ՊՈԼԻԱՄԻՆԻ ՔԱՆԱԿԻ ՓՈՓՈԽՈՒԹՅԱՆ ՈՒՍՈՒՄՆԱՍԻՐՈՒՄԸ ԱՐԳԻՆԱEԻ ԻՍՈՖԵՐԵՆՄՆԵՐԻ INԱՆԱՉՄԱՆ ԸՆԹԱՔՈՒՄ. Ներածություն.   Պոլիամինները բջիջի անփոխարինելի բաղադրիչներն են, որոնք ունեն էֆեկտների լայն շրջանակ:   Նրանց կենսասինթեզի նախորդը L-ornithine ամինաթթուն է, որը կազմվում է L-arginine ամինաթթվից ՝ արգինազ ֆերմենտով:   Օրնիտինից օրնիտին դեկարբոքսիլազը սինթեզում է էվտրեսին պոլիամինը, որից հետո սերմնաբջիջը վերափոխվում է սպերմիդինի ՝ սերմնահեղուկի սինթազի, ապա ՝ սերմինի [13, 15]:  Պոլիամինները հայտնաբերված են համարյա բոլոր էուկարիոտների և պրոկարիոտների բջիջներում:   Դրանք պոլիցիկլային միացություններ են ՝ փոքր մոլեկուլային քաշով, ինչը որոշում է դրանց կենսաբանական ազդեցության բազմազանությունը [9, 11,12]:   Պոլիամինի կենսասինթեզի մեխանիզմի վերաբերյալ կան անհասկանալի կողմեր:   Մասնավորապես, հստակեցված չէ այն հարցը, թե որ արգինազն է ներգրավված պոլիամինի կենսասինթեզում:   Բնության մեջ կա արգինազի երկու իզոտոպ:   Մեկը `ureothelial arginase- ն է, որը հայտնաբերվել է միզուկային օրգանիզմների լյարդում, օրնիտինի ցիկլի վերջին ֆերմենտն է, ամոնիակի չեզոքացման հիմնական մեխանիզմը, իսկ մյուսը` ոչ ureotelicarginase- ն է, որը կենսաբանորեն տարածված է գրեթե բոլոր օրգանիզմներում: , նյութափոխանակության մեջ [5, 8]:   Մասնավորապես, եզրակացություն է արվել, որ ոչ միզածորանային արգինազը, մի կողմից, ներառում է արգինինի ածխաջրածնային կառուցվածքը պրոլինի, պոլիամինի, գլուտամատի կենսասինթեզում ՝ ապահովելով վերջիններիս բիոսինթեզի գործընթացները արգինինի հիդրոլիզով. ինչպես նիգերի քարերի արգինինով հարուստ խմբակցություններում:   Սույն խնդիրն է պարզել արգինազի բնույթը, որը ներգրավված է պոլիամինի (միզածորանային կամ ոչ միզուկային) կենսասինթեզում [6, 7]:  Պետք է նշել, որ պոլամինների հետ կապված արգինազի բնույթի վերաբերյալ գրականությունը սակավ է, ունի թերություններ և շատ դեպքերում հակասական է:  Չնայած պոլամինի և արգինազայի փոխհարաբերությունների վերաբերյալ հրատարակվել են մի շարք գիտական ​​հոդվածներ, պոլիամինի կենսասինթեզի համար օրնիտին ապահովող իզոֆերմենտ արգինազը դեռ չի հայտնաբերվել [12, 17]:   Ենթադրում ենք, որ պոլիամինի կենսասինթեզի համար անհրաժեշտ օրնիտինը արտադրվում է ոչ միզուկային արգինազի գործողությամբ, մինչդեռ ուրեոտելի արգինազը օրնիտինը տրամադրում է urea սինթեզի համար:   L- արգինինից NO և ցիտրուլին ստեղծելու միջանկյալը NG-hydroxy-L-arginine է [10]: Ույց է տրվել, որ NG-hydroxy-L-arginine- ը արգելակում է բոլոր ոչ միզուկային իզոֆերմենտները, որոնք ընդհանրապես ազդեցություն չունեն ureoteric isoenzyme- ի վրա [1]:   Ուստի այն օգտագործվել է ոչ-ուրեոտինազային արգինազի գործունեության փոփոխությունների ֆոնի վրա պոլիամինի քանակի փոփոխությունները գնահատելու համար: Նյութեր և մեթոդներ   Կենդանիներ և ռեակտիվներ   Ուսումնասիրության օբյեկտը լաբորատոր սպիտակ արու առնետներն էին (200-220 գ):  Առնետներին պահում էին 23 ± 2 ° C ջերմաստիճանում 12 ժամ: ամենօրյա լուսավորության պայմաններում ՝ ստանդարտ դիետայով:   Կենդանիներին անզգայացրել են, ապա գլխատել: Գիտափորձում օգտագործվել են սերմնաբջիջների տետրահիդրոխլորիդ, պուտրեսցին դիհիդրոքլորիդ, սպերմիդին տրիհիդրոկլորիդ, 2,3-բուտան մոնոքսիմ և ցելյուլոզա (Sigma Aldrich Co. Ltd. (Taufkirchen, Գերմանիա)): Բարակ քրոմատագրման միջոցով պոլիամինի որոշում:  Փորձարկվող հյուսվածքը հոմոգենացվում է HC1O4- ի 5% սառը լուծույթում `100 մգ / մլ արագությամբ [6]:  1 օրից + 4 ° C ջերմաստիճանի արդյունահանումից հետո նմուշները ցենտրիֆուգում են 15,000 գ ջերմաստիճանում 20 րոպե + 4 ° C ջերմաստիճանում:   200 մկլ HC1O4 էքստրակտին ավելացվել է 400 μl թարմ պատրաստված դենսիլ քլորիդի լուծույթ (5 մգ 1 մլ ացետոնում) 200 HC1O4- ին համապատասխան 200 մկլ նատրիումի կարբոնատի լուծույթ:  Պոլիամինի իլ դենսիլ քլորիդի միջև ռեակցիան հանգչում է 100 μl պրոլինի լուծույթով (100 մգ / մլ) և ինկուբացվում 30 րոպե:   Densilpolyamines- ը արդյունահանվում է 0,5 մլ էթիլացետատով և խառնվում 30 վայրկյան:   Ստանդարտը պատրաստելու համար քայլերը կատարվում են նույն ձվով. Պատրաստվում է պոլիամինի խառնուրդ `յուրաքանչյուրից վերցնելով 20 նմ:   50 մկտ densilpoliamine- ն տեղումներ է կատարում քրոմատագրական թիթեղների նախաադսորբցիոն հատվածում (PTSH-AF-B, silica gel KSKG, RF):  Քրոմատագրությունն իրականացվել է քլորոֆորմ / տրիեթիլամին (25/2, V / V) շարժական փուլի միջոցով:  Քրոմատագրությունից հետո դեղին-շագանակագույն բծերը հանվում են ափսեներից և լուծվում 2 մլ էթիլացետատում:   Պոլիամինի քանակը որոշվում է սպեկտրաֆոտոմետրիկորեն 505 նմ ալիքի երկարության վրա (Genesys 10, Thermo Scientific, ԱՄՆ):   ՌԴ արժեքները որոշվում են հետևյալ բանաձևով. Կետային թռիչքի երկարություն / փուլային թռիչքի երկարություն: Արգինազի իզոենզիմների մեկուսացում և մաքրում:  Sephadex G-150- ով (Potte - Elvehjem Glass, Գերմանիա) լցված աշտարակին ավելացվել է առնետի լյարդ (0,5 × 50 սմ), որը ստացվել է 1500 գ ցրտի պայմաններում ցրտահարումից հետո (CLP): -1, ՌԴ) [2, 3]: Համասեռացումն իրականացվել է 0.2M գլիցինի բուֆերում (pH-9.5):   Աշտարակը հավասարակշռված էր ֆոսֆատային բուֆերի հետ (pH-7.2):  Հավաքվել էին 40 խմբակցություններ:  Առնետի լյարդի լյարդի իզոֆերմենտներ պարունակող խմբակցությունները, որոնք ստացվել են հելի ֆիլտրմամբ, տեղադրվել են CM- ով լցված բջջի վրա (1,5 × 35 սմ): Գրադիենտային արտազատումն իրականացվել է KCl- ի 0,05 Մ, 0,1 Մ, 0,15 Մ, 0,2 Մ և 0,25 Մ լուծույթներով:   Հավաքվել էին 32 խմբակցություններ:   Կոտորակները (4 մլ) հավաքելուց հետո յուրաքանչյուրում արգինազի ակտիվությունը որոշվեց Արչիբալդ մեթոդով, քանակը ՝ սպիտակուցների քանակական վերլուծություն 280 նմ ալիքի երկարության վրա (Genesys 10, Thermo Scientific, ԱՄՆ): Արգինազի գործունեության որոշման կոլորիմետրիկ մեթոդ:   Պատրաստվել է փորձանմուշի 10% համասեռանյութ, որը ցրտահարվել է 3000 պտ / րոպե 10 րոպե 0-4 ° C ջերմաստիճանում:   Մեկուսացված մնացորդը ծառայում է որպես ֆերմենտի աղբյուր:   Պատրաստվել են փորձարարական և թեստային տարբերակներ:  Փորձանոթին ավելացվել են 1,5 մլ գլիցինի բուֆեր, 0,5 մլ գերբնական նյութ, 0,2 մլ MnCl2 × 4H2O, 0,4 մլ L-արգին:  2.6 մլ փորձանմուշային տարբերակները ինկուբացվել են ուլտերմերմոստատում (Ռուսաստան, 1982 թ.) 37 ° C ջերմաստիճանում 60 րոպե, անընդհատ ցնցվելով:   Ֆերմենտի կատալիզացումը դադարեցվել է 1 մլ 20% ԵՆԿ-ի ավելացմամբ:  Կատալիզի վերջնական արտադրանքը որոշվեց մեկուսացված վերածնում Արչիբալդի մեթոդով (1949):   Փորձանոթներին ավելացվել են 2.5 մլ թթվային խառնուրդ, 1 մլ գերբնական նյութ, 0.2 մլ 3% DAMO եւ խաշել մթության մեջ 45 րոպե ջրային բաղնիքում:   Արդյունքում ստացված դեղին գույնի ինտենսիվությունը չափվեց սպեկտրաֆոտոմետրով (Genesys 10, Thermo Scientific, ԱՄՆ) 478 նմ ալիքի երկարությամբ:  Ֆերմենտի ակտիվությունը գնահատվել է սինթեզված urea- ի միկրոմոլներով 1 մլ ֆրակցիայի մեջ `1 րոպե կատալիզի ընթացքում:  0.2 μM NG-hydroxy-L-arginine- ին ավելացվել է ֆերմենտային ինկուբացիոն միջավայր [10]: Արդյունքների մշակում Statistica 10 (StatSoft) ծրագրով:  Արդյունքները ներկայացված են անդ ստանդարտ շեղման (M ± SD) միջին արժեքներով:   Արդյունքները վերլուծվել են Student t-test- ի միջոցով (մեկ նմուշ): Արդյունքներ և քննարկում:   Այս ուսումնասիրության նպատակն էր ուսումնասիրել լյարդում պոլիամինի քանակի փոփոխությունները `ուսումնասիրելու հետևանքից հետո` NG-hydroxy-L-arginine (NOHA) ոչ միզածորան արգինազի արգելակումը: Cefadex G-150- ով helfiltration- ից հետո լյարդի սպիտակուցային-արգինազային ակտիվության սպեկտրը ներկայացված է երկու գագաթներով `13 և 25 խմբակցություններում:   13-րդ կոտորակում պարունակվող իզոֆերմենտը ureothelial arginase- ն է, իսկ 25-րդ կոտորակում `ոչ ureotic իզոֆորմը (ոչ ureothelial arginase 1):  Նախորդ ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ առնետի լյարդի բարձր մոլեկուլային քաշը, երբ կոտորակվում է CM ցելյուլոզայի իոնափոխանակիչ քրոմատագրությամբ, բաժանված է երկու հստակ գագաթների: առաջինը `ցածր ֆերմենտային ակտիվությամբ, երկրորդը` բարձր [1, 6, 7] -ով:   Վերջինս erginase- ի միզասեռական իզոֆերմենտ է `մի շարք ֆիզիկաքիմիական հատկություններով (Km, Mn2 +, մոլեկուլային զանգված, ներբջջային տեղայնացում, հորմոնալ ինդուկցիա), իսկ առաջինը` ոչ ureoteric:   Ելնելով նշված փաստից ՝ hel- ֆիլտրումից հետո KM- ցելյուլոզայի միջոցով իրականացվել է լյարդի բարձր մոլեկուլային իզոզիմի կոտորակում:   Իոնափոխանակման քրոմատագրությունից հետո ստացվում են արգինազի երկու գագաթներ `համապատասխանաբար 8-րդ և 21-րդ կոտորակները:   8-րդ ֆրակցիան պարունակում է ոչ-ureothelial isoenzyme arginase (ոչ ureothelial arginase II), իսկ 21-րդը պարունակում է ureothelial isozyme: Լյարդի ոչ ureothelial arginase 1-ի ինկուբացիոն միջավայրը ավելանում է NOHA- ի 8.5% -ով `0.2 μg NOHA- ի առկայության դեպքում, ոչ ureothelial arginase 2-ի արգելքը` 27,48%, իսկ ureothelial arginase- ը `1,3% -ով: ով (նկ. 1):   Վերջինս ցույց է տալիս, որ ureothelial arginase- ը չի արգելակում NG-hydroxy-L-arginine- ը, կամ որ արգելակումն աննշան է, ինչը կարող է լինել ֆերմենտի մասնակի մաքրման արդյունք: Հետագայում ուսումնասիրությունները նպատակ ունեին դիտարկել պոլիամինի քանակի փոփոխությունը ոչ միզածորան արգինազի արգելակման ֆոնի վրա: Իոնի փոխանակման քրոմատագրման միջոցով հելիոնի ֆիլտրումից հետո ստացված ֆրակցիաներում պոլիամինի քանակը որոշվում է բարակ շերտ քրոմատագրությամբ (NCR) (նկ. 2, աղյուսակ 1): Գծապատկեր 1. Լյարդի ureothelial և ոչ ureothelial arginase- ի գործունեությունը նորմալ է և NOHA- ի ազդեցությունից հետո, p <0,05; n = 7. * - ոչ ուրոթելիալ արգինազի 1 ակտիվություն նորմայում, ** - ոչ ուրոթելիալ արգինազի 1 ակտիվություն NOHA- ի ազդեցությունից հետո, x - ոչ ուրոթելիալ արգինազի 2 ակտիվություն նորմայում, xx - ոչ միզուկային արգինազի 2 ակտիվություն տակ ապա NOHA- ի ազդեցությունը, + - լյարդի ureotellicarginase- ի գործունեությունը նորմալ է, ++ - լյարդի ureothelial arginase- ի գործունեությունը NOHA- ի ազդեցությունից հետո:   Վերջինս ենթադրում է, որ պոլիամինի սինթեզի առաջին ֆերմենտը ՝ օրնիթին դեկարբոքիլազը, զրկված է օրնիտինից, ինչը իր հերթին հանգեցնում է էվտրեսցինի, սերմնաբջիջների և սպերմիդինի քանակի նվազմանը: Արդյունքները հաստատում են, որ առնետի լյարդում պոլիամինի սինթեզի համար անհրաժեշտ էնդոգեն օրնիտինի աղբյուրը ոչ նեյրոհաղորդիչ արգինազի կողմից սինթեզված օրնիտինն է: Նախաձևից որոշակի շեղում է նկատվում լյարդի ոչ միզուկային արգինազ 2-ում, որի դեպքում արգելակումը չի նկատվում սերմնաբջջի պոլիամինի քանակի փոփոխություն:  Բացի այդ, նկատվում է, որ այլ պոլիամինի քանակը նվազում է ավելի փոքր չափով, քան լյարդի ոչ միզուկային արգինազ 1-ի դեպքում:  Այս բացառությունը ուսումնասիրվում է, սակայն, հաշվի առնելով լաբորատոր աշխատանքների արդյունքները, կարելի է ասել, որ լյարդի ոչ միզուկային արգինազի նախընտրած իզոֆերմենտը պոլիմամինների կենսասինթեզի համար օրնիտինի նախընտրելի աղբյուրն է:  Նախորդ հետազոտությունների արդյունքները թույլ են տալիս նման եզրակացություն անել [5, 6]:   Պոլիամինի ազդեցության տակ լյարդի ոչ միզածորան արգինազի առաջին իզոֆերումը արգելակվում է խառը արգելակման մեխանիզմով, իսկ ոչ միզածորան արգինազի երկրորդ իզոֆերումը արգելվում է ոչ մրցակցային արգելակման մեխանիզմով:   Խառը արգելակման ժամանակ պոլիամիները կապվում են ինչպես ոչ միզուկային արգինազի, այնպես էլ ոչ միզուկային արգինազ-արգինինային համալիրի հետ, իսկ ոչ մրցակցային արգելակման ժամանակ պոլիամինները կապվում են միայն ֆերմենտ-սուբստրատային բարդույթին:  Այս փաստը որոշակի առավելություն է տալիս լյարդի ոչ ureothelial arginase- ի 1-ին իզոֆերմենտին, որը կարող է հանգեցնել նման արդյունքի: AB Նկար 2. Սովորաբար նորմալ է լյարդում Densyl polyamines- ի համար և NOHA- ի ազդեցությունից հետո: N 25 կոտորակում (A, Sephadex G-150- ի կողմից հելֆիլտրացիայից հետո) և N8 կոտորակում (CM- ցելյուլոզայի հետ իոնային փոխանակման քրոմատագրությունից հետո) (p <0,05, n = 5): SPM - սերմնահեղուկ, SPD - սպերմիդին, PUT - putrescine, LNUA - ոչ լյարդի ureothelicarginase, NOHA - NG-hydroxy-L-arginine, ՌԴ արժեքները նորմայի և NOHA- ի համար: Ամփոփելով, լյարդում ոչ միզաքարային արգինազի իզոֆերմենտների զսպման դեպքում պոլիամինի քանակը նվազում է:   Արդյունքների հիման վրա կարելի է եզրակացնել, որ կաթնասունների բջիջներում պոլիամինի սինթեզի համար անհրաժեշտ էնդոգեն օրնիթինի աղբյուրը ոչ միզածորանային արգինազի կողմից սինթեզված օրնիտինն է: Աղյուսակ 1. Հելիումի զտման իոնափոխանակիչ քրոմատագրումից հետո լյարդում պոլիամինի քանակը նորմալ է ազդում ոչ-ureothelial arginase- ի իզոֆերմենտային գործունեության վրա NOHA- ի ազդեցությունից հետո (p <0,05, n = 5):  Պոլիամինի քանակը ներկայացված է nM- ի 50 μl պոլիեսթեր լուծույթում: PA. Պոլիամիններ, SPM - սերմնահեղուկներ, SPD - սպերմիդիններ, PUT - պուտրեսցին, LOWA - լյարդի ոչ ֆիբրինային արգինազ, NOHA - NG-hydroxy-L-arginine: PALUA 1 նորմLOWA 1+ NOHA LOUA 2 նորմալ NormalLOWA 2+ NOHA PUTSDPDSPM Հիմնական արժեքից բացի, աշխատանքը կարող է նաև ունենալ գործնական նշանակություն:   Ոչ ureothelial arginase- ի գործունեության փոփոխությունը պաթոլոգիական պայմաններում (քաղցկեղ, նեյրոդեգեներատիվ, աուտոիմունային-վիրուսային հիվանդություններ) կարող է փոխել պոլիամինի քանակը `այդպիսով ազդելով հիվանդության ընթացքի վրա:   Մասնավորապես, ornithine decarboxylase- ի ակտիվության աճը կամ քաղցկեղի պոլիամինի քանակի ավելացում է, որտեղ պոլիամինը գործում է որպես աճի գործոն [11, 12, 14], կարող է կանխվել ոչ ureothelial arginase- ի արգելակմամբ:  Միևնույն ժամանակ, կենտրոնական նյարդային համակարգի նեյրոդեգեներատիվ հիվանդություններում պոլիամինի քանակի իջեցում (պահպանել պոտենցիալ տարբերությունը, մասնակցել նեյրոհաղորդիչների կենսասինթեզի վերականգնման նեյրոնների վերականգնմանը [16, 17]) կարող է կանխվել ոչ հորմոնի միջոցով ureothelial arginase հորմոն: Գրականություն Archibald R., urea- ի գունաչափական որոշումը / J. Biol. Քիմ., 1945, 167:  507. Բունիաթյան Հ., Դավթյան Մ., Ուղեղի ուրեների սինթեզ: J. Neurochem., 1966, 13:  743-753.բիոսինթեզ, NG-հիդրօքսի-Լ-արգինին:   ազդեցությունները կարգավորման ազոտի օքսիդի biosynBiochem 269.  4317-25, 2002.14: Moinard C., Cynober L., de Brandt J., (2005) Polyamines.  նյութափոխանակություն և անմարդկային հիվանդություններ: Կլին Nutr 24: 184-197.15թթ. Մորիս Ս., Արգինինի նյութափոխանակության վերջին նվաճումները:  Արգինազների դերերն ու կարգավորումը .16. Pegg A., McCann P., Պոլիամինի նյութափոխանակությունը և գործառույթը: Am J Physiol 1982, 243: C212J 376 (Pt 1): 1-14. Մարիամ Սարգսյան, Նիկոլայ Ավթանդիլյան, Սուսաննա Կարապետյան ՊՈԼԻԱՄԻՆՆԵՐԻ ՓՈՓՈԽՈՒԹՅԱՆ ՈՒՍՈՒՄՆԱՍԻՐՈՒԹՅՈՒՆ ԼՅԱՐԴԻԱՐԳԻՆԱEԱՅԻՆ ԻՍՖԵՐՄԵՆՏՆԵՐԻ EMԱՄԿԵՏՈՒԹՅԱՆ IMEԱՄԱՆԱԿԸ. ։

Աշխատանքի  նպատակն  է  NG-հիդրօքսի-L-արգինինի  միջոցով  ոչ  ուրեոթելիկ  արգինազի  արգելակումից  հետո  կատարել  պոլիամինների  քանակության  փոփոխության  գնահատում։
   Առաջին  անգամ  առնետի  լյարդում  պարզաբանվել  է  պոլիամինների  քանակության  փոփոխությունը ոչ ուրեոթելիկ արգինազի արգելակումից հետո։
  Բացահայտվել է, որ ոչ ուրեոթելիկ արգինազի  արգելակմանը  զուգընթաց  բջջում  պակասում  է  նաև  պոլիամինների  քանակությունը։
   Տվյալ  աշխատանքը  ցույց  է  տալիս,  որ  ոչ  ուրեոթելիկ  արգինազի  նորագույն  ֆունկցիան  է  պոլիամինների կենսասինթեզի կարգավորմանը մասնակցելը։
