TEMA 8 Biologia Molecular (BIOMOL)  | Biologia Molecular (UdG) | Unybook\nTEMA 8 Biologia Molecular (BIOMOL) (2017)\nTEMA 8 Biologia Molecular (BIOMOL)\nInclou els apunts corresponents al tema 8 de l'assignatura Biologia Molecular: Vectors i estratègies de clonatge.\nNatalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) TEMA 8: Vectors i estratègies de clonatge VECTORS DE CLONATGE I D’EXPRESSIÓ Un vector és una molècula de DNA que unirem la molècula d’interès per aïllar.\nMolècula de DNA que pugui replicar en la molècula hoste i a més permeti una introducció relativament fàcil dins de l’hoste corresponent.\nPrimera classificació de vector de clonatge (obtenció de moltes copies dins l’hoste) i vector d’expressió (permet obtenir el producte codificat o proteïna).\nVector de clonatge Característiques: - - Accepta gran quantitat de DNA  permeti introduir el fragment de DNA més gran possible Presenta regió policonnectora  afegirem el DNA a clonar Presenta sistema selecció clons amb inserció  diferenciar els clons que porten l’inserit als que no Seqüència complementària a oligonucleòtid universal  encebador complementari a la regió policonnectora per un extrem i un altre encebador complementari a l’altre extrem de la regió policonnectora  encebadors universals on afegirem el meu fragment a clonar que permeten seqüenciar fàcilment el que hem introduït enmig de la regió policonnectora Tots han de portar un origen de replicació Vector d’expressió 1 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Pot portar elements que permetin que la proteïna que se m’expressa pugui ser purificada. Unit a la proteïna i facilita la purificació. GFP formant una proteïna de fusió i permet detectar cap a on va la proteïna que s’ha traduït. Facilita la localització dins la cèl·lula, la seva solubilització, purificació... altres elements.\nA banda de tots els elements de transcripció i traducció porta elements addicionals.\nCaracterístiques - Presenta regió policonnectora Presenta sistema d’expressió: promotor, AUG, STOP, terminador Seqüència addicionals per ajudar en solubilització, detecció, quantificació o purificació de la proteïna Tots han de portar un origen de replicació Han de presentar totes les seqüències que em permetin transcriure o traduir el gen que he clonat Vectors: classificació general No és el mateix transformar una cèl·lula eucariota que una procariota. Vectors segons el tipus d’hoste, vectors per transformar cèl·lules eucariotes i vectors per transformar en cèl·lules procariotes.\nCom un vector és una molècula de DNA, es pot classificar en funció del seu origen.\nPoden ser plasmidis (dsDNA dins dels bacteris) o bé vectors que el seu origen és el genoma d’un bacteriòfag (virus que infecta bacteris) el genoma del fag landa i fags filamentosos.\nPer transformar hostes procariotes hi ha vectors que són construccions artificials, un vector que és una molècula de DNA artificial. Conté DNA de més d’un origen. Són vectors que tenen característica de plasmidi però contenen seqüències que provenen de determinats trossos de virus.\nDesprés tindríem cromosomes artificials (són més grossos) construccions artificials per transformar procariotes. Vectors que contenen DNA de més d’un origen. PACs  plasmidi basats en fags 2 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) BACs contenen seqüències d’altres llocs.\nEn hostes eucariotes trobem vectors que serveixen per transformar cèl·lules animals o vegetals. Virus o genomes de virus que infecten cèl·lules animals o vegetals. En animals tenen més utilitat. Trobem també plasmidis (normalment associats a hostes procariotes però també hi ha propis d’hostes eucariotes) i s’utilitzen per clonar. Hi ha propis de llevat i trobem episòmics, d’integració i de replicació. Plasmidis que permeten obtenir transgènics vegetals són els (Ti). Cromosomes artificials serveixen per transformar cromosomes vegetals anomenats YACs.\nTots aquells vectors que porten un asterisc o dos asteriscs serveixen per la construcció de genoteques. Busquem que el vector accepti fragments lo més gran possibles.\nLa diferencia en un asterisc i dos és que el que porten 2 asteriscs són particularment útils per construir genoteques de cara a seqüenciar genomes eucariotes.\nPlasmidis Molècules de DNA de doble cadena presents en cèl·lules bacterianes (transformació d’hostes procariotes) porten molts gens i dins del que són els plasmidis es pot parlar de plasmidis conjugatius i plasmidis no conjugatius. Els primers porten els gens tra.\n3 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Permeten la transferència del plasmidi d’un bacteri a un altre i no ens interessen en biologia molecular.\nVolem controlar on va el vector. Una seqüència important és la ORI, la qual marca l’inici de la replicació (la qual fan independentment del cromosoma bacterià). És crítica i és important per dos motius: 1. Segons quina sigui aquesta seqüència ori determina en quin hoste es pot replicar el plasmidi. Hi ha alguns que són molt restrictius que només permeten la replicació en colis entèrics (ColE1). Un altre és RP4 que només permet replicació en bacteris gramnegatius. Un altre és el RSF1010 que només permet la replicació en bacteris grampositius i gramnegatius. Interessa poder controlar en quins organismes em creixen al laboratori i esperar que si s’escapen del laboratori estan molt controlats i no infectaran altres organismes perquè estem creant transgènics.\n2. Marcar quantes copies del plasmidi tindre dins la cèl·lula. Determina el nombre de copies del plasmidi per cèl·lula. Podem parlar de plasmidis relaxats o bé multicòpia (permeten múltiples copies dins del bacteri). També podem parlar de plasmidis astringents (només permeten una sola còpia per cèl·lula). Aquests plasmidis astringents han de portar forçosament els gens PAR perquè quan la cèl·lula es divideix permet una divisió equitativa dels plasmidis a cadascuna de les cèl·lules filles.\nLa regió policonnectora es troba enmig del gen LacZ. Permet diferenciar transformants que provenen de relligat que dels que portaven els inserits.\nAquells plasmidis que presenten el mateix origen de replicació formen part dels grups de incompatibilitat. Dos plasmidis diferents amb un mateix origen de replicació no poden coexistir dins d’una mateixa cèl·lula perquè quan la cèl·lula es divideixi una cèl·lula filla es quedarà amb un plasmidi, una altre amb l’altre o un dels dos s’anirà perdent.\n4 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) El fag λ Aquest virus és un bacteriòfag i presenta un genoma format per dsDNA lineal i als extrems presenta seqüències anomenades seqüències COS. Aquestes permeten que un cop el genoma del fag s’ha introduït a la cèl·lula bacteriana es recircularitzi i es repliqui com si fos genoma bacterià. Són extrems cohesius, són complementaris.\nUn procés de replicació asimètrica mitjançant cercle rodant i es forma un extrem en 5’ i 3’. Fem créixer la cadena copiant l’altre i acabem tenint un conjunt de genomes que va creixent i es va copiant n vegades. Això es converteix en dsDNA i acabo amb n genomes del fag concatenats. Dins de la cèl·lula, aquests genomes concatenats (on cada tros és un genoma sencer del fag unit per seqüències COS enmig) pot ser empaquetat dins de la càpsida viral perquè existeix una DNAasa que talla les seqüències cos. Paral·lelament s’hauran sintetitzat les proteïnes de la càpsida i la cua i gràcies a altres dues proteïnes (num1 i a) s’acaba sintetitzant un únic genoma per cèl·lula).\nFent servir el genoma d’aquest fag com a vector tenim una sèrie d’avantatges: A la part esquerra trobem les seqüències del gen per sintetitzar la càpsida... el que és interessant del fag és que al seu genoma una part interna aproximadament d’un terç és substituïble pel fragment de DNA que a mi m’interessi. Una segona avantatge és que tot el sistema que hem explicat dins de la càpsida es pot dur a terme in vitro. Kit per empaquetar genomes de fag landa. Formació de concatèmers que per poder empaquetar-los hem de tallar entre les seqüències cos. Quan fem el clonatge tenim el 5 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) genoma del fag landa i si fem el clonatge tindrem un braç dret. Un esquerre i la part del mig. Si tallem i substituïm la part central pel fragment de DNA que m’interessa. Aquest vector accepta fragments més grans que no pas el vector. Podem arribar a inserir fragments de fins a 23 – 25 kb.\nClonatge en el fag λ Es forma un altre cop el mateix amb un fragment al mig. Es formen concatèmers dels fags. A partir d’aquí aquests concatèmers mitjançant un sistema in vitro ser empaquetats en molècules de virions. Encapsidat dins de la partícula formada in vitro.\nUn avantatge d’això és que només la endonucleasa em tallarà entre la seqüència COS i seqüència COS si la distància que em separa les seqüències COS és equivalent a la mida del genoma del fag landa. Pot passar que no serà la necessària perquè la endonucleasa pugui tallar i no podrà ser encapsidat invitro. O se m’ha produït la reacció de lligament correcte o no encapsidaré (no he unit el fragment) o tot allò que encapsidi portarà el fragment i no cal marcador de selecció.\nEstem tallant el vector AMB el fragment unit.\nCom podem fer la encapsidació in vitro?  Empaquetament in vitro del fag λ 6 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Fags filamentosos: M13 A partir de fags defectius que no poden encapsidar el DNA. Hi ha cèl·lules infectades per fags landa que els hi falta una proteïna de la càpsida.\nPodré fer les meves construccions in vitro si tenen la distància correcta per ser reconegudes per la endonucleasa i això només passarà si han incorporar el fragment que té la mida idònia. no fa falta marcador de selecció perquè només es tallarà quan hagi realitzat la reacció de lligament correctament.\nCadascun d’aquests virions porta un fragment enmig corresponent a la genoteca.\nDins del que eren vectors d’origen viral també teníem els fags filamentosos: M13 (aprox 6,4 Kb). Genoma de ssDNA i circular. Queda tot ell embolcallat per una proteïna i en els extrems tenen proteïnes diferents que tenen utilitat.\nCom funcionen? En aquest cas en el cicle infectiu de M13. El virió infecta cèl·lules bacterianes que presenten pilus F. A través d’aquest mecanisme el DNA del fag s’introdueix dins les cèl·lules i aquest DNA rep el nom de molècula infectiva o F+.\nAquest ssDNA es transforma en dsDNA donant lloc a una forma replicativa que es pot utilitzar com el meu vector de clonatge. Dins la cèl·lula que estem infectant aquesta forma replicativa es replica com un vector normal i corrent i dona n copies de dsDNA.\n7 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Arriba un punt que comença una replicació asimètrica en forma de cercle rodant, es produeix un nick i es dona ssDNA. Aquest queda embolcallat per la proteïna que forma la major part del virus i se li afegeixen les proteïnes dels extrems i surt de la cèl·lula per un mecanisme que no es coneix, poden sortir a l’exterior sense provocar lisi cel·lular i així tenim cèl·lules que constantment produeixen virions.\nSi jo tinc un cultiu cel·lular que produeix partícules de virions sense provocar lisi cel·lular sinó que dona lloc a colònies de creixement lent i fem un cultiu que tindran totes les partícules en forma replicativa i el sobrenedant tindrà molècules de virions.\nPassar de dsDNA a ssDNA. Clonar la forma replicativa amb el meu vector fins a obtenir virions que porten ssDNA. Despres de centrifugar ens carreguem les proteïnes i obtenim ssDNA.\nInteressant per seqüenciació, després per mutagènesi i podem obtenir DNA en forma de cadena senzilla.\nEl fragment de DNA que puc introduir pot ser força gran perquè als virus el DNA queda embolcallat per la proteïna. Empaquetament molt compacte i eficient.\nA banda dels fags filamentosos, en el que era la classificació teníem els plasmidis com a vectors de clonatge i genomes de fags. Ens queden ara cromosomes i construccions artificials.\n8 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Còsmids (cos + plasmidi) Aquestes construccions artificials són vectors que contenen DNA de dos orígens diferents. Els còsmids són plasmidis recombinants que tenen les característiques pròpies d’un plasmidi (origen de replicació, regions policonnectores...) i contenen també les seqüències COS del fag landa (seqüències de l’extrem del bacteriòfag que permeten recircularitzar i formar concatèmers). Serveixen també per la creació de genoteques.\nEl vector és relativament petit. Si clono aquest còsmid tindré a la regió policonnectora una diana per un enzim de restricció, a continuació les seqüències cos, la resistència a un antibiòtic, l’origen de replicació... si tallem amb EcoRI tindrem això linealitzat i obtindrem la diana per EcoRI, la seqüència cos, la resistència a ampicil·lina, l’origen de replicació i la diana per EcoRI. A partir d’aquí afegeixo els meus fragments que he tallat amb el meu enzim i vindrà un tros de fragment. Com tinc n molècules de vector tornarem a tenir això que pertany al vector, després el fragment i després torna a començar el vector. Així podem anar fent. Es formaran concatèmers com es formaven en el cas del genoma del fag landa.\nQuina és la gràcia d’això?  puc utilitzar després de les reaccions de lligament i les construccions. Tot un seguit de seqüències que presenten seqüències cos i després un altre cop. La distància entre seqüències cos no serà l’adient a menys que s’hagi introduït el fragment de la mida que toqui. Aprofita les característiques de les seqüències cos del fag landa i la capacitat d’empaquetar. Només l’endonucleasa podrà tallar si s’ha produït la inserció del fragment amb la mida adient. Si s’acaba 9 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) empaquetant finalment significa que s’ha unit el fragment de la mida adient. S’ha produït la reacció de lligament i en principi no necessiten marcadors de selecció.\nEls còsmids permeten el clonatge de fragments més grans que no pas els fragments que emet la substitució de la tercera part del genoma del fag landa.\nA banda dels còsmids, dins de les construccions artificials trobem els Fagèmids Fagèmids Vector d’origen plasmídic que tindrà un gen marcador de resistència a antibiòtic, regió policonnectora, gen lac Z.\nQui porta com a seqüència que no li és pròpia o que no és del propi plasmidi un origen de replicació de fags filamentós. Totes les seqüències necessàries per l’inici i terminació de la transcripció del gen i els gens que permeten encapsidar aquest DNA o encapsidar els virions.\n10 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Plasmidis recombinants que presenten: - Origen de replicació plasmídic Un o més marcadors de selecció Regió policonnectora Origen de replicació de fag filamentós (M13 o f1) + seqüències necessàries per a la iniciació i terminació de la síntesi de DNA víric i per a la morfogènesi de les partícules víriques Si clono el meu clon de DNA i el fico dins d’una cèl·lula es comportarà com un plasmidi normal i corrent. Es replica utilitzant l’origen de replicació propi del plasmidi.\nSi infectem una cèl·lula amb un fag filamentós o fag coadjurant  El plasmidi deixa de replicar-se com a plasmidi i s’inicia la replicació a l’origen de replicació del fag filamentós. Síntesi ssDNA el qual és empaquetat en partícules de virions. Produiré ssDNA (els fags filamentosos permeten aquesta síntesi) i gràcies a la infecció per aquest fag coadjurant es comença a sintetitzar ssDNA que quedarà embolcallat per la proteïna majoritària i es formaran les partícules de virions. La gràcia de M13 no provoca la lisi cel·lular i dona lloc a colònies de creixement lent. Al pelet quedaran totes les cèl·lules i al sobrenedant les partícules de virions.\n11 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Com si fos un plasmidi normal i corrent i obtenir ssDNA. L’avantatge és que admet fragments més grans que no pas M13.\nFàsmids Vectors de clonatge que tenen origen de DNA plasmídic però que porten totes les característiques normals d’un plasmidi corrent i coses extra:  Plasmidis que contenen les seqüències d’integració del fag lambda. (no confondre amb les seqüències COS del fag landa).  Seqüències que permeten que el fag lamda pugui seguir la via lisogènica.\nPermeten que tot el vector amb el fragment clonar de DNA es pugui inserir al genoma de la cèl·lula hoste i aguantarà molt més temps que no pas si estigués sense inserir  El plasmidi pot inserir-se en el genoma de la cèl·lula hoste mitjançant recombinació específica de lloc.  És una manera de conservar de forma estable clons.\nEs comportaria com un fagèmid si estigués sol perquè tindria un origen de replicació.\nDepenent del que vulguem fer triarem un tipus de vector o un altre o bé depenent de l’origen del DNA i tindrà una finalitat o una altre.\nPACs i BACs  cromosoma artificial que serveix per la construcció de genoteques amb la finalitat de seqüenciar genomes eucariotes. Vectors de còpia única (astringent) i com a tals, si dins de la cèl·lula tenim un fragment determinat i tenim moltes còpies d’aquest fragment i aquest pertany a eucariotes, l’ordre per recombinació queda alterat. Si només tinc un sol vector i una sola seqüència és difícil experimentar recombinació homòloga i servirà per construir genoteques per seqüenciar genomes eucariotes. Tenen seqüències molt repetides i, per tant, tinc més probabilitat d’experimentar la recombinació i, amb la qual cosa, altero la seqüència original.\nPACs  basats en el genoma del fag P1 (dsDNA 199 kb) lineal presenta: Vectors basats en el fag P1 Vectors basats en el genoma del fag P1 presenten: - - - Sistema de replicació plasmídic (ori). Baix número de còpies (seqüències par: de partició equitativa en la divisió cel·lular). En estat lisogènic es replica com un plasmidi normal i corrent.\nSeqüència pac necessària per a l’encapsidació del fag  seqüències reconegudes per un enzim anomenat pacasa i encapsida tot el genoma del fag.\n2 sequències loxP reconegudes per la recombinasa cre del fag P1 que permeten convertir el cromosoma lineal en un cromosoma circular  llocs de recombinació que són reconeguts per la recombinasa “cre” del propi fag P1. Aquesta duu a terme una recombinació específica de lloc, centre-específica o NO homòloga.\nAquest vector en porta dues i mitjançant recombinació no homòloga transformem un vector lineal en circular.\nSistema de selecció (resistència a la kanamicina)  marcador de selecció Seqüència policonnectora (accepta 50-100 Kb)  la gràcia que tenen els vectors és que admeten o accepten fragments de DNA molt llargs. Com més llarg és el fragment excepte el vector, més petita la genoteca i més fàcil de rastejar.\n12 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) - Origen de replicació lític del fag que li permetrà seguir la via lítica i aconseguir moltes còpies del plàsmid en el moment de purificar-lo  origen de replicació que fa que puguem seguir la via lítica.\nCom lliga tot això per fer-lo servir com a vector de clonatge?  Braç curt i braç llarg  Braç curt té la seqüència par i el braç llarg conté tota la resta (marcadors de selecció...).\nAquests dos fragments en que he trencat el vector els barrejaré amb els meus inserts i aquests inserts poden arribar fins a 100 kb. Duem a terme una reacció de lligament i per exemple queda el braç curt+insert+braç llarg.\nA diferència del que passa amb el fag lambda o còsmids, el vector reconstituït pot encapsidar amb el fag lambda. Abans de dur a terme la reacció de lligament, els dos fragments es desfosforil·len perquè la lligasa no els pugui tornar a unir. Estratègia per evitar tancaments de plasmidi. Abans no calia desfosforilar perquè si no s’unia el fragment inserit correcte no es podia tancar (no el reconeixia la endonucleasa).\nConstruiré n construccions i un cop les tenim, es poden encapsidar en partícules de virions i podem formar el cap i la cua i mitjançant la pacasa tot queda inserit dins del virió.\nCada partícula de virió porta el fragment de DNA que és lineal.\n+ Infecto cèl·lules que són cre (expressen la recombinasa cre) i aquesta reconeix els dos loxP i aquests estan en la mateixa cadena i en la mateixa orientació. Aleshores, si recordem de quan parlàvem de la recombinació centre-específica o no homòloga depèn de la orientació si estava oposada o no, la part central queda invertida i si teníem els dos llocs de recombinació en la mateixa orientació s’experimentava una deleció i queda en una de les dues molècules el loxP i en l’altre molècula l’altre lloc de recombinació. Això passa a la cèl·lula hoste que porten els virions de les nostres construccions.\nLa cèl·lula hoste està expressant la recombinasa i reconeix els dos loxP i produeix una deleció, pèrdua de la part de la construcció. La resta queda recircularitzada i tenim part del loxP.\nA partir d’aquí, ho tenim clonat, vectors de copia única i si interessa que tinguem múltiples còpies ho podem aconseguir perquè això presenta un origen de replicació de 13 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) P1 lític. Aquest està sota el control d’un promotor (com per exemple promotor lac). Si afegeixo IPTG comença la replicació i podem obtenir múltiples còpies.\nUn PAC vindria a ser un loxP, un tros de fragment de DNA anomenat DNA extra o stuffer, un ori de plasmidi normal i corrent, les seqüències PAC per l’encapsidació, un altre loxP, la regió policonnectora (MCS) que normalment talla un gen anomenat SacB, un origen de replicació de P1 lític, un marcador de resistència (per exemple de kanamicina) i un ori de P1 com a plasmidi. En el fons, és un vector anomenat llançadora. Porten més d’un origen de replicació i això permet que es puguin replicar en hostes diferents.\nSacB és un gen que codifica per una proteïna que introdueix múltiples glucosilacions a diferents proteïnes de membrana. Aquestes que són hiperglucosilades i fan que la cèl·lula peti. Si insereixo el meu fragment aquí, tallo el fragment sacB i si no està actiu no pot fosforilar les proteïnes de membrana, la qual cosa ens permet seleccionar les colònies que porten un inserit perquè sobreviuen. La membrana de la cèl·lula és inestable i les cèl·lules moren en el cas de no incorporar cap fragment. Les colònies han inactivat el gen són les que sobreviuen.\nBACS o fòsmids  incorpora les seqüències COS del fag lambda estan basats en el plasmidi F d’E. coli  còpia única o presenta un baix nombre de còpies per cèl·lula 14 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Pot acceptar inserts de fins a 100-200 Kb, la qual cosa garanteix que cada una de les copies va a parar a una cèl·lula (partició equitativa quan la cèl·lula es divideix) Gens de marcador de selecció i regió policonnectora. En el cas dels fòsmids les seqüències COS del fag lambda. Si m’interessa encapsidar els vectors en partícules de virions. A més a més d’aquestes seqüències COS hi ha alguns BACs que inclouen loxP per arribar a lo contrari que hem explicat abans. Si tenim un loxP en un vector i un altre en un altre vector, els fusionem i formem els fragments que ens interessa.\nUn sol loxP i les seqüències lambda per encapsidar.\nUn altre aspecte interessant és que admeten fragments entre 100 i 200 kb (més grans que els que admeten els PACs).\nAquest vector també té les regions que estan a cantó i cantó de la regió policonnectora. Aquestes són dues regions promotores i els objectius o funcionalitats primeres de PACs i BACs és seqüenciar genomes i un cop tenim les genoteques cada clon té una part del genoma però hem d’ordenar els fragments.\nRecorregut cromosòmic. Necessitem una primera sonda per trobar el clon, aïllo, ... en aquest tipus de vector tinc un fragment i un promotor a banda i banda. Aquest permetrà sintetitzar una cadena de RNA (un serà reconegut per la polimerasa de T7 i l’altre per la polimerasa de Sp6). Es sintetitza una cadena de RNA en un sentit i l’altre en sentit contrari. Tindran seqüències complementaries del gen i es poden fer servir com a sonda per trobar un fragment del gen i alhora servirà per construir una segona sonda. Dissenyes una sonda complementària d’una altre part i mitjançant solapaments vas construint sondes.\n15 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Com volem seqüenciar el genoma sencer hem d’ordenar els clons. Una manera és tenir aquestes sondes de DNA i anar mirant per clons.\nAixò és el que s’anomena CONTIGS. El fet de tenir promotors a cantó i cantó permeten sintetitzar cadenes de RNA per aconseguir sondes i acabar obtenint el genoma sencer. Això és el tipus de vectors que fem servir per seqüenciar genoteques genòmiques (BACs i PACs).\nCòpia única, admeten fragments grans i admeten característiques per obtenir fragments d’interès. Saber cada vector perquè serveix i quines són les seqüències crítiques que fan que aquell vector tingui aquella utilitat.\nClonatge amb llevats i eucariotes inferiors.\nInteressa transformar cèl·lules eucariotes amb un vector però és més complex que transformar procariotes. Vaig a buscar dues coses: - Introduir un gen determinat dins d’una cèl·lula eucariota perquè s’expressi i de vegades de manera transitòria per veure la funció del gen dins de la cèl·lula Transformar una cèl·lula eucariota de manera estable (aconseguir que s’insereixi dins del genoma) i necessito que els vectors em permetin fer això.\nSi ho fem de manera transitòria volem expressar el temps durant un període de temps, perquè per exemple si estudiem com internalitza un fàrmac dins d’una cèl·lula eucariota i pensem que potser s’internalitza per una via endocítica on participa X proteïna, podem agafar aquestes cèl·lules, transformar-les en un plasmidi amb una proteïna X defectiva (anomenat dominant negatiu). Això vol dir que aquesta cèl·lula té la seva proteïna X que participa en la via d’internalització del fàrmac. Si anul·lem aquesta proteïna, anul·lem la feina que faria la proteïna X. El temps que mantinc el plasmidi expressant a la cèl·lula guanya el dominant negatiu i, per tant, bloquegem la via d’entrada. Quan s’expressa, la via X no funciona i interessa que es mantingui un cert temps per saber si el fàrmac entra o no per aquesta via.\nSi el que jo vull és transformar de manera estable i obtenir un eucariota o organisme modificat genèticament hem d’inserir aquell gen dins del genoma de manera estable.\nQuan transformo cèl·lules eucariotes és el que interessa fer a continuació.\nYACs  minicromosoma Incorporen: - Origen de replicació de cromosoma de llevat Regions centromèriques Regions telomèriques, que permeten la replicació com un cromosoma lineal  es pot replicar a la cèl·lula del llevat com un cromosoma normal i corrent Accepten fragments d’entre 0,2 i 2 Mb (molt grans). Podrien ser molt útils per la construcció de genoteques però no ens valen per la construcció de genoteques per seqüenciació de genomes eucariotes perquè quan es produeix la reacció de lligament és possible que com admeten fragments tan grans quedin lligats dos fragments i l’ordre inicial del genoma es perd.\n16 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Quan transformo les cèl·lules de llevat amb YAC i lligament pot entrar més d’un YAC dins la cèl·lula tot i ser de copia única si entren 2 cromosomes com els genomes eucariotes presenten seqüències repetides perden recombinar fàcilment i perdo l’ordre inicial.\nInconvenient: poden experimentar recombinació És circular de bon començament i té un origen de replicació propi de cromosoma de llevat, regió centromèrica i regió telomèrica enganxada per aquest fragment. Al final de la regió telomèrica hi ha una diana per un enzim de restricció. A més a més presenten dos marcadors de selecció en llevat i aquests dos marcadors estan separats per una diana de restricció. Aleshores, per començar a fer el clonatge es transforma el YAC circular en un cromosoma lineal.\nTallo el vector a les dianes de restricció i em quedo amb el vector linealitzat que presenta als extrems les regions telomèriques.\nEntremig tinc el marcador de selecció, ori, regions centromeriques i la diana de restricció.\nTallem a la diana de restricció interna i obtinc un braç esquerre que comença amb la regió telomerica, ... i un braç dret.\nUn cop dividit es barreja el vector amb el conjunt de fragments que interessa clonar.\nDuc a terme la reacció de lligament, lo ideal es que s’introdueixi entre mig del braç esquerre i el braç dret. Admet fragments molt grans. Amb el producte de reacció de lligament transformo i aconsegueixo esferoplasts (no tenen paret i són més fàcil d’introduir el producte de lligament). Selecciono les cèl·lules de llevat introduint els 2 marcadors de selecció perquè volem aconseguir això lineal però pot passar que s’uneixi un fragment esquerre amb el fragment a clonar i un altre fragment esquerre o bé això amb la dreta.\n17 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Permet seleccionar aquells productes de la reacció de lligament en braç esquerre + producte de lligament + braç dret perquè nomes aquests podran créixer en presencia dels dos marcadors de selecció.\nPots evitar relligats desfosforilant.\nComparativa vectors artificials Còsmids són de còpia múltiple. El nombre de clons que necessito són 75.\nFòsmids són variants dels BACs. Són de còpia única. El nombre de clons que necessito és 75.\nSi el YAC no recombinés podria tenir tot el genoma humà en 33.000 o 15.000 clons.\nA mesura que admet un fragment més gran la mida de genoteca es va reduint.\n18 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Altres vectors de llevats  la major part de plasmidis són llançadora per copiar al bacteri molts cops i després ficar-los al llevat Vectors episòmics (YEp) (replicons extracromosòmics) Ori de plasmidi de llevat Seqüències necessàries pel manteniment del plasmidi Es replica sota el control del nucli i existeixen de 50 a 100 còpies per cèl·lula Poden presentar també un origen de replicació del plasmidi procariota (vectors llançadora) Vectors de replicació (YRp) Ori de cromosoma de llevat (ARS) Poden perdre’s en el moment de la divisió cel·lular. Per evitar-ho presenten regions centromèriques que les permeten segregar-se durant la divisió cel·lular com si fossin cromosomes. (YCp)  són els mateixos vectors de replicació però tenen les regions centromèriques per assegurar que no es perdin quan es divideixin Vectors d’integració (YIp) Són plasmidis que s’integren en els cromosomes de llevat mitjançant recombinació homòloga.  s’incorpora el vector que porta el gen que ens interessa i permet obtenir noves soques de llevat que expressen el gen que hem introduït al vector Permeten obtenir noves soques de llevat que expressin el gen d’interès (nou organisme modificat genèticament). Integració estable del gen en el genoma.\nSelecció per complementació de la biosíntesi d’una molècula en una soca de llevat mutant (auxotròfic) Existeixen vectors llançadora entre bacteris i llevats.\nCom a vectors llançadora han de presentar marcadors de selecció que permetin l’expressió en els dos hostes. Marcador de selecció complementa una ruta de biosíntesi d’algun metabòlit necessari pel creixement del hoste.\nOri de replicació propi de llevat, replicació en regió centromèrica, marcador de selecció és un gen que codifica per la síntesi de leucina. Origen de replicació de procariota, un marcador de selecció per bacteri (resistència antibiòtic) i una regió policonnectora.\nSón vector llançadora perquè és més fàcil tenir més còpies si s’ha fet créixer en un cultiu i després de purificar s’introdueix als llevats.\n19 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Vectors per a cèl·lules animals  transformar eucariotes superiors.\nBusco no fer servir la cèl·lula com a manera d’amplificar el gen n vegades sinó que s’expressi el gen. Per tant, si transformo cèl·lules animals busco que expressi un determinat gen.\n1. Introducció del gen dins la cèl·lula animal 2. Si m’interessa, integració del gen dins el genoma de la cèl·lula animal. Si faig això aconseguiré una nova línia cel·lular i, per tant, una línia modificada genèticament que expressa un gen que no li és propi.\nMolts cops el gen 1 es pot fer però ens quedem aquí perquè ja tenim prou. Deixem que el gen s’expressi. Amb el temps que dura l’experiment s’expressa.\nQuins vectors fem servir perquè s’introdueixi el gen? Es fan servir plasmidis que porten seqüències pròpies de virus que normalment són compatibles amb la cèl·lula eucariota i el procés de replicació d’aquesta. Aquests poden ser replicatius o no replicatius.\nPlasmidis (transfecció): - No replicatius: per transformació transitòria  no s’expressa quan la cèl·lula es divideixi i la expressió, per tant, serà transitòria.\n- Replicatius: contenen orígens de replicació de virus. Exemples:  Poliomavirus (SV40)  tenen un origen de replicació de SV40 i normalment porten també un gen que dona lloc a una proteïna anomenada antigen THT necessària per la replicació de SV40. El vector té tot lo necessari per la replicació.\nUna altre opció  transforma només cèl·lules COS. Incorporació del gen que codifica pel antigen T llarg amb un plasmidi que té un ori SV40. Hi ha lisi cel·lular i pensar que puc passar a la següent etapa amb aquests plasmidis és inviable.\n Herpesvirus (Epstein/Barr)  funcionen de manera similar als anteriors però són més estables perquè les cèl·lules triguen més en lisar. Són vectors pensats per aconseguir expressar el gen d’interès.\nContenen promotors virals per a l’expressió Porta seqüències de virus origen viral compatible amb la cèl·lula eucariota. Regió policonnectora, promotor que permet alts nivells d’expressió i plasmidis llançadora 20 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) amb un origen propi de cèl·lula procariota. Gen de resistència a antibiòtic. Quan la cèl·lula es divideix es perd en el cas de plasmidi no replicatiu.\nEn el cas de plasmidis replicatius contenen a més a més un origen de replicació de virus i és compatible amb la replicació de celules eucariotes.\nVectors per a cèl·lules animals Virus (transducció): mecanisme infectiu dels viurs o bacteriòfag per introduir el material genètic dins de la cèl·lula d’interès - - - - Retrovirus: no immunogènics, infecten cèl·lules en divisió. Mutació insercional.  virus que tenen RNA com a material genètic i aquest RNA està encapsidat dins del nucli envolcallat per la càpside... entra a la cèl·lula per via endosomal... el DNA de doble cadena pot entrar al nucli i la gràcia dels retrovirus és que el cDNA es pot integrar dins la cèl·lula que infecta i podem passar del pas 1 al pas 2. Aquesta inserció és totalment a l’atzar, no sabem on es pot produir.\nAdenovirus: infecten també cèl·lules que no estan en divisió, s’expressen a un títols molt elevats. Molt immunogènics. Expressió transitòria.  són virus que tenen un genoma de DNA i així com els retrovirus infecten cèl·lules en divisió aquests infecten cèl·lules que no estan en divisió. Els retrovirus són molt immunogènics i si volem fer teràpia gènica els retrovirus donen molt poca resposta immunològica i els adenovirus fan molta resposta immunològica (xoc anafilàctic bestial). Interacciona amb la membrana de la cèl·lula i per via endosomal interacciona amb la membrana nuclear i introdueix l’ADN del virus al nucli i a diferència del retrovirus aquest genoma viral NO S’INTEGRA DINS DEL GENOMA I, PER TANT, EL TEMPS D’EXPRESSIÓ DEL GEN QUE INTRODUIM AQUEST GENOMA ÉS TRANSITORI. No aconsegueixo línies cel·lulars estables.\nLentivirus: infecten cèl·lules pots-mitòtiques. Mutació insercional.  infecten cèl·lules postmitòtiques i s’integren al genoma, poden produir mutacions insercionals i no podem controlar a on van a parar Baculovirus: infecten cèl·lules d’insecte. Fàcils de treballar. Expressió molt elevada.  tampoc s’integren al genoma i no podem passar al pas 2.\nProducció de proteïnes recombinants.\nClonatge en el promotor (darrere) de la polihedrina (proteïna codificada al genoma del virus) que fa de salvaguarda del virus quan aquest virus no es troba en condicions òptimes i queda envolcallat per aquest virus que forma cossos de dessecació.\nS’expressa o està sota el control d’un promotor d’alt nivell d’expressió.\nAixò s’aprofita per utilitzar el promotor d’aquesta proteïna per clonar al darrere el gen que nosaltres volem perquè aquesta proteïna s’expressa molt i per tant podem obtenir moltes còpies del nostre gen. Permet clonar gens molt grans però si ha d’entrar per recombinació tinc poca eficiència de transfecció o introducció del meu fragment de DNA però tinc elevada eficiència d’expressió.\nS’utilitzen com a vectors d’expressió per tenir gran quantitat de proteïna, fàcil de manipular...\n21 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Accepta inserts molt grans que cal entrar per recombinació homòloga.\nGenoma del retrovirus 22 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Genoma d’un retrovirus. Té dues còpies del genoma (2 molècules de RNA) al nucli i proteïnes que acompanyen com la transcriptasa inversa. Envolcallat per una càpsida, proteïnes de la matriu i altres proteïnes de la part exterior que permeten interaccionar amb la cèl·lula.\nEsquema del genoma de RNA del virus, la part de baix no integrat i la part de sora un cop integrat. El genoma del retrovirus presenta una sèrie de seqüències i les que realment importen com a vector de clonatge són l’extrem U5 i U3 que serveixen com a promotor per produir la cadena i al altre extrem com a senyal de finalització.\nLa part central, tots els gens que són el GAG, POL, ENV es pot substituir per les proteïnes d’interès i ens podem quedar amb els extrems U5 i U3. La psi o lletra grega és necessària per l’empaquetament de virions.\nCom ho fem per aconseguir el vector retroviral i a partir d’aquest després passar del pas 1 al pas 2?  Totes les seqüències del genoma es poden substituir per gens forans excepte la regió ᴪ i LTR.\nEstratègia per aconseguir virus que permetin introduir gens forans en el genoma de les cèl·lules hoste Tenim el genoma d’un retrovirus amb els extrems. Part que hem de mantenir són els extrems. Els gens continguts a les 3 regions es poden substituir pel gen d’interès.\nEliminem la part central i per clonatge es substitueix pel gen + marcador de selecció.\nTallem a la regió policonnectora i transformem.\nEvidentment, això seria com un genoma d’un retrovirus però no podem encapsidar perquè hem eliminat els gens però per aconseguir el que volem fem un cultiu que contenen aquests gens per aconseguir encapsidar.\nVolem aconseguir un retrovirus per infectar la cèl·lula i integri a la cèl·lula hoste el meu gen, no el genoma viral.\nAmb aquest vector transfecto cèl·lules eucariotes que fabriquen partícules de virions però no tenim cap dels gens de GAG, pol, env. Cotransfecto aquestes cèl·lules amb altres vectors que expressen els gens gag, pol i env i dins de les cèl·lules tinc els gens que em permeten fer la morfogènesi de les partícules de virions però els virions encapsiden allò que està entre les regions LTR no el genoma viral.\n23 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Les partícules de virions encapsiden el meu gen i fem el salt cap al pas 2.\nA la següent imatge tinc el meu cultiu cel·lular i aïllo d’aquest cultiu les partícules de virions, encapsidem un RNA que jo he construït prèviament. Aquestes partícules de virions infecto les cèl·lules que m’interessen i tenim les de dins del genoma encapsidades.\nTenim transcriptasa inversa i integrasa. Quan infectem les cèl·lules amb aquestes partícules de virions el meu RNA obtingut del plasmidi construït que havia quedat dins les partícules de virions, mitjançant la transcriptasa inversa passa a cDNA de doble cadena i circularitza, un cop circularitza s’integra dins de la cèl·lula hoste.\nExpressa un cDNA corresponent al meu gen, no corresponent als gens del virus.\n24 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) 25 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Vectors per a plantes Aconseguir regenerar una planta sencera i és relativament més fàcil que en animals: Traiem un tros de fulla, puntes de les arrels que estan en divisió molt activa i fent el cultiu adient aconseguim transformar aquestes cèl·lules en un teixit de cèl·lules desdiferenciades o anomenades cal·lus. Aquest està format per cèl·lules desdiferenciades, es poden disgregar, fer créixer en cultiu i eliminar la paret cel·lular i obtenir protoplast més fàcil de transformar. Aconseguir qualsevol teixit de la planta en les condicions adients. Podem obtenir la planta sencera però serà transgènica perquè hem modificat les cèl·lules de les quals deriva qualsevol teixit de la planta.\nPlasmidi Ti  sistema per transformar cèl·lules vegetals, propi de cèl·lules bacterianes i concretament de Agrobacterium tumefaciens. És gros, té 200.000 bases i dins del plasmidi és responsable de que aquest bacteri pugui infectar cèl·lules vegetals i produir un tumor anomenat call. Aquest tumor aconsegueix fer moltes cèl·lules que sintetitzen aminoàcids que són la font d’aliment del bacteri. Aquest Agrobacterium és dels pocs casos que es coneix de transferència de material genètic procariota a una cèl·lula eucariota (patogen vegetal).\nInfecció per Agrobacterium 26 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Del plasmidi Ti ens interessa la regió DNA-T i està flanquejada per dues regions anomenades LB (esquerra) i RB (dret) que en aquest DNA-T trobarem gens per la síntesi de hormones vegetals i per la síntesi d’uns aminoàcids que anomenem OPINES.\nLes hormones vegetals promouen la divisió accelerada de les cèl·lules vegetals tot produint el tumor. Les opines són els aminoàcids de font d’aliment del bacteri.\nA banda d’aquest DNA-T és un plasmidi de conjugació i presenta els gens TRA, porta els enzims que degradaran els aminoàcids de font d’aliment del plasmidi i porten una regió de conjugació.\nLa regió que ens falta és la regió VIR. Aquesta fa referència a virulència. Aquesta història funciona de tal manera que les cèl·lules vegetals tenen el seu nucli i tenim el Agrobacterium amb el plasmidi TI i tenim gens per la biosíntesi d’hormones i d’aminoàcids. Quan la cèl·lula vegetal està danyada i es trenca la membrana cel·lular s’allibera un compost anomenat acetosfiringona i aquesta atrau Agrobacterium, el qual queda adherit a la paret de les cèl·lules vegetals.\nUn cop s’ha adherit comença l’expressió dels gens VIR. Un dels gens VIR permet l’entrada d’aquest compost a l’interior de la cèl·lula bacteriana i aquest compost fenòlic un cop dins s’acomplexa amb una de les proteïnes dels gens VIR i aquest complex activa l’expressió d’altres gens VIR. Entre d’altres, un gen VIR codifica per activitat endonucleasa i aquesta es fa servir per tallar els extrems del DNA-T que és de doble cadena només talla una de les dues cadenes. L’endonucleasa reconeix els extrems de DNA-T i deixa una cadena tal qual i l’altre la talla. Aquest plasmidi Ti haurà fet saltar una de les dues cadenes de la doble hèlix i això es pot reparar per mecanismes de reparació.\n27 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) El DNA-T en ssDNA s’associa a una altre proteïna relacionada amb els gens VIR. Això afavoreix que el DNA-T surti del bacteri i arribi al citosol de la cèl·lula vegetal.\nMitjançant un procés que no veurem entra a la cèl·lula vegetal.\nUn cop al citosol vegetal aquest ssDNA associat a proteïnes VIR pot arribar al nucli perquè alguna de les proteïnes associades al ssDNA amb codificació pels gens VIR codifica per senyals de localització nuclear, les quals són petites seqüències reconegudes per les importines (proteïnes que permeten importar el que sigui del citosol cap al nucli mitjançant el complex de porus nuclear).\nUn cop tenim un ssDNA-T dins del nucli s’integra al genoma en una posició a l’atzar i un cop integrat es transforma en dsDNA o bé abans de integrar-se es transforma en dsDNA-T. Un cop ho fa, comença l’expressió dels gens que hi ha codificats (codifica per hormones auxines o citoquines que provoquen la formació del tumor o bé codifica per les opines).\nLes opines surten de la cèl·lula vegetal i arriben al bacteri que tindrà, per tant, una font d’aliment ja que el bacteri té enzims que les degraden per fer-les servir d’aliment.\nVectors basats en Ti 2 estratègies per aconseguir que el plasmidi TI s’integri al genoma vegetal. Es basen en l’ús dels plasmidis TI desarmats. Aquest plasmidi li hem substituït el DNA-T intern i no tindrà la síntesi per hormones ni les opines sinó que tindrà el gen a clonar (gen d’interès) més el marcador de selecció.\nVector llançadora que permeten replicar en Agrobacterium i en una soca bacteriana tipus E. coli.\nEs tracta de que tenim el plasmidi TI que conté aquest DNA-T desarmat i té un origen de replicació per Agrobacterium o per una soca de E. coli i tindrà una regió 28 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) policonnectora. Introduïm el gen d’interès en la regió policonnectora i tenim un plasmidi TI desarmat.\nAmb aquesta construcció transformo soques de E. coli.\nIntroducció de gens a Agrobacterium Selecciono les que han transformat, fem créixer el cultiu i per obtenir gran quantitat tenim dues opcions, podem agafar directament el bacteri i introduir-lo en una soca d’Agrobacterium o bé barrejar el cultiu de E. coli i Agrobacterium i per conjugació es passa el plasmidi d’una espècie a una altre. Acabem amb una soca d’Agrobacterium que porta la construcció feta prèviament + plasmidi TI i les regions homòlogues presenten recombinació homòloga. El resultat és que la meva construcció s’integra al plasmidi. Després de la selecció acabo amb el meu gen d’interès i 29 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) marcador de selecció i a cantó i cantó les regions LB i RB. El plasmidi conté els gens VIR per moure el que tinc entre la regió LB i RB cap a la cèl·lula vegetal.\nUn mini TI conté el gen que codifica per la regió que ens interessa. Aquest miniTI l’introdueixo dins d’una soca d’E. coli. Extrec el plasmidi que tinc en prou quantitat i el faig servir per transformar una soca d’Agrobacterium modificada genèticament prèviament que només té els gens VIR.\n30 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) S’expressen els gens VIR, s’expressa la endonucleasa codificada amb un dels gens VIR i actuarà entre la regió RB i LB del miniTI. Es produeix el tall en aquests llocs i es produirà un ssDNA que anirà a parar a la cèl·lula vegetal que s’integrarà al genoma vegetal i posteriorment s’ha de seleccionar les cèl·lules vegetals que han incorporat aquest fragment. Anem a la forma de cal·lus. Obtinc la planta.\nObtenció de plantes transgèniques: regeneració de la planta Agafo una fulla i tallo uns discs. Medi de cultiu i al voltant del tall tindrem cèl·lules que hem danyat. Les cèl·lules danyades desprenen acetociringona i infecto amb Agrobacterium. Faran tota la feina que hem dit abans i produirà cal·lus. Ho fiquem en un medi que hi hagi antibiòtic per poder seleccionar aquelles cèl·lules vegetals que han incorporat el gen. Medi que pugui induir la diferenciació de la cèl·lula desdiferenciada, es transporten aquests brots amb tot allò que pugui fer que es produeixin arrels... a tots els teixits de la planta tenim els gens d’interès.\nTransgènics resistents a herbicides, resistents a patògens vegetals, plantes ornamentals, petits arbres de nadal (gen de luciferasa).\nPer transformar cèl·lules vegetals es pot utilitzar material genètic de virus: Emprar com a vectors genomes virals: - Virus de DNA: el seu genoma es pot manipular inserit en vectors plasmídics Caulimovirus  accepta inserits curts Geminivirus  molt eficients per aconseguir als nivells d’expressió de proteïnes recombinants - Virus de RNA o Tobacco mosaic virus o Potato virus X (PVX) o o No integració en el genoma, ni passar a línia germinal, no es pot aconseguir una transformació estable. Infeccions sistèmiques ràpides. Tota la planta es pot fer servir per produir la proteïna codificada pel gen induït a través del vector viral.\nEmprat biolística (més endavant) 31 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Marcadors de selecció (cèl·lules eucariotes) (inserit = marcador + gen a clonar) Verd  cèl·lules vegetals transformades Vermell  cèl·lules animals transformades Marcador selecció endogen: gen que codifica per una proteïna que reverteix una mutació de la cèl·lula hoste Marcador selecció exogen: confereixen una propietat nova a la cèl·lula que transformem APH: Si tenen inhibida la droga podran fer síntesi proteica i per tant sobreviuen.\nDHFR: afegim Mtx i inhibeix la DHFR però les cèl·lules que han incorporat la variant resistent, tot i tenir l’enzim inhibit com tenen la variant presentaran resistència HPH: posem Higromicina B que inhibeix la síntesi proteica però pot créixer TK: fiquem al medi aminopteridina i el que passa és que les cèl·lules són TK negatives però si s’han transformat amb el marcador de selecció podem sintetitzar pel nucleòtid HGPRT: fiquem àcid micofenòlic però les transformades sí poden sintetitzar GMP a partir de xantina ADA: fiquem Xil-A que provoca danys al DNA (mort cel·lular) i les cèl·lules transformades expressen ADA que inhibeixen Xil-A Ús de TK i de XGPRT com a sistemes de selecció positius MEDI HAT: hipoxantina, aminopteridina i timidina.\n32 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Via salvatge o de reciclatge: aprofita tots els productes de degradació d’una cadena d’àcid nucleic.\nVies de novo: sintetitzo nucleòtids a partir de molècules molt senzilles sobre un anell de ribosa que hem activat Les meves cèl·lules al medi HAT, la H bloqueja tota la via de novo i no podem sintetitzar nucleòtids per aquesta via. L’altre via només funciona si tenim timidina quinasa (TK) i fosforibosil transferasa (HGPRT). Si fiquem H i T (substrats dels enzims esmentats anteriorment). Es tracta de bloquejar una de les vies i ficar els substrats dels enzims de l’altre via i només aquelles cèl·lules que incorporin els gens per codificar els enzims podran utilitzar aquella via per sintetitzar nucleòtids.\nTransformació amb Cl2Ca Sistema basat en l’ús d’agents químics per transformar cèl·lules eucariotes o procariotes utilitzem sempre el clorur de calci (sal).\nCultiu bacterià el faig créixer fins la fase exponencial de creixement, es formen porus en la membrana de la cèl·lula bacteriana i s’obtenen cèl·lules competents.\n33 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Un cop tinc les cèl·lules en aquest estat, afegim el producte de reacció de lligament.\nNormalment, les membranes cel·lulars tenen càrrega negativa i el clorur de calci fa un complex amb el DNA apantallant les càrregues negatives per facilitar la unió a la membrana.\nXoc tèrmic de 2 minuts que permet que aquest DNA (DNA recombinant) que té unit o interaccionant amb la membrana de la cèl·lula bacteriana passi a l’interior a través de porus. Després deixem que es tanqui la membrana.\nAquests protocols per procariotes NO ENS SERVEIXEN PER LA INTRODUCCIÓ O TRANSFORMACIÓ DE PROCARIOTES EN VECTORS MOLT GRANS (PACs i BACs).\nTransformació per lipofecció Formació de liposomes (membranes o bicapes lipídiques que adopten forma esfèrica) i es poden aconseguir barrejant diferents tipus de lípids i sonicant. Quan es formen els liposomes el DNA queda encapsulat i els liposomes es troben en cremes per les arrugues. Aquesta membrana o bicapa lipídica esfèrica, com més igual sigui la composició de la bicapa lipídica a la membrana cel·lular quan posem en contacte els 34 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) liposomes amb la membrana es produeix una fusió i el contingut del liposoma va a parar a l’interior de la cèl·lula i part del contingut va a parar a l’interior del nucli.\nTransformació per electroporació PACs i BACs s’introdueixen a les cèl·lules per electroporació perquè el mètode anterior no serveix. Serveix per transformar tant eucariotes com procariotes.\nProcariotes amb vectors molt grans concretament. Agafem el cultiu i el posem en suspensió en un medi i posar-lo dins d’una cubeta. Afegim el DNA que volem introduir dins de les cèl·lules i aquesta cubeta porta dos elèctrodes que es poden connectar a una font que generarà un voltatge. Apliquem el voltatge controlat durant un temps relativament curt i aquesta descàrrega elèctrica provoca porus a la membrana elèctrica mitjançant els quals el DNA s’introdueix a les cèl·lules i part d’aquest pot arribar al nucli. Posteriorment fem un procés de selecció per veure els que l’han incorporat.\n35 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Resum tipus de transformacions Biolística La biolística consisteix en disparar. El que fem és agafar partícules de tungstè o d’or (1 micròmetre de diàmetre) i es col·loquen en una solució que conté el meu DNA (vector amb el gen inserit) i al voltant de les partícules hi ha DNA introduït a les cèl·lules.\nCol·loquem el teixit vegetal que ha de ser transformat i això seria la secció d’una d’aquestes pistoles. El canó, percutor, la bala i un obturador. El que fem és col·locar en aquest sistema de partícules la meva bala. Tenim un petit forat al obturador.\nDisparo, el percutor fa sortir la bala disparada i davant de la bala hi ha les partícules que sortiran disparades per un forat que reté la bala. Aquestes partícules surten disparades al teixit vegetal. Al punt on impacten s’ho carreguen tot però allà on arriben al voltant amb menys velocitat, les cèl·lules no es moren i la bola permet la entrada dins de la cèl·lula amb el DNA que embolcalla les partícules. Agafo la part del teixit en un medi que permet regenerar les plantes. Arriba al nucli i a determinats orgànuls (mitocondri i cloroplasts). S’ha utilitzat en animals (teràpia gènica i lesions cutànies).\nPrincipalment s’utilitza en cèl·lules vegetals.\n36 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Microinjecció Cèl·lules animals. Consisteix en agafar una cèl·lula, manipular la cèl·lula i es tracta de creuar mascle i femella dels organismes que siguin i aïllar un ou fertilitzat en un estadi primerenc on estan els dos nuclis. Aïllo els ous fecundats i s’aguanten en una pipeta.\nEn una xeringa extremadament prima introduïm el gen que interessa dins del pronucli masculí (més gros, es veu més bé i és més fàcil d’introduir). Els òvuls es fiquen a una mare de lloguer i portarà a terme el embaràs. Donarà lloc a diferents teixits que portin el gen que nosaltres ens interessa. Quin d’aquests aliments porten en algun dels teixits del cos el gen d’interès amb PCR agafant mostres. Les rates es creuen i es pot aconseguir homozigots que poguessin generar organismes que portessin en tots els teixits del seu cos el gens que ens interessa. Transformem una sola cèl·lula cada vegada i és més difícil de realitzar que els altres processos.\n37 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) 38 ...\nTags: biologia molecular biomol tema 8 vectors estràtegies clonatge biologia,molecular,biomol,tema 8,vectors,estràtegies,clonatge\nBiologia Molecular - TEMA 5 Biologia Molecular (BIOMOL) (2017) Apunte


El CE Molins de Rei cau a casa contra el CH Gava | Viu Molins de Rei\nCE Molins de Rei 25-27 Club Handbol Gavà. El femení d’handbol cau a casa contra un rival directe en la lluita pel top 4 de Lliga Catalana. Les molinenques, poc constants, es veuen superades en una justa derrota.\nEl CE Molins de Rei necessita canviar el xip // Jose Polo\nAlguna cosa ha perdut el sènior femení d’handbol del Club Esportiu Molins de Rei. Deixant de banda les baixes de diferents jugadores d’una qualitat indubtable, l’equip entrenat per Isa Rabassa va perdent, poc a poc, la seva essència. Ja no pressionen com abans, la defensa fa aigües en els moments vitals i no tenen la capacitat de sortir a la contra com ho feien altres anys. Ens els moments complicats, quan els partits estan a punt de decantar-se per un costat o per un altre, pateixen. Juguen sota la pressió de l’exigència de ser un equip guanyador, capdavanter, dels millors de Catalunya, però no es troben a si mateixes. Massa por a perdre. S’han oblidat del més important quan ets una persona que deixa part de la seva vida personal sense cap remuneració econòmica a canvi per vestir una samarreta: gaudir jugant.\nPartit dels grans al Poliesportiu Municipal. El femení d’handbol del CE Molins de Rei, tercer, rebia al Club Handbol Gavà, quart a la classificació i equip que marca el límit per a l’accés a la final a 4 de la Lliga Catalana. Per tant, una oportunitat d’assegurar-se un lloc entre les 4 primeres places un cop ha quedat clar que Lleidatana i Granollers es jugaran l’estèril -no serveix de res si després no arribes a la final del top4- primera posició a la fase regular.\nVa sortir el Molins amb un objectiu primordial: millorar la defensa dels últims partits. I durant els primers minuts ho va fer, controlant les combinacions del Gavà, dominant el perillós l’1 contra 1 de les visitant i amb deu aturades a la porteria. Això va servir a les entrenades per Isa Rabassa per, amb un joc correcte en atac, fer un primer parcial de 8 a 5 a favor en els primers minuts. Però la defensa molinenca va començar a mostrar certs dubtes a mitjans del primer temps, fent que el Gavà jugués més còmode. A un equip així no li pots deixar ni un metre i van aconseguir empatar. Amb un 11 a 11 a l’electrònic es va arribar al descans.\nEl Molins va jugar sense les seves senyals d’identitat // Jose Polo\nA la segona part les forces es van igualar i cap dels dos equips va poder escapar-se a l’electrònic. Es podia copsar que el Gavà anava de menys a més i que el Molins era víctima de la tendència inversa. A manca de 4 minuts es va arribar amb 23 a 25 al marcador, dos gols que van pesar massa a l’equip d’Isa Rabassa. Final ajustat, una situació a la qual les molinenques han arribat en moltes ocasions aquesta temporada i la constància del Gavà va poder amb el CE Molins de Rei, que va caure a casa contra un rival directe. Derrota, justa i dolorosa, per 25 a 27.\nEl CE Molins de Rei veu perillar la seva classificació per al top4\nCal un canvi de xip. El CE Molins de Rei veu perillar la seva plaça en el top 4 de la Lliga Catalana. De fet, si el BM La Roca guanya aquesta setmana perdran la seva posició. A més, encara queda visitar la pista de la Lleidatana, segona a la classificació, i del Tortosa, equip més que complicat. L’equip necessita una reacció, tornar a creure en elles mateixes i recordar que, per guanyar, cal deixar la pressió a un costat i gaudir jugant.\n[View the story “CE Molins de Rei 25-27 Club Handbol Gavà (handbol femení març 2013)” on Storify]


Escrit per Toni Ros a les 09:20\nMr. Bostezo ha dit...\nJo no crec que hi pugui haver l’escenari d’una guerra civil ni molt menys. Estant dins de la Unió Europea i amb tants interessos mutus seria pràcticament impossible. Nosaltres no som l’antiga Iugoslàvia, fora de la UE i de l’Europa occidental, nosaltres som al bell mig d’Europa i una part important de l’euro i de la política europea. Està clar que hi ha una Espanya negra que buscarà com sigui boicotejar els processos democràtics de secessió, en el cas que es posin en marxa, i fins i tot és possible que algun militar boig - que n’hi ha molts - provi de portar l’excèrcit a alguna banda de l’estat espanyol. No obstant això la comunitat internacional es posaria del nostre bàndol, del dels demòcrates i no arribaria a passar res. Tot està a favor dels demòcrates. Els totalitaris, els partidaris de la força militar, no hi tenen res a fer, sobretot ara que Espanya és dins de la Unió Europea i qualsevol problema que tingui, és problema europeu intern.\nculturetes ha dit...\nAposto decididament pels "catalufos"! Només faltaria...\nI el pitjor de tot: la majoria silenciosa.\nTenia pensat fer el comentari de que, aquest posible "guerracivilisme" que ens comentes es pot donar a Catalunya en un futur no massa llunyà, pot esgarriar -com a l'antiga Iugoslàvia, compte!- més d'una i més de dues parelles benavingudes, però irremeiablement separades per idees polítiques. Faig tard, però, almenys pel que a mi fa... Tinc un problema menys, o un més, segons com es miri, i no sé pas si me n'he d'alegrar com a català. Vet aquí quina paradoxa!.


Grup Local Anoia : Plataforma Som Energia Grup Local Anoia : Plataforma Som Energia\nGrup Local Anoia\nPropietario: Martí Soler\nBreve descripción: Grup local de Som Energia a l'Anoia\nTaller presentació eines de mesura elèctriques\nPor Francesc Vilches hace 1373 días\nmega.nz - Xerrada del grup local de l'Anoia on es presenten una parell de mesuradors elèctrics per a l'ús dels socis. La presentació inclou exemples i casos d'ús per a mesurar la eficiència energètica i possible...\nReactivació de Grup Local Anoia\nPor Martí Soler hace 1609 días Respuestas (1) Última respuesta por Manel hace 1609 días\nSalutacions. Estem mirant d'impulsar el grup local de L'Anoia i per aquest motiu volem fer una reunió amb tots els membres que poguem de l'Anoia. Estem manejant la data d'aquest dissabte (31-01-15) o diumenge (01-02-15). Publiqueu en aquesta...\nPor Martí Soler hace 2339 días Respuestas (1) Última respuesta por Manel hace 2309 días\nAquest grup s'ha creat amb dues finalitats concretes. Ser el punt de trobada a la comarca de l'Anoia de qualsevol persona, entitat o institució que desitgi contactar amb els socis "actius" de la cooperativa Som Energia a la...\nGrup local de Som Energia a l'Anoia


El vicepresident del Govern presideix diumenge l'acte de lliurament dels premis Vila de Cambrils\nJosep-Lluís Carod-Rovira farà una visita institucional a l'Ajuntament i lliurarà els guardons en les seves diferents categories\nEl vicepresident del Govern, Josep-Lluís Carod-Rovira, presidirà el proper diumenge, 30 de novembre, l’acte de lliurament dels premis Vila de Cambrils en aquesta localitat del Baix Camp. L’acompanyarà el delegat del Govern a Tarragona, Xavier Sabaté.\nEl vicepresident del Govern arribarà a les 12.00 hores a l’Ajuntament de Cambrils on serà rebut per l’alcalde, Robert Benaiges. Posteriorment, presidirà l’entrega dels permis Vila de Cambrils. En concret es lliurarà el primer Premi de Narrativa Marítima Vila de Cambrils “Josep Lluís Savall”, el 22è Premi Internacional de Fotografia Vila de Cambrils, i el 28è Premi de Pintura de Vila de Cambrils. Un cop entregats els guardons hi haurà parlaments de l’alcalde de Cambrils i del vicepresident del Govern.\nUn cop finalitzats els parlaments, el vicepresident del Govern presidirà a mateix ajunatment la inauguració de l’exposició del 22è Premi Internacional de Fotografia Vila de Cambrils. Hi haurà intervencions del president de l’agrupació Fotogràfica de Cambrils, Joan Pastó, l’alcalde Robert Benaiges i el vicepresident.\nJust a la seva arribada a l’Ajuntament de Cambrils, a les 12.00 hores, el vicepresident del Govern atendrà els mitjans de comunicació.\n12:00|.Ajuntament (Pl. Ajuntament, 4) |Cambrils (El Baix Camp)\nAtenció als mitjans i entrega premis Vila de Cambrils


“Quatre arbres”, la rapsòdia infinita d’Empar Sáez – Lemúria\n“Quatre arbres”, la rapsòdia infinita d’Empar Sáez\nPassa de vegades que un llibre et visita, i inesperadament, després d’un procés dorment, es destaca entre la pila de llibres que et demanen ser llegits, i t’acompanya per un estrany misteri en els propis ritmes amb què t’acomodes al món.\nDe ritmes i moviments, naturalment, es compon el fonament poètic, de la poesia, que potser està lluny de ser l’expressió artística més antiga que la Humanitat ha creat, però sí és potser -i tal vegada per aquesta raó- la que més ha intentat connectar i integrar les altres. El poeta, així, busca tal vegada apropiar-se de la imatge pintada en la paret humida de la caverna per una mà que aspira a apropiar-se de la matèria exterior i dominar-la. O reproduir la mateixa dansa del cos que balla en l’intent d’atrapar l’oscil·lació permanent del temps. O el propi registre atàvic de la música, el cant, el primigeni principi del llenguatge (abans de la paraula no vindria la melodia i el seu ancorament, el ritme?) -el cant del cants, com recull un dels poemes-.\nEmpar Sáez ens proporciona en el seu darrer poemari,“Quatre arbres”, una immersió en les claus d’aquest fonament poètic que és en la base de tota manifestació del seu poder -i de la seva impotència, segurament-. Ben entès, no es tracta de cap disquisició filosòfica o metaliterària, ans la més radical i senzilla -i alhora complexa- experiència poètica, quant és irrenunciablement individual i alhora integradora d’una aspiració universal, un anhel d’apropiació de la veu sencera de l’espècie.\nEn aparents dicotomies irresolubles per l’ús de les paraules, de la paraula -si és possible aquí la invocació del gènere comú-, i per la contemplació tan serena com desolada -tenyida d’un escepticisme subtil que sembla refusar la interferència de l’egolatria habitual del poeta- de la impossibilitat de la paraula, del dir, Empar Sáez construeix un poemari sorprenentment breu en imatges, i ric en les seves expressions verbals. En efecte, l’ús d’unes poques imatges que es van repetint, juxtaposant i entrellaçant, enfrontades amb els seus aparents contraris, conformen en bona part l’extensió dels poemes. Componen així una mena de rapsòdia, amb un seguit de motius que es van desplegant en combinacions sempre renovades i, de vegades, contradictòries. El ritme podria fàcilment caure en accents sincopats, donada l’alternança reiterada d’elements oposats (claror/ombra, llum/fosca, brogit/silenci, vida/mort…), però ho presideix tot una mena d’obsessiu moviment mes aviat majestuós, una secreta dansa que persegueix cada poema, sovint cada vers (moltes cops per si sol una unitat de sentit o de desvetllament d’una sorprenent indagació que es resol en el seu mateix enigma). Arbres i bosc són un dels motius més recurrents: la contraposició entre la unitat de l’arbre, a la qual el poeta es lliga (fins a clavar-se en la mateixa escorça vegetal), i el bosc.\nLa unitat es multiplica en quatre (d’aquí el títol del llibre), però no deixa de ser un quantitatiu abastable, fàcilment apamable, al costat de la vastitud del bosc, com altres elements de la natura densa per on som convidats a transitar s’enfronten a la infinitud de l’univers. És aquesta dansa que uneix, doncs, el quantitatiu amb l’inquantificable el que la paraula estrènuament afronta. L’acte d’escriure, doncs, és tant la descripció del quantum i la concreció com la renúncia a l’apropiació de l’infinit. És la victòria i la derrota davant la insondable permanència de l’etern que batega en la limitació del discurs poètic. El somni, aquí, és una de les portes que semblen donar pas a aquesta experiència inefable, aquesta mena de tremolor mística:\nAixí seràs llançada infinitament\nmés lluny de la realitat,\ni del mateix somni que escrius.\nHi ha, en efecte, una invocació a certa capacitat taumatúrgica del llenguatge -potser més pròpiament demiúrgica-, de l’escriptura, alhora que un commovedor reconeixement del fracàs i la derrota. Si de cas, l’atzar pot rescatar -per pura serendípia?- la capacitat definitòria de la paraula: i anuncies que ets per atzar / dita en alguna paraula. L’atzar no és més, potser, que l’acotació dela mesura de la fatalitat de l’infinit a unes magnituds mesurables (siguin temps, distància o qualsevol altra dimensió imaginable)\nEl llibre s’articula en dues parts: “El bosc màgic” i “Sotabosc”. La primera potser més encarada a l’irresoluble gran misteri de la vastitud inexorable de l’univers, i la segona si de cas pouant en la infinita varietat i complexitat del món de les coses peribles. Moltes imatges, però, són comunes a les dues parts. Si de cas la imatge del vent, aquest implacable desequilibrador, presideix la primera, mentre la pluja presideix la segona. Una pluja que sembla capaç de fondre i esborrar la paraula/objecte (significant i significat), pero que també pot, atenció, escriure en el vidre el que tu no pots dir.\nEn fi, ens queden els poemes, però també els poemes que no han estat engendrats, que no han arribat a ser escrits o dits. Amb aquest poema d’una brevetat i concisió perfectes (que en les endreces que han quedat al final del llibre es dedica a la gran Marina Tsvetàieva), deixo dit el que he pogut dir d’un llibre que encara camina amb mi i m’acompanya vés a saber per quines noves paraules i quins nous silencis:\nEls versos que no escric\nem duen per passatges inconeguts,\nm’acompanyen vers una mort dorment\nde la qual no sé tornar.\nEmpar Sáez, “Quatre arbres”. Viena edicions, 2016.\n16 de Setembre de 2016 Eduard, Empar Sáez, Literatura, Poesia\nAnterior Previous post: Mà de dona: Kimpa Vita\nSegüent Next post: Mà de dona: Rosa Parks


Un altre any, Barcelona celebra el dia sense cotxes. En aquest cas, el 22 de setembre, coincidint amb el dia mundial sense cotxes, amb l’inici de les festes de la Mercè i en dia laborable. Així doncs, hi haura carrers que tindran trams totals o parcials on només podran circular vianants, bicicletes i transport públic.\nA més, en lloc de la circulació de cotxes podrem trobar propostes de tot tipus i per a totes les edats. Des de classes de ball a cursos de cuina, passant per espais de lectura o tallers de circ. En definitiva una jornada que reivindica la preocupació que genera la contaminació de la ciutat.\nUn dia per conscienciar-se de l’impacte que la nostra activitat suposa al medi ambient. I també per gaudir de les activitats, dels carrers i de la gent de Barcelona.\nAquests són els carrers afectats:\nPasseig Maritim (des de l’inici del passeig fins al final de l’Escola Mediterrània). Horari del tall: de 17:00 h a 21:00 h\nProvença entre Padilla i Lepant (davant l’entrada del centre). Horari del tall: de 15.30 h a 20.30 h\nBorrell entre Tamarit i Manso. Horari del tall: per determinar\nCruilla Viladomat – Consell de Cent. Horari del tall: de 8 a 18 h\nFigols entre els carrers Lluçà i Poble de Lillet. Horari del tall: De 11.00 h a 19.00 h\nBenavent, entre Travessera de les Corts iFelipe de Paz. Horari del tall: de 16.30 h a 21.30 h\nMontseny n. 2 al 39, desde Gran de Gràcia i Sant Joaquim amb Ros d’Olano. Horari del tall: de 08.00 h a 14.00 h\nC/ Cardener entre Sors i Escorial. Horari del tall: De 09.00 h a 13.00 h\nTrams propers al carrer Trilla: Santa Àgata des de Torrent de l’Olla fins a Gran de Gràcia i Gran de Gràcia fins la plaça Trilla. Horari del tall: de 10.00 h a 13.00 h\nCruïlla de Torrent de l’Olla amb Travessera de Gràcia. Horari del tall: de 15.00 h a 22.00 h\nBetlem entre Perez Galdos i Gran de Gràcia. Horari del tall: de 9.00 h a 15.00 h\nPasseig de la Font d’en Fargues entre el Pedrell i el Montserrat de Casanovas. Horari del tall: De 16.00 h a 22.00 h\nFeliu i Codina entre el Eduardo Toda fins al Chapí. Horari del tall: de 17.00 h a 21.00 h\nPart externa peatonal de la biblioteca. No és cap carrer transitable per cotxes. Horari del tall: de 17.30 h a 20.30 h\nRambla Fabra i Puig entre el n. 45 (Consum) i el 47 (Club Natació Sant Andreu). Horari del tall: de 18.00 h a 22.00 h\nGran de Sant Andreu de Malats a Ruben Dario. Horari del tall: De 8.00 h a 21.00 h\nPerú, entre el Bilbao i el Sant Joan de Malta. Horari del tall: de 08.00 a 13.00 h\nAv. Meridiana entre Corunya i Aragó (de baixada). Horari del tall: de 17.00 h a 21.00 h\nOrganitza: CEM Vintró + CEM Verneda\nPer més informació, podeu visitar el web oficial de la jornada: http://ajuntament.barcelona.cat/setmanamobilitat/ca/dia-sense-cotxes.php


Noves comunitats polítiques | CCCB LAB\nBanc de Selar crumenophthalmus, Kona Hawaii. Font: Flickr.\n«La política és una acció estratègica», escriu Byung-Chul Han a La sociedad de la transparencia (Herder, 2014): «I, per això, n’és pròpia una esfera secreta. Una transparència total la paralitza». Segons que es dedueix de la seva argumentació, el filòsof d’origen coreà s’oposa als principis del Partit Pirata d’Alemanya, proper a l’ètica hacker i a iniciatives com les d’Anonymous. Però no és difícil estendre aquest raonament a un marc global, que inclouria sobretot Wikileaks i les seves conseqüències. La seva defensa del secret polític necessari és un dels molts punts discutibles dels seus assajos, on afirma, per exemple, que Facebook elimina la intermediació, quan en realitat el que fa és fer-la més complexa a través d’un algoritme mutant. Si en l’horitzó de la nostra època hagués de buscar un llibre oposat a La sociedad de la transparencia, optaria per Futuro perfecto. Sobre el progreso en la era de las redes (Turner, 2013), de Steven Johnson. El seu projecte em sembla molt més precís i estimulant que el de Byung-Chul Han, que insisteix en la importància del que és sublim i de la negativitat, en detriment de la massa, del que és vulgar o de la democràcia –que no pot ni ha de ser sublim. I tot plegat pot ser significatiu, ja que l’un és un professor universitari de filosofia i l’altre és un simple divulgador.\nPerò aquest escriptor nord-americà que divulga ciència i tecnologia, a més, és un teòric dels nous mitjans, dissenya aplicacions i impulsa els seus propis projectes polítics. Doncs això és el seu últim llibre publicat a Espanya: una proposta ideològica molt seriosa. I absolutament coherent amb la trajectòria que va començar amb els seus dos primers llibres, Interface Culture: How New Technology Transforms the Way We Create and Communicate (1997) i Sistemas emergentes. O qué tienen en común hormigas, neuronas, ciudades y software (2001; Turner, 2003). Des d’aquelles dues obres en què Johnson analitzava les interfícies i els sistemes complexos, les maneres en què els éssers humans estem creant xarxes cada vegada més sofisticades, tots els llibres subsegüents han anat abordant la innovació tecnocientífica com a sinònim del progrés, amb una atenció particular a la història de les idees durant el segle XVIII, ja que Johnson situa en aquesta època els pilars de la seva poètica com a autor.\nEra una conseqüència gairebé predictible que arribés al concepte clau de Futuro perfecto: la xarxa de parells. Així les defineix: «són descentralitzades pel que fa als seus sistemes de control; cap individu o grup en particular no està “al càrrec” del sistema»; i hi afegeix que són xarxes denses, que van afegint participants amb un alt nombre de lligams entre ells; que són diverses, amb diferents opinions i punts de vista; que tenen més interès en l’intercanvi obert d’idees que no pas en la propietat privada; que acostumen a tenir una estructura d’estrats, afegint plataformes de col·laboració a les ja existents, i que «disposen de certs mecanismes capaços de posar en valor informació que circula per la xarxa, promovent les desviacions positives i frenant les negatives, creant incentius a la participació, o dirigint el sistema cap a certs objectius».\nEls exemples es multipliquen: institucions educatives, organitzacions no governamentals, comunitats veïnals, moviments de protesta, col·lectius artístics. Johnson també es distancia, com Byung-Chul Han, d’aquests autors i activistes que anomena ciberutòpics i de noves encarnacions de la vella idea d’anarquia. Per a ell l’esquerra pot creure en el poder del mercat, ser part del sistema neoliberal. Desconfia, per descomptat, dels executius, dels consellers, dels monopolis, de les multinacionals. «Al contrari que els neoliberals d’abans», afirma, «els parells progressistes no creuen que el mercat sigui capaç de satisfer totes les necessitats humanes». Per això existeix Google, però també –poderosa– Wikipedia. Per cada fracàs relatiu (Occupy Wall Street, la Primavera Àrab), hi ha almenys un èxit rotund d’aquestes estructures horitzontals, participatives, electròniques i humanes, com Kickstarter, que, des de la seva fundació el 2008, ha aconseguit més de 230 milions de dòlars per finançar més de 23.000 projectes creatius: «no és una plataforma per expressar el descontentament envers la lamentable manca de subvencions per a l’art», sinó «per aconseguir que les coses es facin».\nHi ha una nova zona, inestable i polimorfa, en què les comunitats creadores es troben amb els seus mecenes, amb els seus públics, amb les seves comunitats recreadores o recreatives (si no parlem, en realitat, de les mateixes comunitats, que van canviant els seus rols segons el moment del dia o de la setmana, de la lectura a la producció, de la subvenció a l’escriptura, del col·leccionisme a la creació en xarxa). Però són potser encara més interessants aquestes altres franges frontereres en què el crowdfunding es barreja amb la planificació urbana, la solució de problemes socials i la presa de decisions. Emparentat amb Kickstarter des del seu mateix nom, la finlandesa Brickstarter, és una plataforma que pretén actuar com una interfície entre els ciutadans i les institucions, aprofitant les noves tecnologies (sobretot les apps i el social media), per localitzar problemes i buscar solucions que incloguin veïns, voluntaris, inversors, empresaris locals o representants públics. Entre parells progressistes. Una de les moltes iniciatives que, aquí i allà, donen suport a la utopia de Johnson.\nHi estructures corporatives com Facebook, amb una lògica en el nivell dels usuaris que és de parells progressistes, però que, en realitat, es regeix per una estructura jeràrquica, rígida, panòptica, que persegueix el benefici econòmic i practica el control de continguts. «Els parells progressistes», continua Johnson, «desconfien del control i de la burocràcia que concentra un poder excessiu a la cúpula; volen més participació civil i més responsabilitat en temes del sector públic que afecten les seves comunitats». Una implicació que va des del mínim (al jardí de casa, el parc del barri, un blog escolar) fins al màxim (les xarxes globals de comunicació, el dret a la privacitat en l’era dels superservidors). I que suposa una proposta de renovació radical del que s’ha entès per esquerra, en el context tecnològic del segle XXI: «Volen que hi hagi més varietat d’elecció i més experimentació en l’educació pública (…). Creuen que la bretxa de riquesa i ingressos entre rics i pobres ha de tornar a ser més o menys com era en la dècada de 1950. (…) Són ultraliberals en assumptes socials, i consideren que la diversitat és un valor cultural clau. Creuen que l’arquitectura descentralitzada, de parell a parell, d’Internet ha estat una força positiva, i que els governs (i les grans empreses) no l’haurien de tocar».\nMentre a Espanya i l’Amèrica Llatina els nous moviments d’esquerra es pensen en termes de cossos (assemblees) locals, que posen en escac el mercat i que necessiten un líder, Futuro perfecto proposa un ús intel·ligent i responsable de les tecnologies de la informació per localitzar problemes socials, discutir-los, solucionar-los, mitjançant la generació de xarxes humanes, localitzades o deslocalitzades, sense jerarquies prèvies, integrades en les dinàmiques del capitalisme. Noves comunitats profundament polítiques. Ni demòcrates ni republicanes, ni socialistes ni capitalistes, ni anarquistes ni ultraliberals. El que s’ha dit: noves. D’una novetat possible, que està a les nostres mans convertir en probable.


Xisca de Gardi: Sant Oli\nPublicat per Josep Oliveras a 16:26\nTinc com un tuf al nas\nque el bordegàs d'en Quel\namb això de Sant Oli\nens en vol prendre el pel\nel Sant Bisbat ha establert\nque el quinze de Novembre\nSe celebri a Sant Albert\nI qui pot sé aquest Sant Oli?\nun nou sant canonitzat,\nun nouvingut emigrat,\nSant de pa sucat amb oli?\nSi voleu estar segurs\nsobre els sants acreditats\nconsulteu un calendari\namb licència arquebisbal:\n16 de novembre de 2008 a les 4:43\nEls centre americans tenen un sant especialitzat amb les febleses humanes. Beure, fumar, jugar i l’altre que no cito per no ser castigat. L’hi diuen Maximón i es mig sant i mig dimoni. Cal acudi-hi desprès de qualsevol excés en les ares descrites i ens donarà consol i perdo, sense exigir a canvi el compromís de la no reincidència\nEl centre de la veneració es a Guatemala i específicament a Santiago Atitlan. El veiem com un sant laic, vestit amb roba local però també amb americana i corbata. Lluint un nas vermellet i no pas del sol, i que quant va de trajo porta entre els dits una cigarreta encesa. No de guix com tot ell, sinó de les de veritat. Es l’equivalent a l’espelma que posem a santa Rita per un examen mal preparat o a Sant Pancraç perquè ens ompli la botiga. Son els fidels que l’hi fan l’ofrena de tenir permanentment el cigarret encès.\nTel trobes a les cases, a les parades dels mercats i també a algunes esglésies i sempre en posició considerada. Un cop vaig preguntar al capella el perquè de la presencia si es evident que a Roma no els hi deu agradar massa. Em va contestar amb la variable local d’una frase tan nostrada com aquella que diu de que tots tenim botiga i que la volem com mes plena millor.\nAixí sia, que diria en Samora\n17 de novembre de 2008 a les 10:03