ՔՍԱՆՏԻՆ ՕՔՍԻԴԱԶԻ ՀԱԿԱՕՔՍԻԴԱՆՏԱՅԻՆՀԱՏԿՈՒԹՅՈՒՆՆԵՐՈՎ ՕԺՏՎԱԾ ԱՐԳԵԼԱԿԻՉՆԵՐԻԿԻՐԱՌՈՒՄԸ ԳԼԽՈՒՂԵՂԻ ԷՔՍՊԵՐԻՄԵՆՏԱԼ ԻՇԵՄԻԱՅԻՊԱՅՄԱՆՆԵՐՈՒՄՊուրինային  և  պիրիմիդինային  կատաբոլիզմի  կարգավորող  ֆերմենտները  կարող  են  ցուցաբերել  վերականգնող  հատկություններ  պրոլիֆերացիայիգործընթացում։
   Նախորդ  աշխատանքում  մենք  ցույց  ենք  տվել,  որ  ալոպուրինոլը,  որը  հանդիսանում  է  ՔՕ-զի  (Քսանտին  օքսիդազի)  արգելակիչ  է,  ընդունակ  է  կարգավորել  պուրինային  կատաբոլիզմը  լյարդի  հյուսվացքում  [1]  ևխթանել բջջային պրոլիֆերացիան [2]։
 Ալոպուրինոլի հետ կապված հազվադեպ հանդիպող խիստ կողմնակի բացասական  ռեակցիաները  մահվան  առիթ  է  դառնում։
   Այդպիսի  ռեակցիաներիհետևանքով  նկատվում  են  կարմրություն,  բորբոքման  պրոցեսների  խթանում,որոնք  զուգակցվում  են  էոզինոֆիլների,  լեյկոցիտների  քանակության  աճով,տենդով,  լեյկոցիտոզով,  ինչպես  նաև  զարգացող  երիկամային  վնասվածքներով։
   Ալոպուրինոլից  գոյացած  օքսիպուրինոլը  ունակ  է  կազմել  կոմպլեքսայինմիացություններ HLA-B 58։
 1 գենով կոդավորած պեպտիդի հետ։
  Այս կոմպլեքսը խթանում է իմունային համակարգի պատասխանը և նպաստում T-բջիջների գոյացմանը և կողմնակի բացասական էֆեկտների դրսևորմանը [3]։
 Այդ իսկ պատճառով անհրաժեշտություն է ծագում այլ արգելակիչների կիրառումը էքսպերիմենտալ պայմաններում, ինչպես նաև կլինիկայում։
  Մեր կողմից հայտնաբերված նոր ՔՕ-զի արգելակիչը՝ պիրիդոքսինը [4], կարող է հանդիսանալ  լավագույն  միացությունը  հետիշեմիկ  պայմաններում,  որը  չի  ցուցաբերում կողմնակի բացասական էֆեկտներ, ինչպես նաև արդեն իսկ կիրառելիէ բժշկության մեջ։
 Բջջային մշակույթի կիրառմամբ մենք հայտնաբերեցինք, որ պիրիդոքսինըինչպես  նորմալ,  այնպես  էլ  պաթոլոգիկ  պայմաններում  ունակ  է  խթանել  բջջային պրոլիֆերացիան [5]։
 Մեր  աշխատանքում  մենք  գնահատել  ենք  պիրիդոքսինի  նյարդապաշտպանիչ  հատկությունները  պերօքսիդի  առկայության  պայմաններում  «in  vitro»փորձարկումների  շնորհիվ՝  կիրառելով  նյարդային  բջիջներ  պարունակողսաղմնային մշակույթը։
 Նաև դիտարկվել է պիրիդոքսինի պաշտպանիչ հատկությունները փորձարարական ինսուլտի պայմաններում առնետների օրինակով։
 Մեթոդներ1.  Կենդանիների անալգեզիա, անեսթեզիա, էֆթանազիաԱռնետներին  ներարկվել  է  պենտոբարբիտալ  10մգ/100գ։
   Էֆտանազիանկառաջացնենք՝ կիրառելով անեսթետիկների մեծ դեղաչափ։
 2.  Առաջնային մարդու ուղեղից ստացված բջջային կուլտուրաՓորձի  ընթացքի  համար  անհրաժեշտ  բոլոր  գործողություններն  իրականացվել են Հելսինկի դեկլարացիայի համաձայն։
  Մարդու սաղմի հեռացումն իրականացվել է կանանց համաձայնությունը հաշվի առնելով։
  Որպես փորձնական կենսաբանական հիմք` օգտագործել ենք 12 շաբաթական սաղմնային ուղեղ։
  Ստացված ուղեղը մի քանի րոպեների ընթացքում տեղադրում են նեյրոբազալ  սնուցող  միջավայր,  որը  պարունակում  է  0.05%  սիճուկային  ալբումին։
 Կենսաբանական  էքսպերիմենտալ  հումքը  տեղափոխվում  է  թերմոստատայինպայմաններ (t=4C)։
  Կենսաբանական հումքը, տեղափոխվելով լաբորատորիա,370C  աստիճան  պայմաններում  ինկուբացիայի  է  ենթարկվում  լուծույթում  20րոպեի ընթացքում, որը պարունակում է 0.05% սիճուկային ալբումին և 0.13%տրիպսին։
   Ուղեղային  հյուսվածքը  մանրացվում  է  Պաստյորի  պիպետի  օգնությամբ։
   Նստվածքը,  որը  ստացվում  է  15  րոպե  ցենտրիֆուգելուց  հետո(G=5000), լուծում են նեյրոբազալ սննդային միջավայրի մեջ, որը պարունակումէ  1%  սիճուկային  ալբումին,  այս  գործողությունը  կրկնում  ենք  երեք  անգամ։
 Վերջնական  բջջային  ֆրակցիայով  ցանք  է արվում  35  մմ պետրիի  ամաններիմեջ, որոնք նախապես պատված են լինում պոլի-L-լիզինի լուծույթով (Sigma), որը  պարունակում  է  նաև  0.09%  Na2HPO4,  1%  գլյուկոզ,  0.04%  KCl,  0.06%KH2PO4,  0.4%  MgSO4*7H20  և  0.001%  գենտամիցինի  սուլֆատ։
   Մեկ  օր  անց՝միջավայրը փուխարինվում է նոր նեյրոբազալ միջավայրով, որը պարունակումէ 2% B27 հավելումը (Gipco)։
  Բջիջների քանակությունը հաշվարկվել է 7-րդ օրվա ընթացքում։
 3.  Բջիջների ներկումը տրիպան կապույտովԲջիջների սուսպենզիան լուծվում է HBSS միջավայրում։
  Բջջային սուսպենզիայի  0.2  մլ  լուծույթի  վրա  ավելացվում  է  0.3  մլ  HBSS,  0.5  մլ  0.1%-ոց  տրիպան  կապույտ։
   Բջիջները  ներկի  մեջ  ինկուբացիայի  են  ենթարկվում  հինգ  րոպեների ընթացքւմ, որից հետո մոտ մեկ մկլ բջջային ներկ պարունակող սուսպենզիան տեղափոխում են հեմատոցիտոմետրի մեջ (Գորյաևի խցիկ)։
  Մահացած բջիջներն այս պայմաններում ներկված են լինում կապույտ գույնով։
  Անհրաժեշտ է նշել, որ 1 սմ3 խցիկի մակերեսը համապատասխանում է 0,1 մկլ լուծույթին,  այսինքն,  հաշվարկելով  բջիջների  քանակությունը  1  սմ3  ծավալում,մենք կարող ենք խոսել բջիջների քանակության մասին մեկ մկլ լուծույում[6]։
 4. Պրոտեինների քանակական որոշումը Բրեդֆորդի մեթոդովԿումասի բրիլիանտը (G -250) (100 մգ) լուծում ենք 50 մլ 95% էթանոլում,ավելացնում ենք 100 մլ 85% (կշիռ և ծավալ) ֆոսֆորաթթու, որից հետո ավելացնում ենք այնքան ջուր, որ այդ ընդհանուր ծավալը հասնի 1000 մլ-ի, որիցհետո ֆիլտրում ենք վատման #1-ով (watman #1)։
  Ինկուբացնում ենք 20 րոպեիընթացքում։
   Այնուհետև,  օգտագործելով  Carry  80  (Agilent  Technologies,  USA)սպեկտրոֆոտոմետրը,  կիրառում  ենք  590  նմ  ալիքի  երկարությունը,  երբ  որոշում ենք պրոտեինների կոնցենտրացիան կենսաբանական լուծույթում [7]։
 5. Ջրածնի պերօքսիդով առաջացվող գլխուղեղային վնասվածքի մոդելՋրածնի 3% պերօքսիդի լուծույթը 5 մկլ քանակությամբ ներուղեղային ուղիով  սրսկվել  է  սահմանափակ,  կետային  կրանիոտոմիայից  հետո։
   Սրսկումըկիրականացվի հետևյալ գլխուղեղի կոորդինատներում՝ բրեգմայից՝ 2 մմ պոստերիոր, միջին գծից 3 մմ լատերալ, 2 մմ ներքև գանգոսկրի ներքին մակերեսից։
   Սրսկումը  կիրականացվի  ստերիոտոքսիկ  շրջանակի  կիրառմամբ։
 Քսանյոթ համարի ասեղը, որը ունի 30 աստիճանի տակ սրացված կեռ, իջեցվել է դեպի գլխուղեղի պարենքիմա՝ նշված դիրքում։
  Սրսկումից հետո ասեղըմնացել է գլխուղեղում ևս 2 րոպե, որից հետո դանդաղ հեռացվել է։
  Վիրահատությունից  հետո  անցքը  փակվել  է  ոսկրային  մոմով,  կտրվածքը  կարվել  ևկենդանին  վերադարձվել  վանդակ։
   Կենդանին  կկարողանա  ազատ  օգտվելջրից  և  կերակից։
   Ազատ՝  ջրից  և  կերակրից  օգտվելու  ունակություն։
   Հեմատոէնցեֆալիկ  պատնեշի  վնասվածքների  աստիճանը  որոշվել  է  «Evans  blue»ներկի  օգնությամբ,  որը  4մգ/կգ  դեղաչափով,  2  ժամ  փորձի  ավարտից  առաջներարկվել է եղանակով կսրսկվի կենդանիներին (Oie,Ono et all, 2007)։
 6. Վիճակագրական վերլուծությունԲոլոր տվյալները արտահայտված են որպես միջին ցուցանիշ ± SEM։
  Վիճակագրական ճշգրտությունը վերլուծվել է «ONE-WAY ANALYSIS OF VARIANS(ANOVA)»-ի միջոցով։
  Տվյալները համարվել են վիճակագրորեն հավաստի, այնդեպքում, երբ p<0.05։
 Հաշվարկումները  կարող  են  իրականացվել  «Sigma  Stat»  կամ«Graphprism» ծրագրերի օգնությամբ։
 Ստացված տվյալները1.  «In  vitro»  բջիջների  քանակության  հաշվարկը  մշակույթում  ջրածնիպերօքսիդը սնուցող միջավայր ավելացնելուց հետո Մարդկային գլխուղեղի առաջնային սաղմնային մշակույթը պահպանվել է7  օր։
   Յոթերորդ  օրվա  ընթացքում  մշակույթի  միջավայր  ավելացվել  է  3%ջրածնի պերօքսիդ և բջջային մշակույթը պահպանվել է ևս 24 ժամ։
  Հաշվարկվել է ոչ ներկված բջիջների քանակությունը մանրադիտակի դաշտում։
  Մանրադիտակային  ուսումնասիրությունների  ընթացքում  բոլոր  պայմանները  պահպանվել են նույնը. մանրադիտակի սեղանիկի բարձրությունը, լույսի ինտենսիվությունը  և  այլն։
   Ի  համեմատ  ստուգիչ  խմբի  (2680.00±45.34)՝  պերօքսիդստացված  մշակույթի  դաշտում  բջիջների  քանակությունը  զգալիորեն  փոքրանում էր (1631.89±111.77) (նկար 1 A)։
  Ալոպուրինոլի ավելացումը պերօքսիդից15  րոպե  (1852.38±94.79)  առաջ  և  15  րոպե  հետո  (1950.38±33.67)  զգալիորեն և հաստատուն, վիճակագրորեն ճշգրիտ բարձրացնում է այդ ցուցանիշները։
   Հետաքրքրաշարժ  է,  որ  պիրիդոքսինի  ավելացումը  միջավայր  նույնպեսնպաստում  է  բջջային  կենսունակությանը։
   Ավելին՝  վերջինիս  ավելացումը  միջավայրի  մեջ  պերօքսիդից  հետո  ցուցաբերում  է  ավելի  ուժգին  պաշտպանություն  (2392.38±104.01),  (p<0.05),  քան  հետո  (2106.88±79.64)։
   Այսպիով՝ջրածնի  պերօքսիդի  ավելացումը  բջջային  մշակույթի  սնուցող  միջավայր  կտրուկ  իջեցնում  է  բջջիների  քանակությունը  ի  համեմատ  ստուգիչ  խմբի։
   Պիրիդոքսինը, ավելացված մինչև, ինչպես նաև ջրածնի պերօքսիդից հետո, ցուցաբերում  է  նյարդապաշտպանիչ  հատկություններ  և  նպաստում  է  վերջիններիսքանակության պահմանմանը։
 Նկար 1. «In vitro» բջիջների քանակության հաշվարկը մշակույթում ջրածնի պերօքսիդըսնուցող միջավայր ավելացնելուց հետո։
  Փորձերի ընթացքում օգտագործվել է «Boeco»մանրադիտակը, կոնտրաստ ֆազային հավելյալ ոսպնյակների համակարգի հետ միասին (Գերմանիա, 60x1.25x40 խոշորացմամբ)։
  Բջիջներն աճեցվել են ապակու վրա`պատված պոլիլիզինով։
  Որպես սնուցող լուծույթ կամ միջավայր` օգտագործել ենք նեյրոբազալ/B27-ը։
  Նկարները ենթարկվել են անալիզի «Pixcavator 4» ծրագրի օգնությամբ։
  A. բջջային կուլտուրայի մանրանկարները, որտեղ գծանիշը համապատասխա նում է 10 նանոմետրի։
  B. բջիջների քանակությունը`հաշվարկված 7-րդ օրվա ընթացքում։
  Վերջնական հաշվարկների համար կիրառվել է «t-student»։
 2.  Մահացած  բջիջների  քանակության  հաշվարկումը պերօքսիդի  ավելացումից հետո  Մեկժամյա սթրեսի ենթարկելուց 24 ժամ հետո մենք հաշվարկեցինք մահացած բջիջների քանակությունը, ներկելով վերջիններս տրիպան կապույտով։
 Ջրածնի  պերօքսիդը  կտրուկ  բարձրացրեց  մահացած  բջիջների  քանակությունը (740.33±86.16) ի համեմատ ստուգիչ խմբի (245.90±31.72), (p<0.05), (նկար2)։
   Ալոպուրինոլի  ավելացումը  պերօքսիդից  առաջ  (556.78±16.17),  ինչպեսնաև պերօքսիդից հետո (536.70±49.79) նվազեցրեց բջջային մահը։
  Պիրիդոքսինի  ավելացումը  պերօքսիդից  առաջ  (231.50±53.77)  շատ  ավելի  արդյունավետ  էր  (630.22±71.84),  (p<0.05,  ONE  WAY  ANOVA)։
   Բջիջները  ներկվել  են0.04% տոկոսանոց տրիպան կապույտ ներկով և վերջիններիս քանակությունըհաշվարկվել է նույն քանակությունը հաշվարկվել է նույն «Pixcavator 4» ծրագրի օգնությամբ։
 Համաձայն փորձի տվյալների ալոպուրինոլի կիրառումը ջրածնի պերօքսիդից առաջ և հետո, ինչպես նաև պիրիդոքսինի ավելացումը միջավայր պերօքսիդից հետո կանխարգելում է բջջային մահը։
 3.  Ալոպուրինոլի  և  պիրիդոքսինի  փորձարկումը  «in  vivo»  էքսպերիմենտներում Իշեմիկ  տիպի  ինսուլտը,  այնպես  ինչպես  հեմոռագիկը  կարող  են  ավելիսրվել մի շարք հավելյալ մեխանեիզմների շնորհիվ, որոնց թվին է պատկանումազատ  ռադիկալների  գոյացումը,  ինչպես  նաև  հեմոգլոբինի  արտազատումը։
 Մեր փորձերի ընթացքում մենք մոդելավորել ենք ինսուլտի ընթացքում ազատռադիկալների  գոյացման  փուլը։
   Այդ  նպատակով,  մենք  իրականացրել  ենքջրածնի  պերօքսիդի  ներուղեղային  սրսկում։
   Լաբորատոր  սպիտակ  առնետների  սրսկումից  հետո  ներորովայնային  եղանակով  նաև  ներարկվել  է  պիրիդոքսին,  մյուս  խմբերը  ստացել  են  ալոպուրինոլ  խմելու  ջրի  միջոցով  տասներկուկամ վեցական օրերի ընթացքում։
  Տասներկու օր անց կենդանիներին ներարկվել է «Еvans Blue» ներկը և վերջիններս ներսրտային պերֆուզիայից հետո դեկապիտացիայի են ենթարկվել և ներկը էքստրակցիայի է ենթարկվել գլխուղեղի պարենքիմայից։
  Պիրիդոքսինի բարձր դեղաչափի օգտագործման պայմաններում կենդանիների միայն տասնյոթ տոկոսն է կենդանի մնացել։
  Ցածր պիրիդոքսինի դեղաչափերը, ինպես նաև ալոպուրինոլը կանխարգելեցին կենդանիների  մահացելիությունը։
   Ավելին`  ալոպուրինոլը,  ինչպես  նաև  պիրիդոքսինիցածր  դեղաչափը  փորձերում  կանխարգելեցին  հեմատոէնցեֆալիկ  պատնեշիվնասումը և Еvans Blue ներկի թափանցելիությունը դեպի գլխուղեղային պարենքիմա (նկար 3)։
 Նկար 3. «Evans Blue» թափանցումը առնետների գլխուղեղի պարենքիմա։
  A. Ցուցադրելի նկարներ, որոնք ներկայացնում են ամեն խմբի համար բնորոշ ներկի թափանցելիության ինտենսիվությունը գլխուղեղի պարենքիմա։
  B. «Evans Blue» ներկի քանակության որոշումը վերահաշվարկված 1 գ հյուսվածքի վրա։
 Եզրակացություններ և տվյալների քննարկումԱյսպիսով մենք հանգեցինք այն եզրակացությանը, որ ջրածնի պերօքսիդիավելացումը բջջային մշակույթի սնուցող միջավայր կտրուկ իջեցնում է բջջիների  քանակությունը  ի  համեմատ  ստուգիչ  խմբի։
   Պիրիդոքսինը,  ավելացվածմինչև, ինչպես նաև ջրածնի պերօքսիդից հետո, ցուցաբերում է նյարդապաշտպանիչ հատկություններ և նպաստում է վերջիններիս քանակության պահմանմանը։
 Համաձայն  փորձի  տվյալների՝  ալոպուրինոլի  կիրառումը  ջրածնի  պերօքսիդից  առաջ  և  հետո,  ինչպես  նաև  պիրիդոքսինի  ավելացումը  միջավայր  պերօքսիդից հետո կանխարգելում է բջջային մահը։
 «In  vivo»  փորձարկումները  հաստատեցին  մեր  նախորդ  փորձերի  ընթացքում  ստտացված  տվյալները։
   Պիրիդոքսինը  ի  համեմատ  ստուգիչ  խմբի  կանխարգելում  է  հեմատոէնցեֆալիկ  պատնեշի  վնասվածքների  գոյացումը  և«Evans  Blue»  ալբումինային  կոմպլեքսի  արտաթափանցումը  գլխուղեղայինպարենքիմա։
 Գրականությունregulation. Electronic Journal of Natiral Science, 2013. 2(21)։
  p. 17-21.Culture. Central Nervous System Agents in Medicinal Chemistry, 2013. 13(2)։
  p. 108-13.3.  Stamp, L.K., R.O. Day, and J. Yun, Allopurinol hypersensitivity։
  investigating the cause andNeuroscience and Biomedical Engineering, 2014. 2։
  p. 81-86.2013. 1(2)։
  p. 28-34.Transplantation, 1964. 2(Nov )։
  p. 685-694.7.  Kruger, N.J., The Bradford method for protein quantitation. Methods Mol Biol, 1994. 32։
  p.Մ. Տ. Ավետիսյան, Ք. Է. Դանիելյան, Ա. Ս. ՍաղյանՔՍԱՆՏԻՆ ՕՔՍԻԴԱԶԻ ՀԱԿԱՕՈՍԻԴԱՆՏԱՅԻՆ ՀԱՏԿՈՒԹՅՈՒՆՆԵՐՈՎ ՕԺՏՎԱԾԱՐԳԵԼԱԿԻՉՆԵՐԻ ԿԻՐԱՌՈՒՄԸ ԳԼԽՈՒՂԵՂԻ ԷՔՍՊԵՐԻՄԵՆՏԱԼ ԻՇԵՄԻԱՅԻԲանալի բառեր՝ փորձարարական ինսուլտ, պիրիդոքսին, ալոպուրինոլ, նյարդապաշտՊԱՅՄԱՆՆԵՐՈՒՄպանիչ միացություններԱմփոփում։

Նախորդ աշխատանքում մենք ցույց տվեցինք, որ ալոպուրինոլը, որը հանդիսանում է  ՔՕ-զի  (քսանտին  օքսիդազի)  արգելակիչ,  ընդունակ  է  խթանել  բջջային  պրոլիֆերացիան։
   Մեր  կողմից  հայտնաբերվել  է  նաև  մեկ  այլ  նոր  ՔՕ-զի  արգելակիչ՝  պիրիդոքսինը։
   Մեթոդներ։
   Կիրառվել  է  մարդու  ուղեղից  ստացված  առաջնային  բջջային  մշակույթը։
   Ջրածնի  3%  պերօքսիդի լուծույթը ներուղեղային ուղիով սրսկվել է սահմանափակ, կետային կրանիոտոմիայից  հետո`հանդիսանալով  էքսպերիմենտալ  ինսուլտի  մոդել։
   Եզրակացություններ  և  տվյալներ։
   Մենք  եզրակացրեցրինք,  որ  պիրիդոքսինը  ցուցաբերում  է  նյարդապաշտպանիչ  հատկություններ և կանխարգելում է հեմատոէնցեֆալիկ պատնեշի վնասումը։
