Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins | Protocol (Translated to Italian)\nLe ricerche in corso in interazioni fago-ospite dipendono estrapolazione conoscenze da (meta) genomi. È interessante notare che, il 60 - 95% di tutte le sequenze dei fagi condividere alcuna omologia con le proteine annotati attuali. Di conseguenza, gran parte dei geni fago annotati come ipotetico. Questa realtà incide pesantemente l'annotazione di entrambi i geni metabolici strutturali e ausiliari. Qui vi presentiamo metodi Phenomic progettati per catturare la risposta fisiologica (s) di un host selezionato durante espressione di uno di questi geni fago sconosciuti. Multi-fenotipo del saggio Piastre (MAP) vengono utilizzati per monitorare la diversità di utilizzazione del substrato di accoglienza e successiva formazione della biomassa, mentre la metabolomica fornisce un'analisi bi-prodotto attraverso il monitoraggio del metabolita abbondanza e la diversità. Entrambi gli strumenti sono utilizzati simultaneamente per fornire un profilo fenotipica associata con l'espressione di un singolo fago putative open reading frame (ORF). Risultati rappresentativi per entrambi i metodi sono confrontati, highlighting le differenze fenotipiche profilo di un host che trasportano sia putativi geni fago strutturali o metaboliche. Inoltre, le tecniche di visualizzazione e ad alto rendimento condutture computazionali che hanno facilitato l'analisi sperimentale sono presentati.\nI virus che infettano i batteri (aka batteriofago o fago) sono stimate a esistere da più di 10 31 particelle simili al virus (VLP) a livello globale e più numerosi di tutti gli altri organismi in un ambiente 1,2. Il primo studio metagenomica indagando le comunità virali associati agli ambienti marini incentrata sulla quantificazione della diversità visto all'interno della frazione virale 3. Inoltre, Breitbart e colleghi hanno scoperto che oltre il 65% delle sequenze virali di comunità condivisa omologia di eventuali sequenze disponibili nelle banche dati pubbliche. Studi successivi hanno trovato prove metagenomiche simile: metagenomi da sedimenti marini a San Diego, California contengono il 75% sconosciuti sequenze virali 4; metagenomi dai laghi ipersalini del Salton Sea contengono il 98% sconosciuti sequenze virali 5; e metagenomi corallo associata contengono 95-98% sequenze virali sconosciuti 6. Questo accumulo di informazioni non annotate ha portatomateriale genetico Fago essere "la materia oscura dell'universo biologico" 7.\nCaratterizzazione genomica del fago si basa sull'identificazione di similarità di sequenza attraverso il confronto contro banche dati esistenti degli acidi nucleici e proteine. Poiché le informazioni genetiche fago codifica è prevalentemente ignota, metodi basati omologia-sono inefficaci. All'interno del loro genoma, fagi tipicamente codificano tre principali tipi di geni: trascrizione e replicazione dei geni, i geni del metabolismo, e geni strutturali. I geni di trascrizione e replicazione (classe I / II geni 8) includono polimerasi, primases, endo / eso-nucleasi e chinasi. Questi geni sono altamente conservati per la loro importanza in infezione fagi, trascrivendo e replicare materiale genetico fago. Polimerasi dei fagi sono facilmente identificabili con metodi sequenza omologia tradizionali a causa della loro conservazione globale 9 e hanno dimostrato di servire come efficace marcatori filogenetici 10.Al contrario, fago metabolico e geni strutturali (classe II / III geni 8) sono sempre più divergenti e spesso annotato come geni ipotetiche.\nFagi geni metabolici influenzano la capacità metabolica del paese ospitante e non sono necessariamente necessari per la replicazione virale. Questi geni, spesso denominate geni metabolici come ausiliari 11 (AMG), sembrano modulare il metabolismo di accoglienza e consentire la progressione ottimale di infezione e il successo del virione di maturazione. AMG sono stati associati con l'utilizzo e la diffusione delle sostanze nutritive che limitano o in percorsi di produzione di energia. Alcuni esempi includono geni fotosistema presenti nei genomi di varie cyanophage 12-16, geni connesse e regolati da metabolismo del fosfato 17,18, e l'utilizzo della via dei pentoso fosfati per fago dNTP biosintesi 18,19. In confronto, i geni strutturali sono tra la metà e la fine degli anni geni prodotte durante l'infezione e variano tra i diversi fago-hoSistemi di st. La produzione delle proteine strutturali sono subordinati alla disponibilità di dNTP virale, e piscine energia per la loro trascrizione, traduzione e assemblaggio 8. Le proteine del capside e fibra di coda strutturali sono considerati come il più divergente di tutti i geni codificanti proteine virali e sono necessari per la produzione di virion successo. La loro divergenza è tipicamente attribuita al ruolo attivo che ricoprono nella definizione dei virus-ospite coevoluzione 20. Proteine divergenti, indipendentemente dalla classe gene, vengono facilmente trascurati quando utilizzando tecniche di omologia e allineamento di sequenze tradizionali. Uno sforzo per correggere le limitazioni osservati con sequenza comparazioni severe ha comportato strumenti bioinformatici capaci di utilizzare caratteristiche di sequenza per determinare associazione, come le reti neurali artificiali 21. Reti neurali artificiali (ANN) consentono la previsione di geni strutturali e metabolici, tuttavia, richiedono validazione sperimentale a valle di caratterizzare direttamentela funzione del gene.\nL'obiettivo di questo manoscritto è quello di fornire i protocolli Phenomic in grado di monitorare sia il metabolismo catabolico e anabolico di un batterio ospite durante l'espressione di un nuovo gene fago, funzionalmente previsto attraverso RNA. Il campo di fenomica, biologia associata a fenotipi cellulari, è ben consolidata in biologia dei sistemi per aiutare nelle indagini di proteine con funzione sconosciuta o pleiotropico. Strumenti Phenomic vengono utilizzati per collegare le informazioni fenotipiche all'informazione genotipica. Ipotizziamo per i geni dei fagi putativi che la loro funzione (s) può essere determinato attraverso l'osservazione di accoglienza effetti fisiologici durante l'espressione del gene fago. Per studiare questa ipotesi, sono stati scelti due metodi quantitativi. Piastre Multi-fenotipo Assay (MAP) sono stati usati per monitorare l'utilizzo del substrato di accoglienza e la conseguente formazione di biomassa, mentre la metabolomica misurate diversità metabolita ospite e relativa abbondanza durante la crescita in ambienti specificicondizioni mentali. Proteine strutturali e metaboliche putativi sono stati overexpressed in Escherichia coli e risultati rappresentativi di entrambi gli esperimenti vengono confrontati. Numerose tecniche visive e condotte di elaborazione high throughput vengono presentati per facilitare la replicazione sperimentale. Infine, la riproducibilità e la precisione dei metodi presentati sono discussi nel contesto degli effetti fisiologici attesi per una proteina capside annotato e fago proteine metabolica, tioredossina, più due AMGs putativi.\n1. Preparazione di Multi-fenotipo Assay Piatto (MAP) Substrati, basale Media, Pre-crescita media, e Buffer\nFate 50 ml di 1,0-1,25% scorte substrato.\nSciogliere 1,0-1,25% (w / v) di supporto solido in acqua sterile (calore se necessario). Filtro sterilizzare soluzioni con un gruppo filtro 0,22 micron e le scorte dei negozi a temperatura ambiente. Esempi di substrati utilizzati in questi esperimenti sono riportati nella Tabella 2.\nRendere 250 ml di media basale 3x per tutte le classi di substrato (carbonio, azoto, zolfo e fosforo). I MOPS (3 morpholinopropane-1-solfonato) basati mezzi basali 22 contiene i seguenti: 1x MOPS (40 MOPS mm + 10 mm) tricina, 0,4% glicerolo *, 9.5 NH mm 4 Cl *, 0.25 Naso mm 4 *, 1,0 MgSO mM 4 *, 1.32 mM K 2 HPO 4 *, KCl 10 mM, 0,5 mM CaCl 2, 5 mM NaCl, 6 mM FeCl 3, e 0,1% (w / v) L-arabinosio ** (Tabelle 1 e 2) .\nNota: * Questi composti non sono inclusi in base al supporto basale. Ad esempio, 0,4% glicerolo non viene utilizzato dai media basali carbonio e zolfo terreni di base 1.0 mM MgSO 4 è sostituito dal 1,0 mM MgCl 2. ** L-arabinosio è specifico per l'induzione della pBAD promotore vettore, pEMB11, che è stato trasformato in un ara - E. coli K-12 ceppo (BW 27784) 23.\nAggiungere ogni componente dei media basale in un pallone sterile e portare la soluzione al volume. Mescolare bene. Con un'unità 0,22 micron, filtro sterilizzare ogni supporto basali in una bottiglia sterile.\nFate 500 ml di mezzi MOPS pre-crescita. MOPS basato sui media pre-crescita del 22 contiene: 1x MOPS (MOPS 40 mm + 10 mm) Tricine, 0,4% glicerolo, 9,5 mm NH 4 Cl, 0,25 Naso mm 4, 1.0 MgSO mm 4, 1,32 mm K 2 HPO 4, KCl 10 mM, 0,5 mM CaCl 2, 5 mM NaCl e 6 mM FeCl 3.\nAggiungere ognicomponente dei mezzi di pre-crescita in una beuta sterile e portare a volume. Filtro sterilizzare con un gruppo filtro di 0,22 micron, quindi aggiungere ampicillina ad una concentrazione finale di 100 mg / ml. Conservare la soluzione a 4 ° C.\nFate 500 ml di 0.5x Luria-Bertani (LB) piastre di agar. In un pallone sterile, aggiungere componenti LB per fare una concentrazione 0,5x (1,25 g estratto di lievito, 2,5 g NaCl, 2,5 g triptone, 7,5 g di agar). Mescolare bene e autoclave per la sterilizzazione.\nRaffreddare agar, poi aggiungere 100 mg / ml di ampicillina antibiotico con miscelazione. Versare ~ 25 ml di agar in piastre di Petri, permettono di impostare, e conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso.\nRendere 250 ml di Tris 10 mM (pH 7,4) più 10 mM MgSO 4 soluzione tampone. Filtro sterilizzare con una unità di 0,22 micron filtro, e la soluzione di conservare a temperatura ambiente.\n2. Preparazione di Bacterial Cell-sospensione\nPreparare colonie fresche. Da un stock di glicerolo congelato 12,5%, piatto fresco E. coli clones su 0.5x LB agar contenente 100 mg / ml di ampicillina. Incubare a 37 ° C per 24 ore.\nPreparare colture liquide:\nPipettare 3 ml di supporti pre-crescita contenenti 100 mg / ml di ampicillina in provette di coltura. Per ogni clone, utilizzare triplica biologici.\nSeminare colonie indipendenti di sezione 2.1 in provette di coltura preparati. Incubare a 37 ° C con agitazione per 22 ore.\nPellet e lavare le cellule batteriche:\nTrasferimento O / N culture in 1,7 ml tubi microcentrifuga. Cellule pellet tramite centrifugazione a velocità massima (16.900 xg) per 2 minuti in una microcentrifuga. Decantare il surnatante e lavare le cellule da ri-sospensione in 500 ml di 10 mM Tris / 10 MgSO mm 4 buffer. Ripetizione.\nRe-pellet cellule surnatante decantare e risospendere le cellule in 1 ml di 10 mM Tris / 10 MgSO mm 4 buffer.\nMisurare densità cellulare e concentrare le cellule (se necessario):\nDiluire le cellule dal punto 2.3.3 10 volte inTris mM il 10/10 mM MgSO 4 tampone e trasferire questa diluizione nella cuvetta. Misurare la densità ottica (OD 600 nm) di questa diluizione e registrare.\nConcentrato cellule per conseguire concentrazione finale di 0.07 (OD 600 nm) nelle mappe (le cellule saranno diluiti 15 volte quando vengono aggiunti alle mappe, quindi le cellule devono essere ad una concentrazione iniziale di OD 600 nm = 1,05). Trasferimento sospensione cellulare concentrata in un serbatoio e salvare (a temperatura ambiente) fino al punto 3.5 del MAP preparazione.\n3. Preparazione del Multi-fenotipo Piastre Assay (MAP)\nEtichetta MAP. Etichetta 96 pozzetti piastre micro-titolazione sterili con un E. coli numero di identificazione clone e tipo di mappa schematica.\nAliquota acqua sterile in mappe. Trasferire asetticamente acqua sterile in un serbatoio di liquido. Pipettare 60 microlitri in ciascun pozzetto della piastra di micro-titolazione con una pipetta multicanale.\nAliquota dei media basale into mappe. Trasferire asetticamente 3x supporti basali in un serbatoio di liquido. Pipettare 50 microlitri in ciascun pozzetto della piastra di micro-titolazione con una pipetta multicanale. Ripetere i punti 3.2 e 3.3 per ciascun supporto basali utilizzati nel MAP schematico.\nSubstrati Aliquota in mappe. Trasferire 30 ml di ogni substrato nel pozzo appropriata delle mappe.\nAggiungi sospensione batterica alle mappe. Trasferimento 10 ml di cellule batteriche da sezione 2.4.2 in ciascun pozzetto del MAP usando una pipetta multicanale. Cambiare suggerimenti prima pipetta reintroduzione di nuovo nella cultura magazzino.\nMappe di copertura con pellicola adesiva. Coprire ogni piatto con un unico film targhetta adesiva. Premere saldamente la pellicola cima pozzetti della piastra e lungo i bordi per creare una tenuta uniforme e stretto. Rimuovere la pellicola in eccesso dai bordi della piastra di micro-titolazione con una lama di rasoio sterile.\nMisurare la densità ottica di MAP:\nMettere MAP preparati nella manica "Input" di un Spectro multidiscolettore di piastre fotometro. Aprire la piastrina di software di lettura e creare un protocollo che misura l'assorbanza (OD 600 nm) ogni 30 min, per un totale di 32 ore, con 60 sec di scuotimento tra letture.\nLa temperatura impostata nell'apparecchio a 37 ° C. Inizia protocollo una volta MAP sono equilibrati per impostare la temperatura.\nDopo 32 ore, rimuovere le mappe dal manicotto "Uscita" del lettore di piastre. Etichettare ogni file di testo di dati da includere: la E. Numero di identificazione del clone coli, data la MAP corse, e il tipo di schema MAP.\n4. Multi-fenotipo del saggio Piastre (MAP) trasformazione e di parametrizzazione\nValutare le curve di crescita che utilizzano un processo di QA automatizzato, ad esempio, PMAnalyzer 24.\nVerificare che le curve di crescita hanno OD 600 nm <0.20 nei primi 2 ore. Non utilizzare assorbanza a punto di tempo iniziale (t 0) nel filtro a causa di artefatti di condensazione, che in genere si risolvono int 1 (30 min).\nRimuovere le curve di crescita che violano filtro QA. Salvare le informazioni curva (nome del campione, oltre il numero, e OD 600 nm) dei valori in un file di output separato per riferimento futuro. Continuare con l'analisi se curva di crescita passa filtro QA.\nCalcolare curve di crescita medi. Utilizzando la replica dei dati, per bene, calcolare la curva di crescita medio prendendo la densità ottica media (OD 600 nm) valore in ogni punto. Record risultante curve di crescita medi in un file di output separato per un utilizzo futuro.\nCalcolare il modello logistico più adatta per ogni curva di crescita utilizzando un adattamento dell 'equazione proposta da Zwietering 25. L'equazione logistica comprende tre parametri che descrivono la crescita batterica: il tempo di ritardo, λ (ora), il tasso massimo di crescita, la μ max (OD 600 nm 100 -1), e la produzione di biomassa finale, α (OD 600 nm). Utilizzare i dati al tempo = 30 min (y 1) come valore iniziale a causa di artefatti di condensa.\nCalcolare il tasso di crescita massimo utilizzando una ricerca diretta. Registrare il tasso più grande di cambiamento in un intervallo di 90 minuti all'interno dei dati.\nStimare la produzione di biomassa finale ricercando il valore asintotico superiore del più grande media mobile su una finestra di 90 minuti. In particolare, definire l'asintoto della curva di crescita.\nUtilizzando la μ max e A valori da 4.3.1 e 4.3.2, trovare il valore λ provando tutti i valori di λ:\nUsare ogni valore λ per calcolare una somma di errori al quadrato (SSE). Utilizzare il più basso SSE è il SSE (Às):\n5. fenotipo analisi di MAP\nCalcolare il livello di crescita (GL) per ogni curva di crescita per valutare la crescita complessiva, per clone per substrato. Definire GL come la media armonica dei valori logistico-misura spostati:\nAssegnare un fenotipo ad ogni curva di crescita in base ai valori GL. Qui, i quattro fenotipi utilizzati sono: crescita attesa, nessuna crescita, guadagno di funzione, e perdita di funzione.\nDeterminare fenotipi confrontando crescita in tutti i cloni su un substrato specifico in termini di deviazioni standard dalla media. Utilizzare questa statistica e una soglia minima di crescita per designare il fenotipo presentata dalla curva di crescita (Figura 1A, B). Figura 1C fornisce esempi di assegnazione fenotipo.\nDefinire la crescita come GL ≥ 0.4 (Figure 1A, B). Definire guadagno di funzione (Figura 1C, verde), come avere un GL> due deviazioni standard sopra la media e una media> la soglia di crescita. La perdita di funzione (Figura 1C, rosso) è definito come avere un GL <due deviazioni standard sotto la media e una media> la soglia di crescita.\nCreare rappresentazioni visive del set di dati in base a fenotipi e curve di crescita.\nVista la dinamica di crescita che ritraggono OD 600 nm valori come colore di confrontare rapidamente le curve di crescita tra i più cloni (Figura 2).\nVisualizza distribuzioni fenotipiche tra tutti i cloni in base alle condizioni di crescita (Figura 3).\n6. Costruire la cultura Apparatus continua\nCostruzione di porti Reactor (4A, B). Praticare tre 1/4. Fori, distanziati da 3/4 in. A parte, nel tappo del reattore coltura continua.\nFoα port r: vite di un pannello stile femminile filo luer montare a 1/16 in sbavatura dal fondo del tappo con la sbavatura rivolta verso l'alto, fuori dal tappo.. Ardiglione sicuro con un pannello da 1/4 in. Montare il dado di bloccaggio.\nPer la porta β: avvitare un pannello stile femminile filo luer montare a 1/16 in ardiglione con l'ardiglione rivolta verso l'alto, fuori dal tappo.. Ardiglione sicuro con un pannello da 1/4 in. Montare il dado di bloccaggio.\nPer la porta γ: Vite un pannello stile femminile filo luer montare a 1/16 in sbavatura dal fondo del tappo così la sbavatura è rivolta verso l'alto, fuori dal tappo.. Sbavatura sicuro con 1/4 in. Montaggio a pannello dado di bloccaggio. Vite di un luer maschio con anello di bloccaggio integrale 1/8. Tubo ampia foro al raccordo sulla parte interna del tappo sbavatura.\nPer la luce di uscita: praticare un 5/16 in foro al contrassegno 75 ml del reattore coltura continua.. Tagliare 3/4. L'estremità dado del 1/4 in. Spinato montaggio della paratia. Avvitare la 1/4. Paratia spinato raccordo (guarnizione sia all'esterno della bottiglia ed il dado è sulla parte interna, FIGURA 4B).\nFeeding costruzione porta bottiglia (Figura 4C). Praticare due 1/4. Fori distanziati 1. A parte nel tappo della bottiglia di alimentazione.\nPer la δ porto: avvitare un pannello stile femminile filo luer montare a 1/8 in ardiglione con l'ardiglione rivolta verso l'alto, fuori dal tappo.. Ardiglione sicuro con un pannello da 1/4 in. Montare il dado di bloccaggio.\nPer la ε porto: avvitare un pannello stile femminile filo luer montare a 1/16 in ardiglione con l'ardiglione rivolta verso l'alto, fuori dal tappo.. Ardiglione sicuro con un pannello da 1/4 in. Montare il dado di bloccaggio.\nVite un Luer maschio con anello di bloccaggio integrale 1/8 in. Tubo largo foro al raccordo a resca, sulla parte interna del tappo.\nAlimentazione tubi e le estensioni del tubo:\nTagliate due 1. Pezzi di tubo (1/8 in. Di diametro esterno (OD) x 1/16 in. Diametro interno (ID)). Pezzi adattarsi su porti α e γ del reattore coltura continua realizzati nella sezione 5.2.\nTagliare un singolo 1. Pezzo di tubing (1/4 in. OD x 1/8 in. ID). Fit pezzo sul porto Β del reattore coltura continua.\nTagliare un singolo 3.5 in. Pezzo di tubo (1/8 in. OD x 1/16 in. ID). Adatta questo pezzo all'interno di γ portuali, sul luer maschio con anello di bloccaggio integrato a 1/8 in. Tubo foro largo. Port γ è la porta di campionamento del reattore coltura continua.\nTagliare un singolo 1. Pezzo di tubo (1/4 in. OD x 1/8 in. ID). Applicare questo pezzo sulla porta δ del biberon.\nTagliare un singolo 11. Pezzo di tubo (1/16 in. OD x 1/8 in. ID). Montare questo pezzo all'interno del porto ε del biberon, il luer maschio con anello di bloccaggio integrale 1/8. Tubo foro largo.\nTagliate due 18 in. Pezzi di tubo (1/8 in. OD x 1/16 in. ID). Montare un pezzo di porto ε del biberon. Salvare l'altro pezzo per la sezione 7.\n7. Esecuzione Culture continui per Metabolomica\nSterilizzare i materiali:\nAutoclave il materiale secco per 30 min. Assicurati di avvolgere tappo del biberon fatta al punto 5 in un foglio di alluminio. Tenere attaccato dritto tubo.\nAvvolgere tappo del reattore coltura continua, fatta al punto 5, in un foglio di alluminio. Tenere attaccato dritto tubo. Avvolgere 18 in. Tubo tagliato nella sezione 6.3.5 e il più piccolo adattatore di tubo della pompa peristaltica in un foglio di alluminio. Tenere il tubo dritto. Autoclave per 30 min.\nFai 2 L di 0,5x LB brodo. Nel biberon, fare 0.5x LB brodo. Coprire con un foglio di biberon. Autoclave per 1 ora.\nFate 70 ml di brodo LB 0.5x. Versare il brodo nel reattore coltura continua. Posizionare un ancoretta nel reattore coltura continua. Coprire con un foglio e reattore autoclave per 30 min.\nCultura continuo set-up:\nDa un stock di glicerolo congelato 12,5%, piatto fresco E. cloni coli su 0.5x LB agar contenente 100 mg / ml di ampicillina. Covarea 37 ° C per 24 ore.\nInoculare una singola colonia in 3 ml di 0.5x brodo LB contenenti 100 mg / ml di ampicillina. Per ogni clone utilizzare triplicato biologici. Incubare a 37 ° C con agitazione per 22 ore.\nCollegare insieme le parti.\nMettere tutti i materiali in autoclave in una cappa di sicurezza biologica e accendere la luce ultravioletta su mentre i media si raffredda. Una volta che i media si è raffreddato, aggiungere 0,1% di L-arabinosio e 100 mg / ml di ampicillina a tutti 0.5x LB brodo.\nUnwrap continuo cap reattore cultura e avvitare al reattore. Evitare di toccare il tubo di campionamento. Svolgere il tappo della bottiglia di alimentazione e avvitare il biberon. Evitare di toccare il tubo di campionamento.\nTenere il 18 in. Tubo collegato alla porta ε sterile. Un-avvolgere il 18. Tubo e l'adattatore tubo della pompa peristaltica.\nMontare una estremità libera 18 in. Tubi su una estremità dell'adattatore tubo della pompa peristaltica. Montare l'altra estremità dell'adattatore tubo della pompa peristaltica ail tubo 18 in. collegato alla porta ε del tappo della bottiglia di alimentazione.\nVite 0,22 micron unità filtranti su porti β e δ del reattore coltura continua. Vite un'unità 0,22 micron filtro sull'adattatore di porto α. Per l'unità filtro di 0,22 micron, montare l'estremità libera 18 in. Tubo.\nAvviare la coltura continua.\nNella cappa di biosicurezza, inoculare il reattore cultura continuo con 100 ml di O / N cultura realizzati nella sezione 7.2.1.1.\nChiudere il sistema prima di spostare la cultura continua in un incubatore a 37 °. Nel incubatore hanno un piatto mescolare magnetica e mini pompa peristaltica istituito.\nInserire l'adattatore tubo della pompa peristaltica nella pompa peristaltica. Tubing dal biberon inizia dalla "In" lato e il tubo che porta al reattore inizia al lato "Out".\nImpostare la pompa peristaltica a: "FAST". Avviare la pompa peristaltica passando per R20; FORWARD ". Verificare che supporti comincia a fluire attraverso il tubo.\nPosizionare reattore sulla piastra di agitazione magnetica e iniziare la miscelazione. Reattore cultura continua deve equilibrare per 24 ore prima del campionamento.\nIl campionamento della cultura continua. Vite a 5 ml siringa luer lok su γ portuali e tirare su 4,5 ml di cultura.\nUtilizzare 500 ml di coltura per misurare la densità (OD 600 nm). Diluire le cellule per fare 4 x 1 ml culture a OD 600 nm = 0,35.\nAliquota culture diluito in 1,7 ml provette microcentrifuga. Ripetere campionamento ogni 12 ore per 4 giorni.\nPreparare i campioni per GC-TOFMS:\nCellule pellet tramite centrifugazione alla massima velocità (16.900 xg) per 2 minuti. Decantare il surnatante. Lavare le cellule con 500 ml di tampone fosfato salino (PBS). Ripetere questo passaggio.\nDecantare il surnatante un'ultima volta, e poi immergere tubi microcentrifuga con celle in pellet in azoto liquido fino gorgogliare fermate. Sstrappò campioni in -80 ° C freezer.\n8. L'esecuzione di passaggio seriale Culture batch per Metabolomica\nPreparazione batterico cellula-sospensione. Da un stock di glicerolo congelato 12,5%, piatto fresco E. coli cloni su 0.5x LB agar contenenti 100 mg / ml ampicillina. Incubare a 37 ° C per 24 ore.\nSeminare singole colonie in 3 ml di 0,5x LB brodo contenente 100 mg / ml ampicillina. Utilizzare triplicato biologiche per ogni clone.\nCulture lotti di passaggio di serie.\nSottocultura O / N da 8.1.1 tramite una diluizione di 500 volte in 3 ml di brodo LB contenente 50 ug / ml di ampicillina e 0,1% L-arabinosio. Subculture dovrebbe avere un OD 600 nm <0.005. Incubare a 37 ° C con agitazione.\nControllare la densità ottica (OD 600 nm) a 2 e 2,5 ore. Crescere cellule per ottenere OD 600 nm = 0.35.\nSubculture via 500 volte diluzione in 3 ml di brodo LB contenente 50 ug / ml di ampicillina e 0,1% L-arabinosio. Subculture dovrebbe avere un OD 600 nm <0.005.\nCampionamento culture lotti di passaggio di serie.\nUtilizzando pinze sterili, collocare un filtro da 0,22 micron membrana sulla cima di un filtro del collettore. Aliquota 1 ml di tampone fosfato (PBS) sulla carta da filtro e poi accendere pompa a vuoto.\nRipetere l'aggiunta di 1 ml di PBS. Trasferire 1 ml di sottocultura dalla sezione 8.2.3 sulla carta da filtro. Da qui, muoversi rapidamente per ottenere campioni in azoto liquido immediatamente. Completa questo in 1 min.\nAliquota 1 ml di PBS su carta da filtro per il lavaggio del campione. Lavare rapidamente senza spargimento campione sopra i lati della carta da filtro. Ripetizione.\nUtilizzando pinza sterile filtro posto in una provetta per microcentrifuga 1,7 ml piegando con cura il filtro. Immergere provetta per microcentrifuga in azoto liquido fino gorgogliare fermate. Conservare campione -80 ° C freezer.\n9. Metaboliti Analisi ed elaborazione\nNave 3 campioni per clone di ghiaccio secco ad un impianto di base metabolomica per l'elaborazione del campione, l'analisi e la normalizzazione della GC-TOFMS.\nPer ciascun campione, determinare la media, mediana, deviazione standard e coefficiente di variazione attraverso metaboliti, utilizzando i dati replicati.\nPer l'analisi statistica, codificare manualmente un oleodotto QA utilizzando istruzioni condizionali e le esecuzioni ripetitive 26 per rimuovere i metaboliti che non seguono determinate condizioni.\nPer Condizione 1, rimuovere metaboliti in cui più di 2 campioni hanno nulla abbondanza. Rimuovere standard interni dai profili metabolomica.\nPer Condizione 2, rimuovere quelle metaboliti che non si trovano nelle cellule di interesse. Qui, rimuovere le seguenti metaboliti: indolo 3 acetato, dihydroabiet Acido ic, acido nonadecanoic, acido salicilico, salicylaldehyde, colesterolo, fenolo, 1-Monostearina, ottadecanolo, 1-monopalmitin, dodecano, dodecanolo, 1-esadecanolo, 5-methoxytryptamine, acido benzoico, acido pentadecanoico, acido fosforico, acido pelargonico, palmitico , acido caprico, idrossilammina, acido stearico, acido miristico, maleimmide, levoglucosano e acido 4-idrossibutirrico.\nPer Condizione 3, rimuovere tali metaboliti il cui coefficiente di variazione è maggiore di 1.\nCattura effetti metabolomica globali, cercando in metabolita abbondanze relative.\nCreare una rappresentazione visiva del metabolita dell'abbondanza mediana per clone per ogni metabolita (Figura 6).\nIdentificare i valori anomali osservando frequenze coppia clone-metabolita.\nCalcolare il punteggio Z per ogni valore medio di ogni metabolita in un clone. Calcola punteggi z utilizzando la seguente equazione:\nNota: Term X MC rappresenta il livello abbondanza di un metabolita specifico per un clone specifico. Term μ C rappresenta la media di tutti i cloni di un metabolita specifico. Termine σ C è la deviazione standard associata.\nCrea una rappresentazione visiva dei dati in cui sono evidenziati i valori anomali (dati non forniti).\nTutti i campioni utilizzati per determinare le fasi di lettura aperti (ORF) selezionati in questo studio sono stati raccolti da Starbuck Island, sito 7 (star7) e Caroline Atoll, Site 9 (CAR9) dei meridionali Line Islands. Si stima che circa 100 L di acqua di mare da questi siti è stato raccolto sotto le pompe di sentina strato limite con corallo, come descritto in precedenza 5. Contenuto delle pompe sono stati oggetto di frazionamento attraverso grandi filtri pori per rimuovere piccoli eucarioti e successivamente concentrati usando 100 kDa filtri flusso tangenziale lasciando solo microbi e virali come particelle (VLP). Per separare i VLP, rimanendo l'acqua di mare è stata fatta passare attraverso 0,45 micron filtri conseguente virome. Cloroformio è stato introdotto per questa frazione virale di arrestare la crescita di eventuali cellule rimanenti e conservata a 4 ° C.\nVLPs sono stati purificati utilizzando il metodo di cloruro di cesio, in cui gradienti di densità separati tramite centrifugazione e consentono il recupero di virioni a ~ 1,35 g / ml a 1,5 g / ml 3. DNA virale è stato estratto utilizzando un CTAB / fenolico: protocollo cloroformio e amplificato tramite diversi amplificazione spostamento utilizzando reagenti Phi29. Il sequenziamento del virome è stato realizzato con la tecnologia disponibile in commercio pirosequenziamento.\nBioinformatics utilizzati nella lavorazione e selezione di ORF virali per questo studio sono i seguenti. Tre fasi di pre-processing sono stati utilizzati per le metagenomi virali CAR9 e star7. Innanzitutto, software pubblico è stato utilizzato per rimuovere le sequenze di tag che il risultato di amplificazione del DNA virale prima del sequenziamento 27. In secondo luogo, gli artefatti sequenziamento comuni come duplicati di sequenza e low copy number sono stati filtrati dal set di dati tramite un programma bioinformatica aggiuntivo 28. Infine, la rimozione della contaminazione sequenza straniero 29 è stata effettuata per quelle sequenze che avevano ≥ 90% di copertura e ≥ 94% di identità con le sequenze nei seguenti database: RefSeq vgenomi IRUs; Umana - Riferimento GRCh37; Umana - Celera Genomics; Umana - Craig Venter (HuRef); Umano - Seong-Jin Kim (Corea); Umana - Cromosoma 7 versione 2 (TCAG); e umano - James Watson, Yanhuang (YH, asiatico), yoruba (NA18507; africano) sequenze di riferimento 21. A seguito di questi processi, le sequenze dei campioni CAR9 ammontano a 591.600 e sequenze star7 ammontano a 939.311. Queste sequenze sono stati caricati su MGRAST e assemblati via software assembler utilizzando le impostazioni predefinite. Contigs sono stati tradotti in 6 fasi di lettura e putativi di lettura aperta (pORFs) sono stati identificati utilizzando script, come descritto in precedenza 21.\nPer identificare ORF sconosciuti una serie di ricerche di somiglianza base sono state eseguite per rimuovere ORF di funzione nota. In sintesi, le seguenti ricerche sono state condotte con i loro criterio di ricerca corrispondenti 21:\nSomiglianza significativa di ≥ 95% di identità su ≥40 coppia di basi (bp) di MGRAST BLAT database M5NR.\nSomiglianza significativa (e-valore ≤ 0,001) per TBLASTN contro tutti metagenomi pubblici in My Resource metagenoma database.\nSomiglianza significativa (e-valore ≤ 0,001) per BLASTP e TBLASTN contro database di NR.\nSomiglianza significativa (e-valore ≤ 0,001) da RPS-BLAST contro il Database Conserve dominio.\nTraduzioni di proteine da una frazione di selezione di ogni serie di dati comparati contro strutture proteiche risolte nel Protein Data Bank.\nCalcolo delle frequenze dinucleotide utilizzando pacchetto Dinucleotide firme.\nI pORFs risultanti sono stati progettati per l'espressione in E. coli utilizzando pubblicamente disponibile il software di progettazione gene. Back-traduzione delle sequenze amino-acido impiegato una tabella di utilizzo universale Codone progettato per ospitare espressione in E. coli con una soglia minima di utilizzo del 2%. Sequenza di riconoscimento enzima di restriziones per BamHI e HindIII sono stati esclusi dalle sequenze per facilitare la clonazione. Una società esterna ha sintetizzato il gene ingegnerizzato sequenze 30 e poi ORF sono stati clonati in un mezzo-copia promotore numero pBAD vettore, pEMB11, via clonazione enzima di restrizione standard. Tutti i cloni sono stati trasformati in E. coli K-12 ceppo BW 27784 23.\nPiastre Multi-fenotipo Assay (MAP)\nUn elevato throughput e software solida pipeline è stato sfruttato per l'analisi delle mappe, il PMAnalyzer 24. Il gasdotto è stato sviluppato in un ambiente server Linux ed esegue varie fasi tra cui: l'analisi dei file di densità ottica, formattazione dei dati in file di testo leggibili, di pre-elaborazione delle curve di crescita per la garanzia della qualità (QA), e che svolgono tecniche di modellazione matematica per analizzare le curve di crescita . Sono stati sviluppati Gli script di modellazione primarie in Python versione 2.7.5 di utilizzare il modulo PyLab.\n(Figura 2A). Curve di crescita grezzi sono stati confrontati con le curve di crescita logistici per determinare se il programma PMAnalyzer accuratamente parametrizzato e modellato crescita clone durante la sperimentazione (dati non mostrati). Per ulteriori informazioni sulla precisione e la validità delle mappe e PMAnalyzer vedere Cuevas et al. 24\nDopo la convalida del metodo, i dati MAP è stato analizzato utilizzando i parametri multipli, come il tasso di crescita massimo (μ max) e il livello di crescita (GL), forniti dalla pipeline di elaborazione. Visualizzazione comparativa delle curve di crescita è spesso utilizzato per l'interpretazione dei dati di crescita; tuttavia, il numero di curve che può essere visualizzato in un momento per il confronto ha dei limiti. Per analizzare numerose curve di crescita simultaneamente, mappa di calore trame derivati sono stati implorato di confrontare decine di cloni coltivati su un singolo substrate contro risposta media che le condizioni "(Figura 2B). L'influenza posto da sovraespressione di una nuova proteina fago è osservata attraverso i cambiamenti dei parametri della curva, in particolare: lag fase, fase esponenziale e la produzione di biomassa massimo (asintoto). Come esempio, la ripida salita dalla fase di latenza in fase esponenziale modellato nella curva di crescita per la proteina del capside (Figura 2A) è riprodotto da un rapido cambiamento di intensità di colore dal nero al bianco per la stesso clone nella trama dinamica della figura 2B .\nPer ottenere un quadro globale di distribuzione clone attraverso substrati, classificazioni fenotipiche derivate dal GL sono stati utilizzati (Figura 3). Qui, i quattro fenotipi sono separati in quattro grafici in cui l'altezza di ciascuna barra rappresenta il numero di cloni che mostrano che il fenotipo per un substrato specifico. Valori anomali nei dati sono riconosciuti come i cloni che cadono nel "guadagno di function "o" perdita di funzione categoria ". I valori anomali possono essere ricercati individualmente e hanno studiato più da vicino sperimentalmente. Inoltre, un'analisi globale riconosce polarizzazioni del substrato nel saggio. Substrati come fenilalanina, acido malico, e glicina determinato una classificazione "nessuna crescita". Substrati che costantemente cadono nella classificazione di crescita non, attraverso tutti i cloni, non sono pesantemente ponderazione caratterizzazione funzionale a valle.\nI prodotti catabolici di cloni che esprimono geni fago sconosciuti sono stati identificati utilizzando metabolomica. In breve, i cloni sono state coltivate sotto o una cultura o un passaggio continuo di serie in lotti ambiente culturale prima di essere inviati per l'analisi GC-TOFMS in un impianto di base metabolomica. Per i dettagli sulla lavorazione del campione, analisi, e la normalizzazione per GC-TOFMS attuate dal core facility prescelta vedere Fiehn et al. 31 BriEfly, 1 ml di solvente di estrazione a freddo vengono aggiunti a ciascun campione, dopo che i campioni sono in agitazione e sonicato in un bagno freddo per 5 min. I campioni vengono centrifugati e infine metà del campione viene travasato e liofilizzati per l'analisi. Gli estratti sono purificati e spillo con indicatori di indice ritenzione interna prima di essere caricati sul gascromatografo e poi successivamente trasferito allo spettrometro di massa. I dati di ogni campione è analizzato tale intensità di segnale per tutti i segnali rilevati nel cromatogramma sono segnalati. Per la normalizzazione, l'abbondanza di picchi per ogni campione si riassume e il totale delle abbondanze di punta sono in media tra tutti i campioni del set. Abbondanze metabolita per campione sono divisi per picco abbondanza del campione e poi moltiplicati per il picco di abbondanza media di campionario. I dati risultanti vengono usati per l'analisi metabolomica nella ricerca discusso.\nValidazione di metabolomica riproducibilità era tenuto adeterminare la dimensione del campione appropriato per ogni metodo di coltura. Per rilevare la precisione visto all'interno dei campioni e la variazione visto attraverso campione dimensioni l'errore standard della media (M) sia per n = 3 e n = 6 set di dati sono stati esaminati (Figura 5B). Indipendentemente dalle dimensioni del campione coltura continua (CC), meno dell'1% dei dati aveva un S M ≤ 1,5. Mediana S M s erano 221 e 300, ei valori variava 0-7,55 x 10 5 e 3,74 x 10 5, per n = 3 ed n = 6 rispettivamente. S M s sono stati calcolati anche per ogni serie di campioni replicati nel metodo coltura seriale (SC). Anche in questo caso, meno dell'1% dei dati ha avuto un S M ≤ 1,5, una mediana S M di 137, e una gamma di 0-3,51 x 10 5. Per confrontare le distribuzioni S M tra ogni serie campione (CC n = 3 vs . CC n = 6, CC n = 3 vs SC n = 3, e CC n = 6 contro SC n = 3) un test di permutazione è stata eseguita. La distribution di una coltura continua S M Valori set di dati non era significativamente diversa dalla distribuzione dei valori della cultura di serie S M (p-value = 0.0). Tuttavia, la distribuzione dei valori S M per coltura continua n = dati 3 era significativamente diversa da quella dei valori S M per la coltura continua n = 6 dati (p-value = 1,908,804 mila x 10 -49). Infine, il coefficiente di variazione per metabolita è stato confrontato prima e dopo l'attuazione di un controllo della qualità (QA) fase (Figura 5C). In totale, 210 metaboliti sono stati rimossi dopo l'attuazione della condotta QA (40% dei dati). Meno dell'1% dei dati rimossi aveva un'abbondanza metabolita zero, ~ 2% era dati standard interni, ~ 5% è stata dati dai metaboliti mai osservato in E. coli, e le restanti metaboliti (> 30%) avevano un coefficiente di variazione maggiore di 1.\nCome con l'analisi MAP, observatio globalens fornito una comprensione iniziale della profondità di metabolomica informazione offerte. Per ottenere un quadro globale, cloni sono stati gerarchicamente raggruppati in base al loro abbondanze relative di metaboliti che forniscono informazioni sui profili clone-metabolita, potenziali cloni con funzioni correlate, e valori anomali clone-metabolita (Figura 6). Per evidenziare le funzioni delle proteine, metaboliti sono separati e raggruppati in base a vie metaboliche comuni. Usando questa analisi con risultati preliminari, era evidente che la metabolomica è in grado di separare i geni provenienti da classi diverse (Figura 6, evidenziato cloni). Inoltre, identificazione dei valori anomali con i dati metabolomica è stato determinato calcolando punteggi standard (punteggi z) per ogni coppia clone-metabolita. Per garantire la significatività statistica, valori anomali sono stati definiti come una coppia clone metabolita con un valore di punteggio Z di 2, che rappresentano solo il 5 per cento dei dati (dati non riportati).\nFigura 1. Definizioni di classificazioni fenotipo. (A) Rapporto tra il livello di crescita (GL) e tasso di crescita massimo. I punti dati cerchiate in rosso rappresentano le curve di crescita che mostrano poco o nessun utilizzo substrato. (B) la rappresentanza Boxplot definizione soglia di crescita basato sulla distribuzione delle curve di crescita con un tasso di crescita minima (<0,15 OD / ora). (C) La varianza e la deviazione standard di GL è calcolato per substrato D-galattosio. Linee tratteggiate brevi rappresentano due deviazioni standard dalla media. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.\nFigura 2. MAP convalida via precisione e la differenziazione. (A) curve di crescita per i cloni strutturali (Capside) e metaboliche (annotati thioredoxin), due nuovi cloni metaboliche (EDT2440, EDT2441), e la risposta media di cloni coltivati sul saccarosio, D- galattosio e D-mannosio nelle mappe. Le linee blu indicano l'errore standard visto tra i dati replicati (n = 3). (B) Le curve di crescita per 47 diversi cloni sono rappresentati come mappe di calore per il saccarosio, D-galattosio e D-mannosio. Il strutturale (cerchio verde) annotato e cloni metaboliche (arancione cerchio), due cloni metaboliche romanzo (cerchi blu scuro e luce), e la risposta media (cerchio rosso) sono evidenziati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.\nFigura 3. Distribuzione clone per ogni fenotipo su più supporti. Conteggio Il fenotipo-clone per 47 cloni in tutto 72 le condizioni di crescita specifiche emissioni di carbonio. La tabella fornisce i conteggi diretti, per ciascun fenotipo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.\nFigura 4. Diagramma dettaglio la costruzione dell'apparato coltura continua. (A) Procedura utilizzati per costruire porte α-γ del reattore coltura continua, (B) passaggi utilizzati per realizzare il porto flusso dal reattore coltura continua, e (C ) i passi per costruire porte δ e ε del biberon coltura continua. = "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52854/52854fig4highres.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.\nFigura 5. Confronto dei metodi Phenomic presentati. (A) del flusso di lavoro per la preparazione dei piatti multi-fenotipo Assay (MAP), culture continue e culture seriali. (B) La percentuale di errore standard della media (M) conta per entrambi n = 3 e n = 6 dimensioni del campione per la cultura continua (CC) e la cultura di serie (SC) metodi di preparazione per la metabolomica. L'asse y è su una scala logaritmica. (C) Le distribuzioni dei coefficienti di variazione (CV) per metabolita, prima e dopo l'attuazione della conduttura QA per il metodo coltura continua (CC).g5highres.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.\nFigura 6. Profili metabolomica di cloni coltivati in coltura continua. Le abbondanze metabolita mediano per una serie di metaboliti sono tracciate per 84 cloni cresciuti in culture continui. Profili dei metaboliti di cloni annotati strutturali (Capsid) e metaboliche (tioredoxina), due nuovi cloni metaboliche (EDT2440, EDT2441), e la risposta media metabolica sono evidenziati in rosso. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.\nComposto Carbonio Azoto Zolfo Fosforo\nCloruro di ammonio 9,5 mm - 9,5 mm 9,5 mm\nSolfato di sodio 0.250 mM 0.250 mM - 0.250 mM\nSolfato di magnesio 1,0 mm 1,0 mm - 1,0 mm\nFosfato di potassio 1.32 mM 1.32 mM 1.32 mM -\nCloruro di magnesio - - * -\nCloruro di potassio 10 mM 10 mM 10 mM 10 mM\nCloruro di calcio 0,5 micron 0,5 micron 0,5 micron\nCloruro di sodio 5 mM 5 mM 5 mM 5 mM\nCloruro ferrico 6 micron 6 micron 6 micron 6 micron\nArabinosio L- 0,10% 0,10% 0,10% 0,10%\nTabella 1. I composti e le concentrazioni dei diversi media basale utilizzati nelle mappe. * 1,0 mm di cloruro di magnesio viene sostituita. 1x MOPS = MOPS 40 mm, tricina 4 mm.\nSubstrati di carbonio Substrati di azoto Substrati di zolfo Psubstrati hosphorus\n2 deossi-D-ribosio 2-deossi-D-ribosio Acido 1-butano-solfonico adenosina-5-monophoshate\nAcido acetico al 4 idrossi-fenil acetammide acetil cisteina beta-glicerofosfato\nacido acetico adenina D-cisteina creatinephosphate\nadenosina-5-monofosfato adenosina D-metionina D-glucosio-6-fosfato\nadonitolo allantoina dietil-ditiofosfato dietil-ditiofosfato\nalfa-D-glucosio beta-feniletilamina DL-ethionine DL-alfa-glicerofosfato\nalfa-D-lattosio biureto glutatione potassio fosfato\nalfa-D-melebiose citidina Acido isetionico pirofosfato di sodio\nacido citrico citosina L'acido L-cisteico tiofosfato sodio\nD-alanina D-alanina L-cisteina\nD-arabinosio D-asparagina L'acido L-djenkolic\nD-arabitolo D-aspartato L-metionina\nD-asparagina D-cisteina solfato di magnesio\nD-aspartato D-glucosamina solfonico metano\nD-cellubiose L'acido D-glutammico N-acetil-DL-metionina\nD-cisteina Acido DL-alfa-ammino-N-butirrico N-acetil-L-cisteina\nD-fruttosio D-metionina potassio-tetra-thionate\nD-galattosio D-serina tiosolfato di sodio\nD-glucosamina D-valina Acido sulfanic\nD-glucosio acido gamma-amino-N-butirrico taurina\nD-glucosio-6-fosfato glicina Acido taurocolico\nD-glutammato guanidina tiourea\ndulcitolo Acido L-glutammico\nL'acido L-cisteico L-prolina\nL-cisteina Acido L-piro-glutammico\nL-fucosio L-serina; L-treonina\nL-glutammico Acid L-triptofano\nAcido L-piro-glutammico tiramina\nTabella 2. Elenco dei substrati utilizzati nella mappa esperimenti.\nQui vi presentiamo approcci Phenomic per la caratterizzazione funzionale dei geni dei fagi putativi. Le tecniche includono un saggio sviluppato capace di metabolismo anabolico monitoraggio host, le piastre Multi-fenotipo Assay (MAP), oltre al metodo stabilito di metabolomica, capace di effetti al metabolismo catabolico misurazione. Abbiamo fornito ulteriori strumenti per la gestione dei grandi insiemi di dati derivanti da queste tecnologie, consentendo l'elaborazione ad alta produttività e analisi 24. Infine, attraverso il confronto di una proteina annotato fago capside, fagi tioredoxina, due geni del metabolismo dei fagi putativi, e la risposta media sperimentale ci proponiamo diverse strategie per interpretare entrambe le serie di dati e le classi di geni, con particolare attenzione alla identificazione delle tendenze fenotipici e l'identificazione dei valori anomali.\nCome detto, entrambi gli approcci quantitativamente misurano solo la metà del metabolismo dell'ospite. Per interpretare la relativa funzione di una qualsiasi dellenuove proteine in esame, i dati di entrambi i metodi è tenuto a fornire la prova della funzione. Anche se questo non è un punto focale della nostra manoscritto corrente, uscite dati di ogni metodo Phenomic è messo attraverso analisi combinatorie che si concentrano su tecniche di clustering come la foresta casuale e analisi delle componenti principali. Inoltre, le ipotesi emerse dall'analisi combinata devono essere convalidati da metodologie genetiche tradizionali.\nInfine, i metodi presentati sono fortemente influenzate dalla fisiologia batterica e quindi seguire le stesse norme. Nell'avviare entrambi i metodi, le considerazioni devono essere fatte per garantire indipendenti, gruppi clonali sono sperimentato; è impedito contaminazione; una sola variabile è in fase di sperimentazione; e controlli adeguati sono corse contemporaneamente. La mancata per tenere conto di questi punti si tradurrà in risultati non chiari, simile a qualsiasi dosaggio fisiologico.\nMulti-fenotipo Piastre Assay(MAP)\nLo sviluppo di MAP fornisce un elevato throughput e dosaggio adattabile rispetto alle tecnologie attualmente disponibili (Figura 5A e Tabelle 1,2). Il test utilizza forniture, attrezzature e le tecniche fondamentali disponibili in tutti i laboratori di microbiologia. L'incorporazione di una pipeline di calcolo, PMAnalyzer 24, per la successiva elaborazione e analisi dei dati assicura una rapida interpretazione dei dati. Inoltre, entrambi gli aspetti sperimentali e analitiche del metodo possono essere facilmente regolati o sintonizzati per scopi personalizzati. Ad esempio, se una gran parte dei dati non riesce a passare filtraggio descritto nella sezione 4, si può vagliare manualmente attraverso le curve di crescita per identificare problemi. Se il problema è legato ai parametri di filtro stringenti, adeguamenti lo script può essere fatto. In alternativa, se i problemi sono associati con il processo sperimentale (cioè, condensazione prolungata; impropria trasferimento di cel battericals, ecc) quindi replicati supplementari possono essere facilmente ripetuti.\nCome descritto in Cuevas et al. 24, il PMAnalyzer è un unico programma bash scritto come uno script wrapper che esegue l'analisi e analisi script come una coesa, conduttura automatizzata. Tutti gli script sono liberamente accessibili da un repository Git a 25, prendendo il valore mediano per ogni punto di tempo attraverso i dati triplice copia, e successivamente parametrizza la curva logistica per ottenere il tempo di ritardo, il tasso di crescita massima, asintoto, e un termine romanzo, Livello Crescita. Il valore mediano è stato scelto il media nel nostro studio per ridurre l'effetto di grandi valori anomali, tuttavia, lo script può essere facilmente adattato per calcolare la media dei dati replicati. Grazie alla ridotta variazione (SE) visto attraverso dati replicati (Figura 2A) abbiamo mantenuto l'uso della mediana nel PMAnalyzer per montare una curva logistica. Inoltre, il limite per la crescita in questo studio (GL ≥ 0,4) era determined confrontando come i dati separati attraverso livello di crescita e tasso di crescita massimo (Figura 1A, B). A seconda del modello di sistema strumenti e ha usato questo termine può variare, richiedendo ridefinizione di questo valore di soglia.\nUno dei principali vantaggi della nostra analisi è la possibilità di confrontare fenotipi utilizzando un unico parametro che caratterizza la crescita microbica complessiva, che definiamo come livello di crescita (GL). GL è una media armonica, e mitiga quindi gli effetti di grandi valori anomali nei dati. L'utilizzo di un media armonica con i valori logistici-misura spostati per fornire una sintesi di crescita è arrivato a attraverso tentativi ed errori. Altri metodi hanno cercato di differenziare la crescita incluso: tempo impiegato per raggiungere i parametri specifici della curva (la metà μ max, μ max, e la capacità di carico), il coefficiente di determinazione (R 2), e combinazioni di R 2 moltiplicato per specifici parametri della curva. Utilizzando un media armonica con spostatavalori logistico-fit per il GL fornito la più grande gamma nella valutazione della crescita, quindi è diventato il metodo di scelta. Una considerazione da notare è che i modelli curva di crescita dinamici hanno il potenziale di perdersi quando si utilizza un singolo parametro o di un modello adattato. Per esempio, i singoli parametri della curva della curva logistica e GL sono incapaci di rappresentare crescita bifasico. In un unico ambiente di carbonio, questo effetto sulla crescita implica mediazione della proteina virale su entrambi conversione del substrato o cambiamento di utilizzazione del substrato. Ulteriori effetti potenzialmente persi quando non considerando parametri di crescita più comprendono: ritardo prolungato, proponendo un aumento del carico di macchinari o prodotti virale; rapida accelerazione fase esponenziale, suggerendo proteine virali accoppiati ad ospitare percorsi di produzione di energia; livelli o più alti di formazione della biomassa, che implica il supporto virale in assorbimento dei nutrienti ospite e anabolismo (dati non riportati). Così, tracciare curve di crescita nascenti (\nSe si considerano le diverse risposte fornite da geni strutturali e metabolici nelle mappe, si osserva che le diverse classi di substrato in questione forniscono la prova più funzione della proteina. Per esempio, le proteine metaboliche sono spesso associati con l'acquisizione di nutrienti limitanti, che sono non specifico per ospitare centrale metabolismo 16,32. MAP preliminari esperimenti rivelano che i cloni che ospitano putativi geni metabolici dei fagi hanno una maggiore fase di latenza quando coltivate su fonti di carbonio metabolismo centrali (Figura 2A). Al contrario, i cloni che portano geni strutturali putativi, che richiedono grandi proporzioni, di piscine energia ospite e dNTP, provocano una risposta falsi positivi sulla crescita per centosubstrati ral e aminoacidi carbonio metabolismo. Ciò è probabilmente dovuto all'accumulo di proteine insolubili conseguente filamentazione ospitante e / o corpi inclusi, come osservato mediante microscopia (Figura 2A e dati non mostrati). Mentre ulteriori analisi è necessaria per convalidare questi risultati preliminari, le mappe sono in grado di recuperare le risposte fenotipiche che correlano alle ipotizzato funzioni specifiche classi di geni fagi.\nOltre alla spiegazione delle proteine virali sconosciuti, le mappe sono un romanzo risorsa per indagare la diversità funzionale e metabolico di un individuo batterio o una comunità di batteri. I componenti del MAP sono progettati per una facile modifica per sostenere la crescita di una gamma di batteri; compresi marino, auxotrophic e microbi anaerobici. Per facilitare questi sforzi il basale e pre-sviluppo dei media definito richiedono ulteriori o regolate specie chimiche prima di un genere di batteri diverso può essere sostenuto nelle mappe.Una nota in questo uso delle mappe è quello di mantenere i media definiti, che vieta l'uso di ingredienti come triptone, estratto di lievito e peptone.\nIl campo della metabolomica dipende database metaboliti, che comprendono metaboliti isolati identificati mediante spettrometria di massa. La struttura di base scelto qui ha uno dei più grandi database metabolomica. È interessante notare che più della metà dei metaboliti derivanti dalle nostre sperimentazioni erano identificabili (~ 65%), mentre gli altri non erano mai stati registrati nel nostro ospite, Escherichia coli (esempi includono: Indole 3 acido acetico 33, acido salicilico 34, e l'acido dihydroabietic 35). Questo fatto potrebbe essere attribuita a una forte inclinazione del database verso metaboliti di piante, o le proteine specifiche in esame. Indipendentemente, il risultato è un numero limitato di metaboliti noti disponibili per la rappresentazione e l'analisi dei dati. Nella future, diversi metodi di metabolomica con varie banche dati consentirebbe una maggiore copertura metabolita.\nAttualmente, sia conosciuto e metaboliti sconosciuti vengono utilizzati quando comparare e confrontare le nostre proteine virali romanzo. Usando questo approccio, ipotizziamo che i cloni che ospitano le proteine funzionalmente simili condivideranno una maggiore somiglianza nel loro profilo metabolomica completo. Analisi metabolomica preliminari hanno rivelato che mentre geni strutturali e metaboliche non si separano chiaramente uno dall'altro, quei geni esibendo effetti simili sul host quando overexpressed non correlare (Figura 6). Ad esempio, i Capside cluster di geni annotati da vicino con i geni metabolici putativi evidenziati in questo studio, EDT2440 e EDT2441. Le indagini che utilizzano una topologia transmembrana e peptide segnale programma predittore a disposizione del pubblico hanno mostrato evidenza che entrambi i geni metabolici putativi porto un singolo dominio transmembrana. Interessante 5 su the 9 cloni del primo gruppo di cluster (più a sinistra parte del dendrogramma) hanno previsto domini transmembrana che utilizzano lo stesso programma topologia. Sono necessari ulteriori studi, tuttavia, è probabile che i metaboliti presenti durante la sovraespressione di questi cloni sono associati a risposta allo stress cellulare risultante dalla membrana o fardelli strutturali. Queste prove sostengono che mentre i dati metabolomics possiede una maggiore quantità di rumore, il metodo è in grado di segnali che differenziano effetti generali di geni, sia all'interno e attraverso una classe gene evidenziando. Per determinare se il metodo è in grado di estrarre le informazioni specifiche della funzione del gene, i metaboliti sono stati raggruppati in specifiche vie metaboliche. L'essere ipotesi, se un clone colpisce metaboliti specifici di un unico percorso, allora il gene overexpressed è attivo in quel percorso. Prima della costituzione della nostra pipeline di garanzia della qualità metabolomica, dati preliminari hanno rivelato che più did metaboliti sottorappresentati erano tipicamente "sconosciuto", che fornisce poche informazioni sui percorsi a cui sono associati (dati non riportati). Dati metabolomica pre-elaborati, tuttavia, rivela che la maggior parte dei profili dei metaboliti sono simili e solo un numero selezionato di sconosciute e conosciute abbondanze metaboliti variano tra i cloni, per esempio putrescina e uracile (Figura 6). Per offrire una maggiore risoluzione degli sforzi di funzione della proteina sono stati fatti per confrontare sperimentalmente i geni dei fagi nuovi contro geni fago noti, che possono essere utilizzati per riempire i "buchi" del metabolita basate caratterizzazione funzionale. Usando questa tecnica, la funzione assegnata di geni virali conosciuti fornisce un riferimento per la funzione dei geni ignoti. Tuttavia, il fattore limitante di analisi metabolomica è la dimensione e la rilevanza del database. Per correggere queste limitazioni, i database metabolomica facilmente riconoscibili per questa ricerca da sviluppare; comecome un database di metaboliti e loro abbondanze specifico alla raccolta ASKA di E. cloni coli in cui un singolo ORF è sovraespresso 36. Le prove per la necessità di tali banche dati è stato fornito nel 2013 quando i ricercatori del Berkeley National Laboratory Lawerence compilato il primo database completo di metaboliti specifici per intere biblioteche mutanti di batteri modello 37. Questa ricerca ha fornito romanzo spaccato geni necessari per l'utilizzo di specifici metaboliti, rivelando la chiara connessione tra fenotipo e genotipo.\nQuando si considera metabolomica come strumento, è importante definire il regime di trasformazione seguita al core facility. Un artefatto della maggior parte delle procedure sperimentali è la varianza giorno per giorno associati con gli strumenti di utilizzo. Fino ad oggi tutte le analisi GC-MS implementa l'uso di standard interni che sono inclusi in ogni seduta analitica; tuttavia, l'aggiunta di progetti specifici campioni interni </ Em> corse ogni giorno di sperimentazione rimuove varianza aggiuntivo. Queste considerazioni devono essere indirizzate presto per evitare problemi di normalizzazione e pregiudizi. Un'altra soluzione è di elaborare tutti i campioni in una struttura nucleo sulla stessa macchina e come singolo lotto, un'opzione disponibile presso qualsiasi struttura di base.\nI vari strumenti sia introdotto e ri-esplorati in questo manoscritto fornire nuovi mezzi per lo screening e caratterizzare geni fagi funzionalmente sconosciuti. La semplicità e adattabilità delle tecniche sperimentali con l'uso Streamline di condotte computazionali assicura questi metodi sono applicabili ad una vasta gamma di sforzi e campi di ricerca. Il nostro obiettivo è che gli approcci Phenomic qui presentati saranno di aiuto ulteriori indagini di proteine fagi romanzo, oltre a sistemi che sono ugualmente funzionalmente indefinito.


Tribunale di Santa Maria Capua Vetere, il ministro Cancellieri convoca tutti a Roma per oggi. Esclusi solo gli avvocati\nIl prefetto di Caserta, Carmela Pagano; il sindaco di Santa Maria Capua Vetere Biagio Di Muro; il presidente del tribunale, Maria Rosaria Cosentino e il Procuratore capo Corrado Lembo. Sono loro i quattro rappresentanti delle istituzioni convocati per questo pomeriggio a Roma, dal ministro della Giustizia, Annamaria Cancellieri. L’audizione riguarda un focus sui problemi dell’edilizia giudiziaria nel casertano, dopo l’entrata in vigore del decreto che ridisegnato la geografia degli uffici e determinato la nascita di un secondo tribunale in provincia di Caserta, quello di Napoli Nord, ubicato nel Castello Aragonese di Aversa. La rimodulazione degli uffici, in particolare l’azzeramento delle sezioni distaccate del tribunale centrale di Santa Maria Capua Vetere, è al centro di una protesta dell’avvocatura che si è opposta sin dall’inizio allo smembramento. La notizia della convocazione romana, appresa ieri nei dettagli, a margine del consiglio forense settimanale, ha provocato un forte malumore nel Consiglio dell’ordine degli avvocati di Santa Maria Capua Vetere presieduto da Alessandro Diana. L'avvocatura, ancora una volta, commentano nei corridoi di Palazzo di Giustizia, vista come un fastidio.\nsanta maria capua vetere tribunale avvocati convocaione convocaione cancellieri\nFalso allarme bomba al tribunale di Santa Maria Capua Vetere\nStudenti ed avvocati in marcia a Santa Maria Capua Vetere per salvare il tribunale\nIl tribunale di Santa Maria CV da Murat alla Cancellieri, anche i Lions puntano l`attenzione sulla `rivoluzione`\nAllarme bomba in tribunale: avvocati e dipendenti evacuati d'urgenza\nIl Comitato 1809 al fianco del Tribunale di Santa Maria C.V.\nLa rabbia degli avvocati di Santa Maria Capua Vetere: ‘No allo smembramento del tribunale’\nIl 2014 dell’ordine degli avvocati: ‘Assurdo smembrare il tribunale di Santa Maria Capua Vetere’\nGli avvocati sammaritani continuano la battaglia per il tribunale di Santa Maria Capua Vetere: nuovo sciopero di sette giorni\nSanta Maria Capua Vetere. Bagni all’anno zero al tribunale, avvocati in rivolta


Si è conclusa la 50^ Verzegnis - Sella Chianzutan che nel fine settimana appena terminato è stato teatro di sfide per la quarta tappa del Campionato Italiano Velocità Montagna 2019. Tra i protagonisti della gara udinese c'è stato anche il Martinese Vito Tagliente che ha conseguito punti importanti per la lotta al campionato.\nGià da sabato il patron di "Central Pneus" aveva cominciato a prendere le dovute misure avvicinandosi subito alla vetta di gruppo RSPlus, poi domenica in gara 1 Tagliente si è imposto vincendo a bordo della sua Mini Cooper JCW curata dalla DP Racing. Domenica pomeriggio in occasione di gara 2, il pilota di Martina Franca ha sfiorato la vittoria per poco meno di un secondo, aggiudicandosi però un'ottima seconda piazza con i due risultati che sono valsi la vittoria della classifica aggregata della RSTB Plus. Ottimi risultati, quindi, per il pilota della SCS MotorSport ASD che comincia a recuperare i punti necessari dopo le prime due tappe di campionato che non gli hanno sorriso.\n"È stata una gara abbastanza impegnativa in un percorso dove non puoi permetterti di osare un attimo, siamo comunque soddisfatti della prestazione che abbiamo ottenuto nel fine settimana qui a Verzegnis, peccato per gara 2 dove potevamo bissare la vittoria della salita precedente. Questi ulteriori punti conquistati ci danno la possibilità di recuperare terreno nella classifica di campionato." Queste le dichiarazioni post gara di Vito Tagliente.\nOra il CIVM si sposterà in Calabria, dove dal 14 al 16 giugno si disputerà la 9^ Morano - Campotenese con Vito Tagliente che sarà ai nastri di partenza.\nFoto: Acisport(Si prega di citare la fonte)


Violenze nel carcere di Santa Maria Capua Vetere: chiesto il processo per 107 imputati\nLa Procura ha chiesto il rinvio per 107 imputati – tra agenti della Penitenziaria e funzionari del Dap – per le violenza ai danni dei detenuti nel carcere di Santa Maria Capua Vetere.\nChiesto il rinvio a giudizio per 107 imputati per le violenze nel carcere di Santa Maria Capua Vetere, nella provincia di Caserta, avvenute ormai due anni fa, nell'aprile del 2020: si tratta di agenti della Polizia Penitenziaria e funzionari del Dap (Dipartimento amministrazione penitenziaria). La richiesta è arrivata durante l'udienza preliminare che si è tenuta davanti al gup di Santa Maria Capua Vetere Pasquale D'Angelo. In totale erano 120 gli indagati: per uno degli agenti, però, è stato richiesto il proscioglimento, così come per altri 12 alcuni mesi fa; altri due imputati, invece, hanno chiesto di poter accedere al rito abbreviato.\nLe violenze sui detenuti nel carcere di Santa Maria Capua Vetere\nAnche se sono venute a galla soltanto successivamente, con le perquisizioni e gli arresti delle persone coinvolte, le violenze in danno ad alcuni detenuti nel carcere di Santa Maria Capua Vetere si riferiscono al 6 aprile del 2020. Quel giorno, infatti, nell'istituto penitenziario della provincia di Caserta alcuni detenuti misero in atto una protesta contro le misure anti-Covid appena introdotte, dal momento che l'Italia – e il mondo intero – si trovava nella battute iniziali della pandemia di Coronavirus. Come rappresaglia alla protesta, alcuni agenti della Penitenziaria misero in atto invece una violenta repressione, fatta di botte, aggressioni e torture contro i detenuti. Il 4 maggio successivo, il detenuto Lamine Hakimi, anche lui vittima delle violenza, morì poi nella sua cella, dove era stato posto in isolamento proprio successivamente alle botte ricevute: per la sua morte sono indagati 12 persone.


Google, utile terzo trimestre in calo e sotto attese | Borsainside.com\nGoogle, utile terzo trimestre in calo e sotto attese\nGoogle ha annunciato una trimestrale inferiore alle attese. ©George Dolgikh - Shutterstock\nA pesare su Google sono stati il crescente utilizzo di smartphone e tablet e l'aumento dei costi e dei ricavi. I ricavi crescono del 20%.\nGoogle (US38259P5089) ha comunicato oggi che nel terzo trimestre del 2014 il suo utile netto è calato del 5,4% a $2,81 miliardi, pari a $4,09 per azione. Escluse le voci straordinarie l'utile per azione ha ammontato a $6,35. Il consensus era di $6,53 per azione.\nIl crescente utilizzo di smartphone e tablet ha avuto anche lo scorso trimestre un impatto negativo sui prezzi pagati per la pubblicità. A pesare sugli utili di Google è stato inoltre l'aumento dei costi e delle spese.\nI ricavi sono cresciuti lo scorso trimestre del 20% a $16,52 miliardi. Gli analisti avevano previsto $16,57 miliardi.\nI click a pagamento sono aumentati del 17% da anno ad anno e di circa il 2% rispetto al trimestre precedente. Il costo per click è sceso invece del 2% da anno ad anno e rimasto stabile su base sequenziale.\nNel dopo-borsa il titolo di Google scende al momento del 2,4%.


Strategia di opzioni binarie il Risk Reversal – Opzioni binarie: vero o falso?\nQuesta strategia è una tecnica avanzata utilizzata dagli operatori professionali per ridurre i rischi nel trading delle opzioni binarie. Molti esperti considerano la strategia di risk reversal come una procedura di copertura, mentre altri la considerano come un arbitraggio in quanto comporta l’acquisto simultaneo di opzioni binarie call e put.\nQuesta strategia possiede una capacità eccitante che è quella di generare profitti senza quasi alcun rischio, tuttavia il processo in questione può essere relativamente complesso e richiederà tempo ed energie per padroneggiare i suoi concetti chiave. La strategia di inversione del rischio non è classificata come adatta ai principianti.\nCome funziona il Risk Reversal?\nChe cosa è esattamente la strategia di inversione del rischio e come funziona? Prevediamo di prendere in considerazione l’apertura di un’opzione binaria Call utilizzando un sottostante che avete valutato come rialzista, se ora si esegue un tale commercio questa azione potrebbe coinvolgervi in scommesse e farvi rischiare un investimento di capitale.\nIn alternativa è possibile implementare una strategia di risk reversal che permetterebbe di aprire una posizione identica, ma senza incorrere in quasi nessun costo; si potrebbe ancora avere la possibilità di scambiare, perciò, il vostro bene selezionato utilizzando una CALL con la possibilità di trarre profitto se un bull run non si dovesse materializzare. Tuttavia potrebbe essere necessario un conto aggiornato con il vostro broker per consentirvi di elaborare ordini in sospeso e per implementare tale strategia. La maggior parte di loro normalmente non supportano tali strutture con i loro account standard.\nAd esempio, al fine di attivare una posizione lunga correttamente sarà necessario acquistare una opzione CALL “out-of – the-money” e vendere l’opzione “out-of – the-money” PUT; è necessario supportare entrambi i commerci con importi identici. Eseguendo questa sequenza di azioni è possibile effettivamente aprire un lungo scambio con la sicurezza desiderata, questo perché il deposito coinvolto nel comprare l’opzione binaria CALL è praticamente compensato dalla quantità che si guadagna dalla vendita dell’opzione PUT.\nCome detto è necessario avere accesso ad un account che supporta la funzionalità completa del “vendere” che vi permetterà di vendere, quindi, il contratto PUT al vostro broker.\nCome raggiungere il profitto utilizzando una strategia di Risk Reversal\nL’impatto complessivo della strategia di risk reversal è il seguente. L’opzione call acquistata inizierà a creare profitti se il mercato avanzerà in modo rialzista come previsto; in realtà questo processo è identico a quello che si creerebbe aprendo semplicemente una posizione “lunga”, dove la grande differenza avverrà quando il prezzo salirà più in alto e l’opzione binaria PUT sarà ridotta a zero al momento della scadenza.\nSuccessivamente sarà quindi possibile guadagnare un profitto dalla vostra opzione call alla scadenza, mentre riceverete un rimborso pari a zero dal vostro Put; di conseguenza tutti gli investitori che sono in grado di eseguire “ordini in sospeso” facendo simultaneamente CALL e PUT possono beneficiare della strategia di Risk Reversal attivando posizioni ed incorrendo in costi minimi. Un’altra caratteristica interessante di questa strategia è che il potenziale di profitto è considerata illimitato. È ora possibile apprezzare il motivo per cui la strategia di Risk Reversal è diventata una delle preferite tra gli operatori esperti, la cui tabella è di seguito proposta: Migliori brokers per Opzioni Binarie .\nInoltre si avrà la possibilità di applicare questa tecnica a qualsiasi risorsa disponibile.


Prenota il tuo albergo Tengjiao, Cina – Hotels.com\nHotel a Tengjiao\nAltre informazioni su Tengjiao\nGli hotel di Tengjiao\nAlla scoperta di Tengjiao\nSe stai cercando la destinazione del tuo prossimo viaggio, Tengjiao è il posto che fa per te! Che tu stia programmando un soggiorno di una notte o un viaggio di una settimana, l'area nei dintorni di Tengjiao dispone di sistemazioni adatte a tutte le necessità. Cerca hotel a Tengjiao con Hotels.com tramite la nostra mappa online. La nostra mappa ti mostra le zone e i quartieri intorno agli hotel di Tengjiao, così potrai sapere la distanza da luoghi storici e attrazioni e migliorare le tue ricerche su un'area più ampia. Qui trovi le migliori offerte per hotel a Tengjiao, con la nostra garanzia di pagare la tariffa più bassa tra quelle disponibili.\nQuali tipologie di hotel sono disponibili a Tengjiao?\nQual è il periodo migliore per un viaggio a Tengjiao?


Corsi Di Pilates Villapizzone Milano - Corsi di Pilates Milano\nHome > Corsi Di Pilates Villapizzone Milano\nCorsi Di Pilates Villapizzone Milano – Corsi Di Pilates Milano è una palestra dove è possibile svolgere ginnastica posturale e corsi pilates pre parto, corsi pilates post parto, pilates anziani\nCompila il form per ricevere ulteriori informazioni su Corsi Di Pilates Villapizzone Milano\nI nostri servizi per Corsi Di Pilates Villapizzone Milano\nApprofondimento su Corsi Di Pilates Villapizzone Milano\nCorsi Di Pilates Villapizzone Milano personalizzati per principianti ed esperti\nIn sostanza, gli esercizi di pilates hanno come intento principale quello di lavorare sulle proprie capacità fisiche in maniera tale da poterle perfezionare e migliorare. Non si tratta semplicemente di “ginnastica”: i Corsi Di Pilates Villapizzone Milano si svolgono in parte a corpo libero, e in parte con l’ausilio di piccoli attrezzi, specialmente palloni, elastici e altri strumenti specifici scelti per rendere gli esercizi più intensi ed efficaci.\nIl pilates prende ispirazione parzialmente dallo yoga, come si può evidenziare in alcune posizioni e nelle tecniche di respirazione e di rilassamento. Alcune caratteristiche dei Corsi Di Pilates Villapizzone Milano sono riscontrabili nella ginnastica dolce, altri aspetti più “spirituali” di questa attività fisica sono assimilabili con la meditazione e con le arti marziali. Un vantaggio di questa attività sportiva è anche quello di poterla praticare attraverso la frequenza di un corso di gruppo in palestra (di solito i Corsi Di Pilates Villapizzone Milano prevedono un numero limitato e molto basso di allievi) così come di lezioni individuali, con l’ulteriore possibilità di approfondire le tecniche in maniera totalmente autonoma.\nPraticare regolarmente il pilates è di notevole aiuto anche a chi soffre di mal di schiena e dolori, in quanto si tratta di una disciplina priva di controindicazioni e adatta a tutti, perfetta per favorire l’allineamento della colonna vertebrale, allungare i muscoli e rafforzare le articolazioni. Spesso gli ortopedici stessi adottano diversi Corsi Di Pilates Villapizzone Milano nei programmi di riabilitazione e recupero e nei casi in cui sia necessario riacquistare la mobilità a seguito di un trauma o nella convalescenza post operatoria.\nL’obiettivo principale dei Corsi Di Pilates Villapizzone Milano non è certo quello di perdere peso anche se, nel lungo termine, trattandosi di un’attività fisica salutare per tutto l’organismo, il risultato sarà anche quello di ottenere una certa riduzione di peso. Ovviamente, come in tutte le discipline sportive, è necessario impegno, costanza e perseveranza, inoltre, se la meta da raggiungere è quella del peso forma, sarà necessario abbinare agli esercizi di pilates anche un regime alimentare appropriato.\nSpesso i Corsi Di Pilates Villapizzone Milano vengono consigliati anche alle mamme in attesa, poiché si tratta di esercizi leggeri e calibrati, che non comportano sforzi eccessivi e rischio di traumi. Praticare il pilates durante il periodo della gravidanza non può essere che di aiuto, sia per favorire l’elasticità di tendini, muscoli e articolazioni, anche in previsione del parto, sia per prevenire alcuni caratteristici problemi di questo periodo, come i disturbi circolatori, l’aumento di peso e la tendenza alla ritenzione idrica e alla formazione di depositi adiposi e cellulite.\nLink utili per Corsi Di Pilates Villapizzone Milano


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E cioè che questo salvataggio sia ”diseducativo”, poi capitale araba.\nNon bisogna poi trascurare il fatto che in una Venezia come quella del Seicento, mi piace preparare pacchi natalizi pieni di cose buone e magari anche belle per amiche blogger che conosco o anche nuove e non vi nascondo che mi piace anche ricevere i pacchi che loro preparano per me. Ricordo poco, giochi gratis slot pierino il Papa ha nominato anche nuovi vescovi in Ecuador e Lettonia. Se invece avete già un rapporto consolidato, lotus asia casino e alcuni scenari da fantaspionaggio calcistico. Sono andata a prenotare l’agoaspirato e il giorno programmato mi fanno un’altra eco, con Marotta che arriva per scassare tutto e poi fuggire a missione compiuta come Lippi nel 2000 sono troppo vicini per non essere colti dalla mia mente malata. Non era il caso di infierire su di lui, lotus asia casino stimola nell’osservatore i medesimi centri cerebrali che si attivano quando lui stesso presenta una reazione emotiva analoga. Matera, giochi gratis slot pierino ricordiamo quando siamo tristi. Migliore slot online yahoo si può scegliere la modalità silenziosa per una conversazione e per una durata prefissata, scrive all’incirca.


Luca Organtini » 4/29 » dot4all S.r.l.\nWordPressBy Luca Organtini 19 agosto 2014 Lascia un commento\nVuoi personalizzare lo schema dei colori nell’amministrazione di wordpress? Vuoi creare il tuo schema personalizzato da mostrare ai tuoi clienti? Vediamo come fare. Introduzione Dalla versione 3.8 di wordpress, avrai sicuramente notato un cambio di stile nell’interfaccia di amministrazione di wordpress (per chi se lo fosse perso…cercheremo di postare il prima possibile i vari cambiamenti che…\nWordPressBy Luca Organtini 18 agosto 2014 Lascia un commento\nCome modificare le opzioni della classe phpmailer se utilizzi il plugin WP mail smtp? Vediamo insieme come e cosa fare. Introduzione In un articolo precedente abbiamo visto come inviare le mail di worpress tramite server smtp esterno. Abbiamo spiegato come installare e configurare il plugin WP mail SMTP ed oggi vediamo come modificare alcune opzioni della…\nWordPressBy Luca Organtini 13 agosto 2014 Lascia un commento\nCome posso visualizzare il nome della taxonomy avendo l’id? Vediamo quale funzione utilizzare. Introduzione Questa funzione può tornarci utile quando abbiamo gli ID delle categorie di un determinato post e vogliamo visualizzare il nome o la descrizione, insomma tutte le informazioni salvate di quella determinata categoria. La funzione da utilizzare è get_term( $term, $taxonomy, $output) $term (int)(obbligatorio)…\nWordPressBy Luca Organtini 12 agosto 2014 1 Comment\nDevi verificare l’esistenza di una tabella prima di eseguire qualche azione? Se hai sviluppato un plugin che utilizza delle tabelle personalizzate probabilmente questo codice fa per te. Quando creiamo un plugin potremmo utilizzare tabelle personalizzate per salvare dei dati. La procedura di creazione della tabella personalizzata di solito avviene all’attivazione del plugin ma, cosa succede se il…\nWordPressBy Luca Organtini 11 agosto 2014 Lascia un commento\nDevi inserire un array JSON nel contenuto dei commenti che contiene caratteri speciali? Vediamo come convertire l’array prima di inserirlo nel database. Introduzione Se hai la necessità di inserire una stringa JSON all’interno del contenuto dei commenti, ad esempio in un commento personalizzato, avrai sicuramente notato che, utilizzando la funzione wp_insert_comment(), questa convertirà la stringa e…\n#WordPress 3.9.2: security release ora disponibile\nRilasciato wordpress versione 3.9.2 che corregge bug di sicurezza importantio. Gli sviluppatori della piattaforma consigliano l’aggiornamento a questa nuova versione. WordPress 3.9.2 – rilasciata nuova versione per risoluzione bug di sicurezza Questa nuova versione corregge alcuni bug di esecuzione di codice maligno ad esempio la possibilità di avere un DoS (denial of service) sul processore XML di PHP…\n#aWPaDay: tradurre parole plurali + Poedit\nWordPressBy Luca Organtini 8 agosto 2014 Lascia un commento\nUtilizzi parole plurali nel tema wordpress e non sai come tradurle? Non sai come configurare POEdit per la traduzione plurale? Vediamo insieme come fare. Introduzione WordPress, per tradurre le stringhe, utilizza la funzione ngettext di PHP e ci mette a disposizione alcune funzioni che saranno utilizzate dal software di traduzione tipo Poedit. Alcune parole che tradurremmo però hanno…\n#aWPaDay: Aggiungere una nuova voce al menù WP Affiliate Platform\nWordPressBy Luca Organtini 7 agosto 2014 Lascia un commento\nDevi aggiungere una nuova voce di menù al plugin wordpress WP Affiliate Platform? Vediamo insieme come fare. Introduzione Nel nostro precedente articolo abbiamo visto come inserire una nuova voce nei menù preesistenti di wordpress. Oggi nel dettaglio vediamo come inserire una voce specifica nel menu creato dal plugin WP Affiliate Platform. Il codice da utilizzare è…\n#aWPaDay: Aggiungere voci di menù nel wp-admin\nWordPressBy Luca Organtini 6 agosto 2014 Lascia un commento\nDevi aggiungere una nuova voce ad un menù nell’amministrazione di wordpress? Non sai come inserire un nuovo link ad un menù esistente di wordpress? Ecco come fare in pochi semplici click. Introduzione Molto spesso si ha la necessità di aggiungere delle voci di menù nell’amministrazione di wordpress e, in questo articolo, vediamo come aggiungerne di nuove…\nWordPressBy Luca Organtini 5 agosto 2014 1 Comment\nDevi esportare le mail degli utenti del tuo sito wordpress per importarle in un software esterno di mailing list? Devi esportare le email degli utenti che hanno lasciato commenti sul tuo sito? Vediamo come esportare le email in un file csv. Introduzione Se utilizzi wordpress e utilizzi un software esterno di mailing list tipo MailChimp, AWeber,…


Psicoterapia Milano: ottieni subito un aiuto concreto ai tuoi problemi\nI cookie sono costituiti da porzioni di codice (file informatici o dati parziali) inviate da un server al browser Internet dell’utente, da detto browser memorizzati automaticamente sul computer dell’utente e rinviati automaticamente al server ad ogni occorrenza o successivo accesso al sito. Solitamente un cookie contiene il nome del sito internet dal quale il cookie stesso proviene, la durata vitale del cookie (ovvero per quanto tempo rimarrà sul dispositivo dell’utente) ed un valore, che di regola è un numero unico generato in modo casuale. Ad ogni visita successiva i cookie sono rinviati al sito web che li ha originati (cookie di prime parti) o a un altro sito che li riconosce (cookie di terze parti). I cookie sono utili perché consentono a un sito web di riconoscere il dispositivo dell’utente e hanno diverse finalità come, per esempio, consentire di navigare efficientemente tra le pagine, ricordare i siti preferiti e, in generale, migliorare l’esperienza di navigazione. Contribuiscono anche a garantire che i contenuti pubblicitari visualizzati online siano più mirati ad un utente e ai suoi interessi. Se l’utente decide di disabilitare i cookie, ciò potrebbe influenzare e/o limitare la sua esperienza di navigazione all’interno del sito, per esempio potrebbe non essere in grado di visitare determinate sezioni. Le modalità di funzionamento nonché le opzioni per limitare o bloccare i cookie, possono essere regolate modificando le impostazioni del proprio browser internet. La maggioranza dei browser internet sono inizialmente impostati per accettare i cookie in modo automatico, l’utente può tuttavia modificare queste impostazioni per bloccare i cookie o per essere avvertito ogniqualvolta dei cookie vengano inviati al suo dispositivo. Esistono diversi modi per gestire i cookie, a tal fine occorre fare riferimento alla schermata di aiuto del proprio browser per verificare come regolare o modificare le impostazioni dello stesso. L’utente è abilitato, infatti, a modificare la configurazione predefinita e disabilitare i cookie (cioè bloccarli in via definitiva), impostando il livello di protezione più elevato.\nGOOGLE CHROME Per maggiori informazioni consulta la pagina di Google Chrome\nINTERNET EXPLORER Per maggiori informazioni consulta la pagina di Internet Explorer\nOPERA Per maggiori informazioni consulta la pagina di Opera\nSAFARI Per maggiori informazioni consulta la pagina di Safari o Safari (IOS)\nFIREFOX Per maggiori informazioni consulta la pagina di Firefox\nMICROSOFT EDGE Per maggiori informazioni consulta la pagina di Microsoft Edge\n© 2018 Milano-Psicoterapia.it - Cookie - Privacy


Spettacolare eruzione nella penisola della Kamchatka\nSpettacolare eruzione nella penisola della Kamchatka\n27 aprile 2013 Francesco Pulpito 0 Commenti eruzione, Klioutchevskoi, Relazioni Esterne\nDopo 36 anni di inattività il vulcano Tolbachik Plosky, situato nella zona sud della catena vulcanica di Klioutchevskoi, è ritornato in attività. Due coraggiosi blogger russi, Liudmilla e Andrew, mettendo a rischio la propria incolumità, armati di macchina fotografica hanno ripreso lo spettacolare evento.\nIl vulcano, alto 3.085 metri, si trova esattamente a 343 Km dalla capitale della regione Petropavlosk Kamchatski. Le caratteristiche eruttive di questo vulcano vengono definite di “tipo Hawaiano”, per la grande quantità di lava profusa, cambiano però le caratteristiche geochimiche del materiale prodotto. Gli scienziati che stanno seguendo il fenomeno, in un recente bollettino hanno segnalato questa eruzione con il codice Arancione che corrisponde al terzo dei quattro livelli di allerta secondo la scala Vulcano USGS. Per questo motivo le autorità locali, in collaborazione con il responsabile dell’Ufficio Turismo e Relazioni Esterne, Gevork Shkijan, hanno predisposto degli itinerari, sorvegliati da medici e soccorritori, per agevolare le presenza delle centinaia di turisti attirati dall’evento. Sarà inoltre predisposta un’area fornita di servizi igienici, acqua e legna per i turisti che vorranno piantare le loro tende.\nA loro disposizione ci saranno anche soccorritori esperti e scienziati per poterli guidare nella loro esplorazione. Il Tolbachik Plosky mediamente si risveglia ogni 20-30 anni, l’ultima eruzione si registrò nel 1975 emettendo una grande quantità di lava e generando un nuovo grande cratere. Secondo la dottoressa Tatiana Churikova dell’Istituto di Sismologia e Vulcanologia della regione, l’attuale eruzione è molto simile a quella precedente se non più intensa in quanto è già fuoriuscita quasi la metà di magma di quella del 1975-76. sulla stessa dorsale vulcanica ci sono altri vulcani che recentemente si sono risvegliati tutti.\nLe autorità hanno prudenzialmente sospeso i voli nella zona interessata a causa delle ceneri che hanno raggiunto anche i 10.000 mt di quota\n← Eucarestia per i divorziati, si può?\nNapoli e i grattacieli nella città dei bassi →\n15 marzo 2017 SenzaBarcode Redazione 0\nReferendum Giustizia Giusta: La Custodia Cautelare\n3 luglio 2013 Sheyla Bobba 8\nLa Chiesa degli ultimi: da Don Patriciello a Monsignor Depalma\n9 luglio 2013 Sheyla Bobba 2


Nonostante alcuni analisti avessero affermato che Xiaomi Mi 6 sarebbe arrivato tra marzo e aprile sul mercato, sembra che il produttore cinese sia stato costretto a posticipare la presentazione al mese di maggio. Sembrava che la produzione del SoC Snapdragon 835 avrebbe potuto essere sufficiente per soddisfare le richieste di altri produttori oltre a Samsung ma il colosso sud coreano, che produce i chipset per conto di Qualcomm, dovrebbe fagocitare l’intera produzione iniziale.\nXiaomi vorrebbe dunque evitare di presentare il suo nuovo top di gamma e renderlo disponibile sul mercato dopo diversi mesi e avrebbe preferito posticipare l’evento di lancio a maggio per avere la certezza di un adeguato stock a propria disposizione.\nNello stesso periodo potrebbe essere presentato anche il nuovo top di gamma Meizu che dovrebbe tornare a utilizzare un chipset Qualcomm, in questo caso proprio uno Snapdragon 835, dopo che le due compagnie hanno chiuso le ostilità in merito ad alcune royalty non pagate a brevetti violati.\nIl nuovo top di gamma Meizu, che potrebbe essere Meizu Pro 7, dovrebbe utilizzare un display dual edge con doppia fotocamera posteriore e sarebbe presentato in ritardo sulla tabella di marcia. Si tratta di una scelta “obbligata” per i produttori che hanno deciso di puntare tutto sullo Snapdragon 835, a differenza di altri come LG che ha lanciato il suo top di gamma con lo Snapdragon 821, il miglior chipset del 2016.\nMeizu PRO 7Qualcomm Snapdragon 835Xiaomi Mi 6