Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology | Protocol (Translated to Spanish)\nEste protocolo de cinco días se esbozan todos los pasos, el equipo y el software complementario necesario para la creación y ejecución de un eficiente Escherichia coli endógeno basado sistema de expresión libre de células TX-TL a partir de cero. Con los reactivos, el protocolo de toma 8 horas o menos a la configuración de una reacción, recopilar y procesar datos.\nSistemas de expresión de ideales sin células pueden emular teóricamente un entorno celular in vivo en un control en la plataforma vitro. 1 Esto es útil para expresar las proteínas y los circuitos genéticos de una manera controlada, así como para proporcionar un entorno de creación de prototipos para la biología sintética. 2,3 Para lograr este último objetivo, los sistemas de expresión de células libres que preservan mecanismos de transcripción-traducción Escherichia coli endógenas son capaces de reflejar con mayor precisión la dinámica celular in vivo que los basados en T7 RNA polimerasa de transcripción. Se describe la preparación y ejecución de un desarrollo endógeno E. eficiente la transcripción-traducción basada coli (TX-TL) sistema de expresión libre de células que pueden producir cantidades equivalentes de proteína como los sistemas basados en T7 en una reducción de costes del 98% a los sistemas comerciales similares. 4,5 La preparación de tampones y extracto celular en bruto se descrito, así como la ejecución de untres tubos de reacción TX-TL. El protocolo completo dura cinco días para preparar y produce material suficiente para un máximo de 3.000 reacciones individuales en una preparación. Una vez preparado, cada reacción tiene menos de 8 horas desde la configuración hasta la recolección y análisis de datos. Mecanismos de regulación de la transcripción y exógena a la E. coli, tales como represores lac / tet y ARN polimerasa de T7, se puede complementar. 6 propiedades endógenos, tales como ARNm y las tasas de degradación de ADN, también se puede ajustar. 7 El sistema de expresión libre de células TX-TL se ha demostrado para gran ensamblaje escala del circuito, la exploración de los fenómenos biológicos, y la expresión de proteínas bajo las dos promotores T7 y endógenos. 6,8 modelos matemáticos de acompañamiento están disponibles. 9,10 El sistema resultante tiene aplicaciones únicas en la biología sintética como un entorno de creación de prototipos, o "TX- protoboard biomolecular TL ".\nTecnología de expresión libre de células se inició en la década de 1950 como puramente traslacional, avanzando año más tarde para incluir mecanismos de transcripción-traducción acopladas utilizando el ADN del bacteriófago T7. 11,12 Desde entonces, se han realizado numerosos esfuerzos para optimizar la creación de extracto celular crudo (o E . extracto coli S30). 13,14 Estas optimizaciones incluyen la prolongación de la síntesis de proteínas libre de células a través de la regeneración de ATP o modificaciones de tensión y reduciendo el tiempo de protocolo y el costo. existen 15-17 sistemas de expresión de células libres alternativos que uso reconstituido componentes en lugar de crudo extracto de células para la expresión. 5 Tanto extracto celular crudo y métodos de reconstitución se han desarrollado para uso comercial.\nCon el advenimiento de la biología sintética, existe una mayor necesidad de una plataforma bien caracterizado para probar y expresar módulos y circuitos biológicos de ingeniería. 18,19 Esta plataforma debe serversátil, bien caracterizado, fácil de manipular, y se centró en los componentes suministrados por el usuario. A pesar de haber desarrollado la mitad de un siglo antes, los sistemas libres de células basadas en E. coli intrínsecamente compartir estos requisitos, ya que son una representación simplificada en vitro de procesos celulares sin la complejidad de crecimiento y el metabolismo. Además, todos los conocimientos básicos de trabajo en vivo en E. coli se aplica fácilmente a E. sistemas libres de células de E. coli.\nAunque los sistemas de expresión de células libres pueden tener aplicaciones en la biología sintética, hasta la fecha el objetivo de la mayoría de los sistemas de expresión de células libres ha sido la maximización de la proteína y la producción de metabolitos. Esto se logra mediante el uso de bacteriófago T7 transcripción de secuencias conducidos por promotores T7. 20 Aunque la expresión es eficiente y robusta, estos sistemas sirven a un propósito altamente especializado. Métodos de regulación de la célula son limitados, las plantillas de ADN de destino deben serrediseñados para incluir promotores T7, y ciertas secuencias tales como complejos ribosómicos no se pueden transcribir y ensamblados. 21,22 sistemas de expresión libres de células existentes son incapaces de mantener altos rendimientos preservando al mismo tiempo los mecanismos de regulación endógenos, una versatilidad necesaria para la biología sintética.\nHemos desarrollado una E. endógena sistema de expresión libre de células coli que conserva la eficiencia de la expresión de la proteína demostrado por los sistemas anteriores pero añade versatilidad adicional al permitir la expresión y la regulación sobre la base de ambos mecanismos (T7 u otros) endógeno y exógeno. El protocolo descrito aquí está basada originalmente en Kigawa et al. (2004) y Liu et al. (2005), pero tiene importantes modificaciones. Se utiliza Mg y K-glutamato sobre Mg-y K-acetato de etilo para aumentar la eficiencia, quita 2-mercaptoetanol, y la lisis de las células usando un cordón-batidor. 17,23,24 bolas-latidos se elige sobre la homogeneización,métodos basados en la presión, o sonicación debido a su menor coste y rendimientos comparables a los sistemas de la competencia. 23 ácido 3-fosfoglicérico (3-PGA) se utiliza como la fuente de energía ya que se encontró para dar rendimientos de proteínas superiores en comparación con el fosfato de creatina y fosfoenolpiruvato. 4,25 Nuestro sistema puede producir hasta 0,75 mg / ml de proteína indicadora utilizando un promotor con sede en sigma70 con los operadores-fago lambda o un promotor T7 impulsado, de forma similar a los rendimientos procedentes de otros sistemas comerciales. 4,6 Cinco días son necesarias para producir todos los reactivos necesarios (Figura 1). Además, proporciona una reducción de costes del 98% en comparación con los sistemas comparables de células libres de comerciales - costes de material son de $ 0.11 por 10 l de reacción, que se eleva a 0,26 dólares, con mano de obra incluida (Figura 2).\n1. Preparación extracto crudo de la célula\nPreparación de extracto celular crudo durante tres días se necesitan dos personas para llevar a cabo de manera eficiente. El protocolo consiste funcionalmente de tres partes: crecimiento del cultivo (etapa 1.1 al paso 1,11), lisis celular (paso 1,12 al paso 1,37), y extraer la clarificación (paso 1,38 al paso 1,52). Se presenta dividida en día para mayor comodidad. Extracto ideal puede producir 0,75 mg / ml de deGFP de plásmido pbest-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 (Addgene # 40019), y tiene una concentración de extracto celular en bruto entre 27-30 mg / ml de proteína. 4 Sin embargo , extracto de características varían de lote a lote. La siguiente receta suministra suficiente para aproximadamente 3000 reacciones individuales (6 ml de extracto celular en bruto). Si la escala hacia abajo, se recomienda utilizar no menos de 1/6 de los valores dados aquí. Por falta de tiempo, no se recomienda la ampliación.\nPreparar los medios de cultivo bacteriano, cultura de la placa, y los medios de comunicación los suplementos como se describe en la Tabla 1. Ver Material Complementario 1 para las recetas.\n. Cepa BL21-racha de Rosetta2 de -80 ° C sobre una placa de agar 2xYT + P + cm y se incuba durante al menos 15 horas a 37 ° C o hasta que las colonias son fácilmente visibles Nota: Cloranfenicol (Cm) se utiliza para seleccionar para un plásmido codifica ARNt raros en la cepa BL21-Rosetta2.\nPreparar tampones y suplementos como se describe en la Tabla 2. Ver Material Complementario 1 para las recetas.\nPreparar y esterilizar el material necesario para el día 3, que incluye: 6 x 4 matraces Erlenmeyer de L con una cubierta de papel de aluminio (autoclave), botellas de centrífuga estériles 4 x 1 L, embudo (autoclave), 100 g de 0,1 mm perlas de vidrio (en autoclave), 2 revolver-bares (autoclave), 1 L y 500 ml aforado (autoclave), 2 x 1 vasos L (en autoclave), 3 ml jeringa con 18 agujas G (estériles), 2-3 flBoyas de avena, 2-3 10k casetes de diálisis MWCO (estéril), cubetas.\nPreparar mini-cultura 1. Añadir 4 ml de medio 2xYT + P y 4 l de Cm a un tubo de cultivo estéril 12 ml y pre-caliente a 37 ° C durante 30 min.\nInocular mini-cultura 1 con una colonia de la P + + placa de agar 2xYT Cm. Incubar a 220 rpm, 37 º C durante 8 h.\n7 horas y 30 minutos más tarde, preparar mini-cultura 2. Añadir 50 ml de medio 2xYT + P y 50 l de Cm a un estéril matraz Erlenmeyer de 250 ml y pre-calentamiento hasta 37 º C durante 30 min.\nInocular Mini-cultura 2 con 100 l de mini-cultura 1 y se incuba a 220 rpm, 37 º C durante 8 h.\nPesar cuatro 50 ml tubos Falcon estériles vacíos y masa registro en la tabla 3. Chill tubos Falcon en el hielo, los cuales se utilizarán posteriormente en el paso 1.18.\n7 horas y 30 minutos después de la etapa 1.8, se preparan los medios de comunicación definitiva cultivo bacteriano. El uso de un estéril 1 L cilindro graduado, la transferencia de 660 ml de 2xYT + P i mediosnto cada uno de seis 4 matraces Erlenmeyer L y pre-caliente a 37 ° C durante 30 min Nota:. 4 L o mayor se recomienda matraces Erlenmeyer para la aireación adecuada.\nAñadir 6,6 ml de mini-cultivo de 2 en cada matraz Erlenmeyer de 4 l. Incubar a 220 rpm, 37 ° C hasta que el cultivo alcanza una DO de 1,5-2,0 a 600 nm (correspondiente a la fase de crecimiento semilogarítmica). Compruebe periódicamente OD con una dilución 1:10 de cultivo para la precisión Este paso debe tomar no más de 3 horas - 3 hr 45 min;. Rápido crecimiento y la colección durante la fase semilogarítmica es fundamental para la calidad del extracto.\nInmediatamente después de crecimiento, transferir todas las culturas de manera uniforme en cuatro botellas de centrífuga de 1 L y centrifugar a 5000 xg durante 12 min a 4 ° C para sedimentar las células bacterianas.\nAunque la centrifugación, la preparación completa de búfer S30A añadiendo 4 ml de DTT 1 M a 2 L de S30A previamente preparado. Mezclar y mantener tampón en hielo.\nUna vez finalizada la centrifugación, eliminar completamente sobrenadante del paso 1,12 por decanting y borrando las botellas de centrífuga en una toalla de papel estéril.\nAñadir 200 ml de tampón de S30A a 4 º C a cada una de las cuatro botellas de centrífuga, y agitar vigorosamente hasta que las botellas sedimento se solubilizó completamente sin grumos restantes. Centrifugar las cuatro botellas en 5000 g durante 12 min a 4 ° C.\nRetire completamente sobrenadante del paso anterior por decantación y secar las botellas de centrífuga en una toalla de papel estéril.\nRepita los pasos 1.15 y 1.16.\nAñadir 40 ml de tampón S30A a 4 º C a cada botella de centrifugación. . Transfiera cada pellet y la combinación S30A en un tubo Falcon refrigerada de 1,9) Nota: Este paso es transferir los pellets en un recipiente pequeño.\nCentrifugar los tubos Falcon a 2000 g durante 8 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante por decantación.\nRe-centrifugue los tubos Falcon a 2.000 g durante 2 min a 4 ° C. Eliminar completamente el sobrenadante residual mediante una pipeta. Mantener en hielo.\nPesar la fnuestros tubos Falcon con pellet y masa registro en la tabla 3. Calcula la masa de pellets, volumen de tampón S30A es necesario, y la masa de los granos necesarios sobre la base de las fórmulas específicas de la Tabla 3.\nCorrecta carga y de cuentas latido del pellet es fundamental para hacer el extracto de la calidad, y es el paso más difícil. Se recomienda revisar el video antes de intentar. Si no se evitan las burbujas de aire y distribuir granos uniformemente resultará en el extracto de ineficiente.\nAñadir la cantidad de tampón S30A calculado en la Tabla 3 a cada tubo Falcon, vórtice hasta homogeneidad, y volver a hielo.\nMientras se mantiene los otros tubos Falcon en hielo, añadir perlas de forma intermitente a un solo tubo Falcon en tres alícuotas, cada uno con 1/3 de las perlas totales. Después de la adición de cada alícuota de perlas, de vórtice durante 30 segundos. Coloque el tubo de Falcon en el hielo entre los pasos de vórtice y después vórtice final. Después se añade la última alícuota, garantizarperlas se distribuyen de manera uniforme. Se debe formar una pasta espesa.\nPrepare una punta de pipeta de 5 ml (volumen) cortando el extremo utilizando una hoja de afeitar estéril para crear una abertura de 3-4 mm. Dial pipeta 2 ml Nota: Los diferentes conjuntos de pipetas y puntas proporcionan diferentes cantidades de succión que puede no ser suficiente para tirar y soltar la solución de células cordón grueso, una punta de pipeta de 1 ml con fines eliminado puede ser usado en lugar..\nColoque 20 tubos de cuentas que superaron en hielo.\nVerifique alta viscosidad de la solución de célula-perla utilizando pipeta modificado. Debe ser viscoso hasta el punto de apenas sale de la punta de la pipeta durante la eyección. Si es demasiado viscoso, vuelva a ajustar la punta de la pipeta según la etapa 1.25. Si no es lo suficientemente viscoso, perlas se pueden añadir en incrementos de (masa de pellets * 0,05), a una masa máxima (masa de pellets * 5.1). Después de cada adición de perlas, vortex durante 30 segundos y volver al hielo. Vea la Figura 3a para una demostración de la viscosidad.\nRetire la solución de células de cuentas de tubo Falcon utilizando pipeta modificado, y transferir a un tubo de talón superando estéril, llenándolo de tres cuartos de su capacidad con una solución de células de perlas. Gira muy brevemente (1s) en un contador mini-centrifugadora para eliminar las burbujas de aire y sin redistribuir cuentas. Vea las Figuras 3b-d para imágenes fijas de tubo perlas paliza carga.\nTerminar añadiendo solución de células del grano para formar un menisco cóncavo.\nAñadir una pequeña gota de solución de células de cuentas en el interior de una tapa de tubo de bolas-de latir, teniendo cuidado de no obstaculizar el borde exterior de la tapa, de lo contrario, el tubo de talón superando no lo hará sufficientl cerca y. Toque en la tapa en una superficie plana y compruebe que no haya burbujas de aire en la parte inferior de la tapa.\nTape el tubo de cuentas-golpes con el casquillo del grano, superando en el paso anterior. Mano a asistente de golpes de talón. Si se hace correctamente, la tapa debe estar bien sellado, no hay burbujas de aire Should ser visible, y poco solución de células talón (si los hay) se debe volcar fuera. Vuelva a realizar el proceso de carga si hay burbujas de aire visible o la tapa no hace cerrar completamente.\nTubo Falcon Vortex desde el paso 1,24 con la solución de células del grano restante para asegurar una distribución uniforme de los granos. Repita los pasos 1.28 a 1.31 hasta que el tubo Falcon está vacía y, a continuación, repita los pasos 1.24 a 1.31 por cada tubo Falcon adicional.\nConducta pasos 1,33-1,38 simultáneamente. Haga que toma auxiliar lleno de talones golpeando tubos de 1.31 y el lugar en el hielo. Una vez que dos tubos de cuentas-superando llenas se han recogido y han sido en hielo durante al menos un minuto, comience a latir de perlas.\nBatir un tubo durante 30 segundos a 46 rpm. Coloque boca abajo sobre hielo durante 30 segundos sin dejar de batir el otro tubo.\nRepita el paso anterior de tal manera que cada tubo de talón superando llenado se ha de superar para 1 min total.\nRepita los pasos 1,33-1,35 hasta 8 tubos de perlas llenas de batido (o el importe máximo de la centrífuga puede sostener) hAVE ha procesado. Entonces, la construcción de un aparato de filtro de 15 ml Falcon (Figura 3e). Añadir un nuevo casquillo del grano-de latir,-parte plana hacia arriba, al fondo de un Falcon de 15 ml. A continuación, retire el tapón del tubo de talón superando procesado y la columna micro-cromatografía presione firmemente en el extremo del tubo de talón superando procesada hasta que esté completamente sellada. Encajar off final de elución de la columna micro-cromatografía, y coloque la columna micro-cromatografía, elución termina abajo, en el tubo de perlas abalorios vacía. Coloque este complejo en 15 ml Falcon. Repita el procedimiento para todos los 8 tubos de cuentas-superando llenas; mantener en hielo cuando se complete.\nCentrífuga 8 aparatos de filtro, tubo Falcon destapado, en 6000 g durante 5 min a 4 ° C para separar el extracto de sedimento y de perlas.\nVerifique cada tubo perlas paliza ha producido extracto viable. Extracto correctamente batir no será turbia, y el sedimento tendrá dos capas distintas. Deseche todos los tubos turbios, y transferir el sobrenadante de los tubos no turbias i1,75 ml tubos de microcentrífuga nto individuales, teniendo tan poco pellet posible. Mantener en hielo hasta que se hayan procesado todos los tubos de cuentas-de latir. Vea la Figura 3f comparar un cordón tubo-paliza correctamente vs incorrectamente procesada.\nTubos de centrífuga de microcentrífuga de paso anterior a 12.000 g durante 10 min a 4 ° C.\nTransfer-pellet libre sobrenadante en tubos de cuentas que superaron vacíos utilizando una pipeta, consolidando 500 l en un nuevo tubo de talones de latir.\nIncubar paso anterior, con tapas de cuentas-superando retirados, a 220 rpm, 37 º C durante 80 min. Este paso digiere restante ácidos nucleicos utilizando exonucleasas endógenos liberados durante el proceso de cuentas-el gotear, y se puede hacer de pie el tubo de talones golpeando en un tubo de cultivo de tejidos.\nPreparar materiales de diálisis. Preparación completa búfer S30B añadiendo 2 ml de DTT 1 M a 2 L de S30B previamente preparado. Mezclar y añadir 900 ml en cada uno de dos ererile 1 L vasos. Añadir un agitador magnético estéril en cada vaso, mantener a 4 ° C.\nDespués del paso 1.41, extracto debe ser turbia. Consolidar extracto en alícuotas de 1,5 ml en 1,75 ml de tubos de microcentrífuga, y se centrifuga a 12.000 g durante 10 min a 4 ° C.\nCon una pipeta, consolidar sobrenadante libre de pellet en 15 ml tubos Falcon en el hielo, y mezclar bien tapando el tubo y de inversión. Ahorra 10 l de sobrenadante en hielo para el paso de 1.47.\nDetermine la cantidad total de extracto producido, e hidratar el número necesario de 10k MWCO casetes de diálisis sumergiendo en S30B durante 2 minutos, suponiendo 2,5 ml de extracto por casete.\nCargue cassettes con 2,5 ml de extracto. Cada vaso puede tardar hasta 2 cassettes; dializar, revolviendo, a 4 º C durante 3 horas Nota: la carga parcial de casetes es aceptable.. Diálisis aumenta el rendimiento de producción de proteínas.\nDurante el paso anterior, caracterizar la proteína extractoconcentración con un ensayo de Bradford, utilizando extracto de salvado en el paso 1.44. Ver Material Suplementario 2 para más detalles.\nDespués de la diálisis es completa, extracto de alícuota por 1,5 ml en 1,75 ml de tubos de microcentrífuga. Centrifugar a 12000 g durante 10 min a 4 ° C. Un sedimento se forma en la parte inferior del tubo.\nConsolidar sobrenadante claro desde el paso anterior con la pipeta en un tubo Falcon de 15 ml en hielo. Homogeneizar por inversión de 5-10x.\nSobre la base de concentración determinada por Bradford en el paso 1,47, determinar la cantidad de extracto de alícuota en 1,75 ml de tubos individuales. Cada tubo individual debe tener un volumen con 810-900 mg de proteína total. Extracto debe tener una concentración total de proteína mayor que 27 mg / ml. Este paso requiere asistencia para llevar a cabo convenientemente Nota:. Extracto Alícuota por debajo de 30 mg / ml en 30 ml de alícuotas, y la escala si la concentración es mayor, por ejemplo, el extracto de alícuota a 28 mg / ml por 30 l, y el extracto de alícuota a 32mg / ml de 28,1 l.\nAlícuota de extracto siguiente paso 1.50, teniendo cuidado de evitar burbujas. Extracto de flash-congelación en nitrógeno líquido Nota:. Alícuotas con las burbujas se pueden eliminar por centrifugación a 10.000 xg durante 30 segundos a 4 ° C.\nRetire los tubos de nitrógeno líquido utilizando un colador y guardar inmediatamente a -80 ° C. Seguridad: Usar gafas de protección; las tapas de los tubos de extracto podrían desprenderse debido a la diferencia de temperatura entre el nitrógeno líquido y la temperatura ambiente.\n2. Aminoácidos Preparación de la Solución\nSolución de aminoácidos debe ser preparado de forma masiva. La siguiente receta utiliza un kit completo de estrategia en tiempo real de Aminoácidos Sampler, el suministro suficiente para aproximadamente 11.000 reacciones individuales. Si Reducción de escala, se recomienda utilizar no menos de la mitad de un kit. Cada aminoácido en el stock se suministra a 1,5 ml, 168 mM, a excepción de la leucina en 140 mM. La composición final de la solución de aminoácidos es:leucina, 5 mM, todos los demás aminoácidos, 6 mM. Esta es la concentración de trabajo 4x.\nQuite todos los 20 aminoácidos entre -20 ° C y descongelar a temperatura ambiente. Una vez descongelado, agitar hasta que se disuelven los aminoácidos, incubando a 37 ° C si es necesario. Después se disuelven aminoácidos, poner todos los aminoácidos en hielo excepto por Asn, Phe, y Cys, que se mantuvo a temperatura ambiente. Cys puede no disolverse completamente.\nEn hielo, añadir 12 ml de agua estéril a un tubo Falcon de 50 ml estéril.\nAñadir 1,5 ml de cada aminoácido en el siguiente orden, teniendo cuidado de vórtice el tubo Falcon después de cada adición y mantener la solución en hielo: Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, Leu, Cys. Cys se pueden añadir como una suspensión. Después de la adición, agitar hasta que la solución es relativamente clara, incubando a 37 ° C si es necesario. Cys puede no disolverse completamente.\nAlícuota amino solución de ácido en 50 tubos en26 l cada uno en el hielo. Alícuota el resto a 500 l por tubo en hielo. Los 26 ml de alícuotas se utilizarán para la calibración de extracto, mientras que los 500 ml de alícuotas se utilizarán para la preparación de tampón. Mientras alícuotas, el vórtice de stock principal con frecuencia para evitar una distribución desigual de la suspensión.\nAlícuotas congeladas de Flash en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C. Seguridad: Usar gafas de protección; las tapas de los tubos de extracto podrían desprenderse debido a la diferencia de temperatura entre el nitrógeno líquido y la temperatura ambiente.\nOpcional: Realice un ensayo de actividad de la solución de aminoácidos recién hecho en contra de soluciones de aminoácidos previamente realizadas.\n3. Energía Preparación de la Solución\nSolución La energía se utiliza tanto para la calibración de extracto celular crudo y para la creación de tampón, y se debe preparar en grandes cantidades. La siguiente receta suministra suficiente para aproximadamente 10.000 reacciones individuales. Si la escala hacia abajo, es recommended utilizar no menos de 1/24 de los valores dados aquí. A medida que la solución de la energía es un costo económico significativo, los usuarios de primera vez pueden quieren preparar en escala 1/24. La composición final de la energía solución es: HEPES, pH 8 700 mM, ATP 21 mM, GTP 21 mM, CTP 12,6 mM, UTP 12,6 mM, ARNt 2,8 mg / ml, CoA 3,64 mM, NAD 4,62 mM, AMPc 10,5 mM, ácido folínico 0,95 mM, espermidina 14 mM, 3-PGA 420 mM. Este es 14x la concentración de trabajo. Si se desea, cada elemento individual en la Tabla 4 se puede almacenar a -80 ° C para su uso posterior.\nEliminar todos los productos químicos en la Tabla 4 de -80 ° C, -20 ° C, o 4 º C a temperatura ambiente durante 30 min.\nPreparar soluciones madre como se describe en la Tabla 4. Ver Material Complementario 1 para las recetas. Coloque todas las soluciones en el hielo después de la preparación.\nEn un tubo Falcon de 15 ml, añadir en el siguiente orden, teniendo cuidado de vórtice del tubo Falcon después de cada adición y mantener las soluciones on hielo: 3,6 ml de 2 M de HEPES, 144 l de agua, 1,39 ml de mezcla de nucleótidos, 576 l 50 mg / ml de ARNt, 576 l 65 mM de CoA, 276 l mM de NAD 175, 170 l mM de cAMP 650, 288 l 33,9 mM de ácido folínico , 144 l 1 M espermidina, y 3,09 ml de 1,4 M 3-PGA.\nEnergy Solution alícuota en 50 tubos en 7 l cada uno en el hielo. Alícuota el resto a 150 l por tubo en hielo. Los 7 ml de alícuotas se utilizarán para la calibración de extracto, mientras que los 150 ml de alícuotas se utilizarán para la preparación de tampón. Mientras alícuotas, el vórtice de la frecuencia principal.\nOpcional: Realice un ensayo de actividad del recién hecha Energy Solution contra Energy Solutions previamente realizadas.\n4. Preparación Buffer\nBufPreparación fer requiere la realización de crudo celular Extraer Preparación de Aminoácido Preparación de soluciones, y Energía Preparación de soluciones. Cada buffer es exclusivo de un lote de extracto celular crudo. Mg-glutamato, K-glutamato, y la TDT (en ese orden) son optimizados en esta sección para producir reacciones con los niveles máximos de expresión. El siguiente protocolo utiliza una plantilla pre-escrita, TXTL_e (plantilla) _calibration_JoVE.xlsx (material suplementario 3), para calibrar extracto celular crudo pre-preparados y preparar buffer. Sin embargo, también se puede calibrar extracto celular crudo y preparar tampón sin la plantilla mediante la optimización de Mg-glutamato, K-glutamato, y DTT manualmente y la creación de tampón tal que, junto con el extracto, es 75% de un volumen de reacción total. Si la calibración manual, las condiciones finales de la reacción se pueden encontrar en el paso 5.\nComplete el formulario de "Datos Generales".\nDescongelar en hielo 100 mM de Mg-glutamato (4 ° C), 3 M K-glutamato (4 ° C), 6mM Solución de Aminoácidos (26 l, -80 ° C), la solución de Energía (7 l, -80 ° C), 100 mM de DTT (-20 ° C), ADN de control positivo (-20 ° C), 40% de PEG- . 8000 (4 ° C), el extracto celular en bruto (-80 ° C), y agua (4 ° C) Nota: Utilice 1 nM concentración de trabajo pbest-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 (plásmido Addgene 40019) para el control positivo (excitación 485 nm, emisión 525 nm), u otra referencia que produce alta intensidad de señal. 4\nPreparar siete 10,5 reacciones mu l, probando una gama de 4-10 mM adicional de Mg-glutamato, por alícuotas de cantidades Conjunto De Mg-glutamato en tubos de microcentrífuga individuales. Nota: Aunque 10,5 reacciones mu l se preparan inicialmente, la reacción final es 10 l.\nPrepare la mezcla maestra, como se indica en la plantilla en "la calibración Mg-glutamato", añadiendo un extra de 80 mM de K-glutamato. Mantenga en hielo y agitar después de la adición de cada artículo Nota:. Los valores dados aquí y en la plantilla sonAdemás de las cantidades de Mg-glutamato, K-glutamato, y DTT presente en el tampón S30B utilizado para hacer extracto celular crudo.\nAñadir mezcla maestra a las muestras que contienen Mg-glutamato y preparar reacciones. Consulte los pasos 5.10 a 5.13 para obtener instrucciones detalladas.\nEjecutar de reacción a 29 ° C, ya sea en una incubadora o un lector de placas.\n. Determinar la concentración de Mg-glutamato óptimo nivel de la expresión final y la máxima tasa de expresión de la proteína (Figura 4a) Nota: Los tiempos de ejecución varían según el experimento, pero suelen durar menos de 8 horas.\nRepita los pasos 4.2 a 4.7 para K-glutamato en "calibración K glutamato," establecer los niveles de Mg-glutamato a los encontrados en el paso 4.7.\nRepita los pasos 4.2 a 4.7 para la TDT en "Calibración de la TDT", se fija el contenido de Mg-glutamato a los encontrados en el paso 4.7 y los niveles de K-glutamato a los encontrados en el paso 4.8 Nota:. Hemos encontrado que añade la TDT no afecta significativamente al final los niveles de expresión.\nUsovalores encontrados en la calibración en "composición Buffer" para determinar la composición de tampón que estar preparado. Sobre la base de la cantidad de extracto celular crudo producido, una receta mezcla maestra se produce por un importe conjunto de buffers.\nDescongelar las alícuotas que se enumeran en el maestro receta mezcla en hielo. Una vez descongelado, preparar mezcla maestra, manteniendo en hielo y agitación en vórtex después de la adición de cada elemento.\nAlícuota por cantidad indicada en "composición Buffer". Tubos de protección de Flash-congelación en nitrógeno líquido. Aunque alícuotas, vórtice del afuste principal con frecuencia.\n5. Ejecución experimental de una reacción TX-TL\nCondiciones de reacción finales son: 8.9 a 9.9 mg / ml proteen (a partir de extracto crudo), 4,5 mM-10.5 mM de Mg-glutamato, 40-160 mM de K-glutamato, 0,33-3,33 mM de DTT, 1,5 mM de cada aminoácido excepto leucina, leucina 1,25 mM, HEPES 50 mM, 1,5 mM de ATP y GTP, CTP 0,9 mM y UTP, 0,2 mg / ml de ARNt, 0,26 mM de CoA, 0,33 mM de NAD, 0,75 mM AMPc, 0,068 mM de ácido folínico, espermidina 1 mM, 30 mM de 3-PGA, 2% de PEG-8000. Un TX básica -TL reacción consta de 3 partes (tubos): extracto celular en bruto, de amortiguamiento y de ADN. La relación es: tampón 75% y el extracto, DNA 25% Las reacciones pueden variar en volumen, y usamos 10 l por convención para minimizar el volumen de reacción y permitir que se ejecuta en una placa de 384 pocillos.. Volúmenes más grandes requieren agitación para la oxigenación adecuada. El siguiente protocolo utiliza una plantilla pre-escrita, TXTL_JoVE.xlsx (material suplementario 4), para llevar a cabo una reacción de 10 l. Los productos en púrpura indican los valores de entrada del usuario, y artículos en azul indican reactivos adicionales para añadir a la reacción. Sin embargo, también se puede llevar a cabo una reacción de ingeniohout la plantilla siguiendo las condiciones de reacción descritas anteriormente.\nEn "Maestro Preparación Mezclar", inserte el valor del porcentaje de extracto del paso 4.1 en el cuadro de color púrpura.\nDiseñe el experimento in silico usando el "Maestro Preparación Mix" (filas 10 a 17) y "Preparación de ADN" (filas 19 a 50) secciones. En general, las constantes se pueden poner en la sección "Preparación Maestro Mix", mientras que las variables se pueden poner en la sección "Preparación de ADN". Minimizar muestras por experimento para evitar la evaporación de la muestra y experimental sesgo hora de inicio. Vea la Figura 6 para una configuración de ejemplo.\nEn "Maestro Preparación Mezclar," añadir reactivos, tales como inductores o proteínas, que irán en todas las muestras a una concentración constante. Comenzando por la fila 14, llene las áreas sombreadas de color azul, manteniendo un reactivo a cada línea. Las unidades son proporciones relativas.\nEn la sección "Preparación de ADN", añade ADN que será específi muestraIC. ID de la muestra # 1 y # 2 se corresponden con los controles positivos y negativos, respectivamente. ID de la muestra # 3 y arriba son modificables por el usuario para el ADN, la concentración de valores en ng / l, la longitud en pares de bases, la concentración final deseada en nM, y repeticiones (de 10 reacciones mu l). La cantidad de ADN de valores para alcanzar la concentración final deseada se calcula automáticamente. . El total a través de las sumas de las filas a 10,5 * n, donde n es el número de repeticiones Nota: Aunque el volumen de reacción final es 10 l, los cálculos suponen un volumen total de 10,5 l por reacción, para tener en cuenta el volumen perdido durante el pipeteado.\nEn la sección "Preparación de ADN", añadir los reactivos o de ADN adicional que será específico de la muestra a las columnas azules. Concentraciones de ADN Stock en nM se pueden calcular en "Preparación de ADN", mientras que los reactivos específicos de ejemplo requieren cálculo manual basado en un volumen de reacción total de 10.5 * n. Los volúmenes introducidos se restan de la cantidad de agua de la misma fila.\nRetire Numbe necesariaR de tubos de tampón, extracto celular en bruto, y el control positivo bajo "Tubos de descongelar," de -20 ° C o -80 ° C y descongelar en hielo.\nPreparar las muestras de ADN. Para cada muestra Identificación, alícuota a cabo el ADN indicado, el agua, y elementos suministrados por el usuario por la sección "Preparación de ADN" en un tubo de microcentrífuga, a temperatura ambiente Nota:. Para evitar la pérdida de muestra, calibrados recientemente pipetas y de bajo palillo Se recomiendan puntas de pipeta y tubos de microcentrífuga.\nCuando se descongelan tubos de paso 5.7, preparar la mezcla maestra que consta de tampón, extracto, y ningún artículo globales suministrados por el usuario sobre la base de las cajas de color naranja-sombreada, mantener en hielo y agitación en vórtex después de la adición de cada elemento Nota:. Extracto es extremadamente viscoso. Alícuotas con burbujas se pueden eliminar por centrifugación a 10.000 xg durante 30 segundos a 4 ° C.\nAñadir la cantidad de mezcla maestra se indica en las celdas naranjas en "Preparación de ADN" (columna O) para cada muestra de ADN, y mantenga a temperatura ambientetura. Tratar esto como la hora de inicio de la reacción.\nVortex cada muestra, y se centrifuga a 10.000 xg durante 30 segundos a temperatura ambiente para reducir cualquier muestra residual y para reducir las burbujas.\nSi la realización de la reacción en tubos de microcentrífuga, incubar directamente a 29 ° C. . De lo contrario, una pipeta 10 l de muestra en una placa de 384 pocillos Nota: Reacciones en volúmenes superiores a los 10 l pueden requerir agitación para la oxigenación.\nPlaca Centrifugar a 4000 xg durante 30 segundos a temperatura ambiente para reducir cualquier muestra residual y para reducir las burbujas. Sellar la placa después para evitar la evaporación.\nEjecute reacción a 29 ° C. Nota: Los tiempos de ejecución varían dependiendo de experimento, pero por lo general una duración de menos de 8 horas.\nHemos presentado un protocolo de cinco días para la preparación de una Escherichia coli endógena sistema de expresión libre de células TX-TL basado. Una línea de tiempo de la muestra para la creación de los reactivos - extracto celular en bruto y de amortiguamiento - se puede encontrar en la Figura 1. Una vez creado, éstos se pueden almacenar a -80 ° C durante hasta un año. Una vez creados los reactivos, la configuración experimental y ejecución se puede hacer en menos de 8 horas.\nAdemás, hemos optimizado las condiciones de expresión del sistema de expresión libre de células TX-TL. Otras adiciones proporcionadas por el usuario, tales como tampones o soluciones de ADN, deben ser calibrados para la toxicidad de antemano. Por ejemplo, diferentes métodos de procesamiento de los resultados en plásmidos de expresión diferente debido al contenido de sal. También hemos probado el efecto de tampón de elución Tris-Cl en la eficiencia de reacción (Figura 5).\nUn ejemplo de calibración extracto celular crudo, refiriéndose paso 04.01 a 04.09, se muestraen la Figura 4a. En general, nuestros experimentos muestran que el extracto celular en bruto es más sensible a los niveles de Mg-glutamato, seguido de niveles K-glutamato. Para demostrar el sistema de expresión libre de células, construimos y probamos un circuito de retroalimentación negativa basada en tet represión. 26 (Figura 6). En el sistema de expresión libre de células, el mismo recorrido del circuito con y sin ATC muestra un punto final cambia la expresión de 7 veces de reportero deGFP después de ocho horas de expresión. Aunque este experimento no requiere inductores o represores globales, si es necesario se pueden añadir en "Maestro Preparación de la mezcla."\nFigura 1. Línea de tiempo para el extracto celular en bruto, solución de aminoácidos, y preparación de la solución de energía. Un Timelin de cinco días E para una ejecución típica del protocolo se ha dado anteriormente, optimizado para incubaciones durante la noche y pasos de trabajo durante el día.\nFigura 2. Costos y análisis de la expresión de competir extractos celulares crudos. a) Desglose de los costos de mano de obra y materiales del sistema de expresión libre de células TX-TL. Sobre la base de los costos de reactivos a partir de diciembre de 2012, y los costos de mano de obra de $ 14 por hora. B) Comparación de la TX-TL costos del sistema de expresión libre de células frente a otros sistemas comerciales. Los costos se dividen por l, aunque los volúmenes de reacción pueden variar según el kit. C) Comparación de la TX-TL libre de células rendimiento sistema de expresión frente a otros sistemas comerciales. Rendimiento de expresión de proteínas determinada por las normas del fabricante./ 50762fig2large.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver más grande la figura.\nFigura 3. La carga y el procesamiento de un tubo de perlas de latir. a) Demostración de la viscosidad correcta de solución célula-perla. Solución Cell-grano tendrá una viscosidad depende de muchos factores, incluyendo la cantidad de tampón S30A añadido, la cantidad de cuentas de agregados, y el tiempo pasado en el hielo. B) Carga de cordón tubo-batir antes de la centrifugación de mesa rápido. La centrifugación elimina las burbujas acumuladas durante la carga. C) de burbujas a la superficie después de la centrifugación tablero de la mesa. El tamaño de las burbujas puede variar, ya que pueden hacer estallar o eliminar con una punta de pipeta d) de tubo de bolas-superando completamente lleno antes de la limitación.. Se forma un menisco en el cordón de-batiendo tube, y la tapa tiene suficiente para cubrir y causar pequeñas cantidades para llenar en exceso. e) Aparato de filtro cargado correctamente. Estos pueden ser reutilizados. F) Comparación de la correcta vs cordón tubo-superando incorrectamente procesada. El tubo de la izquierda es un tubo bien-beat - que cuenta con un pequeño y bien delineada capa superior, y un sobrenadante claro. El tubo de la derecha es subóptima, en base a la, segunda capa nebuloso más grande y el sobrenadante turbio. Tubos que son subóptimas no deben someterse a un procesamiento adicional.\nFigura 4. Propiedades de preparaciones de extracto crudo. a) parcelas de calibración típicas para extracto celular en bruto. Extracto crudo se calibra para el Mg-glutamato adicional, K-glutamato, y los niveles de TDT, en ese orden. Se muestra fluorescenc punto finale después de 8 horas, así como la tasa máxima de producción de proteína en base a un promedio móvil de 12 minutos. Sobre la base de estas parcelas, un rango aceptable de Mg-glutamato adicional es 4 mM, K-glutamato es 60-80 mM, y DTT es 0-3 mM. Tenga en cuenta que cada extracto en bruto necesita ser calibrado de forma independiente para estas tres variables. B) Variación de preparaciones de extractos. Se muestra de punto final de fluorescencia de dos extractos crudos preparados en fechas diferentes; barras de error son de 1 desviación estándar de tres carreras independientes en diferentes días. Haga clic aquí para ver más grande la figura .\nFigura 5. Efectos de la solución de ADN en la eficacia de la expresión. a) Comparación de dos purificación diferentemétodos para el procesamiento de plásmidos. 1 nM de pbest-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 se prepara usando solamente un kit de Spin Miniprep Qiaprep (método de purificación 1) o post-procesado con un kit de purificación de PCR QIAquick (método de purificación 2). Se muestra la fluorescencia de punto final después de 8 horas, así como la tasa máxima de producción de proteína en base a un promedio móvil de 12 minutos. Las barras de error son de 1 desviación estándar de cuatro carreras independientes en diferentes días. B) Efecto del tampón de elución (Tris-Cl). Diferentes concentraciones de Tris-Cl se comparan en una reacción de expresión libre de células basado en la expresión de 1 nM de pbest-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. Las concentraciones dadas son concentraciones finales de Tris-Cl en la reacción; tampón de elución utilizado es 10 mM de Tris-Cl. Las barras de error son de 1 desviación estándar de tres carreras independientes en diferentes días. Haga clic aquí para ver más grande la figura .\nFigura 6. Muestra de ejecución TX-TL de un bucle de retroalimentación negativa. a) Ejemplo de configuración de una reacción de ejecución libre de células. Tests "en" contra "de" estado de la curva de retroalimentación negativa, con controles positivos y negativos. B) El plásmido mapa de bucle de retroalimentación negativa. C) Los resultados representativos. Los datos reflejan experimento en a) y b), con el control negativo se resta de la señal. Circuito genético muestra en la inserción. Las barras de error son de 1 desviación estándar de tres carreras independientes en diferentes días. Haga clic aquí para ver más grande la figura .\nNombre Concentración Cantidad Esterilización Notas\nEl cloranfenicol (Cm) 34 mg / ml en etanol 1 ml Se esteriliza con filtro (0.22 M) Puede ser hecho en volúmenes más grandes almacenados a -20 ° C para su uso posterior.\n2xYT + P + placa de agar Cm 31 g / L 2xYT, 40 mM de fosfato de potasio dibásico, 22 mM de fosfato de potasio monobásico, 34 mg / ml de cloranfenicol 1 placa Autoclave\n2xYT + P multimedia 31 g / L 2xYT, 40 mM de fosfato de potasio dibásico, 22 mM de fosfato de potasio monobásico 4 L Autoclave\nTabla 1. Reactivos para el día 1 del protocolo de extracto crudo de la célula.\nTris base 2 M 250 ml Se esteriliza con filtro (0.22 M) o en autoclave Se puede almacenar a temperatura ambiente.\nTDT 1 M 6 ml Se esteriliza con filtro (0.22 M) Puede ser hecho en volúmenes más grandes y se almacenó a -20 ° C para su uso posterior.\nBúfer S30A 14 mM de Mg-glutamato, 60 mM de K-glutamato, mM de Tris, pH 7,7 50 2 L Autoclave Para llegar a pH 7,7, valorar con ácido acético. Añadir TDT a 2 mM de concentración final, justo antes de su uso. Almacenar a 4 ° C.\nBúfer S30B 14 mM de Mg-glutamato, 60 mM de K-glutamato, ~ 5 mM de Tris, pH 8,2 2 L Autoclave Para llegar a pH 8,2, se valora con 2 MTris. Añadir TDT a 1 mM concentración final justo antes de su uso. Almacenar a 4 ° C.\nTabla 2. Reactivos para el día 2 del protocolo de extracto crudo de la célula.\nVacío 50 ml Falcon (g)\n50 ml Falcon con pellet (g)\nMasa de pellets (50 ml Falcon con pellet - vacío 50 ml Falcon) (g)\nVolumen de tampón S30A añadir (masa de pellets * 0.9) (ml)\nMasa total de cuentas para agregar (masa de pellets * 5.0) (g)\nTabla 3. Búfer S30A y calculadora de masa del grano, para el día 3 de protocolo de extracto crudo de la célula.\nHEPES 2 M, pH 8 4 ml Ninguno Para llegar a un pH de 8, titule con KOH.\nNucleotide Mix 156 mM de ATP y GTP, CTP y UTP mM, de pH 7,5 94 1,5 ml Ninguno Para llegar a un pH de 7,5, titule con KOH.\ntRNA 50 mg / ml 600 l Ninguno\nCoA 65 mM 600 l Ninguno\nNAD 175 mM, pH 7.5-8 300 l Ninguno Para llegar a pH 7,5-8, titule con Tris 2 M.\ncAMP 650 mM, pH 8 200 l Ninguno Para llegar a un pH de 8, titule con Tris 2 M.\nEl ácido folínico 33,9 mM 300 l Ninguno Aunque se necesitan sólo 300 l, receta en suplementario es de 1,15 ml.\nLa espermidina 1 M 150 l Ninguno Almacenar a 4 ° C, el calor a 37 ° C para fundir.\n3-PGA 1,4 M, pH 7,5 3,2 ml Ninguno Para llegar a un pH de 7,5, se valora con Tris 2 M.\nTabla 4. Reactivos para prepararse para el protocolo Energy Solution.\nMaterial complementario 1. Recetas para los artículos.\nEl cloranfenicol, 34 mg / ml: Preparar 0,51 g de cloranfenicol y añadir etanol a 15 ml. Se esteriliza con filtro (0.22 M), alícuota de 1 ml tubos, almacenar a -20 ° C para su uso posterior.\n2xYT + P + placa de agar Cm: Preparar 1,24 g 2xYT, 1,6 ml de fosfato de potasio dibásico @ solución 1 M, 0,88 ml de solución de fosfato monobásico de potasio @ 1 M, 0,6 g de agar, y el agua a 40 ml. Autoclave. Dejar enfriar a 50 ° C y añadir 40 l Cm. Alícuota de 25 ml en una placa de 100 x 15 mm Petri, y deje que se enfríe durante una hora.\n2xYT + P los medios de comunicación: Preparar 124 g 2xYT, 160 ml de fosfato de potasio dibásico @ solución 1 M, solución de 88 ml de fosfato de potasio monobásico @ 1 M, y agua a 4 L. Aliquot hacia 2 x 1,88 L y 0,24 L. Autoclave.\nTris base, 2 M: Prepare 60,57 g Tris base y agua hasta 250 ml. Esterilizar, almacenar a temperatura ambiente para su uso posterior.\nTDT, 1 M: Preparar 2,31 g TDT y el agua a 15 ml. Se esteriliza con filtro (0.22 M), alícuota de 1 ml tubos, almacenar a -20 ° C para su uso posterior.\nBúfer S30A: Prepare 10,88 g Mg-glutamato y 24,39 g K-glutamato, 50 ml de Tris a 2 M, ácido acético (pH 7,7), y el agua a 2 L. Autoclave, se almacenan a 4 ° C, añadir 4 ml 1 M DTT antes de su uso.\nBúfer S30B: Prepare 10,88 g Mg-glutamato y 24,39 g K-glutamato, Tris 2 M (pH 8,2), y el agua a 2 L. Autoclave, se almacenan a 4 ° C, añadir 2 ml de 1 M DTT antes de su uso.\nHEPES: Preparar 1,91 g de HEPES (MW 238,21), KOH (a pH 8), y agua a 4 ml.\nARNt: Prepare 30 mg de ARNt y agua a 600 l.\nCoA: Preparar 30 mg de CoA (MW 767,53) y agua a 600 l.\nNAD: Añadir 34,83 mg de NAD (MW 663,43), Tris a 2 M (a pH 7,5-8), y agua a 300 l. (Añadir 27 l de Tris a 2 M para llevar la solución a pH 7,5-8).\ncAMP: Agregar 42,80 mg de cAMP (PM 329,22), Tris 2 M (pH 8), y el agua a 200 l. (Añadir 73 l de Tris a 2 M para llevar la solución a pH 8).\nÁcido folínico (33,9 mM): Para 20 mg de sal de calcio de ácido folínico sólido (MW 511.5), añadir 1,15 ml de agua.\nLa espermidina: Preparar 23,55 l de espermidina (MW 145,25) y agua a 150 l. Preparar a temperatura ambiente después de la fusión brevemente a 37 ° C.\n3-PGA: Añadir 1,03 g de 3-PGA (MW 230,02), Tris a 2 M (a pH 7,5), y agua a 3,2 ml. (Añadir 1,73 ml de Tris a 2 M para llevar la solución a pH 7,5).\nNucleotide Mix: Añadir 145 mg de ATP dipotásico dihidrato de sal (MW 619.4), 133 mg de sal disódica GTP (MW 567,14), 79,4 mg de sal disódica dihidrato CTP (MW 563,16), 82,6 mg de dihidrato de la sal trisódica UTP (MW 586,12) , KOH a 15% de dilución (a pH 7,5), y agua a 1,5 ml. (Añadir 353 l de KOH a 15% de dilución para llevar la solución a pH 7,5).\nMaterial suplementario 2. Ensayo de Bradford.\nEliminar los agentes Bradford de 4 ° C y se pondrá a la temperatura ambiente.\nPreparar 50 l de BSA estándar a 1 mg / ml y a 0,1 mg / ml.\nPreparar 40 l de 20x de dilución del extracto de la etapa 1.47.\nAñadir 800 l de agua a 7 cubetas.\nPreparar cubetas estándar para 0 mg / ml, 1 mg / ml (10 l 0,1 mg / ml de BSA), 2 mg / ml (20 l 0,1 mg / ml de BSA), 4 mg / ml (4 l 1 mg / ml de BSA) , 6 mg / ml (6 l 1 mg / ml de BSA).\nPreparar cubetas experimentales para 2 l de muestra y 4 l de muestra.\nAñadir 200 l de agente de Bradford a cada cubeta y mezclar bien bY pipeteado. Incubar a temperatura ambiente durante al menos 10 min.\nProducir curva estándar a una DO de 595 nm usando cubetas de paso 6.5. Rechazar curva estándar si r 2 <0,95.\nDeterminar la concentración del extracto a una DO de 595 nm utilizando cubetas desde el paso 6.6.\nMaterial complementario 3. Tampón de hoja de cálculo de calibración.\nVer TXTL_e (plantilla) _calibration_JoVE.xlsx .\nMaterial suplementario 4. Expresión libre de células ejecutar hojas de cálculo.\nVer TXTL _JoVE.xlsx .\nSistema de expresión libre de células TX-TL basado La Escherichia coli endógeno descrito aquí es una reacción simple-to-run de tres tubos que pueden tener menos de ocho horas de creado para la recopilación de datos. El proceso de creación de todos los reactivos requiere un total de cinco días de tiempo (con requisitos laborales importantes en un solo día), pero produce extracto crudo de 3.000 reacciones y el tampón de decisiones reactivos para 10.000 reacciones (Figura 1). Por otra parte, el extracto crudo y amortiguan de decisiones reactivos son estables durante al menos 1 año a -80 ° C, lo que permite múltiples usos de una preparación de 4. A $ 0,11 por 10 l de reacción (0,26 dólares incluyendo mano de obra), los costos son 98% más bajo que comparables sistemas comerciales (Figura 2).\nHay algunas limitaciones sin resolver, sin embargo, para el sistema. La eficiencia final de cada preparación de extracto celular crudo puede variar en función de la aptitud del usuario y de las condiciones ambientales, aunque tla variación del rendimiento RUEBAS es entre 5-10% (Figura 4b). Como resultado, la variabilidad de lote a lote en tanto la expresión de punto final y en la dinámica de la expresión son de esperar. Estas variaciones probablemente se mantendrá hasta que el extracto está completamente caracterizado, o hasta que la creación de extracto está totalmente automatizado. Si el sistema de expresión libre de células se utiliza para llevar a cabo experimentos cuantitativos sensibles, es aconsejable ejecutar todos los experimentos con el mismo lote de extracto celular crudo. El rendimiento de un solo lote extracto celular crudo, unos 3.000 reacciones, debe ser suficiente para los cursos típicas experimentales. Aunque sospechamos variación puede ser removido por la ampliación y la automatización del procedimiento, tales intentos implicarían una inversión sustancial de recursos.\nAdemás, si bien los niveles de punto final de expresión son razonablemente fáciles de determinar, aún queda trabajo por hacer en la dinámica de la comprensión intrínsecas al sistema libre de células. Se sabe que tanto COMPETENCIA recursosn de recursos y limitación puede afectar la dinámica de expresión. Por ejemplo, limitada Sigma endógeno 70 puede dar lugar a un régimen de saturar con el aumento de la plantilla de ADN que produce un perfil de expresión análoga a la de nucleótidos o aminoácidos agotamiento. 9,27 Sin embargo, la dinámica no tienen que ser entendidos completamente para utilizar el sistema. Para los aumentos puros de rendimiento, optimización se puede hacer mediante métodos de aprendizaje automático. 28 Cuestiones de competencia por los recursos y la limitación pueden ser abordadas por los modelos matemáticos verificó utilizando datos experimentales.\nEl protocolo que se presenta aquí está optimizado para una cepa BL21-Rosetta2, pero es generalizable a otras E. cepas de E. coli. Modificaciones en BL21-Rosetta2, tales como la eliminación del gen que codifica la proteasa lon y la adición de genes que codifican los ARNt raros, permiten para la producción máxima de proteínas. Hemos tratado el protocolo con otras dos cepas de extracto - sólo BL21 y un golpe de gracia-una BL21 trxAd encontraron 50% menos de producción de proteína. Nuestra hipótesis es que los rendimientos disminuyen de manera similar cuando se utilizan otras cepas. Otros cambios en los parámetros, tales como la conmutación de medio de crecimiento 2xYT para LB y otros caldos ricos, han dado lugar a la producción de proteína disminuido.\nSistemas de expresión sin células utilizando tanto la maquinaria de transcripción-traducción endógeno y exógeno y los mecanismos de regulación tienen amplias aplicaciones en proteínas y expresión metabolito y de la biología sintética. 3,29 En vez de estar limitado a los circuitos T7-regulada, se puede imaginar la producción de biomoléculas complejas en un entorno controlable por el usuario usando una mezcla de E. nativa promotores coli y mecanismos de transcripción y regulación suministrados exógenamente. Sin limitaciones de la división celular y el metabolismo, la variabilidad en los circuitos sintéticos tales como el Represilador o en las vías metabólicas de ingeniería tales como los que producen artemisinina se puede reducir o mejor entendida. 30,31 Have utilizado estas ventajas para implementar interruptores genéticos, así como para entender sigma factor de secuestro de 9,32 Dicha tecnología también puede formar la columna vertebral de la "mínima" o células "artificiales" -. pequeño, bien caracterizado y unidades encarnados autosuficientes de extracto de 33,34.\nEn última instancia, esperamos usos inmediatos de este sistema de expresión libre de células endógenas como un entorno de creación de prototipos para la biología sintética. Apodado el "TX-TL breadboard biomolecular", el sistema de expresión libre de células proporciona un entorno controlable donde los circuitos sintéticos cuyo destino final es la expresión in vivo pueden someterse a rondas de prototipos - ciclos de pruebas en el plásmido básico, lineal, o ADN sintetizado químicamente, seguido por el análisis y la modificación rápida. Rondas prototipos pueden ser ayudados por los modelos matemáticos predictivos que se están desarrollando actualmente. Mediante la eliminación de la clonación y la manipulación en vivo para circuitos no finales, anticipamos ingenieríatiempos de ciclo niería para ser reducidos a 1-3 días en lugar de los estándar actuales semana.\nAgradecemos Jongmin Kim, Dan Siegal-Gaskins, Anu Thubagere, y Enoc Yeung asistencia racionalización del protocolo, y Clare Chen y Lee Barclay para la ayuda en las primeras etapas del proyecto. Este material está basado en trabajo apoyado en parte por la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa (DARPA / MTO) Programa Living Fundiciones, número de contrato HR0011-12-C-0065 (DARPA / CMO.ZZS está también apoyado por un Científico Médico UCLA / Caltech Programa de becas de formación y de un Departamento de Defensa, la Fuerza Aérea Oficina de Investigación Científica, Defensa Nacional de Ciencia e Ingeniería de Posgrado (NDSEG) Fellowship, 32 CFR 168. Las opiniones y conclusiones contenidas en este documento son las de los autores y no debe interpretarse como la representación de oficialmente las políticas, ya sea expresa o implícita, de la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa o el Gobierno de los EE.UU..


🍕 Cómo controlar la Smart TV desde el móvil - Mando a distancia\nSimplemente, desenchufa el Apple TV de la corriente y luego vuelve a enchufarlo. Si tienes un Apple TV sin configurar todavía, conecta el Apple TV al router wifi con un cable Ethernet.\n04/04/2020 Antes de que puedas usar un control basado en red para sistemas de control del hogar con Apple TV, primero debes agregar el control remoto a la app Casa en un dispositivo iOS o iPadOS.\nDescargar control remoto para tv lg sin wifi\nTo connect an older TV to the internet, you can use a dedicated streaming device, HDMI cable ✔ Google Assistant voice control. ✔ Works seamlessly with Apple ecosystem. For Amazon Fire TV Sticks and Google Chromecasts, you’ll have to purchase an adapter Controlling an iOS device remotely is difficult to do, as Apple has chosen not to support this functionality. Below are some of the options you have to remotely control your device, as well as instructions on how to do so.\nperfectamente tu Apple TV sin tener su control remoto a mano. La primera opción es usar la aplicación Apple TV Remote disponible en la App Store. de que esté conectado a la misma red Wi-Fi que tu Apple TV, ya que si no es Se trata de una propia función de mando dentro del centro de control Pulsa el botón menú del Siri Remote (control remoto del Apple TV). en cualquier momento sin necesidad de tener conexión a internet. Formas de controlar el Apple TV sin mando a distancia — Utiliza la aplicación Apple TV Remote en en la misma red Wi-Fi, puedes usar la aplicación para controlar tu Apple TV. como el touchpad del mando a distancia.\nCon el Siri Remote tendrás el control absoluto de tu Apple TV 4K y tu Apple TV HD. 1 Usa tu voz para decirle a Siri lo que quieres ver o la superficie Touch para interactuar con tu Apple TV de manera rápida y fácil. Como el Apple TV se conecta a un solo control remoto a la vez, necesitarás un control o un dispositivo iOS para disfrutar de juegos multijugador. En el teléfono, descarga la app de Control remoto de Android TV desde Play Store. Conecta tu teléfono y Android TV a la misma red Wi-Fi. En el teléfono, abre la app de Control remoto de Android TV .\nSeleccioná [red / configuracion de red] y pulsá “OK” en el mando a distancia. Seleccioná [Tipo de red] y pulsá las teclas de flecha del mando a distancia para seleccionar “Dispositivo inalámbrico”. How to Program Universal Tv Remote Without CodingProgramar Televisor Tv Con Control Remoto Universal Sin CodigosComo Programar Control Remoto Universal de Tv 02/08/2020 Sin embargo, la aplicación está específicamente diseñada para ser usada con Apple TV. La belleza de esta aplicación recae en su funcionalidad la cual permite transmitir basado en el sistema operativo de Android y también cualquier contenido que esté almacenado en la red local a tu Apple TV. Ésta también convierte su dispositivo Android en un control remoto todo en uno. 18/03/2021 Sin Apple TV: Se puede “reflejar” también lo que se hace en el iPad u otra tablet a través del ordenador de aula, instalando algún escritorio remoto como TeamViewer. Quienes trabajan en centros con Linux/Vitalinux tendrán instalado en su lugar AnyDesk, que funciona igual y apenas tiene retardo.En cualquiera de los dos casos el procedimiento es el mismo: se descarga la aplicación de 28/01/2020 En este texto podrás aprender a configurar Roku Stick sin control, y ya podrás empezar a despreocuparte por no tener cómo controlarlo de forma remota.\n¿Cómo instalar una antena de uso externo? ¿Cómo configurar el control remoto de Claro TV? Aprende con nosotros a conectar tu portátil a tu TV con un cable HDMI, un Esta solución es sin duda la más práctica y económica de todas, de Western Digital, el Streaming Stick de Roku o incluso el Apple TV. También con el control remoto, localiza el archivo que quieras reproducir y dale al play. En este sentido, le mostraremos algunos consejos sobre cómo conectar el dispositivo Roku a una red Wi-Fi sin el control remoto Roku. Instalación de la Sin embargo, si elige la mejor aplicación de control remoto para sus La aplicación Android TV Remote Control es un producto oficial de Google. controlar cualquier dispositivo Android TV que esté en la misma red Wi-Fi que su 4) y dispositivos de transmisión como Apple TV, Nvidia Shield y Roku.


Openbank oficinas y cajeros: operativa y horarios | Rastreator\nOpenbank oficinas y cajeros: operativa y horarios\nOpenbank es un banco online, por lo que su red de oficinas y cajeros es muy limitada\nEn la red de oficinas de Santander es posible realizar algunas gestiones\nEs posible retirar dinero en cualquier cajero de la red de Banco Santander\nOpenbank no es un banco tradicional al uso. Esta entidad es un modelo de banca a distancia que ofrece productos y servicios muy competitivos a través de los canales digitales y telemáticos.\nPor este motivo, la red de oficinas y cajeros de Openbank es bastante limitada.\nSin embargo, esto no debe asustarnos. Una de las grandes ventajas de esta banca online es que pertenece al Grupo Santander. Gracias a esto, los clientes de Openbank tendrán a su disposición toda la red de oficinas y cajeros de Santander.\nEn este artículo te contamos cómo puedes localizar estas oficinas y cajeros y cuáles son los trámites que puedes llevar a cabo en ellos.\nAunque la vía más habitual para operar en una banca online como Openbank es el portal digital, los clientes de esta entidad también pueden hacer uso de las oficinas físicas en algunos casos.\nEn concreto, los clientes de Openbank tendrán a su disposición las oficinas centrales de la entidad, situadas en el Paseo de la Castellana, nº 134 de Madrid. Para acudir a esta oficina es obligatorio solicitar cita previa, más aún durante la pandemia del Covid-19.\nLos interesados en acudir deberán solicitar su cita llamando al número de teléfono 913 421 000.\nAdemás, recientemente, esta entidad ha abierto una nueva sucursal llamada Openbank Corner y situada en la Plaza de Santa Bárbara, nº 2 de Madrid. Para solicitar cita previa, los clientes deberán contactar con el mismo número de teléfono.\nAdemás, los clientes de Openbank tienen a su disposición toda la red de oficinas de Santander, compuesta por casi 2.000 sucursales. En estas oficinas los clientes pueden realizar operaciones como:\nEl resto de operaciones deberán llevarlas a cabo a través de la Banca Online o la App de Openbank, dado que se trata de una banca digital.\nAsimismo, los clientes de Openbank también podrán hacer uso de las oficinas que Santander tiene en terceros países.\nDel mismo modo que ocurre con las oficinas, los clientes de Openbank podrán operar a través de la red de cajeros de Santander. Esta entidad tiene más de 30.000 cajeros repartidos por todo el mundo donde los clientes pueden operar de manera gratuita.\nEn concreto, todas aquellas personas que sean titulares de una cuenta de Openbank tendrán a su disposición unos 7.000 cajeros automáticos en España.\nEn esta red de cajeros, los clientes de Openbank podrán:\nRetirar efectivo (máximo 600€ por operación)\nIngresar efectivo (máximo 40 billetes)\nConsultar el saldo y movimientos de sus cuentas y tarjetas Openbank\nBuscador de oficinas Openbank\nLos clientes que necesiten un cajero en el que ingresar o retirar dinero en efectivo podrán consultar, a través de internet, cuál es el más cercano a su ubicación.\nPara hacer uso de esta herramienta de búsqueda deberán entrar en la página web de la entidad y pulsar en la opción “Cajeros”, que encontrarán arriba a la derecha.\nA continuación deberán introducir la localidad o Código Postal en el que se encuentran y la aplicación le mostrará, automáticamente, los cajeros más cercanos.


Tania Baides —Atelier • La nit de l'art 2018\nLa nit de l'art 2018\nUn año más la asociación de galerías ART PALMA CONTEMPORANI reunió a todos los profesionales del sector del arte en la Isla. También, a muchos visitantes del resto de España y Europa que no quisieron perderse la cita: comisarios, artistas, galeristas, directores de prestigiosas ferias y coleccionistas. En Tania Baides Atelier tuvimos la suerte de acompañarles en la coordinación, comunicación y relaciones públicas de la cita más emblemática de la asociación (y una de las más importantes de la ciudad de Palma): La Nit de l’Art.\nPalma de Mallorca, septiembre 2018\nUNA NIT DE L’ART CON ESPÍRITU PROFESIONAL, PLURAL E INTERNACIONAL\nLa pasada edición de la Nit de L’Art tuvo como objetivo mantener su espíritu profesional, plural e internacional, y se consiguió una vez más con una completísima agenda que ayudamos a coordinar y comunicar.\nOrganizamos junto a Art Palma una mesa redonda sobre la figura del comisario que reunió a cinco profesionales internacionales ligados a la enseñanza, la teoría del arte y a instituciones y centros privados: Miguel von Hafe, Jonathan Watkins, Jean François Chougnet, Michael Ashbury y Ulrich Loock.\nAdemás, se diseñaron tours en castellano, catalán e inglés por las galerías de Art Palma y por primera vez completaron aforo y abrieron una lista de espera que culminó en la web de Introart.\nPara terminar una semana llena de actividades celebramos un cóctel privado y profesional en Can Balaguer. El color de la edición 2018 fue el Pantone 1925, así que la iluminación, el montaje audiovisual, los arreglos florales e incluso los postres brillaron en pinky red.\nEN TANIA BAIDES ATELIER FUIMOS LA PRIMERA AGENCIA DE COMUNICACIÓN CON LA QUE HA CONTADO ART PALMA CONTEMPORANI\nSer la primera agencia de comunicación con la que ha contado Art Contemporani para la coordinación, comunicación y relaciones públicas de su evento más importante ha sido un honor y un reto a partes iguales.\nCoordinamos a galerías y espacios públicos participantes, a colaboradores y sponsors, gestionamos las peticiones y entrevistas con medios de comunicación, activamos los canales de social media, y coordinamos el programa VIP de actividades.\nCoordinación, comunicación y relaciones públicas de la Nit de l’Art, en colaboración con Art Palma\nMantener el espíritu profesional, plural e internacional que caracteriza a La Nit de l’Art a través de la programación de actividades y la comunicación\nVideo: Guillem Sastre


Hola.. tengo una macbook air version 10.8.5 y la quiero\nFormule su propia pregunta a RICARDO PEREZ\nRICARDO PEREZ, Ingeniero informático\nExperiencia: IT Consultant\nRICARDO PEREZ está en línea ahora\nhola.. tengo una macbook air version 10.8.5 y la quiero actualizar a una version superior como hago ? no se id ni contrasena.. me la regalaron.. la trajeron de EEUU\nCustomer: creo le borraron todo antes de darmela.\nCustomer: no se que modelo es dice osx version 10.8.5 procesador 1,8 memoria 4 gb 1600 mhz disco de arranque macintosf hd\nCustomer: 13 pulgadas mediados 2012\nExperto: RICARDO PEREZ escribió hace 2 años.\nGracias por utilizar JustAnswer le atiende Ricardo, permítame y reviso su caso, si tiene algunos conocimientos informáticos puede guiarlo hacerlo por fuera, si así desea\nRICARDO PEREZ y otros otros especialistas en Informática están preparados para ayudarle\nmucho no entiendo.. ustedes pueden recuperar datos que me solicita icloud como correo electronico e id\npara hacer descargas de appstore me pide informacion que no tengo\nid de apple y contrasena necesito\nnecesito actualizar mi macbook air a una version mas actual\nEstimado irmenido a justanswer me llamo Juan es Si se puede actualizar algo a esa versión . Por ahora estoy en mi trabajo y salgo en 3 horas me esperas?\nPero si requieres contraseña . Debes de desbloquear primero y debe ser del que te la regalo para poder actualizarla si. Os pondré el ID y eso es personal . Además creo que alcanza una versión no tan moderna por el año ybpir la capacidad del disco y su sistema electrónico.\nSi llamas a apple será igual debes d etener\nId que no lo tenemos\nContraseña no lo tenemos\nOtra sería un hard reset pero lo veo complicado desde acá . Porque debe ser allí mismo en el lugar y quizás al reiniciar solicite el Id . Si está algo complicado\nel informatico nunca mas me con testo .. que paso ? resolvio el problema ?\nbuenos días , no es porque no había llegado a casa después de mi trabajo normal. pero aquí estoy. es sumamente conocer el ID anterior o que lo quite el antiguo dueño . ya que es una apple , no android ni windows, que son mas fáciles de descargar aplicaciones y actualizaciones,\ny le recuerdo que aun no ha realizado evaluación alguna , por lo que su deposito esta aun seguro, por si cambia de opinión.\nSi pudiera solicitar su ID asu antiguo dueño seria super sencillo descargar actualizaciones,\nno puedo enviar acceso remoto, solicite al ing. RICARDO PEREZ. por error mio desde mi celular he respondido\nExperto: Alvaro Hervas Barran escribió hace 2 años.\nBuenas tardes, soy Álvaro, técnico de JustAnswer.\nSi lo desea podemos crear un nuevo Apple ID para utilizarlo con el sistema de actualizaciones de Apple.


Club Deportivo Comfenalco, rey de reyes en el fútbol de Bolívar | Comfenalco futbol de bolivar | EL UNIVERSAL - Cartagena\nClub Deportivo Comfenalco, rey de reyes en el fútbol de Bolívar\nEl Club Deportivo Comfenalco fue el rey de reyes en la disciplina del fútbol en Bolívar. En la gráfica, los campeones de la categoría sub 12. // Zenia Valdelamar/El Universal\nSiempre han dado un buen ejemplo en el plano deportivo, pues en la mayoría de las disciplinas son figura, alcanzan sus metas y suelen, la mayoría de las veces, abrazarse con la gloria.\nComfenalco toda la vida ha sido reconocido por sus logros en el deporte, esos que hacen de este club deportivo una gran potencia en la Costa y también en el país.\nEl fútbol no podía ser la excepción de los triunfos del Club Deportivo Comfenalco. El éxito en el pasado Torneo Departamental así lo confirma. Cuatro títulos y un subtítulo obtenidos en cinco finales lo muestran como el de más victorias en este certamen del balompié bolivarense.\nNiños y jóvenes dieron la vuelta olímpica en cada uno de los escenarios en donde se llevaron a cabo las finales del torneo de la Liga. Fue un año fabuloso para ellos, de ensueño y eso es fruto de un trabajo serio y bien planificado.\nLos títulos fueron conquistados en la sub 9, sub 12, junior y pre juvenil, mientras que el subcampeonato se dio en la infantil.\nEn las otras dos categorías en donde participó -fueron 7 en total- el Club Deportivo Comfenalco llevó a sus equipos a jugar semifinal, lo que también da muestras de progreso, de gran protagonismo.\nPara Henry Calderón, coordinador del programa de fútbol en el Club Deportivo Comfenalco, “la campaña fue extraordinaria, los equipos mostraron una identidad futbolística basada en la circulación del balón, superioridad numérica en ataque y mucho orden defensivo. Eso hace que los títulos se disfruten con mayor satisfacción”.\nEn la categoría sub 9, el Club Deportivo Comfenalco le ganó en la final a la Academia de Crespo con marcador de 3 a 2. Los goles fueron marcados por Jhon Mélendez Murillo en dos ocasiones y José Daniel Camargo.\nEn la sub 12 le ganó al Club Alameda la Victoria 4-0 con goles de Franklin Navarro (2), Jurgen Eiliting y Juan Diego Lobos.\nEn la categoría junior, después de un espectacular partido ante el Expreso Rojo, el título fue ganado por la vía de los penales (el juego quedó 1-1 cumplido los dos tiempos).\nEn prejuvenil, ante el mismo Expreso Rojo, el Club Deportivo Comfenalco, ganó la serie final 3-2 con tantos de Sergio Cantillo, Danilo de las Aguas y David San Juan.\nHenry, la cabeza visible del grupo de entrenadores del Club Deportivo Comfenalco, afirmó que “los triunfos que se dan son gracias a un trabajo serio y planificado. Aquí todo se da como consecuencia a algo que se aplica, que se trabaja”.\nCalderón afirma que se cuenta con todas las herramientas necesarias y para esto ha sido vital el respaldo de Napoleón De La Rosa, Subdirector de Servicios Sociales y Unidades de Negocio, quien brinda todas las garantías para que cada uno de los integrantes de los equipos tengan todo a la mano.\n“Tenemos canchas, gimnasio, implementación, vitaminas y una población estudiantil bastante grande en donde encontramos muchos talentos”, sostuvo Calderón.\nDestacó el trabajo de los entrenadores que están con él en este gran proceso formativo con los jugadores de este club.\n“Hay un gran grupo de licenciados como Antonio Miranda Núñez, Juan Carlos Payares, Ángel Salinas Cassiani, Héctor Bustillo Tinoco y Carlos Díaz que han acompañado este proyecto que ha venido dando buenos resultados locales y nacionales”, agregó Calderón.\nSobre su grupo de trabajo destacó que “todos son profesionales que están en permanente capacitación, nos reunimos todas las semanas a intercambiar ideas y conceptos con la idea de que ayuden a nuestra filosofía de juego en cada una de las categorías. Con este grupo siento respaldo, química y armonía en nuestro interés de salir adelante”, puntualizó.\nEn el año 2012, Comfenalco también se ganó el Torneo Asefal en la categoría 1999, el Torneo Nacional en Bucaramanga con los nacidos en 1997 y consiguió el campeonato nacional intercolegiado en la categoría infantil,\nJosé Reyes, Mateo Orozco, David Díaz, David San Juan, Romario Franco, Andrés Fortich, Sergio Castillo, Gerónimo Acosta, Joel Quiroz, Dionatan Montes, Alberto Orozco, Brandon Castro, Carlos Mario Polo, Kevin Pérez, Kevin Fauceth, Carlos Uribe, Luis Bedoya, Camilo Gonzalez, Brayan Martínez.\nEdwin Ballestas, José David Altamar, Heyner Pautt, Franciso Hurtado, Jhon Wilmar Díaz, Héctor Bustillo, Duván Ballestas, Juan Camilo Coneo, Omar Berrío, Alberto Pardo, Stwar Valdez, Danilo de las Aguas, Sergio Cantillo, Mario Bonilla.\nJhon Erik Cubilla, Libardo Guitiva, César Pineda, Carlos Urango, Luis Sarabia, Juergen Elitin, Francisco Cano, Zaid Díaz, Cleobis Castro, Víctor Pérez, Jossep Santoya, Frank Navarro, Juan Lobo y Juan Jiménez.\nJulián Martínez, Geison Fuentes, Diego Isaza, Neicer Torres, Juan Diego Cuesta, Moisés Valle, Esteban Elles, Cristian Gutiérrez, Elson Becerra, Juan Manuel Olarte, Omar Pastrana, José Daniel Camargo, Wilson Vergara, Hernando Aumedo, Willy Miranda y Jhon Meléndez.\nTorneo Liga de Fútbol de Bolívar 2011\nDeportes - Comfenalco\nIndio_mayeyo comentó el Mar, 03/20/2012 - 21:58\nHey no sean rosquerosssss,\nHey no sean rosquerosssss, pongan también los nombres de la infantil. La única categoría que no ganó final y que perdió con Alameda La Victoria.\nAngelical comentó el Mié, 03/21/2012 - 09:41\nno sean rosqueros, pongan\nno sean rosqueros, pongan tambien los escandalos que arman en los campos, peleas, piedras, botellas, mamas y papas jartando ron, buscandole camorras a las otras escuelas, UNIVERSAL investiguen bien antes de sacar una nota de estas, que verguenza, el deportista debe ser integral, señores comfenalco, de la rosa, investigue y no se sentira tan orgulloso , investigue y se dara cuenta realmente de lo que tiene. debiera darle verguenza...\njeremias comentó el Mié, 03/21/2012 - 11:36\nNo desconozco el buen trabajo\nNo desconozco el buen trabajo que se hace en esta escuela, pero también hay que decir lo malo y no me parece ético enseñarle a un jugador a ser tramposo, ejemplo en algunas categorías colocan jugadores pasados de edad, ojala la Liga de Bolívar fuera eficiente en este sentido e hiciera cumplir la ley, claro que esto no sucede solo en Comfenalco, son otros los equipos en donde acuden a este tipo de tretas.\nashlyn comentó el Vie, 03/30/2012 - 10:27\nrey de reyes muy bien\nrey de reyes muy bien puesto, tres veces campeones de la liga, jugadores pasado de donde comfenalco no; unos muchachos muy educados no son problematicos lo que susede es que hay equipos que cuando van perdiendo los padres se toman a pecho la derrota en chanbacu un muchacho de expreso rojo de la 97 agarro un piedra a pegarle a un jugador de camfenalco siempre es lo mismo; juego limpio por favor señores


Arriba de Mejor Cubiertos Bebe - Comentarios y guía del comprador\nArriba de Mejor Cubiertos Bebe Guía del comprador (Actualización 2020)\nInicio » Lactancia y alimentación »\nNuestro objetivo era hacer una guía completa de compra de cubiertos bebe para principiantes, por lo que hemos realizado una investigación extensa y hemos comparado cientos de cubiertos bebe diferentes. Se consideraron factores como el precio, el número de revisiones, la calidad del montaje y el material, así como muchos otros detalles. Si cree que nuestra lista puede mejorarse, contáctenos por correo electrónico y consideraremos sus sugerencias.\nEn este sitio web, puedes encontrar la lista de los mejores cubiertos bebe. Si encuentra algo que le guste, puede solicitarlo de inmediato en el mercado. Su cubiertos bebe será entregado directamente a su puerta!\nClasificando Los 8 Mejores Cubiertos Bebe of 2019\nLehoo Castle Cubiertos de dinosaurio 6 piezas\nO Cucharas Silicona Bebe\nCucharas Siliconas Bebé\n¡Advertencia! ¡No compre ningún cubiertos bebe hasta que lea esto! Haga clic para leer.\nResultados de la prueba y comparaciones para obtener el mejor Cubiertos Bebe\n1. Lehoo Castle Cubiertos de dinosaurio 6 piezas\nFinamente hecho con un gracioso mango de dinosaurio desgin, cómodo para sus niños pequeños.\nLos mangos redondeados han sido diseñados para que recoger los alimentos sea más fácil.\nEl mango largo permite llegar fácilmente hasta el fondo de los frascos.\n4. Munchkin (Excelentes políticas de garantía)\nSu diseño ergonómico se adapta a las manos de los bebés.\n5. O Cucharas Silicona Bebe\n6. Suavinex (Más elegante)\nSus extremos suaves y flexibles están pensada para las encías sensibles, mientras que su textura antideslizante ayuda a evitar que se caiga, si es el bebé quien come solito, facilitando su uso.\nPerfecto para la autoalimentación, a diferencia de otras cucharas para bebés, nuestra cuchara de entrenamiento es un alambre de acero dentro del mango de tpe, suave, fácil de agarrar, puede doblarse a los diversos ángulos, y la diversión del bebé es aprender a comer de forma independiente.\n8. Cucharas Siliconas Bebé\nEntonces vamos a hablar de 3 mejor Cubiertos Bebe of 2019\n№ 1. Lehoo Castle Cubiertos de dinosaurio 6 piezas, Cucharas Y Tenedores Para Niños, Juego De Cubiertos Para Niños Pequeños, Set De Cuchillos Y Tenedores Para Niños, Cuchillo De Acero Inoxidable Para Niños\nDiseÑado para sus hijos: finamente hecho con un gracioso mango de dinosaurio desgin, cómodo para sus niños pequeños. El tamaño de este utensilio para niños pequeños se encuentra con la boca de su niño pequeño. Tenedor con dientes redondeados y cuchillo con hoja no dentada. Grado de alimentos 100% acero inoxidable: los padres pueden estar tranquilos sabiendo que los utensilios para bebés son seguros y no contienen bpa, plomo, látex ni ftalatos. Acero inoxidable 18/0 de alto grado, grosor de 1.2 mm y pulido espejo. Nuestra garantÍa: compre con confianza, el juego de utensilios de lehoo castle está respaldado por una garantía de 1 año. Nunca te arrepentirás de tener los utensilios para niños de lehoo castle.\nRegalo para niÑos ideal: presentado en una caja elegante, ideal para el uso diario y también un gran regalo para su hijo. RecomendaciÓn: recomendamos lavarse las manos para cuidar los cubiertos. Para obtener los mejores resultados, no deje el conjunto en remojo durante un largo período de tiempo. Seque rápidamente después de limpiar.\nGrado de alimentos 100% acero inoxidable\nRegalo para niÑos ideal\nDiseÑado para sus hijos\n¿El bien cubiertos bebe requiere una garantía de por vida?\nCada fabricante ofrece varios términos de garantía. Algunas compañías venden cubiertos bebe con una garantía de por vida, mientras que otras solo ofrecen una protección de uno o dos años. Los modelos más baratos por lo general no tienen ninguna garantía en absoluto. Creemos que la garantía de cinco años es más que suficiente para la mayoría cubiertos bebe.\n№ 2. Munchkin, Set De 3 Tenedores Y 3 Cucharas, Surtido De Colores\nLos mangos redondeados han sido diseñados para que recoger los alimentos sea más fácil. Los colores y la colección enviados pueden variar. Paquete de 3 tenedores y cucharas diseñados para que el niño aprenda a comer solo. Los tenedores redondeados son seguros y han sido diseñados para ayudar a que el niño aprenda a usar los cubiertos. Las cucharas hondas tienen mayor capacidad y facilitan recoger los alimentos.\nLos tenedores redondeados son seguros\nLas cucharas hondas tienen mayor capacidad\nLos mangos redondeados han sido diseñados para\n№ 3. Munchkin, Pack De 4 Cucharas\nEl cuenco de la cuchara, redondeado y blando, es suave para las encías. El mango largo permite llegar fácilmente hasta el fondo de los frascos. Sistema patentado white hot – la punta de la cuchara se convierte blanca cuando la comida del bebé está demasiado caliente. Asa de diseño ergonómico que es cómoda al sujetarla. Libre de bpa, apto para el lavavajillas, para más de 3 meses.\nEl mango largo permite llegar fácilmente\nSistema patentado white hot\n¿Qué necesito verificar antes de elegir un cubiertos bebe?\nGracias a Amazon, no tienes que preocuparte por nada. ¡Elegir un cubiertos bebe en este sitio es muy simple! Puedes comprobar las fotografías. lea la descripción detallada de cualquier cubiertos bebe específico y lea varias opiniones de usuarios. ¡Aprende de la experiencia de otras personas!\n№ 4. Munchkin, Tenedores Y Cucharas Raise, Morado Rosa, Pack De 4\nLos cubiertos atrapan los alimentos con facilidad. Incluye: tenedores y cucharas, sin bpa, aptos para la bandeja superior del lavavajillas. Su diseño ergonómico se adapta a las manos de los bebés. La base mantiene las puntas de los cubiertos alejadas de las superficies y los gérmenes.\nSu diseño ergonómico se adapta\nLa base mantiene las puntas\nLos cubiertos atrapan los alimentos\n¿Qué consideraste exactamente al hacer la lista de las mejores cubiertos bebe?\nPara crear esta guía de compra, nuestro equipo tuvo que pasar por cientos de comentarios de usuarios y comparar docenas de modelos y marcas cubiertos bebe. Encontrar el mejor cubiertos bebe hoy en día es una tarea difícil: la selección en el mercado es tan alta que tendría que pasar meses para estudiar todas las opciones disponibles. Afortunadamente, nuestra lista de TOP-10 te ayudará a encontrar un buen cubiertos bebe mucho más rápido.\n№ 5. O Cucharas Silicona Bebe 6 Uds (4 Cucharas + 2 Tenedores), 2 Versiones, Cucharas Sensibles Al Calor, Cucharas Silicona Bebé Cambian Color A Más De 40 C, Sin Bpa Aptas Para Lavavajillas (azul)\n, satisfacciÓn garantizada – satisfecho o rembolsado – garantÍa de por vida. Si tienes algunas preguntas, contáctanos por amazon, respondemos a todos mensajes dentro de 24 horas. , mamÁs y papas, un detalle menos para preocuparse. Cucharas sensibles al calor se convierten blancas si la temperatura de la comida es más de 40 grados. ahora es mucho más fácil asegurarse que la comida está lista para tu niño. El set contiene 4 cucharas y 2 tenedores, todos sensibles a calor. Viene en dos versiones de colores escoge la tuya. La vajilla es apta para lavar en lavavajillas. Las cucharas son seguras para bebé, sin bpa y ftalato.\n, accesorio indispensable de cada bebÉ – nuestras cucharas silicona bebe son un must-have en casa de cada peque. El set viene en buena caja así que puede servir como un regalo. , con buenas herramientas tu bebe come mÁs fÁcil cucharas y tenedores vienen en colores vivos, así que el niño les da mucho interés y puede comer su porción más fácil y contento.\nEl set contiene 4 cucharas\n№ 6. Suavinex, Set Cuchara + Tenedor + Estuche Booo. Cubiertos Infantiles Para Encías Sensibles. Para Bebés +12 Meses, Color Verde\nSus extremos suaves y flexibles están pensada para las encías sensibles, mientras que su textura antideslizante ayuda a evitar que se caiga, si es el bebé quien come solito, facilitando su uso. Cubiertos de gran ayuda para iniciar el tránsito de la alimentación con biberón al plato. Disponibles en color azul, verde, rosa o lila.\nSus extremos suaves\n№ 7. Qshare, Utensilios Para Bebés, Cucharas Con Estuche De Viaje Seguro, Cuchara De Entrenamiento Para Niños Pequeños Con Agarre Fácil Y Función Flexible\nEstuche de viaje portátil y limpio, bonus es conveniente para llevar la cuchara al salir, asegura que no importa donde sea, los utensilios de su bebé quedarán increíblemente limpios. Perfecto para la autoalimentación, a diferencia de otras cucharas para bebés, nuestra cuchara de entrenamiento es un alambre de acero dentro del mango de tpe, suave, fácil de agarrar, puede doblarse a los diversos ángulos, y la diversión del bebé es aprender a comer de forma independiente. Hold sujeción fácil, el mango ancho y ergonómico de los cubiertos está cubierto por el pegamento suave tpe, diseñado específicamente para adaptarse a las diminutas manos de su bebé y al agarre en desarrollo.\nFácil de lavar, antes y después de usar, limpie. Esterilizado y colocado en agua hirviendo durante 1-2 minutos. En el curso si se encuentra fenómeno roto, por favor reemplazarlo. Safe material, round shape design of spoon without burrs, protects baby’s delicate gums and teeth.\nHold sujeción fácil\n№ 8. Cucharas Siliconas Bebé, Cucharas Siliconas Suaves Cucharillas De Bebé, Cuchillerías A Niños Apartir De 4 Meses Set De Cucharas De 4 Unidades De Yoofoss\nSon pequeños y convenientes las cucharas de bebé, cuenta con 4 cucharas en el paquete, no recomendamos lavarlas en lavavajilla. Estas cucharas silicona atractivo y brillante colore, es más fácil a atraer la atención del bebé. Para los padres, el cuenco de las cucharas, redondeado y blando, podrían usarla sin preocupación. Estas cucharas de bebé hecha de silicona suave, anti-caliente no tóxico e inofensivo, sin bpa, mantiene la salud de la boca de niño. Estas cucharas silicona de bebé se puede protejer la salud de las encías del bebé, mejorar el apetito del bebé.\nEstas cucharas silicona atractivo\nEstas cucharas silicona\n¿Qué factores consideraste al hacer la lista TOP-10 de los mejores cubiertos bebe?\nDurante la creación de esta guía de compra, tuvimos que mirar a través de cientos de cubiertos bebe. Nuestro equipo comparó muchos productos de varias marcas para encontrar el modelo más óptimo con la mejor relación precio / calidad. El objetivo era determinar cubiertos bebe que ofrecen el mayor valor por su dinero, y creemos que lo hemos logrado.\nNo es necesario que se preocupe, ya que el equipo de soporte en Amazon lo ayudará a devolver su dinero o reemplazar el artículo equivocado con el cubiertos bebe elegido. 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El de Pinto sabe que ha llegado su turno, inspeccionado incluso todas las llegadas en alto de la Vuelta\nLejos de los flashes de los fotógrafos y de las cámaras de televisión, que en el último mes sólo han tenido al Tour, a Wiggins y a sus rivales en el punto de mira, Alberto Contador ha hecho los deberes y ya se muestra en condiciones de volver a competir.\nEl campeón de Pinto ha preparado a conciencia su regreso a la competición, que ya está a punto de producirse. Su forma es buena, su ambición voraz y su profesionalidad, como lo demuestra el hecho de que ha visto todas las llegadas en alto de la próxima edición de la Vuelta, infinita.\nComo ya hizo con el Giro, Contador ha seguido el Tour por televisión para analizar en la distancia a sus rivales. Ha visto que Wiggins es vulnerable en la alta montaña, aunque habrá que contar con él si la edición del año próximo vuelve a tener muchos kilómetros contra el crono.\nHa visto que Evans está en la cuesta abajo y que, por el contrario, Froome y Nibali crecen. También que Van Garderen progresa adecuadamente y que los franceses, no sólo Voeckler, sino sobre todo Rolland y el joven Pinot, pueden dar mucha guerra en el corto y medio plazo. Finalmente, ha comprobado que, sin él, su equipo, el Saxo Bank-Tinkoff, pone voluntad, pero escasa fuerza.\nMientras todo esto sucedía en el Tour, él ha inspeccionado todas las llegadas en alto de la Vuelta a España, desde La Collada de la Gallina —la meta inédita en Andorra— a Valdezcaray, pasando por el Cuitu Negro y la Bola del Mundo. Jesús Hernández, su amigo y fiel compañero, le ha seguido en los reconocimientos.\nEl reconocimiento de las etapas de la próxima edición de la Vuelta le ha servido de entrenamiento, pero no se ha conformado con eso y tanto en la Sierra de Guadarrama, su lugar habitual de entrenamiento, como en Sierra Nevada, ha simulado etapas del Tour con más de 4.000 metros de desnivel.\nTanto ha imitado el Tour, que hasta sufrió una caída mientras se entrenaba en Sierra Nevada, sin consecuencias. Por cierto que en Sierra Nevada no dormía en altitud, como hacen muchos cuando se desplazan a la montaña granadina, sino abajo, ya que al madrileño no le gustan las concentraciones en altura, sino los entrenamientos.\nAhora, hecha la base a costa de muchas horas de bicicleta, sólo le queda afinar la forma. En ello está actualmente, aunque tampoco quiere precipitarse porque, si bien el gran objetivo es la Vuelta a España, quiere aguantar el pico de forma hasta el Campeonato del Mundo y el Giro de Lombardía.\nSu regreso a la competición está previsto para el 6 de agosto en el Eneco Tour, una carrera a caballo entre Holanda y Bélgica, donde finalizará el domingo 12. Sólo seis días más tarde, el 18, será de la salida en la Vuelta a España, que se pondrá en marcha en Pamplona. Coger la forma antes de esa fecha se antoja absurdo, por lo que su participación en la Clásica de San Sebastián, el 14, es una incógnita.\nEl Tour 2013\nLa Vuelta a España le puede permitir no pasar esta temporada en blanco, pero su venganza natural se producirá necesariamente en el Tour del año próximo.\nContador confía en que, como dicen los rumores, sea más duro que el de este año. Sabe que, para que se produzca un bonito duelo con Wiggins, los organizadores quizá mantengan el centenar largo de kilómetros contrarreloj, pero espera que, al menos, haya los finales en alto de siempre.\nEl Tour 2013 partirá de Córcega, pero de las tres etapas previstas en la isla, sólo una será para velocistas. De regreso a tierra firme, el Tour tendrá una contrarreloj por equipos en Niza. Si fuera hoy debería preocuparle, porque el Saxo Bank deja bastante que desear, pero Rijs le ha prometido reforzar la plantilla.\n“Lo único que puedo decir es que el Tour del año que viene será más propicio a los escaladores que éste”, dijo el domingo Christian Prudhomme. “Habrá más llegadas en alto”, anunció.\nCrédito Nota: Josu Garai


Just Cause 4 - Reseña\nEl mercado està saturado de juegos de mundo abierto. ¿Just Cause 4 ofrece algo que le permita resaltar entre todos ellos?\nDurante la era de PlayStation 2, era común ver a los jugadores de Grand Theft Auto ignorando las misiones para seguir la historia. Lo usual en las salas de alquiler de videojuegos y las reuniones de amigos era tener «todos los códigos activados» para adquirir todas las armas, invulnerabilidad y demás ventajas con las que destruir todo y sembrar el caos. Los juegos de Just Cause están creados con la misma filosofía que nos llevó a jugar de esa forma y Just Cause 4 trata de llevarla a su máxima expresión.\n¿Es esta clase de diversión suficiente para llenar un juego de mundo abierto? Vamos a averiguarlo.\nRico Rodriguez es un ex-operativo de una agencia secreta del gobierno estadounidense conocida como «La Agencia» (puntos por originalidad). A lo largo de tres juegos se ha vuelto un experto en derrocar gobernantes tiranos y ahora ha venido a hacer lo mismo a Sudamérica. Solís es una isla dominada por Óscar Espinosa, un malvado empresario que controla todo lo que ocurre en el país, incluso el clima, gracias a una serie de tecnologías llamadas ‘Proyecto Illapa’. Los habitantes del lugar se han cansado de esta situación y una rebelión ha comenzado bajo la guía de nuestro héroe.\nEl caos en Just Cause 4 no es simple diversión: es una mecánica de juego más. A medida que causamos destrucción, vamos llenando un medidor. Este hace que más gente se una a nuestro apropiadamente llamado «ejército del caos». Los escuadrones resultantes son usados para fortalecer el frente de combate y expandir nuestro control sobre el mapa. Esta es una forma bastante apropiada para reflejar nuestro avance en un género que usualmente recurre a las aburridas torres de radio para revelar el campo de juego.\nTenemos toda clase de herramientas para destruir tanto edificaciones como a los miembros de ‘La Mano Negra’, el ejército privado bajo control de Espinosa. Nuestro armamento incluye ametralladoras, lanzagranadas, lanzacohetes y hasta lanzarrayos. Podemos conducir toda clase de automóviles, lanchas, helicópteros y aviones, incluso armados con cañones y misiles. Si no tenemos a mano lo que queremos, solo tenemos que pedirlo por radio y nos llegará en cuestión de segundos.\nPero todo esto palidece en comparación con nuestro gancho, gracias al cual podemos salir disparados hacia cualquier superficie como si fuéramos Spider-Man. Esto, en combinación con nuestro paracaídas y traje aéreo, nos permitirá cubrir distancias increíbles y movernos con mucha libertad por los escenarios. También podemos equipar nuestro gancho con globos fulton, retractores y propulsores que podemos combinar de cualquier manera para que prácticamente cualquier objeto en el escenario cumpla nuestra voluntad.\nEsta libertad que tenemos para actuar contrasta con lo limitados que estamos para avanzar a través de las misiones. Aunque aparentemente tenemos la opción de elegir entre tres líneas de misiones principales, la forma en que estas se desbloquean mediante el sistema de frentes de combate hace que casi nunca podamos desviarnos de un orden establecido. Inicialmente, estas misiones ofrecen mucha variedad (escoltar prisioneros, activar computadores en un tiempo límite o destruir generadores), pero la verdad es que en todas ellas hacemos lo mismo: disparar contra los enemigos y seguir los objetivos del mapa.\nEs verdad que podemos usar el gancho de modos creativos, pero el juego no nos anima demasiado a hacerlo debido a que todo se puede solucionar disparando. Si queremos más diversión, tenemos que buscarla nosotros mismos. Esto en ocasiones no es posible por la cantidad de enemigos y disparos que surgen de todas direcciones.\nEso sí, hay un par de misiones en las que tenemos que arrojar autos con explosivos al mar y son lo más divertido que ofrece Just Cause 4.\nLos combates pueden a llegar a ser muy emocionantes, pero tampoco ofrecen demasiada variedad de enemigos o situaciones. Enfrentaremos a la artillería, francotiradores, soldados con escudos, algunos que pueden hacerse invisibles y a las unidades pesadas. A veces llega un tanque o un helicóptero a complicar la situación, pero no son nada que un globo fulton bien posicionado no pueda solucionar. Si decidimos usar un vehículo, los enemigos escalarán la situación con misiles anti-aéreos o munición anti-tanque, lo que termina desalentándolo.\nEs verdad que Solís es enorme y que cuenta con diferentes ambientes en su mapa, pero son los típicos «jungla, desierto y nieve» a los que estamos acostumbrados. Tampoco hay muchas razones para recorrerlos pues están casi vacíos y la mayoría de misiones opcionales no son demasiado interesantes. Estas consisten en realizar hazañas con vehículos y resolver unos pocos puzles sencillos en ruinas indígenas. Los premios son mejoras para nuestro gancho y nuevos vehículos para pedir por radio, algo que como ya se dijo, no se nos anima mucho a usar.\nOtra razón por la que recorremos el mapeado en otros juegos de mundo abierto es descubrir nuevas vistas y capturar imágenes, pero no hay razón para hacerlo en Just Cause 4. Este es un juego bastante feo. La calidad gráfica apenas llega a la altura de lo visto en PlayStation 3 o Xbox 360 y los modelos de personajes son decepcionantes. Por si fuera poco, en un PlayStation 4 base la resolución es de 720p y al jugar en un televisor de alta definición la imagen empeora mucho. Es comprensible que un juego con tantas explosiones y efectos de clima prefiera una resolución relativamente baja a sufrir ralentizaciones, pero estas ocurren de todos modos. También sufre de una gran cantidad de bugs tanto visuales como jugables, algunos de los cuales pueden causar que tengas que reiniciar el juego.\nLa trama tampoco es un aliciente para jugar. Aunque esta alude a la fantasía de rebelarnos contra una sociedad injusta (algo que puede llamar la atención dada la situación actual del mundo), no es más que una excusa para justificar las secuencias de acción que nunca profundizan en los temas de conflicto social. Aunque hay bastantes interacciones con los personajes secundarios, estos no son más que arquetipos. Hasta los villanos son relleno. Óscar Espinosa y Gabriela Morales, la tan publicitada rival de Rico, solo aparecen en videos al comienzo y al final de la historia.\nPero hay un aspecto en que Just Cause 4 resalta y es en su banda sonora. La exploración de Solís está acompañada por agradables melodías de sintetizador acompañadas de elementos folclóricos que pueden ser relajantes o emocionantes dependiendo de la situación. Si sintonizamos la radio en los vehículos encontraremos toda clase de ritmos latinos, como reguetón, salsa, boleros y hasta rock en español. Esto, mezclado con un doblaje lleno de expresiones tan nuestras como «parcero» y otras que no podemos expresar aquí, le da un sabor único y «muy nuestro» que pocos juegos tienen. También es agradable encontrar una combinación de pueblos rurales, carreteras, montañas y ciudades modernas que recuerdan a los paisajes reales de Sudamérica, a diferencia de la imagen retrógrada que tiene Hollywood de nosotros.\n-Los tiroteos y momentos de conducción pueden resultar divertidos y hasta emocionantes.\n-Un elenco mayoritariamente latino.\n-La combinación de modificaciones para el gancho, vehículos y armas se presta para ocurrencias divertidas y creativas.\n-Una baja calidad técnica por la cual abundan los bugs y ralentizaciones.\n-Una historia de relleno que apunta a temas interesantes nunca aprovechados.\n-La mayoría de misiones resultan repetitivas.\n-Gráficos poco atractivos tanto a nivel técnico como de estilo.\nNo hay nada en Just Cause 4 que otros juegos de mundo abierto no hayan hecho y mucho mejor. Su narrativa de rebelión no es más que simple decoración, sus gráficos son feos, su mapa está vacío y las actividades son repetitivas. Hay espacio para causar caos de modo creativo, pero los jugadores tienen que buscarlo activamente pues el juego no lo incentiva. Si sumamos todos sus elementos, no resulta ser más que Far Cry en tercera persona y con bajo presupuesto.\nReseña hecha con una copia digital de Just Cause 4 para PlayStation 4 brindada por Square Enix Latinoamérica.\nTemas relacionados:Avalanche StudiosJust CauseSquare Enix


Cómo usar Plastigauge para medir los espacios libres | Puro Motores\nPlastigauge es un sistema propietario para medir espacios libres entre las superficies encastradas de partes maquinarias, tales como los cojinetes del cigüeñal o del árbol de levas. Hecho de un plástico extruido especial con propiedades de golpe controladas en forma precisa, Plastigauge provee una forma rápida y precisa para verificar los espacios libres de los cojinetes.\nSi vas a medir el cigüeñal, ensambla el motor con el cigüeñal instalado con los nuevos insertos de cojinete en el bloque y en las tapas principales. Asegúrate de que todas las tapas estén numeradas, en orden e instaladas apropiadamente con las flechas apuntando hacia adelante. Dale torque a todos los ajustes y los pernos según la especificación.\nRompe un trozo de Plastigauge. Abre el papel para quitar el Plastigauge y ponlo a través de la superficie del cigüeñal. Posiciónalo en el centro de la superficie del muñón. Instala la tapa del cojinete y dale torque a los pernos según la especificación. Quita los pernos y la tapa del cojinete. Verás el Plastigauge aplastado en el muñón.\nUsando el papel que vino con el Plastigauge, usa la escala en el costado de la envoltura para medir el Plastigauge aplastado. Compara tus medidas con la especificación del espacio libre. Si estás dentro del rango de espacio libre especificado, estás bien para ensamblar.\nNo necesitas limpiar el Plastigauge ya que se disolverá con el aceite del motor. Asegúrate de que estés usando la proporción correcta para tu aplicación.\nDemasiado espacio libre significará que tu motor probablemente esté bajo en presión de aceite. La tolerancia de aceite del cojinete típica es 0,001 a 0,0015 y eso no es demasiado espacio.\nCómo revisar el líquido de la transmisión en un ... →\nCómo cambiar la correa de serpentina en un PT ... →