CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites | Protocol (Translated to Danish)\nVi præsenterer en genom engineering arbejdsgang for generation af nye in vitro-modeller for HIV-1 infektion, at sammenfatte proviral integration på udvalgte genomisk lokaliteter. Målretning af HIV-Afledte reportere lettes ved CRISPR-Cas9-medieret, lokationsspecifikke genom manipulation. Der findes detaljerede protokoller for encellede klon generation, screening og korrekte målretning verifikation.\nHuman immundefekt virus (HIV) integrerer sin proviral DNA ikke tilfældigt i vært celle genom på tilbagevendende sites og genomisk hotspots. Her præsenterer vi en detaljeret protokol for generation af nye in vitro-modeller for HIV-smitte med valgte genomisk integration websteder ved hjælp af CRISPR-Cas9-baseret genom engineering technology. Med denne metode, kan en reporter sekvens af valget integreres i en målrettet, valgte genomisk locus, reflekterende klinisk relevante integration websteder.\nI protokollen, er design af en HIV-afledte reporter og valg af en destination site og gRNA sekvens beskrevet. En målretning vektor med homologi våben er bygget og transfekteret i Jurkat T-celler. Reporter sekvens er målrettet til den valgte genomisk site af homologe rekombination lettes ved en Cas9-medieret dobbelt-strenget pause på destinationsstedet. Encellede kloner er genereret og screenes for målretning begivenheder ved flowcytometri og PCR. Udvalgte kloner er derefter udvidet, og korrekte målretning bekræftes ved PCR, sekventering og sydlige blotting. Potentielle off target begivenhederne i CRISPR-Cas9-medieret genom engineering er analyseret.\nDenne model hivinfektion på klinisk relevante integration websteder kan genereres ved hjælp af denne protokol, Roman celle kultur systemer. Selv om generation af encellede kloner og verifikation af korrekte reporter sekvens integration er tidskrævende, er de resulterende klonede linjer kraftfulde værktøjer til funktionelt analysere proviral integration site valg.\nIntegration af proviral DNA i vært genom ved infektion er et kritisk skridt i livscyklus af human immundefekt virus (HIV). Efter integrationen fortsætter HIV ved at etablere ventetid i langlivede CD4 + T celle subsets som memory CD4 + T-celler. HIV integration synes at være ikke-tilfældige1,2. En række af genomisk hotspots med jævne integreret proviral DNA er blevet påvist i flere undersøgelser gennem sekventering af integration websteder i akut og kronisk smittede personer2,3,4 ,5,6,7,8. Interessant, på nogle af disse websteder, integration, blev den samme locus fundet i en stor del af inficerede celler, fører til tanken om, at integration på tilbagevendende steder positivt kan påvirke klonal ekspansion1.\nFor at fremme vores forståelse af betydningen af tilbagevendende integration websteder, skal proviral integration site valg udforskes. Dog flere tekniske aspekter hæmme studere HIV integration site valg og konsekvenserne. Generelt anvendes celle kultur modeller for HIV latency gerne JLat cellelinjer ikke afspejler klinisk relevante tilbagevendende integration websteder9. Undersøgelser på primære patient-afledte celler, på den ene side aktiverer beskrivelse af integration site landskab af sekventering men tillader ikke for funktionelle analyser. Til vores viden er ingen passende eksperimentel model tilgængelig for funktionelt analysere udvalgte klinisk relevante integration lokaliteter.\nHer præsenterer vi en detaljeret arbejdsproces for at generere nye modeller for HIV-smitte ved hjælp af CRISPR-Cas9-baseret genom engineering technology. Arbejdsprocessen beskrevet heri kan bruges til at generere T-celle-afledte reporter cellelinjer, der model hivinfektion, transporterer gentisk integreret proviral reporter på en valgte integration site. De dermed tjener som nye værktøjer til at undersøge hvordan webstedet proviral integration kan påvirke HIV biologi og hvordan provirus reagerer på forskellige behandling strategier (f.eks., inducibility af latency baglænskørsel agenter). Vores metode bruger fordelene ved CRISPR-Cas9-baseret genom engineering, som integrationen af journalisten sekvens af homologe rekombination lettes ved en Cas9 nukleasen-induceret dobbelt-strenget pause på destinationsstedet. Målwebsteder for integration er udvalgt efter nærhed til de beskrevne tilbagevendende integration websteder fra undersøgelser af HIV-smittede individer og tilstedeværelsen af egnet PAM motiver for Cas9-medieret genom engineering.\nI vores eksemplarisk resultater, har vi fokuseret på BACH2 gen locus, som koder for BTB og CNC homologi transcriptional regulator 2. I kronisk HIV-smittede personer på antiretroviral behandling er BACH2 en af de loci viser berigelse af integrerede HIV-1 sekvenser3,6,7,8,10. Vi har valgt en minimal HIV-afledte reporter bestående af HIV-1-afledt lange terminal Gentag (LTR), tdTomato kodende sekvens og kvæg væksthormon (BGH) polyadenylation signal (PA), som vi har rettet mod to specifikke websteder i BACH2 intron 5. Præsenteres protokollen er optimeret til Jurkat celler, en menneskelig CD4 + T-celle-afledte suspension cellelinie, men andre celle linjer kan bruges og protokollen tilpasset i overensstemmelse hermed. Vi præsenterer en detaljeret arbejdsproces for udvælgelse af mål-webstedet, opførelsen af target vektor med homologi arme, CRISPR-Cas9-medieret målretning af reporter i den valgte genomisk site, generation og udvælgelse af klonede linjer, og omfattende kontrol af nyligt genererede, målrettet reporter cellelinjer.\n1. målretning strategi for genom Engineering og målretning vektor (tv) Design\nBemærk: Det første trin i genom engineering involverer udvælgelse og generation de nødvendige værktøjer for CRISPR-Cas9-medieret målretning. Valg af en genomisk integration site locus, valg af celletype for målretning og design af en HIV-afledte reporter for integration bør gå forud for dette trin. Denne protokol beskriver målretning af en HIV-LTR_tdTomato_BGH-PA minimal reporter i Jurkat target-cellerne. Et flowdiagram for CRISPR-Cas9-baseret målretning, generation, screening og kontrol af klonede linjer arbejdsgang er afbildet i figur 1. Den beskrevne målretning strategi bruger S. pyogenes Cas9 (SpCas9) til at generere gRNA-instrueret dsDNA pauser på et websted for valgte integration. Journalisten er så målrettet til den valgte genomisk locus gennem homologe rekombination ved at give en ikke-lineariseret målretning vektor (tv) der indeholder reporter flankeret af såkaldte 5' og 3' homologi arme (HA)11.\nValg af målrettede locus, gRNA og målretning vektor design\nVælg thegenomic locus være målrettet baseret på den enkelte videnskabelige spørgsmål. Brug offentliggjorte lister over tilbagevendende integration af HIV fundet i patienter i forskellige undersøgelser2,3,4,5,6,7,8 som en retningslinje. I siliciummangan ekstrakt genomisk rækkefølgen af de ønskede genomisk locus at være målrettet (sekvens af komplet gen) eller mindst 5 kb af genomisk sekvens bruger UCSC genom browser (http:// genome.edu.ucsc.edu).\nVælg guide RNA'er (gRNAs) af 20 nt for målretning af den valgte genomisk locus ved hjælp af E-sprød webtool (http://www.e-crisp.org).\nVælg "Homo sapiens GRCh38" som organismen. Input 2.000 bp af genomisk sekvensen der dækker de ønskede genomisk locus har udtrukket i trin 1.1.1.\nStarte en gRNA søgning ved hjælp af medium programindstillinger (enhver PAM, enhver 5' base, off-mål tolerere uoverensstemmelser, og introner/CPG øer er udelukket). En liste med mulige gRNA designs vises, ranking fra højeste til lavere scores for specificitet og effektivitet.\nVælg en gRNA, der helst viser en høj score for specificitet og effektivitet og er så tæt som muligt til den ønskede genomisk locus skal målrettes.\nBemærk: Et kompromis mellem nærhed til den ønskede genomisk locus og design af konkrete og effektive gRNA der skal findes.\nBlast valgte gRNA sekvens mod reference genom ved hjælp af NCBI blast browser (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov) skal kontrolleres for entydighed af gRNA bindingssted.\nVælg "menneskelige" som genomet. Input gRNA sekvens som forespørgslen sekvens. Vælg "meget lignende sekvenser" (megablast) som programmet. Sikre at gRNA sekvens er unikke. Hvis ikke, valgte en anden gRNA fra trin 1.1.2.3 og blast igen.\nNår gRNA sekvens er valgt, skal du vælge i siliciummangan 1.000 bp opstrøms og nedstrøms for gRNA sekvens fra genomisk sekvens udtrukket i trin 1.1.1 som 5' og 3' HA i overensstemmelse hermed.\nBemærk: GRNAs bør være homologe til valgte genomisk integration site locus og beliggende støder op til en protospacer tilstødende motiv (PAM, fx, NGG for SpCas9) (figur 2a). TV'et indeholder reporter sekvens, der er 5' og 3' flankeret af HAs. Har dækning 1000 bp opstrøms og nedstrøms gRNA sekvens11. Fuld gRNA rækkefølgen bør ikke indgå i HA. En overlapning i op til 5 nt er acceptabel (figur 2a).\nGeneration af gRNA og målretning vektorer\nBemærk: For vektor ordninger, se figur 2b.\nFor at generere en vektor for udtryk for SpCas9 og gRNA, skal du bruge pX330-U6-Chimeric_BB-CVH-hSpCas9 som rygraden som både SpCas9 og den fælles vejledning RNA (sgRNA) kan samtidig udtrykkes. For at klone gRNA sekvens i rygraden, skal du bruge BbsI begrænsning websteder12.\nFor at generere tv'et, skal du vælge en høj-kopi plasmid som rygrad (f.eks., pMK eller cDNA3.1).\nFørst, samle reporter (i denne protokol: LTR_tdTomato_BGH-PA) til konstruere rygraden af Gibson forsamling clong13 ved hjælp af en kommerciel forsamling kloning kit, og indføre 5' og 3' flankerende begrænsning websteder (f.eks., 5' PacI og 3' SmaI) for efterfølgende begrænsning fordøjelsen kloning af har.\nForstærke 1000 bp HA fragmenter valgt i trin 1.1.4 fra genomisk DNA (gDNA) af typen celle skal målrettes (i denne protokol: Jurkat celler) ved hjælp af en DNA-polymerase med korrekturlæsning aktivitet (Se tabel 1 og 2 for PCR ingredienser og cykling betingelser). Derefter, indføre reporter flankerende begrænsning websteder på 5' og 3' enderne af hver HA (PacI på 5' HA i begge ender, SmaI på 3' HA i begge ender).\nSekventielt har klon i konstruere rygraden med allerede indhold reporter (genereret i trin 1.2.2.1) softwarebegrænsning enzym kloning14,15. Første, klone i 5' HA bruger PacI begrænsning sites, derefter klon i 3' HA med SmaI begrænsning websteder.\nBemærk: Hvis tv rygraden indeholder en yderligere fluorescerende reporter, uønskede rygraden integration kan vurderes ved flowcytometri (Se trin 3.2.2 og 3.2.3). Hvis tv rygraden indeholder ingen fluorescerende reporter, rygraden integration skal vurderes ved hjælp af PCR (Se trin 3.2.8).\nFigur 1: arbejdsgang for CRISPR-Cas9-medieret målretning, generation, og udvælgelse af klonede reporter linjer med definerede integration websted. (A) generere target vektor og transduce Jurkat T celler med target vektor og Cas9/gRNA udtryk plasmid. (B) Enrich transfekteret celler 72 h post Transfektion af FACS. (C) Lad celler vokse i 10 til 14 dage og bekræfte forekomsten af målretning begivenheder ved PCR og flow flowcytometri. (D) Generer encellede kloner ved at begrænse fortynding og lad kloner vokse til 3 uger. (E) skærm kloner for korrekte målretning af PCR og flow flowcytometri i 96-brønds format. Udvide udvalgte kloner. (F) Kontroller korrekt målretning i udvalgte kloner af sydlige skamplet, PCR, sekventering og analyse af off-target begivenheder i Cas9 liv1975 aktivitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nFigur 2: målretning strategi og vektor design. (en) gRNA og valg af homologi våben. 20 nt gRNA er homologe til den valgte genomisk målwebsted og beliggende støder op til en PAM. homologi arme er komplementær til 1.000 bp op- og nedstrøms for gRNA og bør ikke omfatte gRNA sekvens. (b) skemaer af målretning vektor og gRNA/Cas9 vektor. Målretning vektoren består af den valgte reporter sekvens, der er 5' og 3' flankeret af homologi arme. GRNA/Cas9 vektor er baseret på pX330-U6-Chimeric_BB-CVH-hSpCas9 rygrad. (c) skematisk af målretning af homologe rekombination. Target vektor og guideRNA/Cas9 vektor er transfekteret i Jurkat celler. Cas9 formidler en dobbeltstrenget pause på genomisk målwebstedet (angivet af *) og letter homologe rekombination og integration af reporter sekvens i genomisk target locus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\n2. CRISPR-Cas9-baseret målretning af Jurkat celler\nTransfektion af Jurkat celler\n24 timer før Transfektion, plade 1.25 x 106 Jurkat T-celler i 2,5 mL af RPMI 1640 suppleret med 10% (v/v) føtalt kalveserum (FCS) og 4 mM L-glutamin [refereret til som "RPMI w.o. antibiotika (AB)"] pr. brønd af et 6-godt celle kultur plade. For en enkelt målretning eksperiment, udarbejder en komplet 6-godt plade (dvs., 6 brønde hver med 2,5 mL cellesuspension).\nDen følgende dag, co transfect celler med cirkulær tv og pX330-U6-Chimeric_BB-CVH-hSpCas9/gRNA ved hjælp af en Transfektion reagens specifikt for Jurkat celler.\nTilføje 2 µg af cirkulære tv og 2 µg for pX330-U6-Chimeric_BB-CVH-hSpCas9/gRNA pr. brønd til 250 µL af kommercielle RPMI medium med nedsat serum koncentration optimeret til Transfektion (RPMI med 50% reduktion i serum) i en reaktion tube og bland godt.\nTilføje 12 µL Transfektion reagens langsomt til DNA/medium uden at røre mur af røret og slyng. Lad blandingen inkuberes i 15 min og tilsæt dråbevis til én brønd af celler. Inkuber cellerne ved 37 ° C og 5% CO2.\nBemærk: Udarbejdelse af Transfektion reaktion kan skaleres. Der kræves ingen medium ændring efter Transfektion.\nBerigelse af transfekteret celler ved fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS)\n72 h efter Transfektion, pool transfected cellerne, tælle dem, og forberede berigelse af FACS. Indsamle cellerne i en 50 mL konisk slange, centrifuge på 300 x g og stuetemperatur (RT) for 4 min, vaske cellerne en gang i PBS, centrifugeres igen, suspendere pellet i en passende mængde af FACS buffer (PBS suppleret med 1% FCS + 1 mM EDTA) på 1 x 10 7 celler/mL, og endelig overførsel til et FACS rør.\nForbehold FACS cellerne og sortere dem, der udtrykker den fluorescerende reporter på tv (f.eks., tdTomato i denne protokol). Indsamle cellerne i RPMI 1640 suppleret med 10% FCS, 4 mM L-glutamin, og 50 U/mL penicillin og streptomycin (omtales som "RPMI m / AB").\nEfter FACS sortering, vaske cellerne en gang ved at tilføje 20 mL af RPMI m / AB til sorterede celler og centrifugeres ved 300 x g i 4 min på RT. Resuspend celle pellet i en passende mængde af RPMI m / AB og plade celler i en godt af en celle kultur plade med den passende mængde efter celle nummer post-FACS.\nBemærk: Kultur sortere cellerne i en lille mængde (fx, 24-godt), som betydelige niveauer af celledød er blevet observeret i den første uge efter målretning (op til 80-90%).\nUdvide befolkningens blandet målrettede celle op til en tæthed af 1 x 106 celler/mL i en 75 cm² celle kultur kolbe. Dette vil tage omkring 10 – 14 dage post-FACS sortering.\nBekræftelse af målretning begivenheder ved flowcytometri i befolkningens blandet målrettede celle\nEfter 10-14 dage af ekspansion (når celler har nået en tæthed af 1 x 106 celler/mL i en 75 cm2 celle kultur kolbe), målrettet plade to brønde med 1 x 106 celler af den blandede celle population i 1 mL RPMI m / AB i en 12-godt cellekultur plade.\nFremkalde HIV LTR af journalisten (generation af tv er beskrevet i trin 1.2.2.1.) i en af brøndene ved at tilføje 50 ng/mL phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) og 1 µM Ionomycin (benævnt PMA-Iono). Bruge celler i den anden godt som kontrolelementet ikke-induceret. Kultur både induceret og ikke-induceret celler i 24 timer.\nTage 0,5 mL cellesuspension af ikke-induceret og induceret celler, (hver), vask dem engang i PBS og suspendere hver i 200 µL af FACS buffer.\nAnalysere 100.000 celler ved flowcytometri. Gate levedygtige single-cellerne baseret på størrelse i frem og sidelæns scatter, og analysere fluorescerende reporter gen expression.\nBemærk: På dette trin (10-14 dage post-FACS sortering), forbigående udtryk af fluorescerende reporter ved Transfektion ikke længere bør detectable. Fluorescerende udtryk for dette tidspunkt angiver genomisk integration af reporter sekvens.\nPåvisning af målretning begivenheder ved PCR på genomisk DNA med befolkningens blandet målrettede celle\nBemærk: Til at registrere målretning begivenheder via PCR, design to primer par specifikke for 5' integration (int.) krydset og 3' int. junction. For 5' int. junction PCR, den forreste primer bør binde opstrøms af 5' HA og den omvendte primer i LTR af reporter (primere P1 og P2 i figur 3a). Primer parret til 3' int. krydset PCR bør spænder fra PA af journalisten til 100 – 200 bp nedstrøms af 3' HA (primere P3 og P4 i figur 3a). Primere P1 og P4 vil også tjene til forstærkning af den ikke-øremærket allel i blandet målgruppen. For en skematisk, se figur 3a.\nForberede gDNA fra 2 mL cellesuspension af blandet målrettede cellen befolkningen fra trin 2.2.4. Bruge en gDNA udvinding kit efter producentens protokol. Derefter forberede gDNA af ikke-målrettede celler som kontrol.\nUdføre int. junction PCR'er (primere P1/P2 og P3/P4 for 5' og 3' int. junction, henholdsvis) og ikke-øremærket allel PCR (primere P1/P4) ved hjælp af en high-fidelity DNA polymerase (Se tabel 3 og 4 for PCR ingredienser og cykling betingelser) . Analysere 5 µL PCR produkter på en 1,5% Agarosen/TAE gel.\nBemærk: Hvis blandet målgruppen indeholder celler, der har undergået genom engineering, en specifik PCR produkt bør overholdes, ikke kan spores i gDNA af ikke-målrettede celler (negativ kontrol). For den ikke-øremærket allel PCR, skal man iagttage et produkt af samme størrelse for både målrettet og ikke-målrettede celler (positiv kontrol for genomisk P1 og P4 primere). Hvis ingen bands er observeret, overveje at ændre PCR cykling betingelser ved at øge antallet af cyklusser eller ændre PCR-buffer (for eksempel gennem tilsætning af DMSO eller øgede mængder af Mg2 +) eller ved at ændre polymerasen.\n3. generation af klonede linjer og Screening for korrekte målretning\nBemærk: Efter bekræftelse af målretning begivenhederne i den blandede målrettede celle befolkning ved flowcytometri og PCR (afsnit 2.2-2.4), generere encellede kloner (varighed: 28-35 dage), og skærmen for korrekt integration af reporter sekvens.\nGeneration af encellede kloner gennem fortynding plating\nForberede Jurkat-aircondition medium på forhånd: take off RPMI m / AB medium fra sund, ubehandlet Jurkat T celler dyrkes til 1 x 106 celler/mL, centrifugeres i 5 min. ved 300 x g, og filtrere supernatanten ved hjælp af et 0,22 µm sprøjte filterenhed.\nBemærk: Holde konditioneret medium ved 4 ° C for kortvarig oplagring eller ved-20 ° C til oplagring længere end 1 uge. Forberede 20 til 30 mL af konditioneret medium før fortynding plating.\nTælle de målrettede celler fra trin 2.2.4 efter 10-14 dage af ekspansion og fortyndes dem i RPMI m / AB til en koncentration på 1 x 105 celler/mL. Tage 100 µL 1 x 105 celler/mL opløsning og fortyndes med 9,9 mL medium til at opnå en koncentration af 1000 celler/mL. 1 ml af 1000 celler/mL opløsning og fortyndet med 9 mL medium til at opnå en koncentration på 100 celler/mL.\nPlade 96-brønd plader der indeholder 1 celle pr. brønd og 2 celler pr. brønd. For 1 celle pr. brønd, tag 1 mL 100 celler/mL opløsning og bland forsigtigt med 5 mL af konditioneret medium og 4 mL frisk medium i en steril reagens reservoir.\nFor 2 celler pr. brønd, udtages 2 mL af 100 celler/mL opløsning og bland forsigtigt med 5 mL af konditioneret medium og 3 mL frisk medium. Plade 96-brønd runde-nederste plader med 100 µL af den respektive celle fortynding pr. brønd med en multikanal pipette.\nBemærk: 5 til 10 96-brønd plader pr. målretning konstruktion er tilstrækkelig til at opnå kloner for screening.\nStable 96-brønd plader, dækker hver stak med en 6-godt plade der indeholder 3 mL PBS i hvert hul, og Inkuber plader ved 37 ° C i en fugtig celle kultur kuvøse med 5% CO2 til 3 uger.\nBemærk: Ændrer ikke cellekulturmedium i løbet af denne tid. Må ikke åbne rugemaskinen mere end én eller to gange om ugen. De bedste resultater er observeret i væksthuse med åbent vandreservoir.\nEfter 3 uger til inkubation, visuelt bekræfte tilstedeværelsen af dyrkede kolonier ved hjælp af lysmikroskopi (4 X forstørrelse) og markere brønde med dyrkede kolonier, så de kan ses som punkter på bunden af brøndene.\nForberede en 96-brønd runde-nederste plade med 100 µL af RPMI m / AB pr. brønd. Forsigtigt resuspend celler af en markant godt af pipettering. Overføres 100 µL af cellesuspension til et godt af den nye 96-brønd plade allerede indeholdende 100 µL af RPMI m / AB, derefter blandes forsigtigt af pipettering. Overføres 100 µL af denne cellesuspension til en anden tom 96-brønd runde-bundplade at kopiere pladen.\nFortsæt med alle markerede brønde med dyrkede kolonier. Udfylde alle de tomme brønde med 200 µL af RPMI m / AB medium. Inkuber plader ved 37° C og 5% CO2.\nBemærk: En af disse plader vil tjene for udvidelse af encellede kloner ("stock plade") og den anden som en "dublerede plade" for screening.\nScreening af encellede kloner ved flowcytometri og PCR\nBemærk: Mens encellede kloner udvider, bruge den dublerede plade fra trin 3.1.8 til skærmen encellede kloner for tilstedeværelsen af reporter sekvens af PCR (trin 3.2.4–3.2.12) og angivelse af fluorescerende reporter ved flowcytometri (trin 3.2.2–3.2.3) (Figur 3 c).\nLad dublerede pladen inkuberes i 24 til 48 timer og kopiere pladen igen. Tilsæt 100 µL af RPMI m / AB til hver brønd for at gøre dette, bland forsigtigt af pipettering, og overføres 100 µL til en ny 96-brønd runde-bunden plade ved hjælp af en multikanals pipette. Bruge en trykplade for flow flowcytometri screening og den anden til PCR-baseret screening.\nFor flow flowcytometri screening, stimulere cellerne med PMA-Iono. Forberede en mastermix af 0,1 µL af Ionomocin (1 mM stock), 0,1 µL af PMA (50 µg/µL lager), og 4,8 µL af RPMI m / AB pr. antal brønde, derefter tilsættes 5 µL af mastermix pr. brønd.\nBemærk: Induktion er nødvendige for at med held identificere kloner, hvor LTR muligvis transcriptionally tavs og derfor den fluorescerende reporter er ikke udtrykt.\nLad cellerne inkuberes i 24 timer og forberede flowcytometri som beskrevet i trin 2.3.3 celler. Gate nogen levedygtig single-celler baseret på størrelse i frem og sidelæns scatter og analysere fluorescerende reporter gen expression ved flowcytometri (for eksempel resultater, se figur 3 c). Hvis tv rygraden indeholder en anden fluorescerende reporter med promotor (f.eks., normal god landbrugspraksis), skærm enhver kloner til rygraden reporter udtryk også (Se trin 1.2.2 og følgende note til forklaring).\nBemærk: Rygrad reporter udtryk angiver uønsket integration af rygraden sekvenser.\nNår kloner i den anden dublerede plade er vokset tilstrækkeligt (normalt 24 til 48 h efter duplikering af 96-brønd plade), forberede cellelysater indeholdende gDNA for PCR screening. Centrifuge pladen i 10 minutter ved 300 x g på RT. omhyggeligt tage supernatanten uden at forstyrre den celle pellet.\nBemærk: Alle trin til forberedelse af lysates og PCR-reaktionerne kan udføres med multikanal pipetter.\nVaske cellerne med 100 µL af PBS af blid pipettering og centrifugering plade i 5 min på 300 x g på RT. Tage PBS og tilføje 200 µL af lysisbuffer [200 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 8-8,5, 5 mM EDTA, 0,1% SDS; derefter tilføje 250-1000 µg/mL af proteinase K (frysetørret pulver, vejer i frisk)] pr. brønd. Bland forsigtigt af pipettering, og overføre suspension til en ny PCR-plade.\nForsegle pladen med paraffin film og Inkuber i 1 time ved 55 ° C i en thermocycler. Der centrifugeres ved maksimal hastighed for 10 min (3.000 x g) at spin ned celle debris, og overføre supernatanten til en ny PCR-plade.\nBemærk: Cellelysater i pladerne kan opbevares på dette stadium ved 4 ° C indtil videre anvendelse.\nForberede en 96-brønd PCR plade med 110 µL af dH2O og tilsæt 10 µL af celle lysate (1:12 fortynding). Cellelysater kan være tyktflydende og vanskeligt at pipette. Brug mindst 20 µL pipette tips.\nInaktivere proteinase K ved inkubation i 10 min på 99 ° C i en thermocycler. Efterfølgende brug det inaktiverede og fortyndet cellelysater til PCR screening.\nDesign primere for screening PCR (P5 og P6) baseret på den valgte reporter sekvens for at forstærke 500-800 bp af reporter sekvens. Positiv kontrol PCR, bruger primere P7 og P8, at forstærke 630 bp af et wild-type, ikke-øremærket genomisk locus (NUP188 gen) (figur 3 c og tabel 5). Designe en tredje primer par, der forstærker 500 – 600 bp tv rygrad som en kontrol for uspecifik integration af tv rygraden sekvenser (backbone PCR).\nTil screening, kontrol og rygraden PCR, bruge en kommerciel PCR-mastermix (Se tabel 6 og 7 for PCR ingredienser og cykling betingelser). Bruge 2 µL af de fortyndede og inaktiverede lysate udarbejdet i trin 3.2.8 som en skabelon og køre PCR for 38-40 cyklusser af PCR-amplifikation i 96-brønds format.\nAnalysere 5 µL PCR produkter på en 1,5% Agarosen/TAE gel.\nBemærk: For kontrol PCR, en specifik band af 630 bp bør observeres for hver prøve, bekræfter, at kvaliteten af cellelysater er passende for PCR. En bestemt frekvensbånd i screening PCR (500-800 bp afhængigt af primer design) angiver integration af reporter sekvens. En bestemt frekvensbånd til rygraden PCR (500 – 600 bp, afhængigt af primer design) angiver uønsket integration af tv rygraden sekvenser (for eksempel resultater, se figur 3 c).\nKombinere resultaterne af PCR-baseret screening (trin 3.2.12) og flowcytometri (trin 3.2.3). Vælg kloner, som viser korrekt størrelser af PCR produkter i screening PCR og positiv kontrol PCR og angivelse af fluorescerende reporter efter induktion med PMA-Iono i flowcytometri. Udelukke kloner, der viser alle PCR produkt i rygraden PCR eller udtryk for tv backbone-kodet fluorescerende proteiner, der angiver uspecifik integration af tv rygraden sekvens.\nGradvist at udvide udvalgte kloner fra 96-brønd stock pladen til større godt formater (48/24/12/6-godt) indtil at opnå en T75 celle kultur kolbe format ved at tilføje friske medium hver 2-3 dage. Opretholde en celle tæthed mellem 1 x 105 og 1 x 106 celler/mL.\nSørg for at forberede celle bestande af kloner under udvidelsen: tælle cellerne, centrifugeres ved 300 x g i 5 min på RT, supernatanten fjernes, og suspendere celler forsigtigt i FCS + 10% DMSO på 5 x 106 celler/mL. Alikvot i kryogene hætteglas og brug en cryo-frysning container til at fryse celler til 80 ° C i 1 ° C/min.. For lang sigt opbevaring, overføre dem til flydende Nielsen2.\nBemærk: Det er tilrådeligt at fastholde en T75 celle kultur kolbe (dvs., omkring 1 x 107 celler) under udvidelsen af gDNA med henblik på verifikation af målretning af sydlige blotting (Se afsnit 3.4).\nVerifikation af integration websteder af PCR-sekventering i udvalgte kloner\nBemærk: 5' og 3' int. knudepunkter af udvalgte kloner er PCR forstærket og indsendt til Sanger korrekte rækkefølge for at kontrollere målretning på DNA sekvens plan.\nForberede gDNA af udvalgte kloner og Jurkat wild-type celler ved hjælp af en kommerciel gDNA udvinding kit.\nBruge primer par bindende 5' enden af reporter og opstrøms af 5' HA til 5' int. junction (primere P1 og P2) og 3' enden af reporter og downstream af 3' HA for 3' int. junction (primere P3 og P4) som beskrevet i trin 2.4. Bruge primere P1 og P4 til at forstærke den målrettede integration site på allel uden reporter integrant (figur 4a).\nForberede PCR reaktioner med 100 – 200 ng af gDNA som en skabelon og udføre PCR ved hjælp af en polymerase med korrekturlæsning aktivitet (Se tabel 1 og 2 for PCR ingredienser og cykling betingelser).\nBemærk: Hvis ingen bands er observeret, overveje at ændre PCR cykling betingelser ved at øge antallet af cyklusser eller ændre PCR-buffer (for eksempel ved at tilføje DMSO eller øgede mængder af Mg2 +), eller ved at ændre polymerasen.\nAnalysere 5 µL PCR produkter på en 1,5% Agarosen/TAE gel. Hvis korrekte band størrelser er observeret, rense den resterende PCR produkt ved hjælp af en kommerciel kit og underkaste det Sanger sekvensering. Kontrollere sekvenser af 5' int. junction, 3' int. junction og målrettede site af allel uden reporter integrant ved at tilpasse dem med forventede sekvenser.\nBemærk: Den homologe allel, hvor journalisten ikke har integreret vil sandsynligvis vise Cas9-medieret ændringer på mål-webstedet som nukleotid indsættelser og sletninger (figur 4a).\nUdfør en PCR forstærke den hele målrettede reporter for kloner, der viser korrekt int. junction sekvenser efter justering, og underkaste det Sanger rækkefølge for at kontrollere den korrekte sekvens af den integrant.\nSydlige skamplet analyse for verifikation af målretning i udvalgte kloner\nBemærk: Sydlige skamplet analyse af udvalgte kloner er forpligtet til at kontrollere korrekte målretning og udelukke Cas9-medieret rekombination begivenheder, der kan være opstået på målrettet integration site.\nUdvikle en strategi for passende gDNA fordøjelsen og sonde design før du starter eksperimentet.\nVælg en begrænsning enzym til gDNA restriktion, der genererer passende fragmenter af 2-10 kb længde på den målrettede websted. Visse restriktionsenzymer, såsom Asp718, BamHI, BglI, BglII, EcoRV, HindIII, underofficerI, PstI, PvuII, ScaI, Stu, og SST Jeg har med held brugt til fordøje høj molekylvægt gDNA.\nDesigne to forskellige sydlige sonder: en reporter-specifikke sonde og genomisk sonde. Reporter-specifikke sonden hybridiserer til en sekvens i reporter (dvs., tdTomato-specifikke sonde). Genomisk sonden hybridiserer til en genomisk region tæt på (men ikke overlappende) en HA.\nVælg genomisk sonden, så fragmentet genereret af gDNA fordøjelse, som vil blive opdaget af genomisk sonde bindende varierer i længde (mere end 2 kb) fra de målrettede og ikke-øremærket alleler (figur 4b). En sonde længde af 400 til 1.000 bp anbefales.\nDesign PCR primere til at forstærke de to krævede sonder. Forstærke reporter-specifikke sonden fra tv skabelon ved hjælp af en high-fidelity DNA polymerase (Se tabel 3 og 4 for PCR ingredienser og cykling betingelser).\nForstærke genomisk sonden fra vildtype Jurkat gDNA forberedt med en kommerciel gDNA udvinding kit ved hjælp af en DNA-polymerase med korrekturlæsning aktivitet (Se tabel 1 og 2 for PCR ingredienser og cykling betingelser). Rense PCR-produkter på en Agarosen/TAE gel og udtrække fragmenter ved hjælp af en kommerciel gel udvinding kit ifølge producentens anvisninger.\nUddrag høj molekylvægt gDNA fra 1 x 107 celler i wild-type Jurkat celler og udvalgte kloner fra trin 3.2.14.\nSammenpresse cellerne ved centrifugering ved 300 x g i 5 min på RT, vaske det engang med PBS og suspendere pellet i 4 mL af lysisbuffer [200 mM NaCL, 100 mM Tris-HCl pH 8, 5 mM EDTA, 0,1% SDS; derefter tilføje 250-1000 µg/mL proteinase K (frysetørret pulver vejer frisk)]. Inkuber o/n på 55 ° C, rysten på 350 rpm i en bordplade thermomixer.\nDer tilsættes 4 mL isopropanol og blandes ved inversion 10 til 20 gange. GDNA bør blive synlig som hvide bundfald. Spole det udfældede gDNA på den fine spids af glas pipette, vask af dukker op i 750 µL af 70% EtOH, og lad tørre på RT (5-10 min).\nKaste bundfald ind i en 1,5 mL reaktion rør indeholdende 500 µL 1 x TE buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) og lad det opløse o/n ved 4 ° C, rysten på 350 rpm. Enhver Pipettering af gDNA fra denne fase bør ske med wide-bore tips til at undgå klipning.\nBemærk: Udarbejdelse af høj molekylvægt gDNA er afgørende for det sydlige skamplet analyse, og kommercielt tilgængelige gDNA forberedelse kits er ikke egnede.\nDigest (to gange) 15 µg af gDNA af udvalgte kloner og vildtype Jurkat celler med udvalgte begrænsning enzym (Se trin 3.4.1.1) i en 60 µL reaktion med 6 µL af enzymet (20 enheder/µL): først tilføje DNA, fordøjelsen buffer, og Hedeselskabet2O, inkuberes o/n ved 37 ° C , derefter tilsættes enzymet og der inkuberes o/n ved enzym-specifikke fordøjelsen temperatur. der kræves 15 ug af fordøjet gDNA pr. sydlige sonde.\nBruge 7 µL af 60 µL begrænsning digest for analytisk gelelektroforese på en 1% Agarosen/TAE gel. En smear angiver komplet fordøjelse og god DNA kvalitet for sydlige skamplet analyse.\nUdfælde den resterende begrænsning digest ved at tilføje 1:10 3 M natriumacetat og 2 bind 100% EtOH, derefter inkuberes i 1 time ved-80 ° C og centrifugeres i 30 min. ved 15,600 x g ved 4 ° C.\nSupernatanten og vaske pellet med 70% EtOH. Der centrifugeres i 15 min. ved 15,600 x g ved 4 ° C, supernatanten, lad pellet tørre kort på RT, og opløses i 20 µL af Hedeselskabet2O.\nKøre 1% Agarosen/TAE blotting gel, lastning 20 uL af fordøjet gDNA pr. vognbane. Kør gelen i 2 timer på 60 V, 400 mA.\nBemærk: Procentdelen af Agarosen gel og kører tid/spænding kan justeres efter forventede fragment størrelse til det sydlige skamplet påvisning beregnet i trin 3.4.1.1. De følgende trin i sydlige skamplet analyse er beskrevet i detaljer i en supplerende protokol (trin 1-18). Disse trin består af: vask af blotting gel, duppe på et nylon membran, radioaktive sonde generation, sonde hybridisering og udvikling af autoradiograph film. Sammenligne de opnåede banding mønster efter autoradiograph udvikling i trin 18 (supplerende protokol) med det forventede mønster efter sydlige strategi (for eksempel resultater, se figur 4b).\nAnalyse af off-target begivenheder\nBemærk: Da CRISPR-Cas9-medieret genom engineering kan generere off target effekter, PCR-forstærke 10 højest rangerede i siliciummangan-forudsagt off målwebsteder i udvalgte kloner og underkaste dem Sanger sekvensering.\nBrug CCTop16 (http://crispr.cos.uni-heidelberg.de) til at generere en liste over de ti højest rangerede i siliciummangan forudsagt off target sekvenser.\nInput gRNA sekvensen herunder PAM som bruges til at målrette som forespørgslen sekvens. Vælg "NGG" som PAM og "Menneskelige genom" som reference til off-target forudsigelse.\nAngive maksimal samlede uoverensstemmelser til "4" og målet site længde til længden af gRNA uden PAM. Outputfilen vil give en klassificeret liste over genomisk off-målwebsteder for respektive gRNA.\nI siliciummangan ekstrakt genomisk sekvens 500 bp opstrøms og nedstrøms for hver af de ti højeste rangerede off target hits bruge UCSC genom Browser (http://genome.edu.ucsc.edu) og placeringen af den off-target hit fra CCTop resultatlisten.\nFor hver off målwebsteder analyse, design en PCR primer parre der forstærker et fragment af 600 til 700 bp i længde herunder forudsagte off-mål-webstedet.\nUddrag gDNA fra udvalgte kloner og Jurkat wild-type celler ved hjælp af en kommerciel gDNA udvinding kit. For hver off mål site, udføre en PCR ved hjælp af en DNA-polymerase med korrekturlæsning aktivitet (Se tabel 1 og 2 for PCR ingredienser og cykling betingelser) på wild-type og de respektive klon-afledte gDNA.\nAnalysere 5 µL PCR produkter på en 1,5% Agarosen/TAE gel. Hvis korrekte band størrelser er observeret, rense den resterende PCR produkt ved hjælp af en kommerciel PCR rensning kit og underkaste det Sanger sekvensering. Sammenlign sekvenser af off-target websteder i Jurkat celler og de målrettede kloner.\nI denne repræsentative eksperiment har vi valgt at målrette en minimal HIV-1-afledt reporter bestående af en LTR, tdTomato-kodende sekvens, og polyA-signal sekvensen til to loci i intron 5 af BACH2 gen17. Loci for målretning blev udvalgt efter nærhed til offentliggjorte tilbagevendende integration steder fundet i forskellige undersøgelser på primære T celler fra HIV-inficerede patienter2,4,5,6, 7,8 og tilstedeværelsen af en PAM motiv NGG nødvendige for Cas9-medieret induktion af dobbelt-strenget pauser. Target vektorer blev konstrueret og transfekteret efter de beskrevne protokol. Arbejdsgangen for Transfektion, kontrol for målretning begivenheder, generation af encellede kloner, og screening og udvælgelse af kloner er skematisk vist i figur 1.\nTo uger efter FACS-berigelse af transfekteret celler, var vi købedygtig opdager reporter gen expression efter PMA-Iono induktion ved flowcytometri i 4 til 12% af celler, afhængigt af integration websted (data ikke vist) og PCR produkter på genomisk DNA der spænder over hele 5' og 3' integration krydset fra opstrøms af 5' HA i reporter sekvens og nedstrøms af 3' HA i reporter sekvens, henholdsvis (figur 3a og 3b). At have bekræftet, at målrette begivenheder fandt sted, gik vi at generere encellede kloner ved at begrænse fortynding plating. I vores hænder var plating 5 til 10 96-brønd plader pr. målretning konstruktion tilstrækkelig til at opnå tilstrækkelig kloner for en vellykket skærm. I protokollen (punkt 3.2), er det beskrevet, hvordan man udfører en screening af encellede kloner i duplikerede 96-brønde. I denne forbindelse skal kun positive kloner udvides, hvilket sparer både tid og kræfter. I figur 3 cvises eksempeldata i FACS-screening efter PMA-Iono induktion og PCR screening. Vi observeret en række kloner med høj, lav og ikke fluorescerende reporter gen expression (figur 3 c). For PCR-screening er det vigtigt at medtage en kontrol PCR, som forstærker en genomisk locus af valg til at afgøre, om kvaliteten af cellelysater er passende for PCR. I vores tilfælde, har vi valgt en 630 bp sekvens i NUP188 gen locus for kontrol PCR (for primer sekvenser, se tabel 5). Primere for screening PCR blev derefter designet til at forstærke en kortere sekvens beliggende i journalisten. Derudover blev PCR for en sekvens på target vektor rygraden udført for at udelukke enhver kloner, som havde unspecifically integreret target vektor rygraden sekvenser (backbone PCR, data ikke vist).\nForhånd udvalgte kloner var så udvidet og yderligere analyseret for korrekte målretning af sydlige skamplet og PCR og sekventering. Sydlige skamplet blev udført ved hjælp af en reporter-specifikke sonde og en sonde, der er specifikke for genomisk locus bindende uden for journalisten, men ikke inden for homologi armene af den målretning vektor. Interessant, alle klonerne, der blev testet af det sydlige skamplet var positive i screening PCR på forhånd, men kun en del viste korrekte band størrelser i det sydlige skamplet analyse og heterozygously havde integreret reporter (figur 4b). Det er derfor nødvendigt at ikke kun stole på screening PCR resultater men også kontrollere korrekte målretning af sydlige blotting. For at bekræfte korrekte målretning på DNA sekvens niveau, integration vejkryds blev forstærket af PCR og produkter blev udsat for Sanger sekventering (figur 4a). Navnlig, afslørede sekventering af målet site homologe allel, hvor journalisten ikke havde integreret, Cas9-medieret ændringer. I figur 4a, eksempler til en Cas9-medieret sletning er vist. For at teste for Cas9-medieret off target effekter, var en liste over de højeste rangerede off target sites genereret som beskrevet i afsnit 3.5. Ti højest rangerede off-målwebsteder var PCR-amplificeret fra genomisk DNA af kloner, og produkterne underkastes Sanger sekvensering. I de målrettede encellede kloner vi genereret, blev ingen variationer fra Jurkat vildtype sekvenser observeret på de ti højest rangerede off-målwebsteder.\nFigur 3: Screening af encellede kloner til at målrette begivenheder. (en) skematisk af primer design til påvisning af målretning begivenheder ved PCR i blandet målrettede celle population. Primer par til påvisning af 5' integration junction (P1, P2) og 3' integration junction (P3, P4) er angivet som pile. Primer P1 og P4 også tjene til at forstærke målrettede locus af allel uden reporter integrant (b) genomisk DNA af blandet målrettede celle befolkning blev udarbejdet 10 dage efter FACS berigelse af transfekteret celler og analyseret for 5' integration junction (P1, P2 ), 3' integration junction (P3, P4, data ikke vist) og vildtypeallelen af den målrettede locus (P1, P4). Wild-type Jurkat celler (wt) fungerede som kontrol. (c) første skærmbillede af encellede kloner i 96-brønd plader. 96-brønd plader med enkelt-celle kloner blev screenet for korrekte målretning ved flowcytometri efter PMA-Iono induktion og PCR analyse. Resultater for eksempel kloner er vist. PCR blev udført på cellelysater med reporter-specifikke primere (screening PCR; P5, P6) og primere forstærke en genomisk locus (styre PCR, her: NUP188 locus; P7, P8). Cell lysates af vildtype Jurkat celler (wt) og genomisk DNA fra HIVisB2 klon (B2)18 tilberedt med kommercielt tilgængeligt kit fungerede som en negativ kontrol for screening PCR og positiv kontrol til kontrol PCR, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nFigur 4: analyse af udvalgte encellede kloner for korrekte reporter integration. (en) Sekvensanalyse integration vejkryds og målrettede locus på allel uden reporter integrant. Primer par til påvisning af 5' integration junction (P1, P2), 3' integration junction (P3, P4) og målrettede locus af allel uden reporter integrant (P1, P4) blev brugt. PCR produkter blev forstærket fra genomisk DNA af encellede kloner og underkastes Sanger sekvensering. Sekventering resultater blev justeret for forventede sekvenser. Vist er eksempeldata af en klon. Sekvens kromatogrammer fra genom/HA junction og HA/reporter junction er vist for både 5' og 3' integration junction. Kampe er angivet som prikker. Bindingssted af gRNA er markeret med en boks. Cas9-induceret mutationer er fremhævet med rødt. Skematisk af primer design er vist nedenfor. Pilene angiver primer positioner anvendes til forstærkning. (b) det sydlige skamplet analyse af udvalgte målrettede encellede kloner og Jurkat wild-type celler. Sydlige skamplet analyse blev udført om genomisk DNA med en reporter-specifikke sonde og en sonde anerkende en genomisk sekvens i både målrettet og vildtype allel (genomisk sonde). Data af 7 eksempel kloner er vist. Kloner med korrekte band størrelser er markeret med kasser. Fortyndet target vektor plasmid fungerede som positiv kontrol (+). Skematisk for sydlige skamplet analyse er vist nedenfor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.\nReagens Tilføj per reaktion\nVideresende Primer (20 µM) 1 ΜL\nVende Primer (20 µM) 1 ΜL\n10 x Taq buffer 5 ΜL\n1 µL dNTP'er (2,5 mM) 1 ΜL\nNukleasen-frit vand Fyld op til 49,5 µL\nTaq DNA polymerase (5 U/mL) 0,5 ΜL\nreaktion volumen 50 ΜL\nTabel 1: opskrift på PCR ved hjælp af en polymerase med korrekturlæsning aktivitet. Mængden af hver reagens skal tilføjes pr. PCR reaktion er indiceret. PCR er beregnet til forstærkning med genomisk DNA som skabelon. Opskriften bruges i trin 1.2.2.2 (forstærkning af homologi våben), trin 3.3.3 (kontrol af integration sites), trin 3.4.1.5 (generation af genomisk sonde til sydlige skamplet) og trin 3.5.4 (analyse af off-target begivenheder).\nIndledende denaturering 95 ° C 2 min 1\nDenaturering 95 ° C 40 Sørensen 30-35\nUdglødning 58 ° C 45 s\nUdvidelse 72 ° C 1 min/kb\nTabel 2: cykling betingelser for PCR ved hjælp af en polymerase med korrekturlæsning aktivitet. Cykling betingelser svarer til PCR opskrift der er anført i tabel 1.\n5 x Hi-Fi-buffer 5 ΜL\ngDNA (50-100 ng/µL) eller plasmid DNA (50 ng/µL) 2 µL gDNA eller\nHigh-Fidelity DNA polymerase 0,5 ΜL\nTabel 3: opskrift på PCR ved hjælp af en high-fidelity polymerase. Mængden af hver reagens skal tilføjes pr. PCR reaktion er indiceret. PCR er beregnet til robust forstærkning af DNA skabeloner. Opskriften bruges i trin 2.4.2 (påvisning af målretning begivenheder) og trin 3.4.1.4 (generation af reporter-specifikke sonde til sydlige skamplet).\nUdglødning 58 ° C 30 s\nUdvidelse 72 ° C 30 s/kb\nTabel 4: cykling betingelser for PCR ved hjælp af en high-fidelity polymerase. Cykling betingelser svarer til PCR opskrift der er anført i tabel 3.\nPrimer Rækkefølge (5'-3')\nP7 kontrol PCR F CTTTGTTGGGTAAGCATGGAGGTC\nP8 kontrol PCR Rasmussen CAGTTACTCACCTTTGCACATAGG\nTabel 5: oligonukleotid sekvenser for kontrol PCR. Frem og bak primere for forstærkning af en 630 bp fragment af NUP188 locus er angivet.\nklar-til-brug PCR Master Mix 8 ΜL\nNukleasen-frit vand 8 µl\nCell lysate (1:12 fortynding) 2 ΜL\nsamlede reaktion volumen 20 ΜL\nTabel 6: opskrift på screening-PCR. Mængden af hver reagens skal tilføjes pr. PCR reaktion er indiceret. PCR opskrift er beregnet til screening PCR taktfast 3.2.11.\nUdglødning 58 ° C 1 min\nUdvidelse 72 ° C 1 min\nTabel 7: cykling betingelser for screening-PCR. Cykling betingelser svarer til PCR opskrift der er anført i tabel 6.\nHer, beskriver vi en protokol til at generere HIV-1-afledt Jurkat reporter modeller med valgte proviral integration websteder anvender CRISPR-Cas9-baseret genom engineering.\nFlere punkter i protokollen kræver omhyggelig opmærksomhed i planlægningsfasen. Først, locus skal målrettes skal vælges omhyggeligt, som kan være lettere at målrette end andre, nogle loci (f.eks., afhængigt af regionen og målet kromatin status sekvens sig selv). Gentagne sekvenser er svært at klone i den målretning vektor og ofte ikke entydigt i genomet. Regioner af repressive kromatin er sværere at målrette med CRISPR-Cas9 system19,20.\nDet andet er valg af gRNA afgørende for CRISPR-Cas9-medieret målretning. Med henblik på at generere modeller for hivinfektion med repræsentative integration websteder, ville man ønsker gRNA at binde så tæt som muligt til en integration hotspot. Men dette websted kan ikke være ideel til Cas9 ansættelse; et kompromis skal derfor foretages mellem nærhed af gRNA sekvens til webstedet integration af valg og gRNA kvalitet. Vi har fundet E-sprød webtool pålidelige til at forudsige funktionelle gRNAs. Det er også muligt at foretage en gRNA pre-test af forbigående udtrykker flere gRNAs sammen med Cas9 i celletype skal være målrettet, efterfulgt af en screening for mutationer. En egnet gRNA direkte effektivt Cas9 til mål-webstedet og gRNA supplerende site vil vise mutationer. Længden af har (1,000 bp opstrøms og nedstrøms for webstedet integration) blev udvalgt efter tidligere offentliggjorte undersøgelser11. Generelt vil at reducere længden af homologi våben resultere i reducerede målretning frekvens. En længde af 1000 bp af homologi arm præsenterer et godt kompromis mellem tilstrækkelig målretning frekvens og lethed af target vektor konstruktion.\nFor det tredje skal nok tid bruges på et godt design af journalist konstruere. Minimal reporter bruges i denne protokol, som indeholder en HIV-1 NL4-3 afledt LTR og en tdTomato kodende sekvens, blev designet baseret på følgende princip: enkelt LTRs er blevet beskrevet som udelukkende resterende proviral fragmenter i flere tilfælde af klonede ekspansion i kronisk HIV-1-inficerede individer21. Det forventes at LTR er stærkt påvirkninger kromatin status på integration websteder og organiserer rekrutteringen af cellulære komplekser. Vi har valgt en minimal HIV reporter med fokus på HIV LTR som vigtigste regulerende genetiske element og derefter indført tdTomato som fluorescerende LTR aktivitet markør i stedet for yderligere HIV-1 gener, som genom engineering frekvens blev rapporteret at være højere med mindre målretning indsætter11. I betragtning af de tidskrævende trin af tv kloning, klonudvalg, screening og kontrol af kloner anbefales det at nøje overveje udformningen af HIV reporter i forbindelse med funktionelle studier, der i sidste ende vil blive gennemført på målrettet cellelinjer. Man overveje eksempelvis optagelse af gag leder sekvens, 3' HIV LTR, og/eller andre virale gensekvenser i journalisten. Protokollen kan tilpasses let til sådanne forskellige reporter konstruktioner.\nGenerelt, er det vigtigt at overveje valg af celletype målrettet som encellede klon generation kan være svært med visse cellelinjer. Vi fandt, at Jurkat celler ikke er meget effektive i enkelt klon generation; dog besluttede vi at vælge denne celletype til sin tidligere kendte brug i latent HIV infektion modeller9. Vi opnået de bedste resultater i Jurkat klonede fortynding plettering med 50% konditioneret medium, når pladerne blev efterladt uforstyrret i en inkubator, der blev åbnet ikke mere end 3 gange om ugen. Hvis bruger en anden cellelinie ønskes, anbefales det at pre test mulighed for at generere encellede kloner ved at udføre en fortynding plating eksperiment. Et andet punkt at huske er variationen af Transfektion satser for forskellige cellelinjer. Hvis Transfektion ikke er muligt for den valgte cellelinie, electroporating celler til at målrette kan være nødvendigt. Bemærk, at valget af cellelinje bruges til at målrette ikke kan fastlægges af tekniske aspekter kun, såsom effektivitet for Transfektion eller enkelt klon generation. Også kan betragtes som funktionelle aspekter, såsom transcriptional aktivitet eller inducibility af målrettede gen locus. Dette kræver muligvis screening af forskellige cellelinjer før målretning arbejdsprocessen.\nDet skal understreges, at den beskrevne protokol er tidskrævende. Det bør forventes at tage 3-6 måneder fra det første skridt til endelige klonede cellelinjer. Sydlige skamplet analyse, der bruges til at kontrollere for lokationsspecifikke enkelt integration begivenheder, kan virke besværligt, men vores erfaring er det meget vigtigt - som kun en delmængde af encellede kloner, der viste den forventede integration vejkryds pr. PCR viste en rette mønstre i den sydlige skamplet. Ideelt set eksperimentatorer skal generere en række kloner med den samme indsats målrettet til den samme integration websted til kontrol for klonede effekter i nogen efterfølgende eksperimenter, der gør brug af kloner. Det er muligt at gøre heterozygous og homozygot målretning. I heterozygous reporter cellelinjer er allel uden en integrant tilbøjelige til at vise ændringer på Cas9 målretning websted, som kan blive screenet ved PCR (figur 4a). For homozygote målretning foreslår vi, at begge alleler være målrettet fortløbende.\nUnder hensyntagen til disse overvejelser, indeholder denne arbejdsproces et middel til at skabe kraftfulde cellulære modeller, der kan bruges til at øge forståelsen af kronisk HIV-infektion. For eksempel, kan proviral aktivitet i svar på latency-vende agenter afprøves i forbindelse med tilbagevendende integration websteder. Dette kan være af særlig interesse for forskere i feltet, da holdning effekter har været postuleret for at påvirke HIV ventetid og tilbageførsel22.\nVi takker Britta Weseloh og Bettina Abel for teknisk bistand. Vi takker også Arne Düsedau og Jana Hennesen (flow flowcytometri teknologiplatform, Heinrich Pette Institut) for teknisk support.


Produktbeskrivelse Logitech G305 - mus - LIGHTSPEED - sort\nG305 er en trådløs gamingmus med LIGHTSPEED-teknologi der er designet til maksimal ydeevne, og som kombinerer den nyeste teknologi med en fornuftig pris.HERO-sensor tilhører den næste generation af optiske sensorer til gaming der er udviklet af Logitech G og som kombinerer en fantastisk ydeevne med en hidtil uset effektivitet. I trådløst gamingudstyr er der nemlig ikke plads til kompromiser. DPI kan programmeres fra 200 til 12.000 og gemmes i op til 5 profiler i den indbyggede hukommelse.LIGHTSPEED-teknologi sikrer en trådløs ydeevne der er på højde med ydeevne via ledning. Den omhyggeligt konstruerede forbindelsesløsning fra Logitech G giver spillerne en trådløs frihed og den ydeevne på 1 ms der er nødvendig til seriøs gaming.HERO-sensor og LIGHTSPEED sikrer en så høj effektivitet at du kan spille i 250 timer på kun et AA-batteri. Du kan forvente omkring 9 måneders typisk brug for fuld skrue før du skal skifte batteri. Du skal ikke holde øje med batteriet, for G305 har en et indikatorlys der advarer dig når der er 15 % strøm tilbage i batteriet.Ifølge Logitech G behøver en trådløs gamingmus ikke være tung. G305 vejer kun 99 gram takket være de anvendte letvægtsmaterialer og det meget lave batteriforbrug.G305 holder til 10 millioner klik på de to primære knapper. G305 har også en midterknap, en knap til justering af DPI og to knapper på siden der kan programmeres ved hjælp af Logitech Gaming Software.Knapperne har separate fjederspændingsmekanismer så højre og venstre museknap altid opfører sig ensartet, og at der skal anvendes mindre styrke for at klikke. Dette sikrer præcise og pålidelige museklik selv når der games i højeste gear.Den solide, kompakte og lette konstruktion med indbygget plads til nanomodtageren gør G305 til en praktisk rejsekammerat.


OUTFIT ON A WINTER DAY | Sofie Kücken OUTFIT ON A WINTER DAY – Sofie Kücken\n1. Hvis jeg kunne leve i en anden tid skulle det være i 80'erne. 2. Jeg elsker at spise cherrytom\nOUTFIT ON A WINTER DAY\nTrøje, Zara / Jeans, Pieces / Støvler, Dr Martens / Halskæde, Jane Kønig /Ringe, Moss Copenhagen og Jane Kønig\nI dag var jeg ude og skyde billeder med Kathrine, og vejret var super dejligt. For første gang var det faktisk ikke koldt at gå udenfor uden jakke, fordi solen skinnede.\nJeg elsker dette meget simple og komfortable outfit, som fungerer rigtig godt som et hverdags outfit. Jeg elsker specielt trøjen, som er virkelig cool, fordi syningerne sidder udenpå. Det er en virkelig lækker detalje i følge mig!\nJeg håber at i har haft en god weekend!\nsimpelt forårs outfit\nA WINDY OUTFIT IN APRIL\nALMOST FULL LEATHER OUTFIT\nVirkelig dejligt outfit Sofie, kunne sagtens finde på at gå med præcis det samme! Har også de samme bukser 😛\n1. Hvis jeg kunne leve i en anden tid skulle det være i 80'erne. 2. Jeg elsker at spise cherrytomater. 3. Mit håndled er 13 cm. i omkreds …


Dødens ansigt – Boghjørnet\nBogudsalg på Aalborg Bibliotekerne #1: Udbyttet\n10. marts 2014 29. maj 2017 | Simone Hagemann\nJeg kunne jo ikke holde mig væk fra bogudsalget på Aalborg Bibliotekerne, så jeg var både afsted torsdag og fredag. Torsdag var jeg lidt irriteret, da jeg havde ventet fra før dørene åbnede, og alligevel først kom ind efter 40 minutter, hvilket, jeg simpelthen synes, er for dårligt. Men da jeg først kom ind, var det alligevel ventetiden værd.\nTorsdag var jeg derinde med Irene, og da vi jo havde stået så længe og ventet, var det bare om at komme i gang med at kigge, da vi endelig kom ind. Og af den grund fik vi ikke lige taget en kurv, hvilket vi hurtigt kom til at fortryde. Vi fandt nemlig hurtigt begge en god stak bøger, som vi blev nødt til at have med hjem. I alt fandt jeg seks bøger, jeg måtte have med hjem – og flere af bøgerne, er bøger jeg næsten lige har overvejet at købe. Så jeg var virkelig glad for udbyttet.\nFredag var jeg så derinde med min kæreste og hans ven. Denne gang var der heldigvis ingen kø, og samtidig var der blevet fyldt godt op med flere bøger. Inden for de første par minutter havde jeg derfor allerede hevet to krimier ned af hylden, som jeg længe har ønsket mig. Og det endte med, jeg kom hjem med syv bøger mere.\nFør jeg viser bøgerne frem, bliver jeg lige nødt til at rose Aalborg Bibliotekerne for deres virkelig gode udvalg. Der var rigtig mange nyere bøger, og selve udvalget var generelt meget varierende. I det hele taget er jeg sikker på, at alle ville kunne finde mindst én bog, der ville falde i deres smag. Desuden var en god del bøger, som var i forholdsvis pæn stand.\nJeg fik følgende bøger med hjem:\nDødens ansigt af Cody McFadyen\nI mørket af E.L. James\nPagninikontrakten af Lars Kepler\nSagen om ugledrengens afklippede klo af Dennis Jürgensen\nEn god del af bøgerne, der kom med hjem, var krimier. Hvilket nok på en måde var lidt bevidst. Det er i hvert fald mest krimier, jeg går efter til sådanne udsalg, da prisen gør at jeg kan prøve lidt mere, end jeg ellers ville. Denne gang købte jeg dog kun krimier, som er en del af krimiserier, som jeg allerede ejer én af bøgerne i – hvilket nok også bunder i, jeg længe har ønsket at eje/læse dem.


Ny EU-aftale løser ikke social dumping |\nNy EU-aftale løser ikke social dumping\nSkrevet af Anders Vistisen | I kategorien ARBEJDSMARKED Ingen kommentarer\nTags: Social dumping\nAf Anders Vistisen gruppeformand i EU-Parlamentet (DF)\nFor nylig blev EU´s længeventede revision af udstationeringsdirektivet og principper for sociale ydelser aftalt mellem Ministerrådet og EU-Kommissionen php mobile images. Og der gik ikke længe, før det sædvanlige kor af EU-tilhængere var ude at rose aftalen. Men djævlen ligger som bekendt i detaljen.\nFor aftalen kommer formentlig slet ikke til at have effekt i Danmark og vil intet løse 도리를 찾아서 다운로드. For ifølge arbejdsmarkedsforsker Jens Arnholtz fra Københavns Universitet, i et interview med DR 24.oktober, er udenlandske virksomheder f.eks. ikke forpligtet til at tegne overenskomst, og det vil det nye direktiv ikke ændre på 판도라 영상 다운로드. Da det samtidig er overenskomsterne, der i Danmark, i modsætning til andre lande, i høj grad bestemmer lønniveauet på det danske arbejdsmarked, kommer direktivet ikke til at hjælpe f.eks 용인기 다운로드. danske chauffører, der bliver udkonkurreret af arbejdere fra f.eks. Østeuropa.\nLæg dertil, at aftalen, som Ministerrådet og EU-Kommissionen blev enige om, heller ikke vil stille krav om, at underentreprenører i Danmark kan pålægges at følge den overenskomst, som gælder for hovedentreprenøren v43 firmware. Det vil betyde, at en hovedentreprenør i f.eks. byggebranchen stadig vil have en økonomisk interesse i at udbyde til et utal af underleverandører. Og vi har netop set en del sager, hvor f.eks Autotune evo. håndværkere er blevet hyret ind som underentreprenører, fordi det dermed er muligt at foretage underbetaling.\nMen hvad der næsten er endnu værre, og som er en udløber af aftalen om udstationeringsdirektivet, er nye principper for sociale rettigheder windows xp embedded 다운로드. EU har nu aftalt tyve principper, som alle borgere i EU skal have ret til. Det handler om alt fra social beskyttelse, til børnepasning, boliger til hjemløse, sundhedsydelser osv Is a remix download. Og selv om principperne ikke i første omgang har retsvirkning for landene, så viser historien, at når først EU er gået ned ad en vej, så ender den ofte med at gå hele vejen Windows 10 Pro. Hvem sagde social union? Og EU-Domstolen har tidligere vist, at den meget gerne fortolker i retning af mere union.\nI det hele taget er vi i Dansk Folkeparti langt fra begejstret for udstationeringsdirektivet, og perioden, det er muligt at udstationere medarbejdere i et andet EU-land – Ministerrådet er blevet enige om 18 måneder og EU-Parlamentet 24 måneder, er alt, alt for lang top 10 guns. Hvis der endelig skulle være en tidsperiode, burde den maksimalt være tre måneder, hvilket i øvrigt også passer med den periode, som et gennemsnit er udstationeret. Historien har desuden vist, at udstationeringsdirektivet ofte bliver brugt af arbejdsgiverne til at få billig arbejdskraft fra specielt Østeuropa, der er parat til at arbejde for en meget lavere løn og andre arbejdsvilkår end danskere.\nI stedet kerer vi os om danskerne og deres mulighed for at få arbejde i Danmark. For mens flere danske virksomheder hyler op om mangel arbejdskraft i mange faglærte brancher og bruger det som løftestang til at hente flere udlændinge ind som arbejdskraft, er der mere end 12.000 unge danskere, der mangler en læreplads. Og for os i Dansk Folkeparti er det vigtigere at sikre danskerne en arbejdsplads end at tækkes virksomhedernes ønske om billig arbejdskraft. Udlændinge på danske arbejdspladser kan være ganske fint, men kun hvis det ikke er muligt at skaffe en dansker til samme job. Og så skal udlændinge selvfølgelig have en dansk løn og arbejdsvilkår på alle parametre.\nI Dansk Folkeparti siger vi klart nej. Personer, der arbejder i Danmark, skal have overenskomstmæssig løn, og EU skal ikke udvikle sig til en social union. Det er almindelig sund fornuft. Desværre hjalp Socialdemokratiet regeringen i Folketinget med at bakke op om den skadelige aftale, som Ministerrådet og EU-Kommissionen vedtog. Men for Socialdemokraterne har hensynet til EU også altid vejet tungere end hensynet til danske arbejdere.


Feriebolig Curemonte | Lej nemt feriebolig eller ferielejlighed i Curemonte\nLej feriebolig i Curemonte med vores søgemaskine. Vi har samlet feriehuse og ferielejligheder i Curemonte fra både bureauer og private her på siden, så du hurtigt og let kan finde den indkvarteringsløsning, der passer dig allerbedst.\nHvis du lejer din feriebolig i Curemonte med Campaya, er du sikret den bedste pris på markedet. Vi samler feriehuse og ferielejligheder i Curemonte på tværs af de mange forskellige udlejere her på siden og lejer dem ud til præcis den samme pris, som de også kan lejes til på udlejningsbureauernes egne portaler.\nCampaya har mange års erfaring med at hjælpe danske og udenlandske feriegæster godt afsted på rejser til Curemonte. Når I er indlogerede i jeres feriebolig Curemonte, er der rigtig gode muligheder for at læne sig tilbage i sofaen eller terrassestolen med en god kop kaffe, en kold øl eller måske et glas vin og ellers bare nyde hinandens selskab. En ferie i feriebolig i Curemonte er nemlig indbegrebet af hygge og god stemning. Her er der ingen sure pligter som tøjvask, rengøring og græsslåning. Det eneste, I skal koncentrere jer om, er at få hygget godt og grundigt i hinandens selskab med hyggelige gåture og oplevelser i nærområdet og med brætspil ved spisebordet eller familiemiddage på terrassen.\nHos Campaya har vi gennem en lang årrække hjulpet mange tusinde feriegæster med at finde de perfekte rammer til ferien. Vi er en danskejet virksomhed, som har som sin udtalte ambition at give vores gæster den bedst mulige oplevelse og service. Både digitalt, når I bruger vores søgemaskine og finder den perfekte feriebolig Curemonte, og når I snakker med os i telefonen.\nI er med andre ord sikret et højt serviceniveau og en tryg oplevelse, når I lejer jeres feriebolig Curemonte på Campaya.dk.\nFeriebolig i Curemonte for enhver smag\nDer findes ferieboliger i Curemonte og omegn for enhver smag. Det er oplagt at bruge ferieboligen som udgangspunkt for en kør selv ferie Curemonte, og I kan bruge vores søgemaskine herunder til let at finde den indkvartering, der passer jer bedst. I har mulighed for at præcisere, hvor meget jeres feriebolig Curemonte må koste, hvilken periode I skal bruge boligen i, hvor mange personer der skal være plads til, antal sengepladser, afstand til strand og by, om I må have husdyr med, om det skal være en et feriehus eller ferielejlighed Curemonte med pool og meget mere.\nHvis der ikke er en ferielejlighed eller et feriehus Curemonte, som passer helt præcist til jeres ønsker, kan det være en god idé at søge i et af områderne tæt ved.\nI kan også bruge kortfunktionen til at trække jer rundt i området og se, hvor de forskellige muligheder ligger. Det er en smart måde at blive inspireret på, og samtidig kan I på den måde let finde et feriehus eller en ferielejlighed Curemonte, som ligger tæt på det, I ønsker.\nNogle vil nemlig helst holde deres ferie midt i naturen, mens det for andre er vigtigere at være tæt på by og oplevelsesmuligheder. Den slags kan I helt selv definere i søgemaskinen, så I finder den feriebolig Curemonte, som passer bedst til jeres ønsker.\nFå en minderig ferie i Curemonte\nFor mange er barndommens ferier noget af det, der træder tydeligst frem i hukommelsen. De varme sommeraftener med badeture til stranden, hygge og plasken i poolen og ture ud til lokale seværdigheder. Alt det og meget mere er oplevelser, der brænder sig fast i ethvert barnesind og er noget, som I sammen og hver for sig kan tænke tilbage på i mange år og i nogle tilfælde for altid. Der er ikke noget, der knytter folk sammen som oplevelser, og en feriebolig Curemonte er den perfekte ramme om en masse hyggelige oplevelser i familiens skød. Hvis du selv tænker tilbage, har du så ikke et særligt minde fra en tur til sydens sol, som står knivskarpt i din erindring?


Mynteglæde af Slagt en hellig ko\nJeg har grønt hav. Overvældende grønt og lifligt at drukne i, tror jeg. Velduftende og blødt, spændstigt og velsmagende er det i hvert fald.\nI den ene ende af krydderurtebedet hersker orden. I den anden hersker anarki, for her bor mynterne og jeg holder så meget af, at de får lov. De vokser vildt, breder sig og gør sig smukke i hinandens selskab. De er forskellige. Både smag og udseende varierer, men alle er de gode i hvert deres selskab.\nDer er Æblemynten, som er den frodigste og har lyse tegninger på bladene og er noget af det smukkeste jeg ved. Der er Pebermynten, måske rester af Bergamot Mynten og Grøn Mynte. Sammen med nogle af de andre, søde, friske og frække krydderurter gør de mit sommervand til en helt speciel nydelse. En håndfuld af skidtet krammes i solvarme hænder og smides i en kande iskoldt vand og du har den lifligste sommerdrik.\nSkal jeg kun anbefale to krydderurter til sommerens vand, bliver det slet ikke mynterne, men i stedet salvierne, som vinder.\nSå skal man have Ananassalvie, som er helt og aldeles vidunderlig, frisk og overraskende i sin udsøgte sarte og alligevel kraftige ananassmag og så må den sidste blive den nyindkøbte Solbærsalvie, som simpelthen er helt og aldeles pragtfuld med sin sarte smag af søde solbær – men hvem kan lade være med at supplere med en mynte eller to?\n5. juni 2007 at 07:41\nHusk at mynte spreder sig helt vildt.\nDet kan vaere en fordel at plante den i en spand, man graver ned i jorden, hvis man ikke lige har en kaempe have og et stort forbrug af mojitos.\n5. juni 2007 at 05:39\nDe to nederste billeder er til venstre: Ananassalvie og højre: Solbærsalvie, så der har du billederne, Mette :-)\nIrene, du er et skarn ;-)\nOmkring opskrifter, så må det blive en anden gang. Mit fly afgår om et øjeblik – så vi “ses” om et par dage :-)\n4. juni 2007 at 23:40\nEr også vild med krydderurter, men mynte har jeg aldrig prøvet kræfter med… Men nu får jeg lyst, jeg skal afsted til planteskolen tror jeg, eller hvor man nu køber den henne? Og salvie, jeg har kun den almindelige, det skal der også laves om på!\nLiflig sommerdrik, har du et par gode opskrifter?? Det lyder nemlig lækkert og anerledes og tilmed fantasktisk sundt!\n4. juni 2007 at 23:20\nPaa en hjemlig vandretur i gaar ved en soe i naerheden af Moesgaard vandrede vi pludselig rundt i mynte. Et helt taeppe.\nEn lille paamindelse til os alle om, at vi skal huske at holde oeje med det, der findes udenfor haekken. Ogsaa.\nHvad bruger du ananassalvien til?\nMaa vi bede om et billede af solbaersalvien?\nLiselotte, en halv potte tør jord, det kan man vist ikke kalde “for god ved” … ;-)\n4. juni 2007 at 22:32\nSå køb du en til Kissers have, for den er dejlig, Jonna :-)\n4. juni 2007 at 22:28\nEr lige kommet hjem med faven fuldt af citron melise, er hængt op og bliver til den dejligste te til vinter der er langt borte nu.\nHvis jeg kunne presse en mere ind på altanen så skulle det vist være solbær salvier lyder godt.\nEller købe en til kissers have der får jeg lov og plukke hver gang jeg kommer forbi, dejligt med venner der har have.\n4. juni 2007 at 22:18\nVores krydderurter vokser i den magreste jord på hele matriklen, men de trives tilsyneladende med lidt pineri. Måske du er for god ved din, Irene?\n4. juni 2007 at 21:53\nJamen tak da, så ved jeg da osse at min solbær-salvie kan bruges til noget.\nJeg købte den kun for de dejlige røde blomsters skyld. ;-))\n4. juni 2007 at 21:42\nananassalvie skal jeg vist have fat i naeste gang jeg faar et anfald af groenne fingre (sikkert til naeste foraar)\n4. juni 2007 at 21:41\nVil straks plantet mine mynter et sted i haven .. og vil skrive æblemynte bag øret.\nMynte tea er heller ikke ringe .. en lille hånd fuld, kogende vand og lidt rørsukker i et glas og mums :-)\n4. juni 2007 at 21:33\nAha, det vil jeg da skrive mig bag øret.\nDine purløg får mig næsten til at græde af længsel. Du skulle se de strå i potte, som det lokale supermarked ville prakke mig på forleden. Frygteligt!\n4. juni 2007 at 21:18\nNoget siger mig at jeg skal have min undskyldning af en ananassalvie omplantet snarrest!


U15-DM: AaB Ishockey og Rødovre bedst fra start – Faceoff.dk\nU15-DM: AaB Ishockey og Rødovre bedst fra start\nFørstedagen af U15-DM er afviklet i Rødovre, og det blev hjemmeholdet og de jyske mestre fra Aalborg, der kom bedst fra førstedagens seks kampe. Dem får du her i noteform:\nRødovre-Rungsted 2-1 str: Rødovre måtte lidt overraskende ud i straffeslag i dagens første kamp ved U15-DM, der spilles i Rødovre Skøjte Arena. Et godt kæmpende Rungsted-hold klarede 1-1 i ordinær kamp, men straffeslagene blev vundet af Aya Juhl Petersen, der klarede alle Rungsteds forsøg. Der var i øvrigt masser af skoleelever på lægterne, så de to hold spillede for næsten 600 tilskuere.\nGentofte-Frederikshavn 6-3: Gentofte lynede fra start med tre mål i første periode, og det lykkedes ikke for nordjyderne at komme tilbage i kampen. Vladimir Baran, Gentofte, blev dobbelt målscorer.\nAaB-Herning 3-1: Philip Nolsøe scorede dobbelt for Aalborg i det jyske “lokalderby”, hvor nordjyderne scorede et tidligt mål, men først fik øget sent i kampen. En Herning-reducering var ikke nok til et comeback for midtjyderne.\nRødovre-Frederikshavn 5-1: Rødovre på forkant i hele kampen mod nordjyderne. Ingen problemer for Rødovre, der havde Edvard Lundmark med tre assister og Marcus Pihlmann Jensen med et mål og to assister for hjemmeholdet.\nGentofte-Herning 0-1: Vigtig sejr for Herning, der havde Mikko Lønne Sørensen som matchvinder og dermed bevarede håbet om en topplacering.\nAaB-Rungsted 5-0: Philip Nolsøe fortsatte sit fine spil fra første kamp og leverede tre point for Aalborg, der vandt stensikkert og dermed bragte sig i spidsen for tabellen efter førstedagen.


Hverdags Glimt #24 | Ditteblog\nGod søndag eftermiddag kære læsere. Sikke et skønt efterårs vejr vi har i Aarhus i dag. Derfor må\nJeg føler der er gået meget mere end en uge siden jeg sidst lavede et hverdags glimt indlæg. Måske fordi jeg nåede en del forskellige ting i sidste uge. Events, København, Arbejde, venindetid, kærestetid og arbejde med OH. Vi har forresten skruet lidt ned for opdateringerne derovre nu hvor der ligger en del indhold, da tiden selvfølgelig ikke skal tages fra vores egne blogs. Men der kommer stadig løbende nye artikler og så arbejder vi også på nogle sideprojekter, så husk at følge med på OH’s Instagram også.\nUgen startede med et mandags event på Starbucks. Egentlig ret smart at ligge det på en mandag, hvor man altid trænger lidt ekstra til kaffe. Deres nye fine to-go krus der er designet af deres kunder har netop erstattet deres klassiske krus, indtil de røde jule-krus kommer d. 29. november. Vi fik smagt en masse forskellig kaffe og deres lækre salater.\nTirsdag morgen kl. 7 tog Michelle og jeg færgen til Kbh. Se lige en udsigt ind over Aarhus. Åh så har man jo ikke lyst til at forlade sin yndlings by.\nKbh var nu også rigtig fin og vi fik blandt andet besøgt den populære Instagram café Apollo bar.\nVi fik også besøgt et par PR bureauer og fik set på de kommende kollektioner. Jeg glæder mig så meget til forårs kollektionerne.\nJeg havde taget min yndlings kjole på fra Karen by Simonsen. Jeg synes den er så smuk.\nSidste stop i Kbh var eventet med Maybelline og Gigi Hadid. Jeg har efterhånden fundet en del favoritter fra kollektionen og der er især en mascara som jeg blir nødt til at anbefale jer snarest.\nHjemme igen efter en lang dag i Kbh hvor jeg skulle på arbejde i Companys. Mit ansigt havde virkelig brug for noget opfriskende og som jeg skrev på Instagram, så er Biotherms “Cooling gel” fra “Skin Oxygen” serien blevet en favorit.\nTorsdag var jeg virkelig drænet for energi så min dag blev brugt hjemme på at tage billeder, svare på mails og alt muligt andet man kan gøre i sit eget langsomme tempo. Om eftermiddagen mødtes jeg med to veninder til hindbærsnitter og juleskum.\nFredag mødtes Michelle og jeg på Langhoff & Juul. Vi fik blandt andet planlagt det møde vi skal til i Aalborg i dag.\nVi smuttede også lige en tur i Ganni for at lure på den nye kollektion. SÅ MANGE PÆNE TING!\nFredag eftermiddag gik det rent sent op for mig, at det var Mortens aften. Så det blev lyn udgaven med andebryst, fritter og Jensens sovs. Ikke helt værst faktisk.\nWeekenden bød på arbejde og så mødtes jeg med min veninde Malene som var på besøg fra Kbh. Hun har en lille baby pige i maven og jeg kan slet ikke vente med at møde hende ♥\nNu vil jeg smutte mod banegården og mødes med Michelle til en kop kaffe og en togtur mod Aalborg. God mandag ♥\nÆh, sikke en rar uge! Og fuck hvor er din Karen by Simonsen bare røvflot til dig 😀\nGod søndag eftermiddag kære læsere. Sikke et skønt efterårs vejr vi har i Aarhus i dag. Derfor måtte jeg lige hive Casper ud af …


Villa Launis i Camogli til Bedste Pris-garanti | Agoda.com\nVilla LaunisVia F.Molfino 45, Camogli, Camogli, Italien, 16030 - Se på kortAnmeldelsespoint4,6Baseret på8anmeldelserVilla LaunisSe flere billederSe flere billederSe alle 24 billeder\nMere om Villa Launis\nNår du besøger Camogli, så vil du rigtigt føle dig hjemme på Villa Launis, der tilbyder kvalitetsovernatning og fantastisk service. Herfra har gæster glæde af nem adgang til alt, hvad denne livlige by kan tilbyde. Med sin praktiske beliggenhed tilbyder dette hotel nem adgang til byens vigtigste seværdigheder. På Villa Launis gøres der alt for at sikre gæsternes komfort. For at opnå dette tilbyder hotellet den mest imødekommende service og de bedste bekvemmeligheder. For at nævne blot nogle få af hotellets faciliteter tilbydes der blandt andet parkering, familieværelse. Nyd værelsesfaciliteter i høj kvalitet under dit ophold. Nogle værelser indeholder opvarmning, altan/terrasse, ekstra lange senge (> 2 meter), fjernsyn, køleskab, der er med til at hjælpe gæster med at få ny energi efter en lang dag. Hotellet tilbyder vidunderlige fritidsaktiviteter, som have, der er med til at gøre dit ophold uforglemmeligt. Uanset hvilket formål din rejse har, så er Villa Launis et fremragende valg, når du er i Camogli.\nDu bedes give Villa Launis besked om, hvornår du regner med at ankomme. Du kan gøre dette ved at skrive til hotellet i boksen "Særlige anmodninger" når du booker, eller du kan kontakte overnatningsstedet. Du finder kontaktoplysningerne på din reservationbekræftelse. Ved ankomst opkræves et skadesdepositum på 300 EUR. Depositummet er fuldt refunderbart ved udtjekning, såfremt der ikke findes skader ved inspektion af værelset.


Styrketræning der virker - Side 27 | Aktiv Træning\nHvorfor får jeg spændinger i nakken?\nJeg får ofte spændinger i nakken og hovedpine efter styrketræning. Gør jeg mon noget forkert?\nPrøv kræfter med disse øvelser. Tilsammen giver de dig god træning af hele kroppen.\nHvordan skal jeg ligge under bænkpres?\nJeg synes, at jeg ligger noget ustabilt, når jeg træner bænkpres. Hvordan kommer jeg til at ligge optimalt?\nDrop pausen og bliv stærk\nCirkeltræning er effektiv styrketræning, viser ny forskning. Og du sparer tid med de korte pauser.


Dagens avis er fuld af paradokser | Information\n- Københavns Lufthavn konfiskerer 30 ton væsker fra flypassagerer hver måned, og passagererne sukker over de lange køer i sikkerhedskontrollen. Nu påpeger flere, at netop disse køer er et sikkerhedsproblem - dvs. et oplagt mål for selvmodsbombere.\n- På trods af løfter om det modsatte giver EU færre penge til fattige lande, og indsatsområderne er ofte dikteret af EUs egne interesser frem for lokale behov. Det viser en ny rapport fra CIDSE - sammenslutningen af katolske hjemmeorganisationer. Det er kort sagt ærgerligt for målrettet indsats mod fattigdom og dens følgevirkninger hjælper faktisk. Det er tre millioner tanzanianske skolebørn et godt eksempel på.\n- Samfundet bliver stadig rigere, mens folkesundheden har fået en stærkere social slagside. Fx er der dobbelt så mange svært overvægtige med kort uddannelse sammenlignet med deres højtuddannede medbrgere. Ghettoiseringen af boligkvarterer og job uden arbejdsglæde er nogle af forklaringerne - folk trøstespiser, når de er stressede og utilfredse, påpeger lægen Jerk W. Langer.


Tæt på udsolgt til årets store internationale bygge- og anlægskonference i København - Building Network\nNye bygge- og udviklingsprojekter på vej i Hovedstadsområdet\tDen hollandske betonproducent BYLDIS får flot modtagelse på det danske marked\n4. november 2018 Af Nsyd_Admin\nDen 15. november 2018 går dørene op til den store internationale bygge- og anlægskonference, The 2nd Annual Building Network Construction Conference 2018, der finder sted på det eksklusive Copenhagen Marriott Hotel midt i København.\nBuilding Network og Copenhagen Capacity kan igen i år se frem til, at deres konference tegner til at blive et stort tilløbsstykke. 140 deltagere fra mere end 15 lande har tilmeldt sig konferencen, hvor Europas førende bygherrer, rådgivere og entreprenører møder op for at fremvise planerne for nogle af Skandinaviens største byudviklings- infrastruktur-, hospitals- og hotelprojekter.\nSom en særlig del af konferencen er der skabt mulighed for at reservere tid til personlige samtaler med konferencens 15 oplægsholdere, der blandt andet tæller bygherrer fra Københavns Lufthavne, Stockholm Metro, Banedanmark, Vejdirektoratet og svenske Trafikverket. Derudover kan deltagerne møde direktør Gianluca Racana fra et af de mest eftertragtede og omdiskuterede arkitektfirmaer i verden, Zaha Hadid Architects, samt Arkitekterna Krook & Tjäder, der præsenterer to store hotelprojekter i Danmark.\nPå konferencen vil der endvidere være en helt unik chance for at mødes med beslutningstagerne fra nogle af Europas største entreprenører herunder belgiske Besix, spanske Acciona og det italienske konsortium Itinera-CMB, der har vundet en række større entrepriser på det nye supersygehus i Odense og Sjællands Universitetshospital i Køge.\nDirektør i Building Network Mickey Lund fortæller, at danske rådgivere, entreprenører og leverandører vil få lejlighed til at skabe nye kontakter og vise deres kompetencer frem til de mange store udenlandske aktører i Skandinavien, der deltagerer på konferencen. Den store interesse for at synliggøre sin virksomhed har været så stor, at de sidste udstillingspladser nu også er udsolgt.\nSe om der stadig er flere billetter tilbage til konferencen:


Justin Bieber - Sprouse huset - ligeglad? - Movellas\n"Enlig hjemme!" råbte jeg da vi kom end i huset, det skal lige siges at jeg er flyttet sammen med Justin. Jeg har ikke haft det godt på det siste jeg har haft; kvalme ondt i hovedet ovs. Alle de ting man har når man er gravid, Man kunne godt se at at jeg har en smule baby-mave!. Men jeg har være fald bestilt til til læge, så kom hjem til mig/os klokken 3. Jeg var röv nervøs, for hun kom med dræber midler, eller måske overdriver jeg en lille smule! "Henriette der ikke noget at være nervøs for" smilte han stille "nej nej det heler ikke dig det går ud over!" jeg var meget nervøs. Justin mobil ringet\n' Det Justin '\n' vent lige 2 sek. ' "Må Ryan og Chris(Christian) komme?" spurte han "Jo med glæde!"\n' jeg henter jer. Kl 14:14 køre jeg hjemme fra '\n' okay ses' og han lage på. Nej vent vi der var jo næsten der dræberlægen kom!\n"Justin det jo der dræber lægen kommer!" men hvad vis de opdaget at jeg var gravid? hvad vil folk ikke tro? alle mulige spørgsmål køre i hovedet på mig 24/7! "Det er altså der de kommer" "Så gør jeg ned til den dumme læge jeg skal ikke opdages af Butler og Beadles!" han grinte af mig "hvornår er vi begyndt at bruge efternavne Sprouse" "ej Justin jeg mener det jeg skide nervøs!" "nur lille skat" han gik over til mig og begyndte at kramme mig. "Justin det jo ikke dig der rander rundt med et barn ende i maven mens du skal til lægen og bliver nød til at gå den lange vej ned til dræber stuen og er ved at skide i bukserne!" jeg trak mig væk og kigget ham i øjne "hvad vil du have jeg skal gøre skal de tage med?" jeg kigget på med er-du-åndsvag blikket "hvad tror du ikke de tænker jeg ringer til min læge og siger at jeg kommer end på den fælde dræber stue!" så kig jeg hen og ringet til min læge Jane. Jeg gik tilbage til stuen "Justin?"\n"nej glem det" jeg gik end i stuen og så noget tv "hvad vil du sige?" han satte sig på mit skød "Justin nej!" han kysset mig på kinden og af en eller anden grund rødmed jeg? "kan jeg stadig få dig til at rødme?" "det kan du vel?" jeg stor smilte "Kan jeg ikke ringe og få en hurtiger tid jeg VIL have at du skal med det jo en del af det" "jo det kan du godt" jeg tror han er begyndt at være lige glad? det såret mig rigtig meget. Jeg mistet mit smil, jeg gik oven på og lage mig i sengen. "HENRIETTE VI KØRE NU!" kunne jeg høre Justin råbe, jeg gik nervøst ned af trappen og tog sko og jakke på. Jeg fik til klokken 13:30(1:30) vi satte os end i bilen og Justin starte den. Der var ingen da der sagde noget hele vejen.\nDa vi ankom gik vi ud af bilen. Vi gik end af døren\n"vi har tid til klokken halv 2" Justin tog ordet\n"vent her jeg henter Jane" lidt efter kom Jane.\n"hej Henriette og Justin!" hun kom over og gav os hånden, vi gik end på hendes stue\n"du kan bare ligge dig i sengen" jeg lage mig i sengen med alle mulige dræber midler-\n" I har ikke fortrudt?" hun kigget på mig og Justin med et smil\n"nej vi har ej!" skyndte Justin sig at sige jeg sukket.\n"vi bedøver dig og når du er vågnet er alt overstået okay?" jeg nikket kort og lukket øjne.


jernbaneteknik - sikkerhed | lex.dk – Den Store Danske\nJernbaneteknik - sikkerhed, Truslerne mod jernbanesystemets funktion såsom fejl, udfald, forstyrrelser og uheld imødegås ved instruktoriske og tekniske foranstaltninger. De grundlæggende trafiksikkerhedsmæssige problemer er dels at forhindre sammenstød mellem to tog på samme spor eller på to spor, der krydser hinanden eller løber sammen, dels at forhindre sammenstød med vejkøretøjer.\nEndelig skal kørsel over bevægelige spordele, fx sporskifter, sikres. Disse problemer løses ved samvirken mellem sikkerhedsbestemmelser, sikkerhedspersonalets årvågenhed, bremseindretninger og sikringsanlæg. I sikkerhedsbestemmelserne gives regler for stationsbestyrelse og togfremførelse, signalbetydning, togstørrelser, bremsebestemmelser osv.\nFra jernbanens barndom var reglerne få og enkle; dette sammenholdt med primitive bremsemetoder og signalanlæg stillede store krav til sikkerhedspersonalets årvågenhed.\nVæsentlige forbedringer er opnået gennem fremkomsten af bl.a. den i en togstamme gennemgående bremse og senest togkontrolanlæg (se ATC, HKT og ETCS), der har muliggjort helt eller delvist bortfald af signaler langs banelinjen, og overførsel af sådanne signalers meddelelser direkte til togenes førerrum, så fx stopsignaler ikke passeres.\nTidligere tiders (kurve)semaforer, der ikke fortalte noget om banens tilstand, er for længst erstattet af først armsignaler, senere daglyssignaler, der over for lokomotivføreren oplyser, om sporet er frit eller besat, om tilladt hastighed, afgrening osv.\nIndførelsen af centralsikringsbegrebet i slutningen af 1800-t. har været af afgørende betydning. Sporskifter og signaler sættes i indbyrdes afhængighed, så der kun kan gives kør-signal, hvis sporet er frit og sporskifterne stillet rigtigt. Princippet er også videreført i nutidens computerbaserede sikringsanlæg.\nTilsvarende stor betydning tillægges indførelsen af især sporisolationer på stationer og den fri bane. Mange jernbaneuheld, herunder nogle af de største ulykker, tilskrives fraværet af disse installationer, fordi det har muliggjort fejlagtig signalgivning til besatte spor.\nAfviklingen af toggangen kan baseres på meldingsudveksling mellem nabostationerne, oprindelig vha. morsetelegraf, senere telefon eller radio. Sådan meldingsudveksling er ikke nødvendig, hvor der findes linjeblokanlæg. Fra en fjernstyringscentral kan mange, ofte fjerntliggende stationers signal- og sikringsanlæg betjenes. På sådanne strækninger kan trafikafviklingen være automatiseret, idet togkrydsninger, ændring af togrækkefølge m.m. styres af computerbaserede anlæg. Se også sikringsanlæg.\nLæs videre om jernbanemateriel eller læs hovedartiklen om jernbaner.\nVil du citere denne artikel? Kopier denne tekst og indsæt den i din litteraturliste: Løvborg, Eilert; Gundersen, Erik: jernbaneteknik - sikkerhed i Den Store Danske på lex.dk. Hentet fra https://denstoredanske.lex.dk/jernbaneteknik_-_sikkerhed\ncombination: opdateret af Sara Monggaard for 14 minutter siden\ncamisol: opdateret af Sara Monggaard for 19 minutter siden


4 stjernede hoteller Malmø\n4 stjernede hoteller i Malmø\nMalmö Museum (21)\nFolkets Park (21)\nMalmö Reptilcenter (21)\nKaptensgatan 1, Malmø, Sverige (Vis kort)\nScandic Malmo City Hotel er klassificeret som 4-stjernet og er placeret omkring 29 km fra Hovedbanegård. Hotellet blev grundlagt i 1960, og gennemgik en komplet renovering i 2009.\nMaster Johansgatan 1, Malmø, Sverige (Vis kort)\nDet 4- stjernede Hotel Duxiana Malmo kan prale af central beliggenhed i nærheden af Pildammsparken, som ligger omkring 1,8 km væk.\nDag Hammarskjolds Torg 2, Malmø, Sverige (Vis kort)\nDet stilfulde 4-stjernede Clarion Hotel And Congress Malmo Live tilbyder udstyret med klimaalæg værelser med en betagende udsigt over byen.\nAdelgatan 7, Malmø, Sverige (Vis kort)\nTilbyder moderne værelser, ligger det superior Elite Residens Hotel inden for en 5 minutters gåtur fra Form Design Center . Hotellet råder over 5 etager og blev renoveret i 2006.\nMaster Johansgatan 13, Malmø, Sverige (Vis kort)\nMaster Johan er et klassisk 4-stjernet hotel 1,7 km fra Pildammsparken og 1,5 km fra Turning Torso. Hotellet blev grundlagt i 1990, og gennemgik en komplet renovering…\nMaster Johansgatan 15, Malmø, Sverige (Vis kort)\nBeliggende i centrum af Malmø, og det 5-stjernede Renaissance Malmo Hotel byder på en 24 timers restaurant, som serverer fiske- og skaldyrs-retter. Med indkvartering i en 4-etagers…\nSjomansgatan 2, Malmø, Sverige (Vis kort)\nHotellet ligger i centrum af et kosmopolitisk område, i nærheden af Moderna Museet, Tivoli og Pildammsparken. Dette hotel har været i drift i Malmø siden 2011, og omfatter en moderne…\nPer Weijersgatan 6, Malmø, Sverige (Vis kort)\nBest Western Plus Hotel Noble House er et 6-etagers hotel i centrum af Malmø, som tilbyder en sauna, en frisør og en golfbane samt kvalitets-service, og ligger tæt…\nOstergatan 10, Malmø, Sverige (Vis kort)\nPlaceret ved kasinoer, barer og en koncertsal, omfatter det charmerende hotel 229 værelser og tilbyder jacuzzi, allergivenlige værelser og en frisør. Hotellet blev grundlagt i 1988, og gennemgik en komplet…\nStortorget 7, Malmø, Sverige (Vis kort)\nDet traditionelle 4-stjernede Scandic Kramer Hotel tilbyder komfortable værelser. Hotellet råder over 4 etager og blev renoveret i 1999.\nTriangeln 2, Malmø, Sverige (Vis kort)\nScandic Triangeln er et 4-stjernet attraktivt hotel, som tilbyder en elegant indkvartering indenfor rækkevide af Ribersborgs Strand, Turning Torso og Tivoli. Bosat i en 20-etagers bygning, blev hotellet…\nNorra Skolgatan 24, Malmø, Sverige (Vis kort)\nDet 4-stjernede The More Hotel ligger i hjertet af Malmø. The More Hotel har budt velkommen til gæsterne til dets luksus-værelser siden 2004.\nStora Nygatan 35, Malmø, Sverige (Vis kort)\nDet behagelige 4-stjernede Scandic St Jorgen Hotel ligger i hjertet af Malmø. Scandic St Jorgen Hotel har budt velkommen til gæsterne til dets moderne værelser siden 1966.\nNorra Vallgatan 62, Malmø, Sverige (Vis kort)\nPlaceret i hjertet af Malmø, tilbyder det 4-stjernede Elite Savoy Hotel smagfulde værelser samt allergivenlige værelser, en sauna og en golfbane. Dette unikke hotel stammer fra 1864 og blev…\nTyfongatan 1, Malmø, Sverige (Vis kort)\nDet centrale Story Hotel Studio Malmo består af røgfrie værelser og giver hurtig adgang til Slottsparken, som er 1350 meter væk.\nStortorget 15, Malmø, Sverige (Vis kort)\nEngelbrektsgatan 16, Malmø, Sverige (Vis kort)\nDet 4-stjernede Clarion Collection Hotel Temperance hotel tilbyder røgfri indkvartering og giver hurtig adgang til Pildammsparken, som ligger omkring 1500 meter væk. Siden 1902 har det været et prominent…\nBaltzarsgatan 20, Malmø, Sverige (Vis kort)\nDet 4-stjernede Garden Hotel tilbyder luftige værelser i nærheden af Pildammsparken, Turning Torso og Tivoli. Efter ombyggelsen i 2011, har hotellet en moderne arkitektur.\nAdelgatan 4, Malmø, Sverige (Vis kort)\nLigger cirka 10 minutes gang fra Moderna Museet, er Mayfair Hotel Tunneln et 5-etagers hotel i et shopping område af Malmø, der byder røgfrie værelser med engelsk indretning. Det…\nHyllie Stationstorg 29, Malmø, Sverige (Vis kort)\nDet komfortable 3-stjernede Quality Hotel View tilbyder tøjvask, en strygeservice og rengøring. Inden for få minutter fra det shopping kvarter, i nærheden af Tivoli, Universitetssjukhuset MAS og Sibbarps Saltsjöbad.


Sygdomme - ubehag | Babyer, børn og graviditet - Et magasin for gravide kvinder, forældre og hele familien | December 2021\nHormonelle ændringer i graviditeten, der påvirker en kvindes tandhelse\nGraviditet er et meget vigtigt trin i en kvindes liv, hvor der er flere fysiologiske ændringer, som vi skal kende, herunder hormonelle ændringer i graviditeten, der påvirker kvinders tandhygiejne. I den første konsultation, der foretages med jordemoren, når graviditeten er diagnosticeret, anbefaler vi altid et besøg hos tandlægen, hvorfor?\nPerinatal sorg: antager død, når du forventer en baby\nTabuemne, hvor de findes, tabet af en baby, endnu mere, hvis det endnu ikke var født. Hvor vanskeligt det er at antage død, når vi i virkeligheden forventer liv. Desværre forekommer dette mere, end vi tror, og har et navn: perinatal sorg. I Spanien når en ud af fire graviditeter ikke en periode, dvs. 25 af graviditeterne går tabt på et tidspunkt i graviditeten.\nFødevarer, der skal undgå halsbrand i graviditeten\nDesværre er halsbrand, som kvalme og kraftige fordøjelser, symptomer, der typisk er forbundet med graviditet. Halsbrand har en tendens til at blive mere tydelig i løbet af anden halvdel af graviditeten, og især værre i tredje trimester, når volumen, som livmoren besætter med fosteret, presser på resten af organerne, hvilket efterlader lidt plads.\nSådan behandles lus under graviditet\nEr du gravid, og du har lige fundet ud af, at du har hovedlus? Det er bestemt en situation, der skaber mange tvivl, især med hensyn til hvordan man behandler lus i graviditeten, og det er, at du er på et tidspunkt i dit liv, hvor det ikke er praktisk at tage mange medicin eller stoffer og kemikalier, da kan påvirke babyens udvikling.\nHvad er fostervandssyndrom hos babyer\nUnder graviditet er det meget vigtigt, at kvinden foretager al medicinsk kontrol for at forhindre mulige misdannelser hos babyen, ligesom det er vigtigt, at hun tager sig af sin diæt og er meget opmærksom på den livsrytme, hun fører (det skal være langsomt og uden stress). På denne måde er det muligvis (bare måske) muligt at forhindre fosteret i at lide af fostervandsyndrom, selvom denne sygdom ifølge eksperter ikke kan bestemmes at forekomme på grund af noget særligt, men er tilfældig og ikke arvelig.\nHyppigst og hyppigt ubehag i gravide kvinder\nGraviditet er en fysiologisk situation, hvor hormonelle ændringer forekommer, og hvor kvinden oplever en række ændringer i blodvolumen, hjertefunktion og nyrefunktion for at imødekomme fosterets voksende behov. Disse ændringer kan forårsage noget ubehag, især i den sene graviditet.\nSådan forhindres listeriose i graviditeten: hvad man ikke spiser\nUnder graviditeten skal kvinden tage sig af sin diæt for at undgå ethvert tilbageslag, der kan skade hendes sundhed og babyens i tarmen. Sammen med toxoplasmose og salmonellose kan listeriose i graviditeten udgøre en risiko for graviditet.\nEr du gravid? Det er helt sikkert den bedste nyhed, du nogensinde har modtaget! Den mest normale ting er, at graviditeten går uden komplikationer, men det er også vigtigt at vide, hvordan man identificerer, hvilke er de farligste symptomer under graviditeten, der advarer dig om, at der er noget galt for at gå til lægen.\nDet ønskede moderskab er vidunderligt. Den glæde, der følger af at vide, at du bliver en af familien, er svært at få ord på. Dage er fyldt med lys og en speciel farve. Desværre er der tidspunkter, hvor det store ønske om at være en mor og omfavne babyen er forkortet, hvilket efterlader øde og sorg i forældrenes hjerter.\nKvalme under graviditet reducerer risikoen for brystkræft\nIrriterende, ubehageligt, ubehageligt ... Der er næsten ingen adjektiver til at beskrive den dårlige følelse, som morgensyge forårsager hos gravide kvinder. Nogle kvinder er heldige og oplever dem ikke i første person, men andre må vi & 39; udholde & 39; indtil den fjerde eller femte måned af graviditeten (der er også dem, der lider af dem indtil fødslen).\nMælkestød under graviditet, er det normalt?\nNår en kvinde er gravid, øges brysterne betydeligt i størrelse, nogle bemærker endda, at de farver bh'er eller fliser. af minimale mængder mælk (men ikke alle dem). Dette er noget, der bekymrer både dem, der sker med dem, og undrer sig over, om det er normalt at have en stigning i mælken under graviditeten, og dem, der ikke gør det, i tilfælde af at det betyder, at de ikke vil producere nok mælk til deres barn.\nPletter i ansigtet under graviditet, mareridt for mange kvinder\nDet er meget normalt, at huden under graviditet gennemgår nogle ændringer, blandt andet er for eksempel udseendet af strækmærker, kløe, ansigtets pletter ... Som en generel regel er disse ændringer dog ikke vigtige Det tilrådes altid, at en jordemor og / eller gynækolog undersøger dem, især når det kommer til hududslæt.\nCopyright 2021 \_ Sygdomme - ubehag...


42 cm røver\nSe forrige lille beretning. I løbet af dagen lykkedes det at støve en 40 plus aborre op. Denne på 42 blev dagens største. Så må vi se om Bjarke også når at meld...\nHavde sat den unge hr. Dehli stævne i en lille slutspurts dyst. Nu ryger et par af de mindste fisk lige på listen, som en lille appetizer til at komme ud i sneen. Så følger der m&#...\nHavde sat den unge hr. Dehli stævne i en lille slutspurts dyst. Nu ryger et par af de mindste fisk lige på listen, som en lille appetizer til at komme ud i sneen. Så følger der m&...\nVar en lille smuttur ude med kyststangen efter torsk, sammen med en kammerat. Det lykkedes at finde et par fine fisk. Mit kammera var desværre løbet tør for batteri, så det blev de...\nEn god dag blev endnu bedre\nEfter at have haft en 5+ sandart på vægten, var min dag reddet. Jeg håbede dog nu inderligt på at toppe den op med en storgedde - Det var vist i virkeligheden det, vandet mestendel...\nDet kniber lidt med vejret disse dage - Enten blæser det over 10 m/s, eller også kommer der 5 mm regn. I dag, hvor vejret endeligt ser ud til noget godt, er kalenderen booked med arbejdsrela...\nEn laaaang, men SAND historie\nDet tegnede til at blive "en af de dage" - vel at mÃ¦rke en af de dage, hvor man skulle vÃ¦re blevet hjemme. Jeg havde siddet aftenen inden min bare anden ulketur og forsÃ¸gt at hitte rede i en ordent...\nPå ulkens prædator tur havde jeg fornøjelse af at få Bjarke B på besøg i jollen. Vi kunne med faldende humør og temperatur se til, mens der blev taget sandart, gedde...\nMørketorsk med Kenned\nSå måtte jeg lige vise, at der stadig kan gøres fornuftige fangster på æ hav. Men ufatteligt nok blev dette det eneste regulære hug på min stang, men hva skidt n...\nen enkelt sortstribet\nHavde sat Allan i stævne, da et nyt vand skulle afprøves efter gedder og sortstribede røvere. Dagen blev hugmæssigt meget beskeden, på trods af en ihærdig indsats for at ...\nJig & nap\nForeningens småbåds-torske-ekspert viste vejen til torskenap på æ' hav. Skipperen selv, fandt en lidt bedre fisk, som nok dukker op på siden snarest.. ...\nEn lækker 11 punds fisk taget i et dobbelt hookup efter 3 kast med fluestangen. Nogle gange kan det være taknemmeligt at være geddefisker ...\nEn fantastisk eftermiddag i godt selskab resulterede i nok gedder til at tage pynten af formandens billige point i denne kategori. Nu er det op til de øvrige ulke at slå disse småfisk a...\nBaby , lad mig poppe den for dig\nSom nævnt i anden rapport var gedderne på finnerne idag. Denne fisk gav dagens mest spektakulære fight med adskillige ture i luften og efterfølgende brusebad. Igen mange tak til D...\nJeg fik tilbuddet om at tage på eftermiddagstur på søen med Bjarke og Daniel. Eller jeg masede mig på en tur Bjarke og Daniel havde planlagt … Potato – potato… På vej fra arbe...\nEn super dag i det varme og solrige efterårsvejr gav en fin flok gedder på fluen. Største til mig blev ovenstående. Beretning følger af MBL og Bjarke;) ...\nPå en familietur til Mols fik jeg mulighed for at stikke af lørdag morgen. En chance jeg ikke var sen til at tage. Jeg skulle dog fiske et par pladser af før jeg fandt fiskene i stormve...\nEfter at ha’ tjent en lille dagsløn ved at sidde og fiske aborrer og gedder for DTU aqua(se nærmere:\nEt par timer senere var der nap på ny. Denne gang var der lidt mere gang i fisken, uden at fighten på noget tidspunkt blev alt for nervepirrende. Endnu en vægtigt fisk gled over netramm...\nEfter at have givet laksene i Gudenåen et skud, så var det blevet tid til en lille karpetur med Carpguiding.dk. Jeg skulle med andre ord på karpetur til et af Allans vande. Den gamle r&...\nSå fik jeg endelig en ørred over 60 – godt nok ikke meget over... Jeg tog på tur med fluestangen til mols og fandt et sted der tidligere har givet mig fisk. Langt ude i kastet tog en fi...\nEn kort beretning fra LU-lakseturen til Gudenåen. Herligt vejr, grill, pølser, øl, kage og godt selskab. I dagens sidste kast fik jeg en laks - min første danske. Fisken blev fan...\nNy pr. i skælkarpe\nJeg havde for nylig haft fødseldag og fået en rodpod i gave, så denne skulle da ud og afprøves hurtigst muligt. Derfor blev Kenneth (alias Lindvig) ringet op og en tur efter karper...\nFik denne smukke skabning på 9,7 kg og 75 cm ude på distancen. Det blev ikke til flere nap for mit vedkommende den nat, men med en fordobling af ens PR må man vist også siges at v&...


EM i Duathlon kommer til Rebild - Rebild Kommune\nPressemeddelelse • Jan 15, 2018 14:12 CET\nRold Skov tilbyder ekstremløberne enestående oplevelser i unik natur.\nXTERRA offroad triathlon har fra starten tilbage i 1996 på Hawaii været ensbetydende med et fysisk krævende løb, hvor fællesskab, kammeratskab og eventyr har været i højsædet. I dag har XTERRA bredt sig til 17 lande, og i 2014 kom fænomenet til Danmark. XTERRA har ved siden af det oprindelige triathlon også en Duathlon Serie, og det er det sidste – bestående af trailløb, MTB og trailløb - som kommer til Rebild.\nXTERRA leder i udgangspunktet tanken hen på elitesport og store fysiske udfordringer. Mottoet ”XTERRA er for alle” fortæller samtidig, at enhver interesseret er velkommen til at være med, og at nye deltagere let vil blive grebet af det samlede setup, stemningen, ruterne og den generelle oplevelse.\nTriatland på det internationale landkort\nBorgmester Leon Sebbelin glæder sig over aftalen mellem XTERRA Nordic og kommunen:\n- En event som XTERRA Duathlon passer som fod i hose med vores outdoor-brand, Triatland. Stævnet giver også det lokale erhvervsliv mulighed for international eksponering. Sluttelig understreger XTER-RA Nordics beslutning om at placere det sidste af fem stævner i Duathlon Serien i vores skønne na-tur, at vi her i kommunen har stor erfaring med afvikling af internationale events, og at Triatland er et særdeles eftertragtet terræn.\nXTERRA Nordic ser også frem til samarbejdet. Stævneleder Simon Jørn Hansen udtaler:\n- Naturen og den sportslige oplevelse er i højsædet, når vi vælger en lokation til en XTERRA. Rebild opfylder i høj grad de kriterier, hvor man med Rold Skov og Rebild Bakker utvivlsomt kan få en af de fedeste offroad-oplevelser i Danmark.\nTelefon 99 88 90 00\nLæs mere på XTERRAs hjemmeside\nCyklingFritidLivsstil, mode, fritidOffentlig sektorSportØvrige sportsgrene\n8,36 MB • 4608 x 3072 px\nXTERRA Duathlon Rebild 20...\n34,4 MB • 7952 x 5304 px