ՈՉ ՍՊԻՏԱԿՈՒՑԱՅԻՆ ՀԵՏԵՐՈՑԻԿԼԻԿ ԱՄԻՆԱԹԹՈՒՆԵՐԻ ԵՎ ԴՐԱՆՑ ՊԵՊՏԻԴՆԵՐԻ ԱԶԴԵՑՈՒԹՅԱՆ ՀԵՏԱԶՈՏՈՒԹՅՈՒՆԸ ՊՐՈՏԵԻՆԱԶ K ՖԵՐՄԵՆՏԻ ԱԿՏԻՎՈՒԹՅԱՆ ՎՐԱՆերածություն։
   Պրոտեոլիտիկ  ֆերմենտները  մեծ  հետաքրքրություն  են  ներկայացնում  որպես  ֆարմակոլոգիական  թիրախներ։
   Պրոտեոլիտիկ  ֆերմենտներիկարևոր  ներկայացուցիչներից    են    տրիպսինը,  քիմոտրիպսինը  և  պրոտեինազ  K-ն։
 Դրանք  երեքն  էլ  դասվում  են  սերինային  պրոտեազների  շարքին։
   Պրոտեազներըուսումնասիրվել  են  դեռևս  18-րդ  դարում,  և  հայտնի  էր,  որ  դրանք  կարող  են  ճեղքել սպիտակուցները։
   Սերինային  պրոտեազները  հիմնարար  դեր  են  կատարում  մարդուֆիզիոլոգիական  գործընթացներում։
   Մյուս  կողմից  դրանք  կարող  են  պատճառ  հանդիսանալ  մի  շարք  ախտաբանական  վիճակների  զարգացման,  այդ  պատճառովկարևոր  խնդիր  է  հանդիսանում  տվյալ  հիվանդության  հետ  կապված  յուրահատուկպրոտեազների արգելակիչների հայտնաբերումը։
  Գենետիկական և կենսաքիմիականհետազոտությունների արդյունքում պարզվել է, որ պրոտեազներն օգտագործվում ենվիրուսների  կողմից՝  իրենց  կառուցվածքային  և  ֆունկցիոնալ  սպիտակուցները  հասուն վիճակի հասցնելու համար։
  Այսպիսով կենդանի բջջում վիրուսը սինթեզում է միշարք սպիտակուցներ և ֆերմենտներ` այդ թվում և պրոտեազներ, որոնք ուրույն կերպով  հիդրոլիզում  են  վիրուսի  կողմից  սինթեզված  պեպտիդները,  արդյունքում  առաջացած  սպիտակուցները  մասնակցում  են  վիրուսի  գենետիկական  նյութի  փաթեթավորմանը`  գոյացնելով  վիրուսային  նոր  մասնիկներ,  որոնք  վարակում  են  նոր,  առողջբջիջների։
  Գենային  ինժեներիայի ժամանակակից նվաճումները թույլ են տալիս գիտնականներին այս ֆերմենտները կիրառել որպես «մոլեկուլային գործիքներ»։
 Բնական  ոչ  սպիտակուցային  ամինաթթուներ  և  պեպտիդներ։
   Կենդանի  բջիջներում  ոչ  սպիտակուցային  ամինաթթուները  գտնվում  են  ինչպես  ազատ  վիճակում,այնպես էլ սպիտակուցների և պեպտիդների կազմում։
  Այդ միացությունները կարևորդեր  են  կատարում  օրգանիզմում  ընթացող  պրոցեսների  կարգավորման  և  բջջի  նորմալ կյանքի ապահովման գործընթացում [1]։
 Կենսաբանորեն  և  օպտիկապես  ակտիվ  միացությունների  շարքում  առանձնահատուկ  տեղ  են  զբաղեցնում  ոչ  սպիտակուցային  ամինաթթուներն  ու  դրանցիցկազմված պեպտիդները, որոնք վերջին ժամանակներս հաջողությամբ կիրառվում ենբժշկության,  դեղագործության,  մանրէաբանության  մեջ  և  գիտության  ու  տեխնիկայիայլ  բնագավառներում  [2]։
   Ոչ  սպիտակուցային  α-ամինաթթուները  ֆիզիոլոգիապես ակտիվ են և պիտանի՝ դեղապատրաստուկների կազմում ընդգրկվելու համար (միայնօպտիկապես  ակտիվ  իզոմերների  տեսքով)։
   Ոչ  սպիտակուցային  ամինաթթուներիցառավել հետաքրքրություն կարող են առաջացնել  ռադիկալում տարբեր կառուցվածքի  հետերոցիկլիկ  տեղակալիչներ  պարունակող  α-ամինաթթուները,  որոնք  օրգանիզմի համար  օտար են ինչպես կառուցվածքով, այնպես  էլ հետերոատոմների բնույթով։
 Ոչ  սպիտակուցային  α-ամինաթթուները մտնում են արդի բարձրակտիվ հակաուռուցքային, հիպերտենզիվ, ցավազրկող, ինչպես նաև ալկոհոլային և նարկոտիկ կախվածության վերացմանը նպաստող դեղապատրաստուկների և այլ պրեպարատների բաղադրության մեջ։
 Սերինային  պրոտեազներ  և  պրոտեազների  արգելակիչներ։
   Բոլոր  պրոտեազները  կատալիզում  են  նույն  ռեակցիան`  պեպտիդային  կապի  հիդրոլիզը,  սակայնդրանք  ցուցաբերում  են  ընտրողականություն`  կախված  սուբստրատից  և  հիդրոլիզվող կապի մոտ  գտնվող ամինաթթվի տիպից։
  Կախված կատալիտիկ խմբում ներառված  ամինաթթուներից`  հայտնաբերվել  են  բազմատեսակ  պրոտեազներ,  որոնցիցյուրաքանչյուրը կարելի է ներառել հետևյալ 4 խոշոր ֆունկցիոնալ դասերից մեկի մեջ`սերինային,  ասպարագինային,  ցիստեինային  մետաղպրոտեազներ  [3]։
   Սերինայինպրոտեազները  մասնակցում  են  օրգանիզմի  բազմաթիվ  ֆունկցիաներին`  ներառյալարյան  մակարդումը,  իմունային  ռեակցիան,  բորբոքային  պրոցեսները,  հանդես  ենգալիս որպես էուկարիոտների և պրոկարիոտների մարսողական ֆերմենտներ։
  Մյուսկողմից  սերինային  պրոտեազները  ներառված  են  նաև  մարդու  բազմաթիվախտաբանական պրոցեսների ձևավորման մեջ [5]։
 Խնդրի  դրվածքն  ու  հետազոտման  օբյեկտների  ընտրությունը։
   Աշխատանքինպատակն  է  որոշել  (S)-β-[4-(ֆուրան-2-մեթիլ)-3-բութիլ-5-թիօքսո-1,2,4-տրիազոլ-1-իլ]α-ալանին  ոչ  սպիտակուցային  α-ամինաթթվի  և  նոր  սինթեզված  N-ֆորմիլ-մեթիոնիլալանիլ-(S)--ալանին  α-[4--(ֆուրան-2-իլ-մեթիլ)-3-բութիլ-5-թիօքսո-1,2,4-տրիազոլ-1-իլ]α  պեպտիդի  հակամանրէային  հատկությունը  ու  ազդեցությունը  պրոտեինազ  K-իակտիվության վրա՝ որպես սերինային պրոտեազների ներկայացուցիչ։
 Հետազոտության  նյութեր  և  մեթոդներ։
   Աշխատանքում  օգտագործվել  են    հետևյալ  նյութերը`  Tritirachium  album-ի  պրոտեինազ  K  (Sigma),  HEPES  (Sigma),  2  %SDS, ցուլի շիճուկային ալբումին (Sigma), ոչ սպիտակուցային α-ամինաթթուներ` (S)-β[4-(ֆուրան-2-իլ-մեթիլ)-3-բուտիլ-5-թիօքսո-1,2,4-տրիազոլ-1-իլ]-α-ալանին  և  այն  պարունակող  պեպտիդ`  (N-ֆորմիլ-մեթիոնիլ-ալանիլ-(S)-β-[4--(ֆուրան-2-իլ-մեթիլ)-3-բութիլ-5-թիօքսո-1,2,4-տրիազոլ-1-իլ]-α-ալանին  (սինթեզված  ԵՊՀ  ասիմետրիկ  սինթեզիլաբորատորիայի  և  ՀՀ  ԳԱԱ  «Հայկենսատեխնոլոգիա»  գիտաարտադրական  կենտրոնի ոչ սպիտակուցային ամինաթթուների սինթեզի լաբորատորիայի գիտաշխատակիցների կողմից)։
 Պրոտեինազ K-ի ակտիվության որոշումը։
  Պրոտեինազ K-ի ակտիվությունը չափվել է ըստ ազատ ամինո խմբերի քանակի, օրտոֆտալալդեհիդի մեթոդով [6]։
  ՕՖԱ-ի ռեագենտը  30  մլ  ծավալում  պարունակել  է`  100  մմոլ/լ  բորաթթվի  բուֆեր  pH  9,7,5մգ/մլ  օրտոֆտոլալդեհիդ  և  2,5  մկլ  մերկապտոէթանոլ։
   T.album-ից  անջատված  պրոտեինազ K-ն լուծվել է թորած ջրում 10-20 մգ/մլ  կոնցենտրացիայով։
  Պրոտեինազ K-իակտիվության  չափման  համար  օգտագործվել  է  200  մկլ  ռեակցիոն  միջավայր  հետևյալ բաղադրությամբ. 1 M Ֆոսֆատային բուֆեր pH 7.2՝ 20 մկլ, 2 % SDS՝ 20 մկլ,մերկապտոէթանոլ 100 մմոլ/լ՝ 40 մկլ, ֆերմենտ՝ 20 մկլ, ցլի շիճուկային ալբումին (20մգ/մլ)՝ 100 մկլ։
 Ռեակցիոն  միջավայրը  30  րոպե  պահվել  է  37  օC  ջերմաստիճանի  թերմոստատում  (UTU  4-UNIVERSAL  ULTRATHERMOSTAT  Max.  200  օC),  հետո  ռեակցիոն  խառնուրդից ամեն սրվակի համար վերցվել է 50 մկլ լուծույթ, որի վրա ավելացվել է 10 մկլտետրաքլոր քացախաթթու ռեակցիան կանգնացնելու համար և չափվել է սպեկտրաֆոտոմետրով 340 նմ ալիքի երկարության տակ ռեակցիայի սկզբում և 30 րոպե անց։
 Ապա յուրաքանչյուր կյուվետի մեջ լցվել են հետևյալ լուծույթները. H2O՝ 1,5 մլ, ռեակցիոն միջավայր՝ 50 մկլ, ՕՖԱ-ի ռեագենտ՝ 1,5 մլ։
  3-5 րոպե անց գրանցվել է A340-ն։
 Պրոտեինազ K-ի ակտիվության չափման համար օգտագործվել է հետևյալ բանաձևը` A=∆A340*Vռեակց.միջ/ε* (ֆերմենտ ռեակցիոն միջավայրում)*∆t։
 ε-ն  էքստինկցիայի  գործակիցն  է,  որը  հաշվարկվում  է  ստանդարտ  լուծույթի(0,033  մմոլ/լ  մեթիոնին)  համեմատությամբ  A340-ի  միջոցով։
   Ապա  տվյալները  վերահաշվարկել  է  1  մմոլ/լ  մեթիոնինի  լուծույթի  համար.  H2O՝  1,5  մլ,  մեթիոնին՝  10  մկլ,ռեագենտ՝ 1,5 մլ։
 Ոչ սպիտակուցային ամինաթթուների ազդեցությունը մանրէների՝ հակաբիոտիկների  նկատմամբ  կայունության  վրա  հետազոտելու  համար  թեստ-կուլտուրաներ  ենընտրվել գրամ բացասական և գրամ դրական մանրէները` ներառյալ դրանց ռեկոմբինատային շտամները, որոնք կրում են տարբեր հակաբիոտիկների նկատմամբ կայունգեն ունեցող պլազմիդներ։
  Օգտագործված շտամները ներկայացված են աղ. 1-ում.Աղյուսակ 1ՇտամներՄիջավայրըՄՊԱՄՊԱՄՊԱՄՊԱՄՊԱՄիջավայրեր։
   Աղյուսակում  բերված  կուլտուրաների  աճեցման  համար  օգտագործվել է մսապեպտոնային ագար (ՄՊԱ)։
  1 լ ջրին ավելացվել է 20 գր ագար, ապաախտահանվել է շոգեգոլորշային ավտոկլավում 1 մթն. ճնշ. տակ` 20 րոպե։
 Վարակազերծ  պայմանների  պահպանում։
   Օգտագործվող  Պետրիի  թասերը,փորձանոթները նախօրոք 120-180 րոպե վարակազերծվել են 180-220 ˚C-ում, չորացուցիչ  պահարանում։
   Միկրոբիոլոգիական  ասեղը,  նշտարը,  ապակյա  մածկաթիակը օգտագործելուց  առաջ  վարակազերծվել  են  սպիրտայրոցի  բոցի  վրա`  սպիրտով  մշակելուց  հետո։
   Առհասարակ  փորձի  բոլոր  փուլերը  կատարվել  են  վարակազերծ  պայմաններում` սպիրտայրոցի բոցի առկայությամբ` վարակից խուսափելու համար։
 Մինչև  բուն  փորձն  իրականացնելն  անհրաժեշտ  է  նախ  ստանալ  E.coli-ի  ռեկոմբինատային շտամները։
  Վերջիններս ստացվում են տրանսֆորմացիայի մեթոդով, որիմիջոցով  որևէ  հակաբիոտիկի  նկատմամբ  կայուն  գեն  ունեցող  պլազմիդային  ԴՆԹ-նտրանսֆորմացվում է կոմպետենտ բջիջների մեջ։
 Վերացանքսի  տեխնիկան։
   Որպեսզի  շտամներն  անընդհատ  թարմ  լինեն  (պահպանեն  ակտիվությունը),  անհրաժեշտ  է  վերացանքս  կատարել։
   Վերացանքսը  համապատասխան  պլազմիդներով  շտամի  ու  դրան  համապատասխանող  ռեկոմբինատային  շտամի  դեպքում  կատարվում  է  հարուստ  ՄՊԱ  (մսապեպտոնային  ագար)  միջավայրում։
   Օգտագործելուց  առաջ  միջավայրը  հալեցվել  է,  թողնվել  որոշ  չափով  սառելու։
  Ստուգվել է pH-ը, որը պետք է լինի 7։
  Անհրաժեշտության դեպքում, եթե pH-ի շեղում է եղել, ավելացվել է NH4OH-ի լուծույթ կամ HCl-ի լուծույթ` pH-ն անհրաժեշտ ցուցանիշին հասցնելու նպատակով։
 Փորձից հետո տեսակավորվել են կուլտուրաները՝ ըստ իրենց աճման ջերմաստիճանի` թերմոստատում (մակնիշը՝ TC-80 M-2, ջերմ.՝ 37 ˚C)։
 Ցանքսի  տեխնիկան։
   Ցանքսը  կատարվել  է  միաշերտանի  ագարային  մեթոդով`միկրոբիոլոգիական  ասեղով  (ստերիլ)  վերցվել  է  յուրաքանչյուր  կուլտուրաներից  ևփորձանոթների  մեջ  (ստերիլ)  2  մլ  ՄՊ  արգանակով  պատրաստվել  է  գիշերային  կուլտուրա, որը պահվել է 1 օր` թափահարիչ սարքի մեջ 37 ˚C-ում։
  Հետո ցանվել է գազոնը` (ապակյա մածկաթիակով) պատրաստված գիշերային կուլտուրայից 0.2 մլ լցնելովմիջավայրերի վրա, Պետրիի թասերի մեջ ավելացվել է հակաբիոտիկ։
 Ոչ  սպիտակուցային  ամինաթթվի  և  պեպտիդի  տեղադրումը  ագարի  վրա։
   Միդեպքում օգտագործվել են ոչ սպիտակուցային ամինաթթվի բյուրեղները (ինչն ապահովում  է  կոնցենտրացիայի  գրադիենտը  դիֆուզիայի  ընթացքում),  որոնք  նշտարով(ստերիլ) լցվել են համապատասխան կուլտուրաների գազոնների վրա։
 Մյուս  դեպքում  կիրառվել  են  ոչ  սպիտակուցային  ամինաթթվի  լուծույթները  50մկլ 5 մՄ կոնցենտրացիայով, որոնք կաթեցվել են համապատասխան կուլտուրաներիգազոնների վրա։
  Լուծույթները ախտահանվել են ջրային բաղնիքում` 30 րոպե։
 Արդյունքները  և  դրանց  քննարկումը։
   Հետազոտվող  նյութերի  ազդեցությունըպրոտեինազ K-ի վրա ուսումնասիրվել է վերը նշված երկու մեթոդով [4]։
  ՊրոտեինազK-ի  ակտիվության  որոշումը  համաձայն  առաջին  մեթոդի`  ըստ  ազատ  ամինախմբերիքանակի ստացվել են հետևյալ տվյալները.Աղյուսակ 2.Ոչ սպիտակուցային α-ամինաթթուների ազդեցությունըպրոտեինազ K-ի ակտիվության վրաՄիացությունՍտուգիչ(S)-β-[4-(ֆուրան-2-իլ-մեթիլ)-3-բութիլ-5-թիօքսո-1,2,4-տրիազոլ1-իլ]-α-ալանինՊրոտեինազ K, %Աղյուսակից  երևում  է,  որ  ոչ  սպիտակուցային  α-ամինաթթու  (S)-β-[4-(ֆուրան-2իլ-մեթիլ)-3-բուտիլ-5-թիօքսո-1,2,4-տրիազոլ-1-իլ]-α-ալանինը  արգելակել  է  ֆերմենտիակտիվությունը 66,2 %-ով։
 Աշխատանքի երկրորդ փուլում իրականացվել է N-ֆորմիլ-մեթիոնիլ-ալանիլ-(S)-β[4--(ֆուրան-2-իլ-մեթիլ)-3-բութիլ-5-թիօքսո-1,2,4-տրիազոլ-1-իլ]-α-ալանինի ազդեցության  ուսումնասիրությունը  մանրէների`  հակաբիոտիկների  նկատմամբ  կայունությանվրա, այսինքն՝ հակաբիոտիկ պարունակող միջավայրում հետազոտվող նյութը  թողելէ  որևէ  ազդեցություն  կուլտուրայի  աճի  վրա,  թե  ոչ։
   Ստուգվել  է՝  դրանց  բյուրեղներըդնելով  E.coli-ի  ռեկոմբինանտային  շտամների  գազոնով  ցանված  ՄՊԱ  միջավայրիվրա։
  Արդյունքները ներկայացված են աղ. 2-ում։
 N-ֆորմիլ-մեթիոնիլ-ալանիլ-(S)-β-[4--(ֆուրան-2-իլ-մեթիլ)-3-բութիլ-5-թիօքսո-1,2,4տրիազոլ-1-իլ]-α-ալանին ազդեցությունը մանրէների աճի վրաԱղյուսակ 3.ՇտամներBacillus sp. (թերմոֆիլ)ՄիացությունN-ֆորմիլ-մեթիոնիլ-ալանիլ-(S)-β-[4-(ֆուրան-2-իլ-մեթիլ)-3բութիլ-5-թիօքսո-1,2,4-տրիազոլ-1-իլ]-α-ալանին+  կուլտուրայի աճը-   կուլտուրայի աճի արգելակումՓորձարարական աշխատանքի նպատակն էր գտնել ոչ սպիտակուցային այնպիսի ամինաթթուներ, որոնք հնարավոր է կիրառել դեղամիջոցների արտադրության մեջորպես  մանրէների`  հակաբիոտիկների  նկատմամբ  ունեցած  կայունության  դեմ  պայքարող պոտենցիալ միջոցներ, և արդյունքում այդպիսիք ստացվել են։
 Գրականություն1.  Սաղյան  Ա.,  Ամինաթթուների,  պեպտիդների  և  սպիտակուցների  քիմիա,  Երևան,2010, էջ 4, 11։
 5.  Rinderknecht H., Pancreatic secretory enzymes, in “The Pancreas։
  Biology, Pathobiology, andՀերմինե ԱվետիսյանՈՉ ՍՊԻՏԱԿՈՒՑԱՅԻՆ ՀԵՏԵՐՈՑԻԿԼԻԿ ԱՄԻՆԱԹԹՈՒՆԵՐԻ ԵՎ ԴՐԱՆՑ ՊԵՊՏԻԴՆԵՐԻ ԱԶԴԵՑՈՒԹՅԱՆ ՀԵՏԱԶՈՏՈՒԹՅՈՒՆԸ ՊՐՈՏԵԻՆԱԶ K ՖԵՐՄԵՆՏԻ ԱԿՏԻՎՈՒԹՅԱՆ ՎՐԱԲանալի բառեր՝ ոչ սպիտակուցային հետերոցիկլիկ ամինաթթու, պեպտիդ, պրոտեինազ K ֆերմենտ։

Ուսումնասիրվել  է  ոչ  սպիտակուցային  ամինաթթու  (S)-β-[4-(ֆուրան-2-մեթիլ)-3-բութիլ-5թիօքսո-1,2,4-տրիազոլ-1-իլ]-α-ալանինի և նոր սինթեզված N-ֆորմիլ-մեթիոնիլ-ալանիլ-(S)-β-[4-(ֆուրան-2-իլ-մեթիլ)-3-բութիլ-5-թիօքսո-1,2,4-տրիազոլ-1-իլ]-α-ալանին  պեպտիդի  հակամանրէային հատկությունը ու ազդեցությունը պրոտեինազ K-ի ակտիվության վրա՝ որպես սերինային  պրոտեազների  ներկայացուցիչ։
   Ցույց  է  տրված,  որ  (S)-β-[4-(ֆուրան-2-մեթիլ)-3-բութիլ-5-թիօքսո-1,2,4-տրիազոլ-1-իլ]-α-ալանինն  արգելակում  է  ֆերմենտի  ակտիվությունը  66,2  %-ով։
   Իսկ   դիպեպտիդ  N-ֆորմիլ-մեթիոնիլ-ալանիլ-(S)-β-[4--(ֆուրան-2-իլ-մեթիլ)-3-բութիլ-5-թիօքսո-1,2,4տրիազոլ-1-իլ]-α-ալանինը  ազդեցություն  է  ցուցաբերել  որոշ  կուլտուրաների  աճի  վրա  (C.  freundii 62 և Bacillus sp. (թերմոֆիլ))։
