ՀԵՏԱ HՈՏՈՒԹՅՈՒՆ ՈՉ Սպիտակ ՀԵՏԵՐՈԻԿԼԻԿԱԿԱՆ ԱՄԻՆԻԿՆԵՐԻ ԵՎ ՊԵՏՏԻԴՆԵՐԻ ԿՊՏԵՏԻՆԱEԻ K ՏԵԽՆՈԼՈԳԻԱՅԻ ԷՖԵԿՏԻ ՎՐԱ   Որպես դեղաբանական թիրախներ մեծ հետաքրքրություն են առաջացնում պրոտեոլիտիկ ֆերմենտները:   Պրոտեոլիտիկ ամենակարևոր ֆերմենտներից են `տրիպսինը, քիմոտրիպսինը և պրոտեինազը K: Բոլոր երեքը դասակարգվում են որպես սերինային պրոտեազներ:   Սպիտակուցները ուսումնասիրվել են դեռ 18-րդ դարում, և հայտնի էր, որ դրանք կարող են կոտրել սպիտակուցները:   Սերինային պրոտեազները հիմնարար դեր են խաղում մարդու ֆիզիոլոգիական գործընթացներում:   Մյուս կողմից, դրանք կարող են առաջացնել մի շարք պաթոլոգիական պայմաններ, ուստի կարևոր է գտնել հիվանդության հետ կապված հատուկ պրոտեազի ինհիբիտորներ:  Գենետիկական և կենսաքիմիական ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ պրոտեազները օգտագործվում են շրջապատողների կողմից ՝ իրենց կառուցվածքային և ֆունկցիոնալ սպիտակուցները հասունացնելու համար:  Այսպիսով, կենդանի բջիջում վիրուսը սինթեզում է մի շարք սպիտակուցներ, ֆերմենտներ, ներառյալ պրոտեազները, որոնք յուրովի են հիդրոլիզացնում վիրուսի կողմից սինթեզված պեպտիդները, արդյունքում ստացված սպիտակուցները մասնակցում են վիրուսի գենետիկ նյութի փաթեթավորմանը ՝ կազմելով նոր վիրուսի մասնիկներ որոնք վարակում են առողջ նոր բջիջները:  Գենետիկական ինժեներիայի ժամանակակից առաջընթացը թույլ է տվել գիտնականներին օգտագործել այս ֆերմենտները որպես «մոլեկուլային գործիքներ»: Բնական ոչ սպիտակուցային ամինաթթուներ և պեպտիդներ:   Կենդանի բջիջներում ոչ սպիտակուցային ամինաթթուները և՛ ազատ են, և՛ կազմված են սպիտակուցային պեպտիդներից:  Այս միացությունները դեր են խաղում մարմնի գործընթացները կարգավորելու և բջիջների բնականոն կյանքը ապահովելու գործում: Կենսաբանորեն ակտիվ միացությունների շարքում առանձնահատուկ տեղ ունեն ոչ սպիտակուցային ամինաթթուները և դրանց պեպտիդները, որոնք վերջերս հաջողությամբ օգտագործվել են բժշկության, դեղագործության, մանրէաբանության, գիտության և այլ բնագավառներում [2]:   Ոչ սպիտակուցային α-ամինաթթուները ֆիզիոլոգիապես ակտիվ իտանի են, որոնք հարմար են դեղերի մեջ ներառելու համար (միայն օպտիկապես ակտիվ իզոմերների տեսքով):   Ոչ սպիտակուցային ամինաթթուներից ավելի շատ հետաքրքրություն են ներկայացնում տարբեր արմատական ​​կառուցվածքի հետերոցիկլիկ փոխարինիչներ պարունակող α- ամինաթթուներ, որոնք մարմնի համար օտար են ինչպես կառուցվածքով, այնպես էլ հետերատոմների բնույթով: Ոչ սպիտակուցային α-ամինաթթուները ներառված են ժամանակակից հակաուռուցքային, հիպերտոնիկ, ցավազրկող, ինչպես նաև այլ դեղամիջոցներում, որոնք օգնում են վերացնել ալկոհոլ-թմրամիջոցների կախվածությունը և այլ դեղամիջոցներ: Սերինային պրոտեազների և պրոտեազի ինհիբիտորներ:   Բոլոր պրոտեազները կատալիզացնում են միևնույն ռեակցիան ՝ պեպտիդային կապի հիդրոլիզը, բայց դրանք ցուցաբերում են ընտրողականություն ՝ կախված սուբստրատից, հիդրոլիզացված կապի մեջ առկա ամինաթթվի տեսակից:  Կախված կատալիտիկ խմբում ընդգրկված ամինաթթուներից ՝ տարբեր պրոտեազներ են հայտնաբերվել, որոնցից յուրաքանչյուրը կարող է ներառվել հետևյալ չորս հիմնական ֆունկցիոնալ դասերից մեկում ՝ սերին, ասպարագին և ցիստեին մետալոպրոտեազներ [3]:   Սերինային պրոտեազները ներգրավված են մարմնի բազմաթիվ գործառույթներում, ներառյալ մակարդումը, իմունային պատասխանը, բորբոքային պրոցեսները, հանդես գալով որպես էվկարիոտների և պրոկարիոտների մարսողական ֆերմենտներ:  Մյուս կողմից, սերինային պրոտեազները մասնակցում են մարդու բազմաթիվ պաթոգեն գործընթացների զարգացմանը: Խնդրի դիրքը և հետազոտական ​​օբյեկտների ընտրությունը:   Աշխատանքի նպատակն էր որոշել (S) -β- [4- (ֆուրան-2-մեթիլ) -3-բուտիլ-5-թիոքսո-1,2,4-տրիազոլ-1-իլ] α-ալանինի ոչ- սպիտակուցային α-ամինաթթու և նոր Սինթեզված N-formyl-methionylalanyl- (S) -alane α- [4 - (ֆուրան-2-իլ-մեթիլ) -3-բութիլ-5-թիոքսո-1,2,4-տրիազոլ- 1-իլ] α Պեպտիդի հակաբիոտիկ հատկություններ և դրա ազդեցությունը պրոտեինազ K- ի գործունեության վրա, որպես սերինային պրոտեազների ներկայացուցիչ: Հետազոտական ​​նյութեր և մեթոդներ   Օգտագործվել են հետևյալ նյութերը. Tritirachium ալբոմի պրոտեինազ K (Sigma), HEPES (Sigma), 2% SDS, ցուլ շիճուկային ալբոմ (Sigma), ոչ սպիտակուցային α- ամինաթթուներ (S) -β [4- (ֆուրան -2) -իլ-մեթիլ) -3-բուտիլ-5-թիոքսո-1,2,4-տրիազոլ-1-իլ] -α-ալանինի պարունակող պեպտիդ (N-formyl-metionion-alanyl- (S) -β- [4 - - (ֆուրան-2-իլ-մեթիլ) -3-բուտիլ-5-թիոքսո-1,2,4-տրիազոլ-1-իլ] -α-ալանին (սինթեզվում է «« Հայբիոտեխնոլոգիա »գիտական ​​արտադրության լաբորատորիայի կողմից ՝ ԵՊՀ-ի կողմից) կենտրոնի ոչ սպիտակուցային ամինաթթուների սինթեզի լաբորատորիայի հետազոտողներ): Պրոտեինազ K ակտիվության որոշում:  Proteinase K- ի ակտիվությունը չափվեց ազատ ամինո խմբերի քանակով `օրթոֆթալդեհիդային մեթոդով [6]:  30 մլ ծավալով ՕՖԱ-ի ռեակտիվը պարունակում էր. 100 մմոլ / լ բորաթթվային բուֆեր pH 9,7,5 մգ / մլ օրթոֆտոլալդեհիդ և 2,5 մկմ մերկապտոէթանոլ:   T.album- ից արտանետված սպիտակուցային K- ն լուծարվել է թորած ջրի մեջ `10-20 մգ / մլ կոնցենտրացիայի մեջ:  200 մկլ ռեակցիոն միջավայր `հետևյալ բաղադրությամբ, օգտագործելու համար օգտագործվել է սպիտակուցազ K ակտիվությունը չափելու համար. 1 մ ֆոսֆատային բուֆեր pH 7,2 - 20 մկլ, 2% SDS - 20 մկկ, մերկապտոէթանոլ 100 մմոլ / լ - 40 մկլ, ֆերմենտ ՝ 20 մկլ, ցուլ շիճուկ albumin (20 մգ / մլ) - 100 μl: Արձագանքի միջավայրը պահվում էր 30 րոպե 37 ° C ջերմաստիճանում (UTU 4-ՈՒՆԻՎԵՐՍԱԼ ՈՒԼՏՐԱԹԵՐՄՈՍՏԱՏ. Առավելագույնը 200 ° C), այնուհետև յուրաքանչյուր ռեակցիայի խառնուրդից վերցվում էր 50 μl լուծույթ, որին ավելացվում էր 10 μl քացախաթթու: և ալիքի երկարության արձագանքի մեկնարկից 30 րոպե անց: Դրանից հետո յուրաքանչյուր կիվետայի մեջ լցվեցին հետևյալ լուծումները: H2O - 1.5 մլ, ռեակցիայի միջավայրը `50 μl, OFA ռեակտիվը` 1.5 մլ:  3-5 րոպե անց գրանցվեց A340- ը: Հետևյալ բանաձևը օգտագործվել է սպիտակուցազ K ակտիվությունը չափելու համար. A = ∆A340 * V ռեակցիայի միջավայր / ε * (ֆերմենտային ռեակցիայի միջավայրում) * ∆ տ: ε - ոչնչացման գործակիցն է, որը հաշվարկվում է ստանդարտ լուծույթի (0,033 մմոլ / լ մետիոնին) համեմատությամբ A340- ի հետ:   Դրանից հետո տվյալները վերահաշվարկվեցին 1 մմոլ / լ մեթիոնինի լուծույթի համար: H2O - 1,5 մլ, մեթիոնին `10 մլ, ռեակտիվ` 1,5 մլ: Ոչ սպիտակուցային ամինաթթուների ազդեցությունը հակաբիոտիկների նկատմամբ մանրէների դիմադրության վրա ուսումնասիրելու համար ընտրվել են գրամ-բացասական և գրամ-դրական բակտերիաներ, ներառյալ դրանց վերամիացվող շտամները, որոնք տարբեր հակաբիոտիկների դիմացկուն պլազմիդներ են կրում:  Օգտագործված շտամները ներկայացված են աղով: 1. Աղյուսակ 1 շտամներԲնապահպանությունMPAMPAMPAMPAME միջավայրեր:   Measpeptone agar- ը (MPA) օգտագործվել է աղյուսակում նշված բերքը աճեցնելու համար:  1 լիտր ջրի մեջ ավելացվել է 20 գ ագար, ախտահանվել գոլորշու ավտոկլավում 1 մ-ի համար: ճնշում 20 րոպեի տակ: Վնասազերծված պայմանների պահպանում:   Օգտագործված Petri ամաններն ու փորձանոթները նախապես ախտահանվում էին 120-180 րոպե 180-220, C ջերմաստիճանում չորացման պահարանում:   Մանրէաբանական ասեղը, նշտարը, ապակե ծածկույթը ախտահանվել են ալկոհոլի բոցի վրա ՝ այն օգտագործելուց առաջ, ալկոհոլով մշակելուց հետո:   Ընդհանուր առմամբ, փորձի բոլոր փուլերն իրականացվել են ախտահանված միջավայրում ՝ ալկոհոլային կրակով, վարակից խուսափելու համար: Բուն փորձը կատարելուց առաջ անհրաժեշտ է նախ ձեռք բերել E.coli- ի ռեկոմբինատիվ շտամներ:  Վերջիններս ստացվում են վերափոխման մեթոդով, որով հակաբիոտիկակայուն գենով պլազմիդ ԴՆԹ-ն վերափոխվում է իրավասու բջիջների: Վերացման տեխնիկա:   Որպեսզի շտամները անընդհատ թարմ լինեն (ակտիվությունը պահպանելու համար), անհրաժեշտ է դրանք վերացնել:   Հեռացումն իրականացվում է համապատասխան պլազմիդային շտամի և համապատասխան ռեկոմբինանտ շտամի առկայության դեպքում `MPA- ով հարուստ միջավայրում (միսպեպտոնային ագար):   Օգտագործելուց առաջ միջավայրը հալեցնում են և թողնում որոշ չափով սառչի:  Ստուգվեց pH- ը, որը պետք է լինի 7:  Անհրաժեշտության դեպքում, եթե pH շեղում կար, ավելացվեց NH4OH լուծույթ կամ HCl լուծույթ ՝ pH- ը պահանջվող մակարդակին հասցնելու համար: Փորձից հետո բերքը տեսակավորվեց ըստ իրենց աճի ջերմաստիճանի ջերմաստիճանում (ապրանքանիշը ՝ TC-80 M-2, ջերմաստիճանը ՝ 37 ˚C): Սերմանման տեխնիկա:   Sանքը կատարվել է միաշերտ ագարի մեթոդով, յուրաքանչյուր մշակույթից վերցվել է մանրէաբանական ասեղ (ստերիլ): Գիշերային խողովակներում (ստերիլ) պատրաստվել է 2 մլ MP արգանակ, որը պահվել է 1 օր ցնցումներում 37 ˚C ջերմաստիճանում:  Դրանից հետո սիզամարգը ցանվեց (ապակե սպաթուլայով), որը պատրաստվել էր 0.2 մլ գիշերային կուլտուրա լցնելով լրատվամիջոցների վրա, Petri- ի կերակրատեսակներին ավելացվեցին հակաբիոտիկներ: Ոչ սպիտակուցային ամինաթթու պեպտիդի տեղադրում ագարի վրա:   Այդ դեպքում օգտագործվել են ոչ սպիտակուցային ամինաթթվի բյուրեղներ (որոնք ցրման ժամանակ ապահովում են կոնցենտրացիայի գրադիենը), որոնք թափվել են (ստերիլ) համապատասխան մշակույթների մարգագետինների վրա: Մյուս դեպքում օգտագործվել են ոչ սպիտակուցային ամինաթթուների լուծույթներ 5 մկմ-ով 50 μl կոնցենտրացիայում, որոնք նետվել են համապատասխան մշակութային գազերի վրա:  Լուծույթները 30 րոպե ախտահանվել են ջրային բաղնիքում: Արդյունքները և դրանց քննարկումը:   Ուսումնասիրված նյութերի ազդեցությունը պրոտեինազ K- ի վրա ուսումնասիրվել է վերը նշված երկու մեթոդներով [4]:  Պրոտեինազ K ակտիվության որոշում ըստ առաջին մեթոդի ՝ ազատ ամինո խմբի կողմից Ստացվել են հետևյալ տվյալները. Աղյուսակ 2. Ոչ սպիտակուցային α- ամինաթթուների ազդեցությունը պրոտեինազ K ակտիվության վրա Բարդ հսկողություն (S) -β- [4- (ֆուրան-) 2-իլ-մեթիլ) - 3-Բութիլ-5-թիոքսո-1,2,4-տրիազոլ 1-իլ] -α-ալանինի Պրոտեինազ K,% Աղյուսակը ցույց է տալիս, որ ոչ սպիտակուցային α-ամինաթթու (S) -β- [4- (ֆուրան-2-իլ-մեթիլ)) -3-բուտիլ-5-թիոքսո-1,2,4-տրիազոլ-1-իլ] -α-ալանինը խանգարեց ֆերմենտի ակտիվությունը 66,2% -ով: Երկրորդ փուլում N-formyl-mehionyl-alanyl- (S) -β [4 - (furan-2-yl-methyl) -3-butyl-5-thioxo-1,2,4-triazole-1- The α-ալանինի ազդեցության ուսումնասիրություն հակաբիոտիկների նկատմամբ բակտերիաների դիմադրության վրա, այսինքն `հակաբիոտիկ պարունակող միջավայրում փորձարկվող նյութը որևէ ազդեցություն ունեցել է բերքի աճի վրա, թե ոչ:   Փորձարկվել է ՝ իրենց բյուրեղները տեղադրելով E.coli ռեկոմբինատիվ շտամների մարգագետնում ցանված MPA միջավայրում:  Արդյունքները ներկայացված են աղով: 2-ում: N-Formyl-metionion-alanyl- (S) -β- [4 - (ֆուրան-2-իլ-մեթիլ) -3-բութիլ-5-թիոքսո-1,2,4 տրիազոլ-1-իլ] -α-ալանին Ազդեցությունը մանրէների աճի վրա Աղյուսակ 3.Bacillus sp. (ջերմաֆիլ) N- ֆորմիլ-մեթիոնիլ-ալանիլ- (S) -β- [4- (ֆուրան-2-իլ-մեթիլ) -3-բուտիլ-5-թիոքսո-1,2,4-տրիազոլ-1-իլ միացություններ ] -α Փորձարարական աշխատանքի նպատակն էր գտնել ոչ սպիտակուցային ամինաթթուներ, որոնք կարող են օգտագործվել դեղամիջոցների արտադրության մեջ, որպես մանրէների պոտենցիալ հակամանրէային դիմադրություն, և արդյունքում դրանք ստացվեցին: Գրականություն 1. Սաղյան Ա., Ամինաթթուների, պեպտիդների և սպիտակուցների քիմիա, Երեւան, 2010, էջ 4, 11: 5. Rinderknecht H., Pancreatic secretory enzyms, «Ենթաստամոքսային գեղձ.  Կենսաբանություն, պաթոբիոլոգիա և Հերմինե Ավետիսյան ՀԵՏԱՈՏՈՒԹՅՈՒՆՆԵՐ ՈՉ Սպիտակ ՀԵՏերոցիկլիկ Ամինաթթուների և նրանց Պեպտիդների ազդեցության վրա, որոնք ունեն սպիտակուցներ ։

Ուսումնասիրվել  է  ոչ  սպիտակուցային  ամինաթթու  (S)-β-[4-(ֆուրան-2-մեթիլ)-3-բութիլ-5թիօքսո-1,2,4-տրիազոլ-1-իլ]-α-ալանինի և նոր սինթեզված N-ֆորմիլ-մեթիոնիլ-ալանիլ-(S)-β-[4-(ֆուրան-2-իլ-մեթիլ)-3-բութիլ-5-թիօքսո-1,2,4-տրիազոլ-1-իլ]-α-ալանին  պեպտիդի  հակամանրէային հատկությունը ու ազդեցությունը պրոտեինազ K-ի ակտիվության վրա՝ որպես սերինային  պրոտեազների  ներկայացուցիչ։
   Ցույց  է  տրված,  որ  (S)-β-[4-(ֆուրան-2-մեթիլ)-3-բութիլ-5-թիօքսո-1,2,4-տրիազոլ-1-իլ]-α-ալանինն  արգելակում  է  ֆերմենտի  ակտիվությունը  66,2  %-ով։
   Իսկ   դիպեպտիդ  N-ֆորմիլ-մեթիոնիլ-ալանիլ-(S)-β-[4--(ֆուրան-2-իլ-մեթիլ)-3-բութիլ-5-թիօքսո-1,2,4տրիազոլ-1-իլ]-α-ալանինը  ազդեցություն  է  ցուցաբերել  որոշ  կուլտուրաների  աճի  վրա  (C.  freundii 62 և Bacillus sp. (թերմոֆիլ))։
