Venner Dating Halsnæs / Dk Dating\nFrederiksværk singler oprette annoncer på sexcet.net og date og finde nye rejsevenner. Herefter kan du oprette en datingannonce og du kan finde rejsevenner. Frederiksværk ligger i Halsnæs Kommune, som er en af landets største. Selvom advarsler ikke vil være i stand til at finde hjælpere. Vær meget voksen gratis dating site solrod strand lidt tro med dating profiler understrege, at der er. Det er ikke en kæreste, men en ven eller en man mødes med for at have sex. Det kan også være, at man søger efter en bolleven på en datingside. Der findes....\nI den forbindelse bruger Youtube bl. Stor discountkæde lukker: Det sker der med maden. Seneste spørgsmål om emnet. Gratis nettdating side, norge date, beste sider, sider norsk nå. Il ya forte chance que vous verrez un profil de quelqu'un que vous connaissez. Disse cookies kan lagre data, der identificerer den enkelte bruger eller som indeholder specifik information om brugeren. Hvis begge parter er enige, kan man aftale, at man bare ses engang imellem til uforpligtende sex.\nDu bliver seksuelt mere erfaren og venner dating Halsnæs ud af, hvad du kan lide. Køb ejendom og erhvervsgrund. Europol: Igangværende cyberangreb er uden fortilfælde. Cookies hjælper os desuden med at få overblik over dit besøg på hjemmesiden, så den løbende kan optimeres og målrette hjemmesiden til dine behov og interesser. Nyt projekt i Nordsjælland Håndbold: "Det er lidt vildt, det vi har gang i heroppe". Nye træningskammerater, find kæreste og venner. Hillerød Kommune er allerede i fuld gang med at DMI-varsel: Risiko for kraftig regn i dele af landet. Modbydeligt overfald og røveri mod årig kvinde: Sådan hjalp borgerne i menneskejagt på tre romaer i bil tværs gennem landet. Udfyld formularen og send en e-mail med link til denne side samt en eventuel kommentar til din ven. Denne side er skabt af legitimerede sundhedsspecialister. Vi bruger til ingen gebyr dating sites Ringkøbing-Skjern også cookies til at målerette annoncer og salgsoptimere hjemmesiden, venner dating Halsnæs.\nAggressive romaer bag groteske gaderøverier: Fastholder kvinder og flår deres smykker af. Årets mærkeligste tweet fra politiet: Numsevideo lægger op til e-sports brag. Højdepunkter: Pourié gav Randers glimrende udgangspunkt mod AaB. Her kan du date online under seriøse og trygge rammer. Dating norske kvinder halsnæs.\napps til afslappet tilslutninger Hjørring\nGratis online dating sites uden beregning Høje-Taastrup\nÆgteskab efter en affære Hedensted


Hent MOBI PDF Askepot - Brødrene Grimm - Bog\nAskepot - Brødrene Grimm - Bog.pdf\nOg når jeg kommer i... 01 - Snehvide 02 - Askepot 03 - Tornerose 04 - Bord daek dig 05 - Kongesoennen som ikke var ban 06 - Mor Hulda 07 - Jernhans 08 - Den kloge Bondepige. Eventyret om Askepot - Lydbog for børn med dansk tale. Sådan starter det klassiske eventyr om Askepot der skal så grueligt meget igennem inden hun får sin prins.\nDenne store samling af Grimms eventyr omfatter 35 eventyr i udvalg og oversættelse af Anine Rud og rigt illustreret af Svend Otto S. Læs mere. 01 - Snehvide 02 - Askepot 03 - Tornerose 04 - Bord daek dig 05 - Kongesoennen som ikke var ban 06 - Mor Hulda 07 - Jernhans 08 - Den kloge Bondepige.\nFamiliens Ære - Danielle Steel - BogImagining Nature - BogÅrbog For Feinschmeckere - BogBlomster Til Dommeren - Margery Allingham - BogÅrets Sjoveste Biler 2016 - BogCanal Locks - No Problem - Thomas Veber - BogBruce Lee´S Kampmetode - Bruce Lee - BogIslændingesagaerne - Bind 1 - BogAutonom Pusher Mentor - Ulrik Dahlin - BogVitello Gør En God Gerning - Kim Fupz Aakeson - Bog


Bellas bedrifter: Origami-nisser...\nFredag fik jeg brev fra min mor, og med i brevet var en lille origami-nisse samt kopi af foldevejledningen (som i denne uge (uge 43) vises i Familie Journalen. Nissen er i øvrigt designet af Minako Ishibashi).\nOPDATERING: du kan finde foldevejledning til nissen her.\nDa Louise og jeg i går var til kreative dage-messe i Fredericia var det derfor oplagt, at vi kiggede efter smukt papir til at folde nisser af ... og som vi så hyggede os med at folde i går aftes :-) Vi foldede også juletræer :-)\nDe prikkede nisser er foldet af papir str. 15x15 cm, og de små nisser er foldet af papir i str. 10x10 cm.\nMessen var som altid inspirerende, og denne gang med bedre plads i "gaderne", så man bedre kunne komme til. Jeg fik købt en del papir, som jeg glæder til at folde bl.a. flere nisser af. Jeg kiggede også efter perler og smykkedele, men jeg syntes ikke at kvaliteten var høj nok, så det fik jeg ikke noget med hjem af. Jeg søgte højt og lavt efter et nyt falseben, fordi jeg har forlagt det jeg har, men det fik jeg heller ikke med hjem. Til gengæld fik jeg købt et par gode julegaver, som jeg af gode grunde ikke kan røbe indholdet af her på bloggen :-)\nAlt i alt en god og inspirerende messe, og Louise og jeg glæder os allerede til næste år :-)\nIndsendt af Bella kl. 12.04\nEtiketter: DIY, kreative dage-messe, origami, origaminisse, origamipapir\nAnonym 27 oktober, 2014 11:40\nDet var en rigtig dejlig og inspirerende dag:-)\nBella 27 oktober, 2014 14:13\nJa, det var det -- og tak for det, Louise!\nUnknown 24 november, 2014 19:22\nWow hvor er de nisser fine.. Jeg har ledt og ledt på Familie Journalens hjemmeside uden held med diagrammet. Har du mon et link? Den ville være perfekt til klippeklistredag på fredag på mit arbejde nemlig :) på forhånd tak. Mvh Louise\nBella 24 november, 2014 20:19\nNej ,jeg har desværre ikke et link, men kan du ikke sende mig en mail til: mail.til.bella@gmail.com, så skal jeg prøve om jeg kan hjælpe.


Behandling mod tyndt og svækket hår fra Strong HairPro serum\nDenne serum er lavet af ekstraordinære ingredienskomplekser, herunder Capixyl ™, Keravis ™, Redensyl ™ og Keratec ™. Ved jævnlig påføring trænger denne serum ind i hovedbunden og folliklerne, hvor den nærer tyndt eller svækket hår. Den øger hårets styrke, tykkelse og volumen. Håret bliver fyldigere, skinnende og med en sund udstråling. Strong HairPro er ligeledes et fantastisk supplement til behandling af meso mod hårtab.\nPåfør 2 til 3 dråber på fugtigt, håndklædetørt hår, masserer ind i hovedbunden. Skal ikke skylles ud. Red håret igennem og style som sædvanligt. Bruges 1-2 gange om dagen morgen og aften.


Dolce Casa Family Hotel & Spa i Moena til Bedste Pris-garanti | Agoda.com\nStrada Giuseppe Kostner 15, Moena, Moena, Italien, 38035\nbaseret på 49 anmeldelser Se alle 71 billeder\nFamilie-juniorsuite (2 voksne + 2 børn) (Family Junior Suite (2 Adults + 2 Children))\nFamily Room (2 Adults + 1 Child up to 17 years old)\nFamilie-suite med 2 soveværelser (Family Two-Bedroom Suite)\nOm Dolce Casa Family Hotel & Spa\nDet 4-stjernede Hotel Dolce Casa ligger i Moenas centrum og byder på gratis wellness-center med indendørs swimmingpool og spabad. Hotellet har både indendørs og udendørs legepladser og solterrasse med liggestole.\nDolce Casa har en stor have med bordtennis og bordfodbold. Indendørs bydes på et bredt udvalg af wellness-faciliteter, herunder sauna og tyrkisk bad.\nMorgenmaden består blandt andet af hjemmebagte kager, wienerbrød og pålæg. Æg og bacon kan bestilles. Restauranten serverer italienske retter og specialiteter fra Sydtyrol.\nVærelserne har alle træmøbler og gulvtæppe eller trægulv. Samtlige værelser har tv, opholdsområde og eget badeværelse med hårtørrer og toiletartikler. Værelserne har desuden alle udsigt over haven, byen eller de omkringliggende bjerge, og nogle af værelserne har balkon.\nMoenas busstation ligger 2 minutters kørsel derfra, og der tilbydes gratis afhentning. Der tilbydes desuden bustransport til skiområdet Passo Lusia. Der er gratis parkering.


Kirkeministeriet ansætter egypter til at missionere blandt arabere - Udfordringen\nKirkeministeriet ansætter egypter til at missionere blandt arabere\nAf Maria Vibe Callesen\t 10. apr. 2003/15\nKirkeministeret har nu ansat egypteren Nabil Astafanos til at udbrede kendskabet til kristendommen blandt arabisktalende indvandrere.Nabil Astafanos er evangelist og leder projektet Greater Love. Det er syv sogne og et missionsselskab, som står bag projektet. Omdrejningspunktet er Vigerslev kirke, hvor evangelisten skal danne en arabisksproget menighed.\n– Det drejer sig om at hjælpe mennesker til at lære Bibelen, Jesus og Gud at kende og derigennem ændre deres liv, siger han til Kristeligt Dagblad\nDansk Europamission har stået bag støtten til Nabil Astafanos, men i år har Kirkeministeriet overtaget. Dansk Europamission er dog stadig med i projektet, da bestyrelsesformanden er Henrik Ertner Rasmussen, som er generalsekretær i missionsselskabet.\nPower i evangelisation\nFolkekirken til debat i Århus


Menneskelige hjerne udvikling skrider frem gennem en serie af netop orkestreret processer, med tidligere stadier fornem spredning, migration og neurite udvækst; og senere stadier karakteriseret ved axon/dendrit udvækst og synapse dannelse. I nervesystemets udvikling, er ofte en eller flere af disse processer forstyrret, fører til abnormiteter i hjernen dannelsen og funktionen. Med fremkomsten af menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) teknologi har forskere nu en rigelig forsyning af humane celler, der kan opdeles i stort set enhver celletype, herunder neuroner. Disse celler kan bruges til at studere både normal hjernens udvikling og sygdom patogenese. Et antal protokoller ved hjælp af hiPSCs at modellere neuropsykiatriske sygdomme brug terminalt differentieret neuroner eller brug 3D kultur systemer betegnes organoids. Mens disse metoder har vist sig uvurderlige i at studere menneskelig sygdom patogenese, er der nogle ulemper. Differentiering af hiPSCs i neuroner og generation af organoids er lange og dyre processer, der kan påvirke antallet af eksperimenter og variabler, der kan vurderes. Hertil kommer, mens post mitotiske neuroner og organoids giver mulighed for undersøgelse af sygdom-relaterede processer, herunder dendrit udvækst og synaptogenesis, udelukker de undersøgelse af tidligere processer som spredning og migration. I nervesystemets såsom autisme, rigelige genetiske og post mortem tyder på, mangler i tidlige udviklingsprocesser. Neurale forløber celler (NPC), en meget proliferativ celle population, kan være en velegnet model til at stille spørgsmål om ontogenetiske processer og sygdom indledning. Vi udvider nu metoder lært af at studere udvikling i mus og rotter kortikale kulturer til menneskelige NPCs. Brug af NPCs tillader os at undersøge sygdomsrelaterede fænotyper og definere hvordan forskellige variabler (fx, vækstfaktorer, narkotika) indvirkning udviklingsmæssige processer herunder spredning, migrering og differentiering i kun et par dage. I sidste ende, dette værktøjssæt kan bruges i en reproducerbar og høj overførselshastighed måde for at identificere sygdoms-specifikke mekanismer og fænotyper i nervesystemets udvikling.\nBrug af enklere organismer og musemodeller har belyst mekanismerne af grundlæggende hjernens udvikling samt sygdom patogenese. Trods disse fremskridt stadig ætiologien af mange neuropsykiatriske lidelser undvigende fordi ikke alle resultater i enklere organismer er direkte relevante for komplekse aspekter af sygdomme hos mennesker. Yderligere, den større kompleksitet af den menneskelige hjerne ofte gør det vanskeligt at model menneskelig udvikling og lidelser i dyr. Med evolution og udvikling af menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs) teknologi, kan somatiske celler omprogrammeres til stamceller og derefter opdeles i neuronale celler til at studere sygdomme hos mennesker. Fremskridt i hiPSCs og "omic" teknologier (genomforskning, transcriptomics, proteomics, metabolomics) lover at revolutionere forståelse af menneskelige hjerne udvikling. Disse teknologier nu gøre muligt et "præcision medicin" tilgang til karakterisering af neuropsykiatriske sygdomme på et sag til sag grundlag.\nDen nuværende hæfteklamme i feltet hiPSC sygdom-modellering er at differentiere celler i specifikke neuronal undertyper i en éncellelag eller bruge et 3D kultur system kaldet en organoid til at sammenfatte aspekter af hjernens udvikling1,2, 3. Disse systemer har været utrolig værdifuld i at undersøge og afdække unikke aspekter af menneskelig udvikling og sygdom4,5,6,7. Men både neuronal kulturer og organoids kræver ofte overalt fra uger til måneder i kultur før de er klar til at studere. Tidskrævende arten af disse protokoller og de nødvendige midler til at opretholde disse kultur systemer ofte begrænse antallet af eksperimenter, der kan udføres, og antallet af variabler (som vækstfaktorer eller narkotika), der kan testes. Desuden, mange undersøgelser bruger post mitotiske neuroner og organoids har fokuseret på processer såsom dendrit udvækst eller synapse dannelse, som opstår senere i udvikling. Mens disse processer har været impliceret i patologi af udviklingsforstyrrelser som autisme og skizofreni, er tidligere udviklingsmæssige hændelser, der indtræffer før endelige neuronal differentiering også vigtige for sygdom patogenese8 ,9,10,11,12,13. Ja, de seneste genomisk undersøgelser viser, at de midten af fostrets periode, som består af spredning, proces udvækst og migration, er særlig vigtigt i autisme patogenese11,14. Derfor er det vigtigt at studere neurale stamceller og stamfader cellepopulationer til bedre at forstå disse tidligere processer. Organoid systemer, der er anset for bedre at kunne sammenfatte menneskelige hjerne udvikling på grund af deres 3D karakter og organiseret struktur, indeholder en stamfader pool, der har været udnyttet til at studere nogle af disse tidligere hændelser. Men stamfader befolkningen i organoids er ofte sparsom og mere som radial gliaceller end neurale stamceller eller stamfader celler5,15. Det ville således være gavnligt at have en høj overførselshastighed metode til at studere tidlige stadier af nervesystemets udvikling i befolkningens aktivt proliferativ celle.\nI laboratoriet, har vi lavet en protokol, der bruger hiPSC-afledte neurale forløber celler (NPC), en blandet befolkning af neurale stamceller og stamceller, der er meget proliferativ, at studere Neuro-udviklingsmæssige processer såsom spredning, celle migration, og indledende proces (neurite) forlængelse. Disse undersøgelser blev udviklet fra teknikker, der anvendes i vores lab i årtier at kunne studere nervesystemets udvikling i rotter og mus kortikale kulturer16,17,18,19,20, 21,22,23. Vigtigere, blev det også vist sig at fænotyper og regulerende signaler defineret i rotter og mus kultur systemer er meget intelligent af mekanismer, der er aktive i vivo, der angiver værdien af disse teknikker16, 17,18,19,24. Efter indledende differentiering af hiPSCs til NPCs, disse metoder giver os mulighed at studere vitale udviklingsmæssige processer i løbet af få dage. Disse metoder har mange fordele: (1) de kræver lidt avanceret udstyr og er nem at implementere, (2) talrige eksperimentelle replikater kan gennemføres i en kort periode, giver mulighed for hurtig bekræftelse af reproducerbarhed af resultaterne, og (3) kultur variabler som belægning matricer, virkningerne af vækstfaktorer og aktivitet af narkotika kan testes, hurtigt og omkostningseffektivt. Desuden, vi drage fordel af ekstracellulære vækstfaktorer veletableret rolle som kritiske regulatorer af forskellige udviklingsprocesser. NPCs var udsat for at vælge udviklingsmæssige signaler, der direkte stimulerer begivenheder som spredning, neurite udvækst og celle migration, og har fundet de forbedre evnen til at identificere mangler, der ikke er synlige i kontrol betingelser19 , 25 , 26 , 27 , 28. på samme måde at lette vurderingen af lægemidler giver en kraftfuld avenue for at vedtage præcision medicin teknikker for at teste effektiviteten af forskellige terapeutiske indgreb. Således, denne protokol giver en høj overførselshastighed, reproducerbar, og enkel metode til at studere tidlige hjernens udvikling, sygdom patogenese og de potentielle gavnlige effekter af vækstfaktorer og narkotika på udviklingsforstyrrelser fænotyper.\n1. sikkerhedsprocedurer og biosikkerhed kabinet vedligeholdelse\nBiosikkerhed niveau-2 (BSL-2) sikkerhedsprocedurer\nFølg retningslinjerne for institutionens arbejde med BSL-2 materialer. Bortskaffe BSL-2 materialer ifølge institutionens praksis. Angive lokaler og udstyr, der bruges til BSL-2 materialer. Bære alle personlige værnemidler (PPE), herunder laboratoriekittel og handsker.\nBiosikkerhed kabinet vedligeholdelse\nBruge en biosikkerhed kabinet certificeret til brug af BSL-2 niveau materialer.\nDrej på UV-lyset i biosikkerhed kabinet i mindst 15 min., og derefter spray overflader med 10% blegemiddelopløsning. Tillad blegemiddelopløsning at sidde i 15 min., tørre ned i kabinettet og tænde luftstrømmen før brug.\nRadioaktivt tritium [3H]-thymidine (Tritium) sikkerhedsprocedurer\nBemærk: Tritium er en kategori 5 radioaktiv kilde, «den mest usandsynlige farlige» kategori. Følg institutionens retningslinjer for at arbejde med radioaktivitet. Nogle institutioner kan kræve certificeringer eller tillader for at håndtere tritium.\nModtage undervisning fra institution om, hvordan man korrekt håndtere og bortskaffe tritium. Bortskaffelse af radioaktivt affald i passende beholdere, ifølge institutionens politik. Bære PPE, når du arbejder med tritium.\n2. neurale induktion fra iPSCs\nBemærk: For at gøre NPCs, en let ændret udgave af en protokol, der ledsager et kommercielt tilgængelige neurale induktion kit blev fulgt. Sættet består af Neurobasal (NB) medier og et 50 x neurale induktion Supplement (NIS), som bruges til at gøre en 1 x neurale induktion Medium (NIM). NIS bruges også til at gøre 100% udvidelse Medium (Se afsnit 3.1). Et link til protokollen er fundet i materialer og udstyr samt referencer afsnit43.\nPassage iPSCs når de bliver 70-80% sammenflydende.\nPlade 300.000 iPSCs til 1 godt af en menneskelige stamceller-kvalificeret ekstracellulære matrix-efterligne gel (ECM-efterligne gel) belagt 6-godt plade med 2 mL af feeder-fri iPSC medium med 5 μM af ROCK hæmmer. Se punkt 3.2 instruktioner på belægning brønde med ECM-efterligne gel.\nEn dag senere, fjerne iPSC medium + ROCK-hæmmer og vask iPSCs gang med 1 x PBS. Tilsættes 2 mL af NIM til iPSCs.\nBemærk: 50 mL af NIM er lavet ved at tilføje 1 mL 50 x NIS og 250 µL (50 enheder/mL, 5 μl/mL) Penicillin/Streptomycin (P/S) til 49 mL af NB medier.\nChange media af neurale induktion hver 2 dage ved sugning brugt medium og erstatter med 2 mL af NIM indtil celler blive sammenflydende (omkring 4-5 dage). Ændre medierne dagligt, når cellerne er sammenflydende.\nPassage celler efter 7 dage i NIM og plade i en ECM-efterligne gel belagt 6-godt plade med 2 mL af 100% udvidelse Media og 5 μM ROCK inhibitor. Cellerne betragtes Passage 0 (P0) NPCs på dette punkt. Se punkt 3.1 nedenfor for instruktioner til at gøre 100% udvidelse medier.\nPassage celler ved hjælp af de metoder, der er beskrevet i afsnit 3.4. Vent, indtil cellerne har nået P2 og er sammenflydende inden fællesinstansen for at plette for NPC markører og plating for eksperimenter (figur 1).\n3. dyrkningsmedier, overfladebehandling og vedligeholdelse af NPCs\nMedia forberedelse til vedligeholdelse af NPCs (100% udvidelse medier):\nGøre 50 mL 100% udvidelse medier ved at kombinere 24,5 mL af DMEM/F12 med 24,5 mL NB.\nDer tilsættes 1 mL af 50 x NIS til DMEM/F12 + NB løsning. Tilføje 250 μL af P/S løsning til medier.\nBemærk: Medier kan være køle (4 ° C) og bruges i op til 2 uger. Mindre mængder af medier kan gøres ved at justere mængderne af DMEM / F12 + NB + NIS ved hjælp af de samme forhold som for 50 mL volumen.\nForberedelse af ECM-efterligne Gel belagt kultur plader for NPC vedligeholdelse\nAlikvot ECM-efterligne gel på diskenheden skulle lave 6 mL brugsopløsning. Beregn rumfanget af kigge på arket analyse certifikat siden ECM-efterligne gel fortyndingsfaktoren varierer fra batch til batch og lot til lot.\nTø en ECM-efterligne gel alikvot på is og opløses i 6 mL af kolde DMEM/F12 medier.\nDer tilsættes 1 mL af ECM-efterligne gel/DMEM/F12 løsning til hver brønd med en 6 godt plade. Inkuber 6-godt plade med ECM-efterligne gel-løsning til 30 minutter ved 37 ° C.\nOpsug ECM-efterligne gelopløsning efter 30 min inkubation og erstatte med 100% udvidelse medier eller opbevares i køleskab plader (4 ° C, op til 1 uge) uden sugning ECM-efterligne gel-løsning.\nVedligeholdelse af NPCs\nPlade NPCs med en tæthed på 1,5 millioner celler ind i en ECM-efterligne gel-belagte godt indeholdende 2 mL af 100% udvidelse medier.\nNPCs der inkuberes ved 37 ° C i et fugtigt miljø med 5% CO2.\nTilføj 5 μM af ROCK hæmmer til medierne for NPCs på P3 eller lavere eller optøede NPCs at forhindre overdreven celledød. Ændre medier efter 24 timer til at fjerne ROCK inhibitor.\nPassage celler hver 4-9 dage, afhængig af hvornår de bliver sammenflydende. Celler betragtes sammenflydende, når de bliver et tæt pakket éncellelag der dækker hele bunden af skålen overfladen.\nPlade NPCs med en tæthed på 1-1,5 millioner celler pr. én brønd af et 6-godt plade (Se afsnit 3.4). Fjerne brugte medier hver 48 h og erstatte med 2 mL af 100% udvidelse medier.\nLøft, adskille, og Pellet NPCs for vedligeholdelse og/eller Plating for forsøgsbetingelser\nOpsug medium, vaske cellerne en gang med 1 x PBS. Opsug PBS og tilsæt 500 μL af 1 x celle detachement løsning i 1 godt af sammenflydende NPCs. Incubate i 10 minutter ved 37 ° C.\nTilsæt 500 μL af stuetemperatur (RT) PBS og vask det godt med en P-1000 pipette for at sikre fjernelse af celler. Indsamle PBS løsning + celler ind i en 15 mL konisk rør. Vaske pladen igen med 1 mL PBS og tilføje flydende til røret.\nSpin cellerne ned ved 300 x g i 5 min til pellet.\nFjern supernatanten fra celle pellet og genopslæmmes celler i 1-5 mL af pre varmede DMEM/F12 medier. Fortynd celler til en tæthed på 1 til 4 millioner celler/mL af medier. Kvantificere celler ved hjælp af en hemocytometer.\nPlade det krævede antal celler, specifikke for enten NPC vedligeholdelse (afsnit 3.3) eller den enkelte analyse gennemføres (Se efterfølgende afsnit for flere detaljer).\nJuster suspension cellevolumen med medierne, så mellem 15 til 100 μL af celler, der bruges til hver brønd/parabol. Denne lille plating volumen sikrer at der er endog celle fordeling og at vækstfaktorer, narkotika eller substrater i mediet ikke udvandes.\nInkuber celler ved 37 ° C. Ændre media hver 48 h for NPC vedligeholdelse eller se de specifikke oplysninger om individuelle assays.\nMedia forberedelse til eksperimentelle betingelser (30% udvidelse medier)\nFortyndes 100% udvidelse medier af 70% (såkaldte 30% udvidelse) ved at tilføje 1:1 DMEM/F12 + NB løsning for at gøre medierne for forsøgsbetingelser.\nGøre 20 mL 30% udvidelse medier ved at tilføje 6 mL 100% udvidelse medier og fortynding med 7 mL af NB og 7 mL DMEM/F12 medier. Der tilsættes 5 µL/mL af P/S løsning.\nBemærk: Hvis 100% medier indeholder allerede P/S, derefter tilføje 5 μl/mL for kombineret DMEM / F12 + NB = (14 mL) x (5 μl/mL) = 70 μL af P/S i stedet for 100µL.\nTilføje belægning substrater og vækstfaktorer på ønskede koncentrationer til 30% udvidelse medier.\n4. vurdering af DNA-syntese, S-fase indrejse og celle numre af NPCs\nForberedelse til DNA-syntese, S-fase indrejse og celle nummer Assay\nGøre en 1 mg/mL stamopløsning af poly-D-lysin (PDL) i dH2O og filter sterilisere. Fortyndes 1:10 i dH2O at gøre en 0,1 mg/mL PDL løsning og tilsæt 300 μl til hver brønd af en 24 godt plade eller 1 mL til en 35-mm ret. Inkuber i 20 min. på RT.\nVaske PDL wells 3 gange for 5 min med dH2O. aspirat dH2O og tilføje 300 μL/brønd eller 1 mL/fad laminin (5 μg/mL) fortyndet i 1 x PBS. Dække plader med parafilm og holde i et sterilt, biosikkerhed kabinet overnatning på RT (12-24 h).\nForberede 30% udvidelse Media (Se afsnit 3.5) efter 12-24 h. Tilføj køretøjer, vækstfaktorer eller narkotika af interesse i den ønskede koncentration i mængder, der er mindre end 10% af den samlede løsning til at undgå fortynding NIS i 30% udvidelse Medium.\nVask hver godt af 24-godt plade to gange med 1 x PBS (5 min). Opsug 1 x PBS og tilføje 450 μL af medier (uden eller med narkotika/vækstfaktorer). Inkuber plade ved 37 ° C i mindst 15 min før plating celler.\nTil hvert eksperiment, oprette 2-3 brønde eller retter pr. betingelse.\nPlade NPCs (Se afsnit 3.4):\nNPC DNA syntese Assay: 100.000 celler/brønd i en 24 godt plade\nS-fase Entry: 500.000 celler/35 mm parabol\nCelle nummer Assay: 50.000 celler/brønd i en 24-godt plade\nNeurale forløber celle DNA syntese Assay\nPlade 100.000 celler/brønd i en 24-godt plade og vurdere i tre eksemplarer/tilstand.\nTilføje radioaktivt, tritiumholdigt [3H]-thymidine til næringssubstratet (1,5 μCi/mL) i hver brønd efter 46 h i kultur. Inkuber celler ved 37 ° C i 2 timer.\nBemærk: Når du bruger radioaktive materialer, modtage undervisning fra din institution, Følg radioaktivitet sikkerhed protokoller og bortskaffe radioaktive materialer i de behørigt udpegede affald beholdere.\nFjerne og korrekt bortskaffe radioaktive medier efter 2 h. tilføje 300 μL pre varmede 0,25% trypsin-EDTA (0,5 mM) til hver brønd og Inkuber i 20 min ved 37 ° C.\nDrej på celle mejetærsker (Se materialer og udstyr afsnit) og pumpen og sikre, at pumpetryk er under 200 PSI. Placer filtrerpapir gennem rummet i celle mejetærsker og rive den højre hjørne for at markere papirretning.\nPlacer indsamling rør af celle mejetærsker i en tom "blank" bakke og tryk på prewash at fugte filtrerpapir. Placer indsamling rør i stikprøven brønde og køre (start).\nNår cellen harvester er færdig med indsamling af prøver, løfte klemme og advance filtrerpapir gentage for alle prøve sæt. Altid prewash i en tom, "Tom" plade.\nTørt filtrerpapir under en lyskilde og oprette tilsvarende hætteglas i en bakke. Punch ud papir chads i hætteglas og tilsættes 2 mL flydende scintillation cocktail til hvert hætteglas. Cap og etiket hætteglas.\nInkuber hætteglas i flydende scintillation cocktail i mindst 1 time før du læser tæller pr. minut (CPM'er) på en scintillation maskine.\nNPC S-fase post Assay\nSe afsnit 3.4 for trin til at løfte, adskille, pellet og genopslæmmes celler.\nPlade 500.000 celler pr. parabol i 35 mm retter tilberedt i afsnit 4.1, kun 1 fad/betingelse for dette trin.\nAgitere retter frem og tilbage i alle retninger for at sikre ligelig fordeling af celler. Inkuber celler ved 37 ° C i 46 h.\nForberede tre 35 mm plader overtrukket med PDL/Laminin pr. tilstand efter 24 timer. For eksempel, hvis der er en 35 mm skål af 30% udvidelse medier og en 35 mm skål af 30% udvidelse medier + FGF (10 ng/mL) derefter pels 6 PDL/Laminin plader til brug på den næste dag.\nTilføje 2 μl/mL 5 mm EdU til kulturer efter 46 h. Incubate i 2 timer.\nAdskille og sammenpresse cellerne (Se afsnit 3.4). Genopslæmmes celle pellet i 3 mL 30% udvidelse medier eller 3 mL 30% udvidelse medier + ønskede vækstfaktorer/narkotika.\nPlade 1 mL pr parabol på forhånd belagte PDL/Laminin retter. Agitere retter frem og tilbage i alle retninger for at sikre ligelig fordeling af celler. Der inkuberes ved 37 ° C i 2 timer til at tillade cellerne til at holde sig til fadet. Se figur 2 for en forenklet tidslinje.\nS-fase post analyse\nLave retter med iskold 4% PARAFORMALDEHYD (PFA i 1 x PBS) i 20 min. Derefter, vaske op 3 gange i 5 min. med 1 x PBS.\nDer tilsættes 1 mL af 1 x PBS med 0,05% natriumazid at undgå bakterie-og svampevækst. Celler kan opbevares ved 4 ° C i op til 6 måneder hvis retter (forseglet med parafilm) holdes i PBS + natrium indeholder løsning, selv om ikke alle immunologiske antigener er godt bevaret efter lange forsinkelser i analysen.\nAssay celler ved hjælp af en kommerciel EdU reaktion kit (Se producentens protokol). Pletten celler ved hjælp af DAPI eller en anden nukleare markør, og billedet ved hjælp af Fluorescens mikroskopi.\nVurdere andelen af EdU positive celler over samlede levende celler (cellen total antal) blind i 10 systematisk tilfældige felter (10 x). Medtag ikke døde celler i analysen.\nUdnytte både fase kontrast billeder og fluorescerende billeder til at bestemme positive EdU farvning og til at fastslå, hvilke celler der er døde eller levende (figur 3).\nTælle alle celler, der har både glat og endda cellemembranen i fase kontrastindstillinger, og en stor fragmenteret kerne af fluorescerende DAPI nukleare pletten, da disse celler er live (figur 3A-B).\nUdelukke alle celler, der er fase lyse, har en brudt ujævn cellemembranen og har en lille, kondenseret kerne som visualiseret ved DAPI fluorescerende imaging, da disse celler er døde (figur 3A-B). Vurdere levende celler for udtryk for EdU ved at identificere celler, der har lyse fluorescerende EdU pletten dækker hele kernen eller plettet fluorescerende farvning i cellekernen (figur 3 c).\nNPC celle nummer Assay\nEfter 2 dage i kultur, etiket og forberede 1,5 mL microcentrifuge rør og 0,5 mL microcentrifuge rør. I hver 0,5 mL tube, tilsættes 5 μl af Trypan blå.\nTil hver brønd med en 24 godt plade, fjerne medium og tilføje 200 μl 1 x celle detachement løsning og plads i rugemaskine for 10-15 min.\nEfter den tildelte tid, når cellerne har ophævet, tilsæt den ønskede mængde 1 x PBS til hver brønd.\nBemærk: Typisk på dag 2, tilføje 300 μL 1 x PBS til godt indeholdende cellerne plus 200 μl af detachment løsningen, for en samlet maengde paa 500 μL. Med ekstra kultur inkubationstiden, som cellerne bliver mere sammenflydende, øge fortyndingsvolumen som nødvendigt. For eksempel på dag 4, tilsæt 500 μL af 1 x PBS og på dag 6, tilføje 800 μL 1 x PBS. Samlede diskenheder bliver 700 μL og 1 mL, henholdsvis.\nBruger en P-1000 pipette, pipetteres op og ned i hver godt 4 til 5 gange for at fjerne celler. Undersøge plade under et mikroskop for at sikre, at alle celler er skilt. Overfør celler til 1,5 mL rør.\nInvertere 1,5 mL rør med fortyndet celler 2 til 3 gange. Derefter tage en 50 μL alikvot af celler fra midten af røret og tilføje til 0,5 mL rør med Trypan blå (Se 4.5.1).\nPipette celle løsning op og ned 2 til 3 gange. Føje celler til hemocytometer og analysere straks. Venter længere end 10 min kan øge celledød eller tilstedeværelsen af celler, der har overtaget Trypan blå.\nForsigtigt tilføje 10 µL af celle + Trypan blå blanding til hver side af hemocytometer til at udføre Repliker tæller. Tælle celler ved hjælp af fase kontrast mikroskop. Tæl ikke med døde celler eller de mørke blå celler, der har overtaget Trypan blå.\nFor at opnå den samlede celle nummer, brug gennemsnitlige celle nummer tælles fra 4 hjørner af hemocytometer og anvende følgende ligning:\nBetyde cell antal x media volumen (mL) x 10,000 = samlede celle nummer/brønd\nOpsug og Gentag proceduren på resterende brønde. Ændre medier på de celler, der ikke er regnes, hver 48 h. Repeat assay på dage 4 & 6.\n5. NPC Neurite analyse\nForberedelse af retter og medier for Neurite analyse\nGøre en 1 mg/mL stamopløsning af poly-d-lysin (PDL) i dH2O og filter sterilisere. Fortyndes 1:10 i dH2O til at gøre en 0,1 mg/mL PDL løsning og tilsættes 1 mL til hver 35-mm ret. Inkuber i 20 min. på RT.\nI mellemtiden forbereder 30% udvidelse Media (Se afsnit 3.5) og tilføje 5 μg/mL (5 µL/mL) af fibronektin løsning (1 mg/mL stock) til medierne.\nNår medierne er forberedt, tilføje køretøjer, vækstfaktorer eller narkotika af interesse på ønskede koncentrationer.\nBemærk: Det er bedst at tilføje køretøj, vækstfaktorer eller narkotika, ved mængder < 10% af den samlede løsning til at undgå at udvande fibronektin og andre komponenter i 30% udvidelse medium.\nEfter 20 min, vaske PDL op 3 gange for 5 min med dH2O at fjerne overskydende PDL. Sikre retter er tørre før du tilføjer medier.\nSted 1 mL af medier (med eller uden narkotika/vækstfaktorer) + fibronektin løsning i hver PDL belagt parabol.\nInkuber retter ved 37 ° C i mindst 30 min før plating celler for at sikre ordentlig fastgørelse af fibronektin PDL.\nTil hvert eksperiment, opsætning af 2-3 retter pr. betingelse (fx, 3 køretøj-holdige retter, 3 stof-holdige retter).\nPlating NPCs for Neurite analyse\nSe afsnit 3.4 for trin til at løfte, adskille, pellet og resuspend celler.\nPlade 50.000 celler pr. parabol i retter tilberedt i afsnit 5.1. Agitere retter frem og tilbage i alle retninger for at sikre en jævn fordeling af celler.\nAnalyse af Neurites\nEfter inkubation celler for 48 h, Aspirér medium og lave retter med is kold 4% PFA i 20 min.\nEfter 20 min, vaske op 3 gange i 5 min. med 1 x PBS. Efter den sidste vask, tilsættes 1 mL af 1 x PBS med 0,05% natriumazid.\nAnalysere retter blindt på en fase-kontrast mikroskop på 32 X. Tælle samlede celler og celler med neurites i 3, 1 cm rækker, udvælges tilfældigt men reproducerbare positioner. Regne mindst 150 celler pr. parabol til at sikre passende stikprøver.\nBemærk: En neurite er defineret som en udvidelse (proces) fra cellen organ, der er > 2 cellen kroppen diametre i længden. I celler med flere processer betragtes den længste proces til kriteriet. Celler med processer, der er < 2 cellen kroppen diametre i længde ikke er inkluderet (figur 4).\nTilføje sammen det samlede antal celler og det samlede antal celler med neurites i hver skål. Beregne % af celler med neurites. Gennemsnitlig procentdel af celler med neurites på tværs af replikat retter. Tillid til eksperimentelle reproducerbarhed er etableret når alle rækker i hver tallerken er ens, og gennemsnit blandt retter er meget ens, med standard fejl af middelværdien (SEM) < 10%.\nAlternativt kan du analysere neurites ved at gennemføre immuncytokemi for markører som beta-III-tubulin (TUJ1) eller MAP2. Efter farvning for markør af interesse, skal du tage 10 systematisk tilfældige billeder på et fluorescerende mikroskop på 10 X. Billede mindst 200 celler. I dette tilfælde erhverve billeder ikke for tæt på kanten af skålen. Analysere procentdelen af celler med TUJ1 eller MAP2 + neurites (Se figur 10 for et eksempel).\nDer tilsættes 1 mL 100% udvidelse medier til en 35-mm skål med ingen belægning substrat. Inkuber retter i mindst 15 min. ved 37 ° C, før plettering NPCs. Forbered 2-3 retter for at sikre, at der vil være nok neurospheres til celle migration assay.\nBemærk: Fraværet af en belægning substrat sikrer at NPCs forblive suspenderet i medierne, som er afgørende for neurosphere dannelse. Belægning retter vil forhindre neurosphere dannelse.\nSe afsnit 3.4 på trin at løfte, adskille, og pellet celler. Resuspend celle pellet i 2-5 mL af pre varmede 100% udvidelse medier. Plade 1 million NPCs i hver 35-mm skål forberedt i afsnit 6.1.1.\nNPCs der inkuberes ved 37 ° C i 48 til 96 h vil tillade NPCs aggregat og form neurospheres. Vurdere sfære størrelse ved hjælp af en live lineal på en fase-kontrast mikroskop. Vente på de fleste områder at nå frem til en anslået diameter 100 µm (± 20 μm) (figur 5). Mindre kugler vil helt sprede og bryde fra hinanden under migration assay.\nFremstilling af plader til Neurosphere Migration Assay\nOpløses ECM-efterligne gel delprøver (Se afsnit 3.2) i 6 mL 30% udvidelse medier. Når ECM-efterligne gel/30% ekspansion Media løsning er forberedt, tilføje køretøjer, vækstfaktorer eller narkotika interesser på ønskede koncentrationer.\nBemærk: Køretøj-, narkotika- og vækstfaktor koncentrationer skal øges til konto for tilsætning af 200 µL af neurospheres i afsnit 6.3.\nPlade 1 mL af ECM-efterligne gel /30% udvidelse Media løsning (± køretøjer, vækstfaktorer eller stoffer) i en brønd på en 6-godt plade. Gøre 2-3 boringer pr. eksperimentelle tilstand. Alternativt kan der anvendes 35-mm retter. Inkuber plader til mindst 30 minutter ved 37 ° C.\nBemærk: Ikke Aspirér ECM-efterligne gel/30% ekspansion Media løsning til dette assay. Plating kugler på en indsugning ECM-efterligne gel vil føre til hurtige og overskydende migration.\nIndsamle neurospheres dannet i afsnit 6.1 og placere dem i en konisk slange. Vask 35 mm retter med 1 mL af 1 x PBS til at sikre, at alle neurospheres er indsamlet. Spin ned de indsamlede neurospheres på 100 x g i 5 min.\nGenopslæmmes i neurospheres i 1-3 mL af pre varmede 30% udvidelse medier. Hvis 1 fad med neurospheres indsamles, bruges 1 mL af medier til resuspend kugler. Hvis 2 retter er indsamlet, 2 mL af medier er tilføjet til resuspend sfærer, etc. afpipetteres forsigtigt og brug kun en P-1000 til at sikre områder ikke er brudt.\nPlade 200 μl af den resuspenderede neurospheres i ECM-efterligne gel/30% udvidelsesløsning fremstillet i afsnit 6.2. Rock plader i alle retninger for at jævnt distribuere neurospheres. Inkuber plader i 48 timer ved 37° C.\nFjerne ECM-efterligne gel/30% ekspansion Media løsning og løse celler i 4% PFA, vask og holde celler i 1 x PBS + 0,05% natriumazid.\nAnalyse af Neurospheres\nErhverve billeder af hele neurospheres ved hjælp af fase kontrastindstillinger på 10 X. Sikre kugler ikke rører hinanden. Måle gennemsnitlige migration ved hjælp af ImageJ software.\nSpore den ydre omrids af neurosphere ved hjælp af værktøjet frihånd linje. Freehand linjen kan tilgås ved at højreklikke på ikonet "straight" linje. Manuelt spore ved hjælp af en mus.\nBrug funktionen til at beregne området i sporingen. Sikre, at "område" er valgt som en læse-out i vinduet "Sæt målinger" findes under fanen analyser. Se figur 6 for spor af ydre omrids i blå.\nSpore den indre cellemasse af området område og foranstaltning. Se figur 6 for spor af indre kontur i rød. Kvantificere gennemsnitlige migration ved at fratrække den indre cellemasse fra det samlede neurosphere område.\nForanstaltning neurospheres, der udviser en tætpakket indre cellemasse med celler migrerer ud som en sammenhængende tæppe (figur 6).\nMedtag ikke celler uden for gulvtæppet eller løsrevet fra neurosphere for måling. Se figur 6 eksempler på celler (cirkel i hvidt), der er udelukket fra det ydre tæppe måling. Analysere et minimum af 20 neurospheres for hver betingelse.\nÉt mål af disse undersøgelser er at definere den proliferativ aktivitet af NPC'ere, dvs en stigning i celle antal. Dette opnås ved at vurdere DNA syntese af cellen total befolkning, en høj overførselshastighed tilgang, der måler iblanding af radioaktive sporstof tritiumholdigt thymidine i celle ekstrakter, og afspejler alle celler involveret i S-fase, uanset om de er syntese i 5 minutter eller hele to timer. Derudover tillade disse assays bestemmelse af andelen af celler, som angiver S-fase, og cellen total numre, en mere arbejdskrævende assay af enkelt celler. Celler syntetisere DNA i S-fase, et skridt, der går forud for mitosen og celledeling, som skal ske for at øge celle numre. Da disse processer tage nogen tid, kan ændringer i DNA syntese vurderet på 48 timer ikke være forbundet med ændringer i celle numre på dette tidspunkt. Ikke desto mindre, konstateredes det, at ændringer i DNA syntese på 48 timer pålideligt forudsige stigninger i celle numre på dage 4 og 6.\nI vurderingen af DNA-syntese, celler er belagt med en tæthed på 100.000 celler (~ 50% sammenflydende) i en 24-godt plade og får lov til at vokse i 48 timer før du foretager målinger. Ved hjælp af denne tæthed sikrer, at cellerne ligner deres éncellelag miljø, men også dyrker ikke så hurtigt i løbet 48 h, at medierne bliver for sure. Medier, thats for sure kan påvirke cellestofskiftet og således ændre spredning resultater. Hvis specifikke cellelinjer er meget proliferativ, forskeren bør overveje at ændre celle tæthed, medier volumen, eller medier udveksle frekvens for at undgå stærkt sure betingelser. Hvis betingelserne er ændret, er det afgørende at være konsekvent, når man sammenligner forskellige cellelinjer, fordi celle-til-celle kontakt afhængige ændringer helt sikkert påvirke vækstrater. Den enkle design af disse assays gør det muligt for os at teste forskellige vækstfaktorer. Som det ses i figur 7, tilsætning af fibroblast vækstfaktor (FGF, 10 ng/mL) for 48 timer stigninger DNA syntese af ~ 40%. Derudover DNA syntese assay er reproducerbare som alle kloner og enkeltpersoner viser en stigning i DNA-syntese efter FGF stimulation. Potentialet for variabiliteten af baseline og FGF stimuleret DNA syntese blandt forskellige upåvirket individer såvel som potentialet for klonede variabilitet i samme individ er vist i tabel 1. Denne variation er det vigtigt at teste flere iPSC kloner pr. individ, samt vurdere et minimum af 3 til 5 NPC linjer stammer fra hver forskellige iPSC klon. Et minimum af 3 forsøg for hver NPC linje blev udført.\nDNA syntese assay tillader os hen til hurtigt at vurdere talrige eksperimentelle grupper i en høj overførselshastighed mode og foranstaltningen afspejler den samlede sum af DNA syntese uanset S-fase varighed (5 minutter til 2 timer). For at definere andelen af celler involveret i S-fase, var S-fase post assay ansat. Til dette assay celler dyrkes på det samme densitet som tidligere nævnt for at tillade éncellelag-lignende dynamics at forekomme, men derefter de adskilles efter 2 dage og tilladt at kortvarigt overholde plader at foretage single-celle analyse. Tælle celler i en éncellelag kan være vanskelig på grund af høje celle til celle kontakt og regional variation i pladen. Dette paradigme tillader os at model cellerne som en éncellelag og derefter analysere dem som enkelt celler. Det fungerer også som en metodisk uafhængig bekræftelse af data indhentet i DNA syntese assay. Som det ses i figur 8, øger 48 timer af FGF (10 ng/mL) stimulation andelen af celler ind i S-fase af ~ 25%.\nI vurderingen af celle tal, bruges en lavere celle tæthed end i de førnævnte assays, med 50.000 celler bliver forgyldt pr. brønd med en 24 godt plade. Igen, denne tæthed blev valgt til at sikre, at hurtigere cellelinjer ikke vokser så hurtigt over 6-dages periode, pH af mediet bliver for sure og bliver gul. I figur 9, mens celle numre ikke kan være betydeligt forskellige mellem kontrol og FGF (10 ng/mL) grupper på 2 dage, er ændringer i DNA-syntese ved 48 h (figur 7) egnede til forudsigelse af ændringer i celle numre på 4-6 dage.\nMens NPCs er typisk kulturperler på høj densitet, er neurite analysen udført med en tæthed på 50.000 celler forkromet til en 35-mm skål for at vurdere enkelte celler. Selv ved denne lave tæthedsgrad, NPC kulturer express cytoskeletal proteiner og transskriptionsfaktorer karakteristisk for NPCs såsom NESTIN, SOX2 og PAX6 (fig. 10 A-D). Dette angiver, at en lav densitet dyrkning ikke væsentligt ændrer celle skæbne i denne tidsramme. Derudover har lignende low-density betingelser været brugt i rotter og mus kultur systemer for at opdage fænotyper, der var i sidste ende reproducerbare i vivo16,17,18,19, 20,21,22,23. Efter 48 timers inkubation, en lille del af NPCs begynde at udvide neurites, som det ses i fig. 11A og B, og kvantificeres i grafen i figur 11C. Andelen af celler, der strækker sig neurites, neurites længde og antallet af neurites/celle kan måles for at vurdere udviklingsmæssige parametre. For at præcist at vurdere andelen af celler med neurite udvækst, er det vigtigt, at cellerne er forgyldt som enkelt celler eller klynger af < 5 celler og ikke så store aggregater. Som det ses i figur 10 E-F, udtrykke cellerne forsynet med neurites (hvid pil) også umodne neuronal markør beta-III tubulin (TUJ1). Som nævnt i metoderne, fluorescerende billeder kan erhverves af TUJ1 plettet NPCs og derefter disse billeder kan tælles for andelen af TUJ1 + neurites at sikre neuronal oprindelsen af processer. I vores laboratorium, har analyser af enten metoden viste statistisk lignende resultater.\nDen enkle design og den hurtige karakter af neurite analysen også tillade os at teste effekten af udviklingshæmmede relevante vækstfaktorer, cytokiner og peptider. For eksempel Figur 11 viser, at neuropeptid hypofyse adenylate cyclase aktivering polypeptid (PACAP, 3 nM) øger neurite udvækst i NPCs. PACAP er en vigtig udviklingsmæssige faktor, der har bred udtryk i CNS og har vist sig at være vigtigt i hjernens udvikling. Gnaver undersøgelser i vores lab og andre labs har fundet at PACAP har udbredt fase afhængige af udviklingsmæssige virkninger såsom regulering af neurite udvækst, migration og spredning i både baghjernen og forhjernen16,22, 29,30,31. Nylige undersøgelser af Ataman et al. (2016) ved hjælp af kulturperler menneskelige føtal kortikale celler viser, at neuronal aktivitet inducerer en 9-fold stigning i PACAP genekspression, der angiver peptider betydning i menneskers neuronal udvikling32. Ja, tabel 2 viser procentdelen af neurites i kontrol og PACAP (3 nM) forhold mellem talrige linjer stammer fra upåvirket individer. Som det ses i tabel 2, er der nogle variation i procentdelen af neurites udtrykt i cellelinjer stammer fra forskellige kloner fra samme person og fra NPCs stammer fra forskellige individer. Disse upåvirket individer har imidlertid en stigning i neurite udvækst svar på PACAP, der angiver assays reproducerbarhed.\nLigesom neurite udvækst er celle migration en vigtig udviklingsmæssige proces afgørende for ordentlig forbindelse, organisation og ledninger af hjernen. Neurospheres gøre det muligt for os at studere NPC migration i en typisk high-density betingelse, der vedligeholder celle-celle kontakt blandt NPCs (figur 12). Udviklingshæmmede relevante faktorer kan også blive testet på neurospheres at vurdere deres virkninger for migration. For eksempel figur 12 viser, at PACAP (10 nM) øger migration af NPC'ere.\nFigur 1: NPCs på passage 3. NPCs på P3 express flere fase-specifikke markører herunder (A) pluripotente transkriptionsfaktor, SOX2 (B) transkriptionsfaktor specifikke for forhjernen NPCs, PAX6, og NPC cytoskeletal proteiner NESTIN. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nFigur 2: skematisk af S-fase post assay. Tidslinje for S-fase post Assay. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nFigur 3: kvantificere S-fase posten. (A) fase billede viser fase-mørke levende celler (hvide pile), en fase-lyse døde celle (hvid stjerne) og en fase-lyse levende celle (grøn pil). (B) fluorescerende DAPI pletten viser kondenseret kernen i en død celle (hvid stjerne) og store kerner i en levende celle (hvide og grønne pile). (C) fluorescerende EdU billede viser lyse EdU positive kerner (rød pil) og plettet EdU positive kerner (rød stjerne). (D) fase og fluorescerende fletning af billeder 3A - 3 C.\nFigur 4: identificerer neurites. Fasekontrast billeder af NPCs. (A) A celle med en proces > 2 celle organer i længden, og dermed opfylder kriteriet for en neurite. (B) en celle med en proces < 2 celle organer i længden, og derfor ikke betragtes som neurite-bærende. (C) repræsenterer en celle med 2 processer-den længere proces er vurderet til neurite kriterium. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nFigur 5: at vælge neurospheres for migration assay. (A) fase kontrast billede af en repræsentant inden for neurospheres på 24 h. kugler er alle mindre end 100 μm og er således ikke indsamles for migration assay. (B) fase kontrast billede af en repræsentant inden for neurospheres på 72 h. Alle områder er inden for det 100 μm ± 20 µm interval, der viser de er klar til at blive indsamlet til migration assay.\nFigur 6: kvantificere Migration. (A) fase kontrast billede af en repræsentativ neurosphere. (B) blå kontur viser spor til at måle samlede neurosphere område. Rød viser konturen bruges til at måle området af den indre celle masse. Migration er defineret som samlede neurosphere område-indre celle masse område. Bemærk, de hvide cirkler viser celler, ikke der i en sammenhængende tæppe, da disse celler er udelukket fra migration konturer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nFigur 7: vurdering af DNA syntese. Repræsentative resultater af kontrol versus FGF-behandlede NPCs. FGF (10 ng/mL) stiger DNA syntese på 48 h (p ≤ 1 x 10-3). (n = 2-4 brønde/gruppe/eksperiment; 3 forsøg). Fejllinjer udgør SEM.\nFigur 8: andelen af celler ind i S-fase. (A) fase kontrast billeder af NPC cellerne inkuberes i kontrol versus FGF (10 ng/mL) behandlede medier for 48 h. mellemværker repræsenterer højere forstørrelse billeder af celler farves for fluorescerende EdU markør i kontrol og 10 ng/mL FGF medier. Røde pile indikerer celler, der er EdU positive og hvide pile viser celler, der er EdU negative. (B) grafen for repræsentative resultater af kontrol versus FGF (10 ng/mL) behandlet NPCs. FGF stigninger S-fase post på 48 h (p ≤1 x 10-3). (n = 2-4 retter/gruppe/eksperiment; 3 forsøg). Fejllinjer udgør SEM.\nFigur 9: optæller celler på dag 2, 4 og 6. (A) fase kontrast billeder af celler i kontrol og FGF (10 ng/mL) behandlede medier på dag 2, 4 og 6. (B) grafen for repræsentative resultater; Bemærk at FGF (10 ng/mL) øger ikke altid celle numre på 2 dage, men på 4-6 dage stigninger er tilsyneladende (p ≤0.05). (n = 2-4 brønde/gruppe/eksperiment; 3 forsøg). Fejllinjer udgør SEM.\nFigur 10: karakterisering af NPCs i lavdensitet betingelser. (A, C, E) Fase kontrast billeder af NPCs i low-density betingelser. (B) NPCs express stem/stamceller celle markører NESTIN (grøn), SOX2 (rød) og nukleare markør DAPI (blå). (D) PAX6 (rød), DAPI (blå). (F) på lav densitet, celler udvide neurites (hvid pil) også udtrykke umodne neuron markør TUJ1 (grøn). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nFigur 11: Neurite udkommet. (A) fase kontrast billede af NPC'ere. De sorte pile peger på celler med neurites. (B) tilsætning af neuropeptid PACAP (3 nM) øger procentdelen af celler med neurites (p ≤1 x 10-2). (C) kvantificering af neurite udvækst i kontrol og 3 nM PACAP indeholdende medier. (n = 2-4 retter/gruppe/eksperiment; 3 forsøg). Fejllinjer udgør SEM.\nFigur 12: Neurosphere Migration. (A) fase kontrast billeder af neurospheres. (B) tilsætning af PACAP (10 nM) øger neurosphere celle migration (p ≤10-2) (C) kvantificering af celle migration. (n = 20 kugler/gruppe/eksperiment, 3 forsøg). Fejllinjer udgør SEM.\nPatienten Klon # CTRL FGF\nPatienten 2 1 7,664 14,060\nTabel 1: DNA syntesen. Et resumé af DNA syntese værdier (i CPM'er) af NPCs stammer fra to iPSC kloner pr. to upåvirket individer.\nPatienten Klon # CTRL PACAP\n2 16.50% 21,10%\nPatienten 2 1 8,90% 14.10%\nTabel 2: Procentdel af celler med Neurites. Et resumé af procentdelen af cellerne forsynet med neurites i NPCs stammer fra to iPSC kloner pr. to upåvirket individer.\nProtokollerne præsenteres her illustrere hurtige og enkle metoder til at studere grundlæggende udviklingsforstyrrelser processer og teste vækstfaktorer og narkotika ved hjælp af hiPSC-afledte neurale forløber celler. hiPSC teknologi har revolutioneret studiet af patogenesen af udviklingsforstyrrelser sygdomme ved at forsyne os med hidtil uset adgang til levende menneskelige neuronale celler fra berørte personer. Faktisk har der været talrige hiPSC undersøgelser af nervesystemets udvikling herunder Rett syndrom, Timothy syndrom, skrøbelige-X syndrom, og skizofreni, som har afdækket sygdoms-specifikke afvigelser i dendritter, synapser, og neuronal funktion4,33,34,35,36. De fleste af disse undersøgelser har primært fokuseret på terminalt differentieret, post mitotiske neuroner, der selv betragtes som relativt funktionelt umodne, udelukker undersøgelse af tidligere udviklingsforstyrrelser processer såsom spredning og migration. Disse sidstnævnte processer har været stærkt involveret i patogenesen af nervesystemets udvikling og arrestordre yderligere undersøge8,9,10,11,12 , 35 , 37 , 38. brugen af NPCs gør det muligt for os at studere disse vigtige tidligere begivenheder og giver samtidig mulighed for at undersøge mere modne processer som celler evne til at udvide umodne axoner/dendritter (neurites). Yderligere, nogle af disse assays kan også udvides til at studere andre parametre, såsom neurite længde, antallet, og forgrener sig eller den længst afstand, som en celle.\nNogle nyere undersøgelser har brugt organoid modelsystemer for at studere tidligere udviklingsmæssige begivenheder i en 3-D "mini hjernen system"1,39,40. Endnu, selv i disse organoid systemer, proliferativ forløber celle befolkning er begrænset og tidlige modning og migration er vanskelige at studere15,39. Ud over at begrænse undersøgelsen af tidligere udviklingsmæssige fænomener, brugen af terminalt differentieret neuroner eller organoids er ofte tidskrævende, dyrt, og begrænser antallet af variabler, der kan vurderes i systemet. Dette er fordi at gøre neuroner og organoids kan kræve viral induktion protokoller, særlige væksthuse og udstyr, flere uger af tid og store mængder af medier. I modsætning, med undtagelse af DNA syntese analysen (som er behandles senere nedenfor), denne protokol let kan anvendes på studiet af nervesystemets udvikling og kræver ikke omfattende uddannelse, dyre værktøjer og ressourcer eller software. Den lethed og relativt lave omkostninger ved at føje narkotika og vækstfaktorer i disse assays, gør denne protokol en nyttig høj overførselshastighed teknologi til at teste forskellige mulige behandlinger for udviklingsforstyrrelser og neuropsykiatriske sygdomme. Desuden, da vækstfaktorer handling via defineret cellulær signalering veje, de kan også bruges som værktøjer til at teste for potentielle signalering defekter i udvikle systemer. Endelig, da NPCs er en proliferativ selvstændig fornyelse befolkning, store mængder af celler kan produceres og befrugtede tillade eksperimenter skal udføres effektivt uden at gøre NPCs fra iPSCs hver gang.\nFor at kunne ansætte disse assays, er det vigtigt at bemærke følgende kritiske trin. Denne protokol placerer NPCs i forskellige betingelser for vedligeholdelse og udvidelse versus eksperimenter. Specifikt, mens NPCs er induceret, reducere vokset, og passaged i medium indeholdende neurale induktion supplere (NIS), vores forsøgsbetingelser tillægget med 70%, hvilket placerer celler i en begrænsende miljø, giver os mulighed for at tilføje tilbage og afprøve virkningerne af vigtige vækstfaktorer. For det andet er det vigtigt at holde styr på passage af NPCs. I vores undersøgelser, har vi generelt begrænset passage antallet af cellelinjer fra P3 - P8. I passager udtryk tidligere end P3, nogle linjer ikke håndfast karakteristiske markører. På højere passager, mens nogle cellelinjer har meget konsekvent vækstrate eller svar til vækstfaktorer, muligvis andre cellelinjer dramatiske ændringer i cellevækst eller svar. Skønt ikke rutinemæssigt rapporterede, har vi, og mange andre oplevet denne dramatiske ændring i proliferativ satser på højere passager. Grunden kan til dette er usikkert, men denne ændring kan afspejle en begrænset selvfornyelse kapacitet af NPCs. definere, hvorfor og hvordan spredning priser ændres over udvidede passager give indsigt i udvikling og sygdom patogenese, men yderligere forskning vil savn at blive gennemstegt. Endelig, den kommercielle neurale induktion protokol, som vi bruger kan undertiden give dårlig kvalitet neurale stamceller, især hvis de begyndende iPSCs ikke er af høj kvalitet (dvs., har differentiere celler på grænsen af celle kolonier, karyotype abnormiteter). I nogle tilfælde, celle morfologi er forvrænget og udtryk af markører er ikke til stede. Brug ikke disse kulturer. I andre tilfælde vokse NPCs med fladere "forurenende" celler, som kan fjernes ved hjælp af en differentieret celle detachement løsning behandling for at sikre næsten ren NPC populationer før brug i eksperimenter. At have høj kvalitet NPCs er afgørende for korrekt resultater: Se materialer og udstyr afsnittet for et link til en neurale induktion protokol, hvor man kan finde billeder af høj og lav kvalitet NPC'ere.\nFor hver af assays præsenteret, er det vigtigt at bemærke følgende kritiske trin, potentielle fejl og fejlfindingstip. For celle nummer, DNA-syntese og neurite assays er det vigtigt at pladen celler, som dissocieres enkelt celler og ikke som klumper, som dette kan forvrænge DNA syntese foranstaltninger, celletal og neurite adfærd. For at sikre klumper af celler ikke er belagt, prøve en lille mængde af celler med en P1000, plade på et dias, og kontrollere hvis cellen klumper er til stede. Hvis klumper er noteret, afpipetteres celler op og ned for at manuelt break apart klumper før plating. DNA-syntese og celle nummer assay, er celler løftet med enzymer til optælling og analyse. Det er afgørende at visuelt bekræfte celler er helt ophævet fra kultur fartøj til at få nøjagtig tæller og eventuelt enzym inkubation længere kan bruges. Lavt celletal eller lav CPM'er for DNA syntese assay, celler kan være forgyldt ved højere indledende tætheder, radioaktivt tritium [3H] - thymidine kan føjes til dobbelt tid (4 timer i stedet for 2) eller tritiumholdigt [3H] - thymidine koncentration kan blive fordoblet. For neurite analysen, kan indledende plating tæthed fordobles uden at risikere øget celle til celle kontakt. Være opmærksom på fordelingen af celler på tværs af en parabol og tælle 1 cm rækker, således at hver del af skålen er med i stikprøven. Hvis neurite procentdel er for lavt på 48 h, analysen kan udvides op til 6 dage eller typen belægning substrat eller koncentration kan ændres til at fremme større procentdel af neurites. Det er dog vigtigt at bemærke, at belægningen gange og metoder vi har præsenteret i protokollen blev udvalgt til optimal neurite udvækst og celle sundhed efter at teste mange forskellige substrater, substrat koncentrationer og belægning gange. For neurosphere analysen, kan brug af mindre multikanalpipetter (P20, P200) føre til klipning og brud på større områder. Det er således bydende nødvendigt, at pipettering gøres forsigtigt og med en P1000 eller en serologisk pipette. For pelleringsmidler neurospheres, anbefales lavere hastigheder (100 x g i stedet for 300 x g) også at forhindre neurosphere dissociation. Under kuglen plating, sikre at kugler er tilstrækkeligt lange mellemrum, som kugle for kugle kontakt kan påvirke migration. I tilfælde, hvor overførslen er for hurtigt eller for langsomt, kan inkubationstiden faldt eller steg henholdsvis. Belægning substrater kan også ændres for at ændre migration priser.\nDe anvendte metoder er hurtige, enkle og gælder for studiet af nervesystemets udvikling, er der visse begrænsninger. For én, mange af analyserne præsenteret (celle nummer assay, neurite assay, migration assay) kræver efterforskerne at gøre subjektive beslutninger (f.eks., er det en neurite? Er denne celle død?) potentielt fører til investigator bias og lavere reproducerbarhed. Imidlertid kan gennemføre analyser blinde og fastsættelse af strenge normer for hver beslutning inden for en analyse, som illustreret i metoderne, forbedre disse fordomme. Disse assays kræver ligeledes manuelle målinger og tæller, hvilket kan være tidskrævende og labor intensiv. Men i laboratorier, der har udstyr og tekniske ressourcer, disse assays kan være drønede med brug af automatiserede celle tællere og programmer, der kan udføre automatiske målinger41,42. I tilfælde af DNA syntese assay, disse metoder er specifikke for vores celle mejetærsker og scintillation maskine (Se materialer og udstyr); men der er andre tilgængelige modeller og metoder, der kan bruges til at få de samme oplysninger, som Omnifilter-95 celle mejetærsker. For nogle institutioner, kan anvendelse af radioaktive kilder ikke være muligt. I dette tilfælde en alternativ metode ved hjælp af en fluorescerende thymidine analog, såsom EdU, analyseret på en fluorescerende mikrotiterplade læser, vil give mulighed for erhvervelse af de samme oplysninger på bulk analyse af DNA syntese44.\nVores low-density kultur system adskiller NPCs i enkelte celler eller små klumper, en betingelse, der adskiller sig fra den tætpakkede arten af NPCs i udviklingslandene neuralrøret. NPCs er dog sunde og udtrykkelige rigtige markører (figur 1, figur 10). Desuden vores forudgående undersøgelser af mus og rotter kortikale kulturer viser parallelle resultater i in vitro- kulturer, og i vivo modeller angive den nytte og værdi af benytter indeværende henvende16,17,18 , 19 , 24. Desuden, dette system giver en kraftfuld tilgang for at forstå modning af celler og studere cellen delpopulationer. For eksempel, kan Immunhistokemi udføres på neurite analysen til at fastslå, hvilke specifikke neuronal celletype udvider en neurite. I sidste ende, trods nogle begrænsninger, denne unikke protokol giver enkel, kraftfuld og hurtige metoder til at studere nervesystemets udvikling.\nDette arbejde blev støttet af New Jersey guvernør Rådet for medicinalforskning og behandling af autisme (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), Nancy Lurie markerer Family Foundation, Mindworks velgørende bly tillid og jødiske samfund grundlaget for større MetroWest NJ.


Kærmarksvej 7, 5610 Assens\nPris: 795.000 kr. | Kontakt Natalia Masiewicz: 30206731\nLANDLIG IDYL OG RIGELIG PLADS TIL TILVÆRELSEN\nDet tager under ti minutter at køre fra Assens til jeres nye adresse hjemme på Kærmarksvej 7, og på den korte tid er byliv og villaveje skiftet ud med fred, ro og landlig idyl. I overtager en matrikel på 4.584 kvadratmeter i første parket til de åbne marker, så der er rigeligt med plads til tilværelsen, og I kommer helt tæt på naturen, men samtidig har I nem adgang til alt, hvad hverdagen kræver. Der er skoler både i Assens, i Ebberup og tæt på Sandager, og jeres nye hjem ligger lige udenfor den hyggelige landsby, Turup; her bliver I en del af et aktivt lokalmiljø med boldklub, bankospil, fællesspisninger, fastelavn, juletræstænding og meget, meget mere. Kort fortalt, her vil I straks føle jer hjemme.\nNår I ankommer til Kærmarksvej 7, kommer I helt ned i gear, for naturen er jeres nye nabo - foruden den ene naboejendom, som I deler vej med. Her på den lukkede vej ligger jeres ejendom helt perfekt for enden, hvor I bor dejligt ugeneret med luft omkring jer og højt til himlen. I den naturskønne kulisse venter jeres nye hjem: en charmerende villa, der kan dateres helt tilbage til år 1827, så den passer perfekt ind i de landlige omgivelser.\nHuset er forbundet med to længer, som giver jer en masse bonuskvadratmeter, der fordeler sig på en stor garage samt flere disponible rum; det ene højloftede rum er indrettet med alt fra tekøkken til brændeovn og egen terrassedør. Her får I en masse indretningsmuligheder, for rummet kan give plads til såvel hjemmekontoret som kunstnerens atelier!\nVender I blikket mod huset, møder I 110 charmerende kvadratmeter, og træet som materiale går igen flere steder i indretningen, hvilket skaber en varm og hyggelig atmosfære. Derudover er pladsen fordelt på et badeværelse, kombineret entré og bryggers, to værelser, et spisekøkken og to stuemiljøer. Den største stue fuldendes desuden af en lang række brede vinduespartier, der skaber en flydende overgang til alt det grønne, der venter jer udenfor. I haven vil udelivet blomstre, med mange gamle frugttræer og bærbuske samt en lille dam - plads er der jo nok af, så I kan udleve drømmene om alt fra bålplads til hængekøjer og en selvforsynende tilværelse.


(Opdateret 7 april, 2014)\nFay's hvalpe, uge 2\nLittle Denmark's J-kuld, Fay's hvalpe uge 2. Venstre til højre:\nHan (Little Denmark's Juke In The Box),\nTæve (Little Denmark's Jitterbug Jade),\nTæve (Little Denmark's Jazz Jazmine).\nHos Fay og hvalpe går livet sin stille og fredelige gang. Ligesom Sussi's hvalpe, så sker der en rasende hurtigt udvikling med hvalpene nu, hvor de for hver gang de er vågne, næsten kan noget nyt.\nFay passer dem stadig så fint, men ligger ikke hos dem i deres kasse så meget som Sussi gør med sine. Men hun holder meget tæt øje med dem, hvis nogen af de andre hunde nærmer sig indgangen til løbegården, så smutter Fay straks derind.\nHun sover i korte perioder af natten hos mig i sengen, ellers ligger hun det meste af tiden i hendes kasse udenfor hvalpenes kasse, eller inde hos hvalpene.\nHun er også meget tit nedenunder i omegnen af køkken og/eller stue, for at holde øje med os andre og hvad der ellers foregår. Det er medvirkende årsag til, at løbegård og hvalpe sidst på ugen, flytter ned i køkkenet. Så kan hun nemlig både passe hvalpe, og deltage i det sociale liv med resten af familien.\nAl den træthed er smittende...\nEn hyggestund i mors kasse under skift af sengetøj\nHvalpene i deres 3. uge\nFay's hvalpe kan også se ting tæt på nu. Om ikke helheder, så lys og skygge, og synet forbedres dagligt. Første gang de så min hånd kom de selv nysgerrigt hen til den, åbnede munden og smagte på den. De øver sig i at gå, og kommer fint omkring i kassen nu. Ligesom Sussi's hvalpe reagerer Fay's også på synet af hinanden og deres mor, ved at logre med halen. Glade små hvalpe, der allesammen bare er skabt sådan fra starten!\nVi ser dem vise den første legeadfærd ved at løfte poter og "slå" ud efter hinanden og deres mor, hvilket uvilkårligt skaber overbalance, fordi motorikken ikke er helt i orden endnu, så de som regel vælter. Vi ser dem også "bide" fat i hinanden og deres mor, med endnu tandløse gummer. Selv "ruskebevægelsen" er en instinktbetinget adfærd, som de kan lige fra starten!\nDe begynder også at kunne høre i denne uge, vi kan se det ved at de løfter hovederne og dermed reagerer når vi kommer ind i kontoret og taler eller laver støj. Sidst på ugen kan vi se dem reagere kraftigt på uvant støj, hvilket er en stor årsag til at de flyttes ned i køkkenet, hvor der sker noget mere jævnligt hele tiden, og er flere forskellige lyde dagen lang, end der er i kontoret på 1. sal. Nu er de naboer til Sussi's hvalpe, som er næsten ved siden af i stuen. En af de første etaper i de små skidt vi tager lidt ad gangen, som til slut og indenfor forholdsvis kort tid, vil føre dem allesammen sammen.\nNormalt vil en morhund være lidt bekymret for hvalpenes sikkerhed og nye omgivelser i forbindelse med sådan en flytning, og ofte søge tilbage til der, hvor de var før. I værste fald vil hun forsøge at flytte på hvalpene. Men Fay tog flytningen med ophøjet ro, ligesom hun gør med alt andet, og flyttede bare ind i løbegården i køkkenet med den største selvfølgelighed, somom hun simpelthen tænkte "okay, så bor vi her, bum".\nDe har nu fået deres første ormekur.\nLøbegården i køkkenet som Fay og hendes hvalpe er flyttet ind i. Tæpperne forhindrer de andre hunde i at gøre det utrygt at de står og stirrer ind, hvilket de snart gør, men ikke endnu. Fay føler det er helt i orden med den flytning, hun tager det hele med ophøjet ro. (Tipoldemor Maddy fik lige sneget sig ind i billedet)\nHvalpene har prøvet at mosle lidt rundt i hvalpefoder opblødt i vand, og de lapper det gerne i sig, selvom det stadig kun er en snack, mor står for hovedparten endnu.\nDe tidligste renlighedsvaner\nHvalpene er ikke længere afhængig af deres mors hjælp for at kunne tisse. De er stadig afhængige af, at hun gør dem rene, men de kan også noget selv...\nEn hvalp vil nemlig helt instinktivt forsøge at kravle væk fra hvor den sover, for at besørge. Jo større de bliver, des mere bevidst bliver den handling. Hvis man tidligt skaber en vane for dem, vedrørende deres underlag, kan man være heldig at tilføje lidt til vanen, f.eks. hvis der er aviser, når de kravler væk, så måske at de vænner sig til at besørge på aviser.\nSå det er ikke fordi vores hvalpetæpper ikke er store nok, at man på nogle billeder kan se, at de ikke fylder hele kassen. Det er helt bevidst, fordi de er ved at vænne sig til at ligge og sove på det bløde underlag i den ene ende af kassen, og kravle over på aviserne i den anden ende, når de "skal".\nDer er stadig lidt uheld på aviserne under tæppet, men det er mindre og mindre. Om kort tid kan de selv kravle ud af deres kasse - og ikke mindst ind igen. Når de kan det, vil hele området omkring kassen være dækket med aviser, og deres kasse vil indenfor få dage med lidt tilvænning være ren og tør.\nMed dette set-up er tæppet indenfor få dage tørt hele tiden, og de bruger hun aviserne til at besørge på\nHvalpene sover tit i "en stabel", så tæppet er rigelig stor soveplads til dem endnu\nHun vejer nu 1182g/\nHun vejer nu 1151g/\nHun vejer nu 1300g/\nHan vejer nu 1260g/


Landstræner: Vi har en perfekt plan for træningskampene | Sermitsiaq.AG\nLandstræner: Vi har en perfekt plan for træningskampene\nGrønlands fodboldlandshold skal på træningslejr og gennemføre flere træningskampe mod danske fodboldhold i næste uge. Endelig, efter anderledes coronaår, udtaler landstræner.\nLørdag, 04. september 2021 - 14:27\nEt coronaår med restriktioner og udbredt smitte har hæmmet fodbolden i Grønland. Men nu skal fodboldlandsholdet til Danmark på træningslejr i dagene 7.-16. september. I den anledning skal holdet spille mod flere danske hold.\nLandstræner Morten Rutkjær glæder sig til kampene og siger til Sermitsiaq.AG, at holdet har lagt en solid plan for hver spiller til hver kamp.\n- Målet med samlingen i Danmark er at få spillet truppen sammen og få set den enkelte spiller an i forhold til form, hvordan er de som holdspiller og hvordan tackler de kampe på højeste niveau, siger Morten Rutkjær.\nPres og modgang en del af planen\nMorten Rutkjær fortæller til Sermitsiaq.AG, at kampenes resultater ikke er afgørende for denne omgang. Til gengæld ønsker han at se, hvordan spillerne reagerer på pres og modgang under en kamp.\n- Især kampen mod FC Nordsjælland og Holdet fra Ghana vil spillerne komme ud på Max grænsen. Det er bevidst at få den derud så jeg kan se hvordan de tackler modgang i kampene, siger han.\nFundament for stærkt hold bygges op\nGrønlands landshold skal spille i alt fem kampe i Danmark i dagene 8.-14. september.\nGrønland – Vildbjerg 8. september kl. 18.15 dansk tid\nGrønland – Herning 9. september kl. 18.15 dansk tid\nLandstræner Morten Rutkjær fortæller, at året 2021 bruges til at opbygge på landsholdets samlede styrke.\n- Jeg forventer lige nu at spillerne yder maksimalt og gør sig umage. At de er stolte over at hive landsholdstrøjen over hovedet og vil gøre alt for at vi kan spille et godt landshold sammen, siger han og fortsætter:\n- Vi bruger 2021 til at bygge et Fundament op på og omkring landsholdet. Og vi er godt på vej. Jeg er positiv, siger Morten Rutkjær til Sermitsiaq.AG.


Sexlegetøj Billigt Fisse Søges / Eroleg retub\nDamer Big Black Cock XXX Videos Movies free Online Jeg elsker at få min fisse slikket godt og længe.\nBilligt sexlegetøj - Spar op til 77 hos Winkwink Værelse søges - Gratis Danske Sexnoveller og erotiske Sexlegetøj udsalg Få sexlegetøj til ekstra gode priser her Billigt sexlegetøj - Hos Winkwink har vi et stort udvalg af billigt sexlegetøj i høj kvalitet med prisgaranti og dag til dag levering - Her har et stort udvalg af dildoer, vibratorer, penisringe og andre bestsellere! Vi sender altid med diskrete pakker! Kvinde Søges Til Sex Svane Pono, Gratis PornHub Videoer Pige søger bolleven Sexpiger Hemmelige venner med fordel Sexlegetøj Køb Billigt Sex Legetøj Altid 100 Prisgaranti Stille 22-årig pige søger billigt værelse, da jeg skal til at starte på mit drømmestudie. Værelset skal helst være på 14 m2, og det må ikke være for dyrt Hvis du kan hjælpe mig, så ring på XX XX XX XX, så kan vi aftale at mødes. Sexlegetøj udsalg med ekstra lave priser.\nUng pige med lækker våd fisse - Nudie Sexlegetøj DK s Største Sexshop Sexlegetøj Dildo Leder du efter lækkert, billigt sexlegetøj af høj kvalitet til en ekstra god pris, er du kommet til det helt rigtige sted. Her på siden har vi samlet alle vores tilbud på sexlegetøj til kvinder, mænd og par, så du nemt kan se det store udvalg. Afspil pornofilmen: Moden dansk kvinde får en god omgang pik. Føtex kagemand pris massage valby langgade / Skøger pornhubb Luder i skive posthus rødovre centrum danish teen sex sex Massage bordel engangsknald søges / Sexbabes camsex Sex kontakt annoncer escort guide /URL_match danish granny porn sex. Gratis svensk porno sexlegetøj billigt moden kvinde escort soccer mom porn.\nMen når det er tid til at sprøjte, jeg vil have dig tage kondomet og ryk på mine dejlige bryster og min søde ansigt. Vores fragt priser, er nogle af Danmarks billigste, men som en ekstra bonus, så giver vi selvfølgelig fri fragt ved alle ordrer på over 500. Jeg løftede røven, og i et hurtigt tag fik hun trukket bukser og boksershorts af mig, så jeg nu sad i bar røv i min sofa. Lækkert var synet også næste dag, da jeg åbnede døren for Julie, foran mig stod en lækker babe, hun havde noget langt lyst hår der var farvet med nogle sorte striber, hendes ansigt var smukt med nogle markante kindben, og et sødt smil. Vi har anal produkter, bondage og fetish produkter, penis ringe, glidecremer, sexmøbler og meget mere. Uanset hvad du har brug for, kan du finde det hos os, og få mere ud af dit sexliv med frækt nyt sexlegetøj, som vil bringe dig masser af nydelse og glæde. Nydelsen var ekstrem, og jeg kunne ikke trække den længere, jeg mærkede den velkendte kildrende fornemmelse i nosserne, og så kom jeg.\nMed et dybt støn pressede jeg min pik langt ind i munden på hende, mens jeg nærmest knækkede sammen over hende. Vores sexolog Marie Oddershede, står til rådighed for dig, hvis du har spørgsmål. 13:02, jeg er på i aften, fredag kom og få varme, er tændt, kontakt mig Tilbyder : Frækt blow, hvor du får lov at sprøjte ud over mine bryster, 600, ca 10-15 minutter. Username or E-mail, indlæser, har du ikke en konto? År og kan tegnes, når du køber et produkt hos Belugi. Belugi handler udelukkende med kvalitetsleverandører, der kan dokumentere indholdet i deres produkter.\nPå et tidspunkt begyndte jeg at presse lidt på hendes hoved, når hun lod det glide ned over min pik, Julie strittede ikke imod, og jeg kunne mærke hvordan lidt mere af min pik gled ind i hendes mund. Da tre fjerdedele af min pik var inde i hendes mund, kom hun med en halvkvalt lyd, og slog mig i maven med sin ene hånd. Jeg holdt pikken inde i hende et øjeblik, så tog jeg fat i hoften på hende med den ene hånd, den anden klemte jeg fast om hendes bryst, og så begyndte jeg at kneppe hende i nogle lange seje bevægelser. Min tunge var overalt på hendes fisse, og jeg skiftede mellem at gøre den blød og hård, en gang imellem lod jeg den strejfe klitoris, hvilket fik Julie til at udstøde et. Jeg elsker at få min fisse slikket godt og længe. Gøre dig glad og give dig ultimativ nydelse i forbindelse med køb og brug af erotik- og sexlegetøj. Skulle du være i tvivl omkring et produkt, og om det egner sig til dig, så har vi i vores produktbeskrivelser, netop valgt at beskrive hvem produkterne henvender sig til, og hvor avanceret produktet. Da jeg havde sagt det, stak jeg igen tungen frem, og kærtegnede hendes fisse, hvilket fik Julie til at stønne højt. Hun slap taget i min pik, og lagde begge sine hænder på min mave, så hun nærmest overgav sig til mig.\nDet samme gælder din transaktion, hvor vi har fokus på din tryghed og diskretion, derfor vil du opleve, at der på dit kontoudtog vil stå Scandia Trading ApS, i stedet for. Hun lod sine læber glide halvvejs nedover min pik, indtil hendes mund ramte hendes hånd, der stadig var om min pik. Jeg vil ride din hårde pik, indtil du kommer flere gange. Kundeservice og -fokus er derfor i højsædet kombineret med, at vi via meget store indkøb hos vores leverandører, altid tilbyder diskret dag-til-dag levering (bestil inden. Opret dig, har du allerede en konto? Hos os, finder du et kæmpe udvalg af sexlegetøj. Jeg vil gerne sutte din pik i aften. Jeg stoppede mit pres på hendes hoved, men holdt det fast, så min pik forblev dybt begravet i hendes mund. Hendes bryst var fast og spændstigt, hendes lækre røv gned sig op af mit underliv og min pik var dybt begravet i hendes stramme fisse, hendes lange ben lå nærmest viklet ind i mine.\nJeg synes det er mega frækt at du spiller og tømm. Jeg pressede alt hvad jeg kunne, og Julie reagerede med at klynke og stønne højt, mens hun vred sig under mig. Vi kalder det 'Lyst til mere'. GOD komme og kneppe mig allerede i denne weekend? Og bestiller du inden. Her er der ingen lange ventetider på at få byttet sine varer. SexlegetØJ - 100 prisgaranti Hos Belugi køber vi stort ind, da vi forhandler sexlegetøj i Danmark, Sverige, Norge og Finland. Vi har alt fra de mest populære og kendte produkter, til de mere alternative og specialiserede produkter!\nMed mere end 250 leverandører, er Belugi Nordens største online webshop! Vi kalder det ganske enkelt: Lyst til mere! SexlegetØJ, SEX legetØJ, sexlegetØG, sexlejetØJ - 100 lyst TIL mere Kært barn har mange navne. Jeg begyndte at kneppe hende i nogle langsomme stød, og viskede tilbage to måneder, hun tog en dyb indånding og lukkede øjnene og sagde så ok, men hver forsigtig. Du kan også finde os på Facebook, hvor vi jævnligt har nye konkurrencer og skriver om de ting der røre sig når det gælder sexlegetøj. Derfor garanterer vi at vores pakker bliver afsendt på en 100 diskret måde, som på ingen måde vil vise hverken naboen eller postbudet hvad der er i pakken. 149,-, 10 rabat på alle ikke nedsatte varer, deltagelse i VIP Belugi konkurrencer, invitationer til VIP Belugi arrangementer og mulighed for at blive produkttester og give anmeldelser af nye produkter. Vi aftalte at vi skulle mødes dagen efter, og jeg fik travlt med at rydde op og gøre rent, så lejligheden fremstod lækker.\nFind det helt rette sexlegetøj, vores fokus er ikke bare at sælge dig et produkt. Jeg satte mig i sofaen, og hun satte sig i lænestolen der stod for enden af bordet, vi snakkede lidt frem og tilbage, og jeg syntes godt om hende, sex massage i nordjylland danske amatør piger hun virkede dog til at være mere fræk. SexlegetØJ OG lingeri - 100 billig eller gratis fragt Hos Belugi tilbyder vi markedets laveste fragtpriser fra. Knus, julie, sådan stod der på sedlen nede i supermarkedet, jeg tog en af de små lapper med telefonnummeret og gik hjem. VIP Belugi medlemmer får fri fragt ved køb for over. Derfor vil du ved langt de fleste af vores produkter, finde fyldige beskrivelser om produktet, og endda også finde tips og gode råd til hvordan du får mest ud af det. Selv kunne jeg heller ikke forlænge nydelsen, synet af hendes 22-årige lækre krop der vred sig foran mig og presset på min pik, gjorde at jeg kunne mærke hvordan mine nosser trak sig sammen, og skød spermen.


Oprøret i de franske forstæder\nDanish translation of The revolt of the French estates by Greg Oxley (November 8, 2005)\nGadekampene i Frankrig er taget til i de sidste dage. Nu breder de sig over 200 distrikter. Tusinder af biler er blevet brændt. Hundredvis af kontorer og butikker er blevet raseret. Det franske kamppoliti, CRS, og politiet er overvældede, demoraliserede og udmattede. Forstæderne til Frankrigs store byer er nu kamppladser.\nDen umiddelbare årsag til urolighederne er to unges død. De frygtede endnu en politiaktion, og gemte sig i en transformerstation. Men ud over denne tragiske hændelse kan den ekstraordinære store bevægelse kun forklares på baggrund af arbejdsløshed, fattigdom, og social og etnisk diskrimination, som er blevet ophobet i årtier. Det er også en reaktion mod kynismen hos den parasitiske og korrupte klasse, som står for ”republikansk orden” og dagligt harcelerer mod ”forstædernes afskum”, og hvis reaktionære mentalitet bliver udstillet i det provokerende og aggressive sprog hos indenrigsminister Nicolas Sarkozy.\nDer er ikke blevet sparet nogen lejlighed til at fordømme urolighederne og glemme de virkelige årsager bag denne vrede. Gadekæmperne bliver udstillet som hooligans, kriminelle og manipuleret af bandeledere. Virkeligheden er en ganske anden. Det, der foregår, er en opstand i ungdommen – ikke den kastrerede ungdom, men den mest undertrykte, nedtrådte og mest desperate ungdom. De borgerlige er chokerede over deres metoder? Er de unge ikke ”civiliserede” nok? Men kunne man forestille sig, at forklaringen bag deres grove manerer (ifølge borgerlig smag) skal findes i det faktum, at de for størstedelens vedkommende er vokset op i absolut elendighed, for slet ikke at tale om politibrutalitet!\nEr der overhovedet en eneste af disse unge, der ikke har været offer for fattigdom eller diskrimination? De er fulde af had. Men i modsætning til, hvad vi ofte hører, er had ikke altid en dårlig ting. Had kan være en stor hjælp til menneskelig frigørelse, når det rettes mod dette onde systems uretfærdighed.\nFra kommunisters og fagligt aktives synspunkt kan der være mange ting at indvende mod de metoder, de unge bruger. Det er ikke arbejderbevægelsens metoder. De skyder forbi målet. Vi kan ikke bifalde ødelæggelsen af skoler, sundhedsklinikker, forretninger eller biler. Men sådanne aktiviteter ligger i sådanne mobiliseringers natur. Før de første fagforeninger i det nittende århundrede, var der mange sager, hvor arbejdere i desperation smadrede fabrikker og maskiner og angreb tilfældig ejendom. Men de unge vi taler om, kender ikke til arbejde – og mange af deres forældre er også udelukket fra det. I mange af områderne er beskæftigelsesgraden på omkring 40 pct. Blandt de unge selv er der mange, der er uenige i sådanne aktioner, men til forskel fra strejkende arbejdere, der har organisationer og træffer kollektive beslutninger, har de ingen mulighed for at stoppe dem.\nMen dette til trods er regeringens og mediernes attitude over for sådanne ødelæggelser fuldstændig hyklerisk. De græder krokodilletårer. Vi forstår fuldstændig den vrede, der er hos de arbejdere og deres familier, der lider under ødelæggelserne. Disse arbejdere har intet at gøre med de sociale årsager til gadekampene. De er selv ofre for kapitalismen. Men det er nødvendigt at sige én ting: hvis disse gadekampe fortsatte i et år, ville de ikke være i stand til at ødelægge lige så mange forretninger, arbejdspladser eller offentlige skoler, klinikker og andre services, som den vandalisme, der bliver udført af hooligans i jakkesæt og slips, og sidder i arbejdsgiverorganisationen MEDEF og regeringspartiet UMP.\nDe Villepin og Chirac har opfordret til ”orden”. De Villiers har ogsa talt om ro og orden, og har opfordret til at sende hæren ind for at slå oprøret ned. Men hvilken slags ”orden” snakker vi om her? Det er ”orden” for en republik, der er pilrådden og baserer sig på korruption. Det er en orden, hvor et lille antal store kapitalister underordner hele verden deres appetit efter profitter og magt. Det er en orden, hvor de unge forventes passivt at acceptere deres lod i livet, hvor arbejderne stille underordner sig markedets love, hvor de rige bliver rigere mens fattigdom bliver mere udbredt. Sarkozys fjendtlighed over for forstæderne, som han bittert præsenterer som rugekasse for muslimsk fundamentalisme, kriminalitet og endda terrorisme, er intet andet end den anden side af hans fjendtlighed over for arbejderne i sømandsforbundet SNCM (som blev mødt af antiterrorkorps, da de strejkede imod privatiseringer, red.), RTM eller enhver anden gruppe af arbejdere, der forsøger at kæmpe imod privatiseringer og social forarmelse.\nDette oprør viser, hvad der sker i den franske arbejderklasse under overfladen. Det er en udfordring for fagbevægelsen, for Socialistpartiet og Kommunistpartiet, som ikke må ignorere sådan en vigtig bevægelse. Hvis vi skal vælge mellem disse modige, kampvillige og beslutsomme oprørske unge – på trods af alle deres fejl på grund af deres politiske uerfarenhed og manglende organisation – og de hærdede repræsentanter for kapitalismen, som har sendt CRS imod dem, har vi ikke svært ved at vælge, hvor vi står.\nNår Francois Hollande (en af lederne af Socialistpartiet) nægter at kræve Sarkozys afgang, under påskud af ikke at ville støtte gadekampene, gør han intet andet end at støtte Sarkozy selv. Når vi har sagt det, er det ikke nok, at Sarkozy træder tilbage. Vi må kræve, at hele regeringen trækker sig tilbage – det vil sige omgående nyvalg.\nDe unge har ikke brug for moraliserende taler, men et revolutionært program for handling, der er lige så meget imod kapitalismen, som kapitalismen er imod os. De ”blinde” gadekampe af den type, vi nu ser, er ikke kun et resultat af kapitalismens forfald; de skyldes også den fejlslagne politik, som 15 års venstrefløjsregeringer har ført siden 1981. Her har repræsentanter for Socialistpartiet og Kommunistpartiet været tilfredse med at gennemføre en række små reformer, der intet gjorde for at ændre ved kapitalismen. Den sidste venstrefløjsregering gennemførte endda store programmer for privatiseringer, som Chirac, Raffarin og de Villepin blot har fortsat siden 2002.\nI dag er vores opgave som socialister og kommunister, tålmodigt at forklare til hver af de unge, til hver arbejder og til hver arbejdsløs eller pensionist, at kapitalisme betyder socialt forfald, og der ikke findes nogen vej til at vende denne tendens, så længe bankerne og de store virksomheder forbliver under kapitalisternes kontrol. Vi må række vores hænder i solidaritet til de unge i oprør; forklare til dem, at ingen gadekampe, uanset hvor store eller udbredte, de er, vil være i stand til at løse deres problemer. Vi må invitere dem til at organisere sig med os for at forberede os og kæmpe for at omstyrte kapitalismen.\nRepræsentanterne for kapitalismen vil komme med den mængde knipler, tåregas og håndjern, der er nødvendig for at ”genoprette ro og orden”. Men de kan ikke løse nogle af de problemer, som knuser disse unge. Gadekampene vil uundgåeligt slutte og dø ud. Men de rodfæstede årsager vil vedblive. Blandt de unge, der modigt slås mod CRS’ brutalitet i dag, vil vi finde et godt antal, der vil kæmpe for socialismens sag – så længe vi henvender os til dem i et sprog, de kan forstå – et revolutionært sprog.\nDet der forberedes, er en revolution. Det kapitalistiske system er ude af stand til at møde de behov, som folk har. Systemets eksistens er i konflikt med de sociale erobringer fra fortiden. Systemets repræsentanter angriber arbejderklassen, de arbejdsløse og pensionisterne. Arbejdsløshed, usikkerhed og elendighed breder sig. Mens de Villepin taler om at lette ungdommens ”lidelser”, forbereder regeringen og MEDEF nye angreb på arbejdsløshedsunderstøttelsen. Oprøret i Frankrigs gader er et konkret udtryk for de skarpe spændinger, der er blevet opbygget i det franske samfund. Gadekampene er et yderligere bevis – sammen med mange andre – på, at Frankrig er trådt ind i en epoke med grundlæggende social ustabilitet, og i denne epoke vil arbejderne i dette land blive nødt til at tage udfordringen op og gøre en ende på kapitalismen.


Give away – Vind Camilla Plums nye kogebog: “Helt i kage” | Becauseitmatters\nGive away – Vind Camilla Plums nye kogebog: “Helt i kage”\nBy Mette On September 16, 2012 In Konkurrence With 27 Comments Permalink\nI går skrev jeg om besøget hos Camilla Plum, hvor vi deltog i lanceringen af den seneste kogebog: “Helt i kage.” Vi blev forkælede med det vildeste kagebord og fik en rigtig fin guidet tur rundt i haven og drivhusene. Et skønt besøg og en dejlig måde at slutte en arbejdsuge af på.\nI dag er det din tur til at få noget ud af besøget.\nCamilla Plums seneste kogebog: “Helt i kage”\nJeg fik nemlig en ekstra kogebog med hjem og den synes jeg, du skal have chancen for at vinde.\nFortæl mig – i en kommentar herunder eller på Facebook – hvilken kage, du allerbedst kan lide og hvorfor.\nSå vil jeg sammen med lykkens gudinde trække lod blandt deltagerne og finde en vinder.\nSend dit svar inden på onsdag kl 18. Vinderen vil blive offentliggjort torsdag.\nDet er en rigtig dejlig og inspirerende bagebog, som er baseret på få grundopskrifter, du kan variere efter årstiden.\nSeptember 16, 2012 at 11:41 · Reply\nDen bog kunne jeg godt bruge, elsker at bage kage!\nMin yndlingskage er helt klart “Manhatten cheesecake”, da den kan laves i utallige versioner og smagsnuancer. Den kan laves dagen før, og derfor perfekt som dessert når man har inviteret gæster.\nSeptember 16, 2012 at 11:46 · Reply\nSikke en dejlig give away 😉\nYnglingskage..det er godt nok svært når man kan lide næsten alt sødt 🙂\nSå kommer jeg ned på 2..hindbærsnitte, uhmmm så enkelt, men smager fantastisk..\nDrømmekage, er også fantastisk og rigtig go’. De 2 kager går man aldrig galt i byen med, det behøver ikke være så pokkers fancy ;)))\nSeptember 16, 2012 at 12:52 · Reply\nYndlingskage… Hm, det er virkelig svært at vælge! Jeg er vild med mormors kiksekage, farmors julestang, fars kanelsnegle og de fleste af min mors eksperimenter. Når jeg selv skal bage bliver det dog tit hindbær- eller solbærsnitter 🙂\nSeptember 16, 2012 at 14:16 · Reply\nI har søreme haft en dejlig tur ude på gården 🙂\nMen yndlingskage… det er søreme et godt spørgsmål… jeg tror, jeg hælder til en chokoladekage med chokoflødeostecreme oven på – it’s worth dying for!\nSeptember 16, 2012 at 14:46 · Reply\nja, om man kan kalde det en kage, ved jeg ikke – det er vel nærmere en desset. Lige som resten af min famile er jeg ret vild med sveske-trifli! Jeg elsker simpelthen smaget af flødeskum, svesker og makroner – ja, ikke nok med at de knasende sprøde hjemmelavede makroner får lov at trække i lidt sherry, så får sveskerne også en sjat, når de simrer på kogepladen…\nVi er faktisk så glade for sveske-trifli i min familie, at vi spiser det ovenpå Ris à l’amande til jul i stedet for kirsebærsovs.\nJeg ved, at jeg har sagt det før, Mette, men jeg synes, at din blog en super skøn!\nSeptember 16, 2012 at 17:38 · Reply\nMin yndlings kage er en kakao brownie, som cirkulerer på div. amerikanske madblogs, og som vist nok stammer fra Alice Meredit. I øvrigt ville en amerikaner mene, at brownie ikke er en kage, men jeg håber, den kan godkendes her 🙂\nHvorfor? Fordi jeg elsker chocolade, og fordi denne brownie er så fudgie som jeg vil have dem, så er den hurtig at rører sammen, jeg plejer at bruge kasserollen smøret har været smeltet i som røreskål (= mindre opvask)\nSeptember 16, 2012 at 18:59 · Reply\nSjovt, min veninde og jeg diskuterede faktisk yndlingskager i dag. Vi er begge au pairs i Paris og bor derfor hos forholdsvist fremmede mennesker. Derfor kan det være lidt svært at udfolde og udfordre de kreative evner i køknet, da der ikke altid er mulighed for det. Og gud, hvor jeg dog savner det!! Til gengæld gør de parisiske pâtisseries det rigtig godt, når det kommer til kager. Og jeg er solgt til en rigtig god cannélet – mums, en fantastisk blødhed og stadig en fin smag, som ikke er alt for sød. Og ellers – der er vel ikke noget, som slår en god saftig brownie 😀\nSeptember 16, 2012 at 19:50 · Reply\nMin yndlingskage er nok en lækker hjemmebagt hindbærsnitte, med et fyld af hjemmesylt. Det er knasende, blødt, syrligt og sødt på samme tid! Mmm… Ellers kan jeg selvfølgelig heller aldrig stå for en svampet tung chokoladekage, med masser af god chokolade og nødder 🙂\nAnne Gravesen says:\nSeptember 16, 2012 at 20:15 · Reply\nJeg elsker bare chokolade så yndlingskagen må også være en chokoladekage – helst dejlig klistret i midten\nsara bodekær clausen says:\nSeptember 16, 2012 at 20:37 · Reply\nLyder som en skøn tur- må have været en god oplevelse! jeg vil da også gerne være med i konkurrencen om den super fine bog 🙂 Jeg er rigtig glad fro kager med creme og friske bær så fx. nøddekage med creme og blåbær, jordbær, hindbær. Ellers slår kager med æble og kanel heller aldrig fejl- men egentlig er det jo umuligt at vælge da der er så mange favoritter!\nSeptember 16, 2012 at 20:49 · Reply\nUh, den er svær. Kun en yndlingskage… Så må det vist blive en æbletærte med brombær og rigtig god vanlijeis.\nSeptember 16, 2012 at 21:44 · Reply\nUh det er svært. En eneste enkelt yndlingskage? Kan man virkelig det? Hmm. Det må være noget så klassisk som fragilité, men i min udgave er den pimpet med passionsfrugt, hindbær og lakrids.\nSeptember 16, 2012 at 21:56 · Reply\nUuha, det er sørme svært at svare på.\nÆble-frangipane er rigtig god eller en Manhattan bagt ostekage med hyldeblomst gele eller en Blondie eller en gulerodskage med valnødder og flødeost glasur….Jeg kan simpelthent ikke vælge hvad for en kage der er den bedste. Der er så mange gode. Og jo mere jeg tænker på ynglingskager, jo flere dukker op.\nSeptember 17, 2012 at 08:22 · Reply\nDejlig give-away! Min yndlingskage må være en gulerødskage med cream cheese frosting. Elsker den svampede kage til det blødere topping, mums!\nSeptember 17, 2012 at 08:44 · Reply\nMin yndlingskage er uden tvivl en jordbærtærte med mazarinbund, som skal serveres i sommersæsonen, når de friske danske jordbær er allerbedst. Og derfor er det en kage, jeg mener skal nydes, når det er sommer. Faktisk er kagen nærmest indbegrebet af sommer for mig.\nSeptember 17, 2012 at 10:25 · Reply\nMin yndlingskage er Lemon merenque pie! Jeg blev forelsket første gang jeg så en lille en i en svensk cafes kage montre. Og umiddelbart efter postede du et indlæg med selv samme kage -og den har vakt begejstring flere gange. Aldrig har den skuffet eller ikke lykkes for mig. Mums! (en rå æblekage med revet æbler fra weekendens æblerov, makroner og lidt flødeskum er BESTEMT heller ikke dum)\nSeptember 17, 2012 at 13:39 · Reply\nÅh, elsker kage generelt, så yndlingskage – den er godt nok svær… det må være cheesecake – lavede en med jordbær og chokoladebund er i sommer, og den var dælme god! 🙂\nSeptember 17, 2012 at 21:05 · Reply\nDen kage som jeg allerbedst kan lide er helt sikkert gulderodskage. Jeg har sammen med min far og bror fundet frem til den bedste gulderodskage opskrift. Inden da, var jeg faktisk ikke helt så begejstret for gulderodskage og sværgede til kager med en masse chokolade i. Men med den første bid af gulderodskagen, så var jeg solgt. Og den bliver kun endnu bedre af at stå nogle dage – hvis man altså kan holde fingrene væk 😉\nSeptember 18, 2012 at 12:05 · Reply\nDen bog gad jeg godt have fingrene i! Min yndlingskage er en kanellagkage, der lægges sammen med en smørcreme og overhældes med karamel, nam! Den tager kegler HVER gang og går under navnet Den Ultimative blandt venner og på min blog 🙂\nSeptember 18, 2012 at 17:44 · Reply\nMin yndlingskage er en jordbærtærte, der smager af sol og sommer og vækker dejlige ferieminder 🙂 Hindbærsnitten kommer ind på en sikker 2. plads, og derefter squashkage med nødder. Og så skal jeg nok stopper her 😉\nSeptember 18, 2012 at 18:35 · Reply\nUhh, jeg kan ikke lide kage – og derfor kan jeg heller ikke bage dem – siger mine børn! Jeg har dog en gang næsten vundet en præmie for et sød lille pindsvinekage lagt sammen af købte lagkagebunde med smørcreme og syltetøj imellem. Det hele blev dygtigt camouleret med mandelstykker som pigge og overhældt med chokolade. Sluttelig pyntede jeg den med et par store blå, bedende øjne, så måske derfor forbarmede folk sig over den 😉\nLykke Gravesen says:\nSeptember 18, 2012 at 19:32 · Reply\nJeg er helt forelsket i othellolagkagen – en SKØN SKØN klassiker som man kan variere – senest har jeg lavet den med rabarberskum – MUMS!!!\nMette Storm says:\nSeptember 19, 2012 at 07:35 · Reply\nDet lyder som en herlig dag hos Camilla Plum… Som alle skriver er det rigtig svært at vælge én kage, men da jeg jo kommer fra Fyn må det jo være brunsvinger fra bager Clausen i Kerteminde – mums det smager bare fantastisk..!\nSeptember 19, 2012 at 12:08 · Reply\nMin yndlingskage er marengslagkage med mandelflager, ribsflødskum og smeltet hvid chokolade. Mmmh!\nBogen ser herlig ud, den kunne jeg godt bruge som inspiration til dessert til min 18 års fødselsdag, som jeg skal holde om 3 uger 🙂\nSeptember 19, 2012 at 13:12 · Reply\nJeg kan utrolig godt lide den gode brunelagkage min mormor bager. Opskriften er desværre hemmelig, men det er uden tvivl en kage der bringer hele familien sammen, og en kage vi alle kan lide. 😉\nOctober 12, 2012 at 21:10 · Reply\nHejsa – og tak for en skøn blog!\nJeg bor lige nu i nærheden af San Francisco, hvor jeg har haft lejlighed til at smage en Banana Cream Pie fra det berømte Tartine Bakery. Og dét er med eet blevet den aller bedste kage i min bog 🙂\nOctober 12, 2012 at 21:20 · Reply\nUhm – det lyder sørme også skønt.\nJeg har desværre ikke besøgt Tartine Bakery, men har brødbogen derfra og drømmer om at sætte tænderne i et af de fantastiske brød. At der så også hører kager med, ja – det havde jeg egentlig aldrig skænket en tanke. Men ….. selvfølgelig!\nEt skønt sted, du bor med nogle fantastiske råvarer. Læser du bloggen: http://www.101cookbooks.com – her er masser af gode tips til dit lokalområde.\n← Pærestrudel – Inspiration efter et sødt besøg hos Camilla Plum\nNaCl #20: FORMIDABLE Fyn →