nepůsobilo na snížení počtu E. coli. Použitím chromogenních a fluorogenních substrátů k izolaci a identifikaci E. coli se zabývali Suiero a kol. (2001), Robertson a kol. (1998), González a kol. (2003), Feng a kol. (1982), Farnleitner a kol. (2002), Berg a kol. (1988), George a kol. (2001). Shrnutí poznatků o stanovení koliformů v pitných vodách obsahuje práce Rompré a kol. (2002). Pro typizaci kmenů E. coli byla popsána např. metoda latexové aglutinace pro detekci shiga-like toxinů (Karmali a kol., 1999) nebo multilokusová enzymová elektroforéza (MLEE) (Souza a kol., 1999; Pupo a kol., 1997).\nKoliformní bakterie byly poprvé identifikovány pomocí PCR amplifikací úseku genu pro b-D-galaktosidázu (lacZ) Bejem a kol. (1990, 1991a, b). Amplifikace specifického úseku genu uidA (b-D-glukuronidáza) byla použita Tsaiem a kol.(1993) a Juckem a kol. (1996) k identifikaci E. coli. K identifikaci patogenních kmenů E. coli bylo vypracováno mnoho PCR postupů založených na detekci faktorů virulence. Nejčastěji byla pozornost zaměřena na amplifikaci sekvencí genů: stx I a II (shiga-like toxiny), lt (teplotně labilní toxin), st (teplotně stabilní toxin), ipaH (fragment invazivního plazmidu), eaeA (intimin), hlyA (enterohemolyzin), invE, bfpA, rfb, fliC (další povrchové antigeny) a uidA (b-D-glukuronidáza) (Watterworth a kol., 2005; Vidal a kol., 2004; Wang a kol., 2002; Venkateswaran a kol., 1997; Jinemann a kol., 2003; Jothikumar a kol., 2002; Paton a Paton, 1998b; Reid a kol., 1999; Toma a kol., 2003; Gannon a kol., 1997; Franck a kol., 1998; Fagan a kol., 1999; Cerna a kol., 2003; Ibekwe a kol., 2003; Campbell a kol., 2001; Louie a kol., 1998; Bertin a kol., 1996). K bližší charakterizaci kmenů byly použity tyto metody: ribotypizace (Carson a kol., 2001), polymorfizmus délky restrikčních fragmentů (RFLP) (Arthur a kol., 1990), pulzní gelová elektroforéza (PFGE), polymorfizmus délky amplifikovaných fragmentů (AFLP) (Smith a kol., 2000), multilokusová sekvenční typizace (MLST) (Tartof a kol., 2005) anebo náhodně amlifikovaná polymorfní DNA (RAPD) (Hurtado a Rodríguez-Valera, 1999).\n1.4.2 Izolace a identifikace salmonel\nStandardními metodami pro detekci salmonel jsou metody kultivační. V ČR je ke stanovení salmonel používána kultivační metoda podle TNV 75 7855 (Tab. 1.1). Principem metody je pomnožení v neselektivním tekutém médiu (peptonová voda) a následná kultivace na selektivních půdách xylóza-lysin-dezoxycholátovém médiu a médiu s brilantovou zelení, fenolovou červení a laktózou podle Edela a Kampelmachera.\nK izolaci salmonel ze vzorků vod a výkalů bylo popsáno použití neselektivních a následně selektivních pomnožovacích médií a kultivace na modifikovaném Rappaport- Vassiliadisově a poté Hektoen agaru (Feder, 2001). Freydiere a kol. (1991) ve své práci použila ke stanovení salmonel v klinické mikrobiologii Rambachův agar. Koivunen a kol. (2001) zjistil, že pro stanovení salmonel z komunálních odpadních vod je jednokrokové pomnožení v Preussově tetrationátovém bujónu lepší než použití peptonové vody a Rappaport-Vassiliadisova média. Alonso a kol. (1992) srovnával vhodnost použití dvou tekutých médií k pomnožení a Rambachova a Hektoen agaru k izolaci salmonel z mořské vody. Rambachův agar spolu s testovanými tekutými médii prokázal největší účinnost a selektivitu. Vykultivované kolonie byly podrobeny aglutinaci se séry proti O, Vi a H antigenům. Kromě sérologické typizace bylo popsáno použití fagotypizace či analýzy celobuněčných proteinů SDS-PAGE (Betancor a kol., 2004).\nIdentifikaci salmonel pomocí PCR použila řada autorů. Jones a kol. (1993) a Burtscher a kol. (1999) použili k identifikaci gen hns (DNA vazebný protein). Amplifikaci sekvence genu hilA (hyperinvazivní lokus A ostrova patogenity 1) popsali Cardona-Castro a kol. (2002) a Pathmanathan a kol. (2003). Cohen a kol. (1996) zkoumal možnost identifikace salmonel pomocí amplifikace fragmentu genu fimA (hlavní podjednotka fimbrie typu 1), Feder a kol. (2001) invA (gen invazivity) a Riyaz-Ul-Hassan (2004) stn (gen pro enterotoxin salmonel). Molekulární typizací izolátů Salmonella enterica ssp. enterica se zabývala Thorpdahl a kol. (2005). Testovala využití metod MLST, PFGE a AFLP. Z těchto metod byla zvolena jako nejvhodnější metoda PFGE.\n1.4.3 Izolace a identifikace enterokoků\nPro izolaci a identifikaci enterokoků byla popsána řada kultivačních médií. U nás se podle ČSN EN ISO 7899–2 (tab. 1.1) používá selektivní médium Slanetz-Bartley s následnou konfirmací produkce eskulinu. Brodsky a Schiemann (1975) hodnotili záchyt intestinálních enterokoků na Pfizerově selektivním enterokokovém (PSE) a KF agaru (médium pro stanovení intestinálních enterokoků podle American Public Health Association) a zjistili, že na PSE byl sice záchyt nižší, ale toto médium bylo selektivnější. Slanetz a kol. (1957) sledoval počty intestinálních enterokoků ve vodě a výkalech pomocí m-enterokokového agaru, který vyvinul. Yoshpe-Purer (1989) srovnávala použití KF, m-enterokokového a žlučeskulinového agaru pro stanovení intestinálních enterokoků v mořské vodě. KF médium bylo shledáno neselektivním a nevhodným k izolaci intestinálních enterokoků z mořské vody. Přehled dostupných chromogenních a fluorogenních médií k izolaci intestinálních enterokoků uvádí ve své práci Manafi (2000). K detekci intestinálních enterokoků podle standardních (normovaných) metod jsou využívána média podle Slanetze-Bartleyové, aziddextrózový bujón a média s přídavkem eskulinu a nebo žlučových kyselin (Doming a kol., 2003a). Z dalších fenotypových metod byly pro typizaci popsány: biotypizace na základě fermentace cukrů a enzymatické aktivity (Lang a kol., 2001), analýza profilů celobuněčných proteinů SDS-PAGE (Tyrrell a kol., 2002), latexová aglutinace (Petts, 1995), MLEE (Tomayko a kol., 1995) či analýza metylesterů mastných kyselin (FAME) (Lang a kol., 2001).\nK molekulární identifikaci a typizaci enterokoků jsou využívány metody: PCR zaměřená na amplifikaci úseků genů pro 23S rRNA (Frahm a kol., 2003), 16S rRNA (Santo Domingo a kol., 2003) nebo tuf genu, který kóduje elongační faktor Tu (Ke a kol., 1999), FISH, RAPD, AFLP, ribotypizace (Beimfohr a kol., 1993; Doming a kol., 2003b) aj.\n1.4.4 Izolace a identifikace Clostridium perfringens\nKlasická identifikace C. perfringens podle Vyhl. 252/2004 Sb. spočívá v kultivaci v thioglykolátovém bujónu, na mCP agaru, zesíleném klostridiovém bujonu či tryptózosulfit- cykloserinovém agaru za anaerobních podmínek (Votava, 1999; Goldner a kol., 1985; Armon a kol., 1988; Bisson a Cabelli, 1979). Pro typizaci izolátů se používají sérologické metody (McClane a kol., 1984; Genigeorgis a kol., 1973; Fach a kol., 1997).\nPro identifikaci C. perfringens je nejrozšířenější používanou metodou PCR. Augustynowicz a kol. (2002), Fach a kol. (1997) a Kanakaraj a kol. (1998) identifikovali C. perfringens pomocí genů plc (fosfolipáza C) a cpe (enterotoxin). Yoo a kol. (1997) ve své práci provedl pomocí PCR rozdělení izolátů do pěti skupin podle schopnosti produkovat hlavní letální toxiny. Van Damme-Jongsten (1990) zjišťovala přítomnost genu pro enterotoxin DNA hybridizací u C. perfringens typu A. Billington a kol. (1998) hledal u izolátů C. perfringens typu E tichý gen pro enterotoxin. Typizace izolátů byla provedena např. ribotypizací, RFLP, PFGE nebo analýzou plazmidů (Schalch a kol., 1994; Maslanka a kol., 1999; Eisgruber a kol., 1995; Sparks a kol., 2001).\n1.4.5 Izolace a identifikace legionel\nPrvní kultivace byla provedena na agaru Mueller-Hintonové s přídavkem hemoglobinu a IsoVitaleXu (suplement s L cysteinem), které byly později nahrazeny pyrofosfátem železitým a L-cysteinem a vedly k vývoji Feeley-Gormanova agaru (Feeley a kol., 1978). Později byl aktivním uhlím nahrazen škrob a zdrojem aminokyselin se stal kvasničný extrakt, což je základ pro většinu médií používaných ke kultivaci legionel (Feeley a kol., 1979). V současné době se používá agar s aktivním uhlím a kvasničným extraktem obohacený a-ketoglutarátem a selektivními doplňky (Fields a kol., 2002). Ke stanovení legionel z vodovodní vody z nemocnic byla Reinthalerem a kol. (1993) testována tři selektivní média: MWY, BMPAa a GVPC agar (média se selektivními suplementy pro kultivaci legionel). Autor doporučil používat ke kultivaci GVPC agar po úpravě vzorku kyselinou. Bartie a kol. (2003) izolovala legionely z prostředí na aBCYE (médium s růstovým suplementem pro kultivaci legionel), GVPC a MWY agaru. Nejcitlivějším médiem bylo médium aBCYE, selektivita u těchto médií byla srovnatelná. Metoda přímé fluorescence byla popsána k detekci legionel v plicní tkáni a respiračních sekretů nebo k identifikaci izolátů legionel (Hayden a kol., 2001). Ze sérologických metod je známá nepřímá imunofluorescence, enzymatická imunoanalýza a mikroaglutinace (Farnshy a kol., 1978; Klein a kol., 1979). Metoda MLEE byla použita k odlišení subtypů L. pneumophila (Selander a kol., 1985). Metoda, zavedená v posledních letech v ČR (ČSN ISO 11731-2), je založena na zakoncentrování vzorku a jeho tepelné nebo kyselé úpravě za účelem minimalizace doprovodné mikroflóry a kultivaci na tlumivém kultivačním médiu s aktivním uhlím a kvasničným extraktem a tlumivém kultivačním médiu s aktivním uhlím, kvasničným extraktem a selektivním suplementem.\nGenotypová identifikace legionel je založena především na amplifikaci sekvence genu pro 5S rRNA, 16S rRNA a oblasti 23S-5S spaceru (mezigenový mezerník) (Mahbubani a kol., 1990; Miyamoto a kol., 1997; Rantakokko-Jalava a Jalava, 2001; Bej a kol., 1991d; Herpers a kol., 2003). Identifikace L. pneumophila spočívá v amplifikaci úseku genu mip (zesilovač infektivity pro makrofágy) (Bej a kol., 1991c; Ballard a kol., 2000; Catalan a kol., 1994; Declerck a kol., 2003b; Lindsay a kol., 1994; 2003; Pascal a kol., 2001; Wellinghausen a kol., 2001; Wilson a kol., 2003). Hybridizaci kolonií použil Satoh a kol. (2002). K odlišení kmenů L. pneumophila byly použity metody PFGE, RAPD, AFLP, ribotypizace, plazmidová analýza (Gomez-Lus a kol., 1993; Valsangiacomo a kol., 1995; Maher a kol., 1987; Fields a kol., 2002) aj.\n1.4.6 Izolace a identifikace Staphylococcus aureus\nPro stanovení S. aureus jsou standardně používány kultivační metody. U nás je podle ČSN EN ISO 6888-1 běžné použití Baird-Parkerova agaru a konfirmace koagulací králičí plazmy. Flowers a kol. (1977) sledoval růst stresovaných bakterií S. aureus na následujících médiích po přídavku katalázy: Baird-Parkerova agaru, tryptikázo-sójového (TSA), TSA se 7 % NaCl, Vogel-Johnsonova agaru, slaného agaru s manitolem, telurit-polymyxinžloutkového agaru, staphylococcus 110 agaru, tryptikázo-sójového bujónu (TSB) a TSB s 10 % NaCl. Výsledkem jeho práce bylo zjištění, že přítomnost katalázy výrazně zvyšuje počet resuscitovaných buněk. Niskanen a kol. (1978) porovnával šest selektivních médií pro stanovení enterotoxinogenních kmenů Staphylococcus aureus a zjistil, že Baird- Parkerův agar je z nich nejvhodnější. Biotypizace, fagotypizace, imunoblotování, MLEE apod. slouží spolu s genotypovými metodami k charakterizaci kmenů S. aureus (Tenover a kol., 1994).\nPro detekci Staphylococcus aureus byla popsána amplifikace genu nuc (termonukleáza) (Kim a kol., 2001). U meticilin rezistentních kmenů je pozornost zaměřena na hledání sekvence mecA (meticilinová rezistence) genu (Jaffe a kol., 2000; Mason a kol., 2001). Pro typizaci izolátů lze použít metody: ribotypizace, plazmidová analýza, restrikční analýza amplifikovaného genu pro koagulázu, typizace sekvence IS257/431, restrikční analýza inter-IS 256, PFGE aj. (Tenover a kol., 1994; Deplano a kol., 1997).\n1.4.7 Izolace a identifikace Pseudomonas aeruginosa\nZákladní metodou podle ČSN EN 12780 pro detekci P. aeruginosa je kultivace na selektivních médiích s cetrimidem a kyselinou nalidixovou (Kodaka a kol., 2003; Doern a kol., 1992; Fonseca a kol., 1986). Charakterizace kmenů se provádí biotypizací, sérotypizací nebo stanovením antibiotické citlivosti (Hernandez a kol., 1997).\nZ těchto metod je známa aplikace PCR, zaměřená na detekci specifických úseků genů 16S rDNA, algD (alginát), oprI a oprL (otevřený čtecí rámec), genu pro exotoxin A (da Silva Filho a kol., 1999; McIntosh a kol., 1992; De Vos a kol., 1997; Spilker a kol., 2004; Khan a kol., 1994). Metody jako plazmidová analýza, ribotypizace, RAPD, PFGE jsou používány k typizaci kmenů (Hernandez a kol., 1997; Bennekov a kol., 1996; Blanc a kol., 1993; Kersulyte a kol., 1995; Mahenthiralingam a kol., 1996).


[Страница 59/106] - Руководство: Универсальный пульт ДУ PHILIPS SRU5060\nPokud se televize vypne (na pohotovostní režim), okamžitě uvolněte\ntlačítko pohotovostního režimu na SRU 5060.\nOvládač SRU 5060 nyní našel kód, kterým může ovládat váš televizní\nZkontrolujte, zda můžete ovládačem SRU 5060 ovládat všechny funkce\nna svém televizním přijímači.\nPokud se tak nestane, opakujte automatické nastavení.\nSRU 5060 pak vyhledá kód, který funguje lépe.\nPoté co SRU 5060 projde veškeré známé kódy, vyhledávání se\nautomaticky zastaví a tlačítko standby přestane blikat.\nAutomatické programování televizního přijímače trvá maximálně\n5 minut. Pro DVD, CD, VCR, AMP a STB je tento čas 2 minuty\nManuální nastavení dálkového ovladače\nPříklad: televizní přijímač\nTelevizní přijímač zapněte manuálně nebo pomocí původního dálkového\novládače. Vylaďte na kanál 1.\nNa konci této příručky si podle značky svého\ntelevizního přijímače zjistěte příslušný kód.\nU všech značek je uveden alespoň jeden\nčtyřmístný kód. Zaznamenejte si první kód.\nDejte pozor! Pro televizní přijímače,\nvideorekordéry, DVD, atd. jsou uvedeny různé\nNa našich internetových stránkách www.philips.com/urc můžete přímo\nvybrat číslo typu zařízení, kde získáte správný kód.\nZkontrolujte, zda jste si zaznamenali kód ze správné tabulky.\nStiskněte tlačítko SELECT pro výběr TV.\nDržte tlačítko stlačené, dokud nezačne svítit\nStiskněte současně po dobu tří sekund\ntlačítka 1 a 3, dokud tlačítko standby dvakrát\nnezabliká a pak zůstane svítit.\nNyní pomocí digitálních tlačítek zaveďte kód, který jste si zaznamenali\nv bodu 2.\nTlačítko standby nyní dvakrát zabliká.\nPokud tlačítko blikne jednou na delší dobu, kód nebyl zadán správně\nnebo byl zadán chybný kód. Začněte znovu od bodu 2.\nZaměřte ovládačem SRU 5060 na televizi a zkontrolujte, zda správně\nJestliže televizní přijímač reaguje správně na všechny pokyny tlačítek, je\novládač SRU 5060 připravený k provozu. Nezapomeňte si poznamenat\nJestliže přístroj nereaguje na žádné pokyny tlačítek nebo reaguje\njen na některé, musíte postup od bodu 2 opakovat a použít další\nkód uvedený v seznamu.\n(59 из 106)


Otřesný zákrok, naštval Limberský kouče Legie. Mrzí nás to, zní z Plzně - iDNES.cz\nDavid Limberský v dresu Plzně. | foto: Ladislav Němec, MAFRA\nPo ošklivém faulu plzeňského Davida Limberského otřesený slovenský útočník ve službách Legie Varšava Ondrej Duda sotva odkulhal ze hřiště, podpírat ho museli lékař s masérem. Kouč polského týmu po přípravném utkání v Turecku českého reprezentanta ostře kritizoval.\n„Neříkám, že to udělal úmyslně, ale byl to otřesný zákrok, který do přípravného zápasu nepatří,“ prohlásil Henning Berg na internetových stránkách Legie. „Měl dostat červenou kartu a po takovém faulu by měl jít před soud,“ uvedl norský kouč k incidentu.\nLimberský v souboji prošlápl Dudovi nohu a slovenský reprezentant musel střídat. Podle informací polských médií neutrpěl žádnou zlomeninu a mimo hru bude minimálně pět týdnů. „Stalo se to přímo přede mnou a až mě z toho rozbolela hlava,“ podotkl prezident Legie Boguslaw Lesnodorski. „Nechápu, proč Viktoria hrála tak agresivně. A jejich trenér jim přitom za podobné zákroky tleskal.“\nLimberského zákrok v čase 20:55:\nS tím však nesouhlasí vedení Plzně. „Rád bych se ohradil proti vyjádřením prezidenta Legie, který hovořil o přehnané agresivitě hráčů Viktorie a pochvalách trenéra Koubka při jednotlivých nedovolených zákrocích. Toto kategoricky vylučuji,“ řekl generální manažer Viktorie Adolf Šádek. „Utkání se hrálo z obou stran ve vysokém tempu, osobní souboje byly vedeny tvrdě a korektně ze strany obou týmů.“\nKritiku prezidenta Legie odmítl i trenér Koubek. „Výrok prezidenta je daleko za hranou fotbalové etiky a já se chci ohradit vůči nařčení, že bych se měl kdykoli takového chování dopustit, neboť toto prohlášení zkrátka není založené na pravdě,“ prohlásil Koubek.\nÚmysl odmítl i Limberský, který se prý ještě během utkání snažil vše vysvětlit zástupcům Legie. „Jednalo se o situaci, ve které rozhodovaly desetiny vteřiny. Já bohužel přišel do souboje později, než jsem chtěl,“ popsal Limberský.\n„Ondrejovi jsem se omlouval bezprostředně po střetu a po mém vystřídání jsem se pokoušel všechno vysvětlit také hráčům a trenérům Legie přímo na lavičce. S Ondrejem jsem byl v kontaktu i na hotelu, zopakoval jsem, jak mě mrzí jeho zranění, a popřál mu brzké uzdravení. Věřím, že se co nejdříve vrátí na fotbalové trávníky,“ dodal reprezentační bek.\nTémata: Plzeňský kraj, zranění, Adolf Šádek, David Limberský, Ondrej Duda, Plzeň, Viktoria Plzeň


nástěnné malby a dekory\n<< Rulíšek 2012 atd atd atd\nIvo Habán 2012\nfrom painting to pure ornament and back from painting to pure ornament and back from painting to pure ornament and back\nMarkéta Zlesáková diplomovala v atelieru doc.Lindovského na Akademii výtvarných umění v Praze. Od té doby se specializuje na volnou malbu a ornamentální nástěnné malby a tapety. V současné době zpracovává inspirace z jednoletého uměleckého pobytu na Novém Zélandu a v Tongánském království.\nČím je nejvíce fascinovaná jsou šťavnaté pralesní kompozice, které zpracovává ve svých malbách a textilních dekorech.\nV podstatě stále osciluje na pomezí volného umění a užitého textilního umění, tyto dvě výrazové formy se stále prolínají a přinášejí vzájemnou inspiraci.\nJejím zatím nejrozsáhlejším cyklem jsou „Kamufláže“, lesní a pralesní motivy.\nRáda používá různé formy pro, v závěru, klasický závěsný obraz. Komplikovanost zdánlivě chaotického obrazu a následné vynoření se systému, ornamentu, to je forma, kterou autorka považuje za nejgeniálnější výraz umění a ráda by se jí přiblížila. Islámské ornamenty jsou pro ní inspirativní a nepřekonatelné.\n„Chci raději dosáhnout souzvuku s přírodou než ji napodobovat.“ (Georges Braque)\nTvorba Markéty Zlesákové názorně ukazuje širokou škálu možností přístupu ke skutečnosti obklopující člověka, nepřebernou mnohotvárnost vidění a prožívání přírody a života. Setkáváme se v ní s řadou tématických okruhů i způsobů jejich uchopování: od interiérů, přes občasné zapojení lidské postavy, často až k nerozeznání zapletené do okolního prostředí (byť není přesvědčeným figuralistou) až ke klasickým krajinám, z nich vycházejícím lineárním horizontům a jejich občasné abstrahující transformaci v dekorativní motivy a kamufláže. A právě její inspirace přírodou (mimo jiné i díky intenzivním zážitkům z pobytu v Thajsku, na ostrově Bali, Novém Zélandu a na souostroví Tongánské království), respektive krajinou a hustým podrostem tropické vegetace v jejích dílech dominuje. Pro autorku se stává příroda důležitou múzou a inspirací. Vychází vždy z reálné podoby skutečnosti, avšak zachycuje ji svým vlastním, osobitým způsobem, jak s jasně čitelným rukopisem a rázným vedením tahů štětce, tak nezaměnitelnou barevnou paletou laděnou převážně do modrých, zelených až fialových odstínů. Henri Matisse prohlásil: „Když maluji zelenou, neznamená to trávu, když maluji modrou, neznamená to nebe.“ Této svobody dosáhla autorka při proměňování reálného přírodního motivu v abstrahující stylizaci, kdy konečný obraz vykrystalizuje v dekorativní kompozici, nebo přímo do maskovacího vzoru (připomínajícího vojenské uniformy). Vidíme propojení obou témat, jako u obrazu „Prales“ (2010), kdy stylizovaná houština džungle zřetelně přechází v geometrizující maskovací motiv. Ale tento příklad trochu předběhl vývojovou linii tvorby Markéty Zlesákové. S dekorativními prvky a díly dosahujícími téměř až k hranici geometrické abstrakce se setkáváme již na jejích grafikách a sítotiscích („Západ slunce“, linoryt z roku 1999, několik variant „Východu slunce“, „Bazénky“, 2002 atd.). „Bazénky“ pak dále můžeme spatřit v jiné technice - malbě olejem na fólii o rok později (2003). Tyto geometrické objekty však tentokrát jakoby z části zakrýval velký zelený list. Téma slunce později dále zpracovává v olejích na plátně – „Západ slunce I. – III.“, 2011. Dalšími příklady ze současné doby jsou i olejomalby „Mřížky I.“ a „Mřížky II.“ (oba 2011). Pro tvorbu kamufláží byl v autorčině vývoji velmi zásadní obraz\n„Kamufláž I.“ (akryly na fólii, 2003), polyptych, skládající se ze čtyř obdélných polí. Zde se příznačně objevuje porůznu zakombinovaný o rok starší obraz „Muž a žena“, proměňující se ve směru zleva doprava v čím dál výraznějších až základních barvách do více tvarově oproštěnějších stylizací vegetativních motivů. Barevná skvrna se proměňuje a nabývá důležitějšího významu. Podobně je tomu i u obrazu „Kamufláž- autoportrét“ (olej na plátně a překližce, 2003). Zde se nachází různě zpracovaná autorčina podobizna na třech obdélných polích. Ve směru zprava doleva vidíme klasicky portrétovanou figuru s tropickou flórou v pozadí, která se v prostředním poli postupně rozkládá a zjednodušuje až do maskovacího vzoru, kde nám postava pomalu začíná splývat s formulovanou vegetací, aby v třetím obdélném poli vyšla synkreze postavy s pozadím v jediný, výrazně barevný, dekorativní celek. Sama na toto téma dodává: „Posun reálného prostoru do kamuflovaného je pro mě zajímavým momentem pro zpracování. Využívám tohoto znejistění nejen v námětu, ale i ve formě zpracování. Tím mám na mysli prolínání obrazu nebo grafiky s textilem. Vnímám zde úzkou hranici mezi obojím.“ Další příklad využití dekorativních prvků a jejich splývání s reálnými lze vysledovat u obrazů, ve kterých využívá již předem předtištěných květinových či kamuflážních vzorů, do kterých velice citlivě komponuje jednotlivé předměty a figury, např. „Babi a já“ (olej na látce a sololitu, 2003), nebo novějších obrazech jako „Čtenář“ (2009) či „Vzpomínka na A. Christie I.“. U druhé verze už je však dekorativní květinový vzor namalovaný olejem a ne tištěný (2010). Dosti zásadní díla představuje cyklus šesti obrazů „Paměť I. – VI.“ z let 2004 až 2005. Zde v kombinované technice akrylu a oleje na plátně rozkrývá své intimní prožitky spojené s odchodem z velkoměsta na venkov. Téma zachycené na plátnech má základ v několika fotografiích. Pro autorku je zásadní hluboký niterný zážitek a otázka, kterou sama vyslovila: „Jakou barvu má vlastně paměť?“ U všech šesti děl vidíme vývoj jak po obsahové, tak po formalin stránce. Malba na prvním obraze je popisnější, rukopis je do určité míry sevřenější, podobně je tomu i na druhém obrazu. Poté se již výraz malby přetváří, stává se uvolněnějším. Vidíme stylizovanou krajinu, kterou prochází drobná postava autorky samotné; snad ne náhodou ve směru, kterým se odehrává děj na plátnech zachycený. Autorka dále opouští dřívější popisnost ve prospěch expresivněji podané vegetace a přírodních motivů, až ve finále dochází k jednoduchému, abstrahovanému krajinnému motivu s měsícem. Při pohledu na tento obraz nelze nevzpomenout slov německého prozaika a dramatika Gerharta Hauptmanna: „Domníváš se, že tma je jen popřením světla, a zatím je to světlo v jiné\npodobě.“ Jedním z důležitých tématických prvků, který se na těchto plátnech poprvé vyskytuje a ke kterému se autorka dodnes vrací, je téma okna. Na prvním zachycuje ještě okno v městském bytě, které na druhém přímo přechází do otevřeného okna na chalupě, kterým je vidět okolní příroda, objevující se i v dalších obrazech. Všechny výjevy však mají jeden společný bod: lineární, vodorovný pás složený z několika různě barevných pruhů, který prochází dolní částí všech šesti obrazů jako jakýsi horizont. Zdůrazněn je tu určitý moment – moment propojení všech děl do jedné vzpomínky. Ano, tento pás je tou sjednocující vzpomínkou, pamětí, po jejíž barevnosti se autorka ptá. Významnou událostí v uměleckém životě Markéty Zlesákové byla účast na mezinárodním malířském sympóziu, pořádaném v srpnu roku 2010 Jihočeským krajem, organizací Kulturní most a Alšovou jihočeskou galerií v Hluboké nad Vltavou. Ještě je však nutno připomenout její účast na sympóziu Velký formát (2005) v jihomoravských Valticích, což svědčí o autorčině schopnosti a umu vyrovnat se s prací na prostorově rozměrných plátnech. Na Hluboké se autorka naplno ponořila do práce v plenéru. Snad ani sama netušila, jak ji pobyt v jižních Čechách poznamená. Vzniklo zde několik velice kvalitních děl, jako „Stmívání“, „Hladina II.“, „Kachničky“ nebo „Rybník na Hluboké“ (vše akryly na plátně). Důležitý byl ovšem fakt, že se pro ni stala práce v plenéru dalším plodným východiskem a inspirací. Jednak, podle jejích slov, je fotografie příliš neživá na práci s krajinou, jednak její záliba ve ztvárňování vodních hladin je důsledkem okouzlení „vodní krajinou“ jižních Čech. Díla zachycující krajinná zákoutí, ztichlé vodní hladiny zarostlé rákosem či lekníny, nebo naopak zurčící potoky, vyvolávají v člověku vzpomínku na díla slavných impresionistů. Ne nadarmo se některé z jejích obrazů nazývají „Imprese“ (2010). Markéta Zlesáková si přesto v žádném případě nedává za cíl napodobovat díla slavných autorů, ale ubírá se svou vlastní cestou hledání a poznávání odpovídající jejímu naturelu i současné době. A to nejen díky své, již zmíněné, osobně charakteristické barevné paletě. Zde se přímo nabízí paralela se slovy jednoho z nejpřednějších představitelů německého expresionismu počátku 20. století, Franze Marca: „Věříme, že svými obrazy jsme srdci přírody aspoň tak blízko jako Manet, který rafinovanou malířskou interpretací vnější formy a barvy uměl dát broskvi anebo růži její vůni a zároveň ukázat její vnitřní tajemnost. – Dnes hledáme pod závojem zdání skryté formy přírody, které pokládáme za důležitější než objevy impresionistů. Hledáme a malujeme vnitřní duchovní stránku přírody, protože tuto stránku vidíme právě tak, jako si kdysi lidé\nuvědomili existenci fialových stínů a ovzduší okolo věcí. – Věříme velmi vážně, že naše formy odvozujeme z přírody, právě tak jako všichni umělci v minulosti.“ Jak vidíme, výtvarný svět Markéty Zlesákové je velice členitý a bohatý. Při své tvorbě ráda hledá a používá různé formy a způsoby vyjádření, experimentuje, má zálibu jak v klasické plenérové malbě, tak v komplikovanosti zdánlivě chaotického obrazu ornamentu či kamufláže, z něhož vystupuje finální dílo ve svém řádu. Autorčina tvorba je neustálé učení a hledání, jak o něm mluví sv. Augustin: „Hledáme, abychom nacházeli, ale nacházíme, abychom hledali - tedy hledáme, abychom hledali.“ Jedno však lze s jistotou prohlásit: Markéta Zlesáková nejen že neustále hledá, ale také nachází. A její díla jsou svědectvím jejího pracovitého a upřímného hledání.