Se presenta un caso de lesión mucosa en un paciente masculino de 48 años de edad, casado,de profesión ingeniero forestal, venezolano, con residencia en la ciudad de Mérida al occidente de Venezuela. Por su ocupación refiere frecuentes visitas a bosques de localidades del piedemonte andino de los estados Mérida, Trujillo, Táchira y Barinas, además de localidades llaneras del estado Apure y otras del estado Bolívar, al sur de Venezuela, incluyendo la Gran Sabana, Imataca y el Dorado. El paciente afirma haber pernoctado largos períodos en localidades donde la leishmaniasis es considerada endémica y manifiesta reconocer los insectos incriminados como transmisores de Leishmania. Asimismo, refiere no haber presentado lesiones cutáneas primarias atribuidas a esta parasitosis. El historial clínico del paciente se remonta a 1996, manifestando haber sufrido molestias con sangrado por fosas nasales y formación de costras en el tabique nasal. Al año siguiente mediante examen realizado por un médico otorrinolaringólogo le fue detectada lesión en el tabique nasal. Referido a un dermatólogo le fue aplicada prueba de intradermorreacción (IDR) con aplicación de leishmanina para despistaje de leishmaniasis, arrojando resultado negativo. Posteriormente le fue aplicado un curetaje quirúrgico para eliminar una costra del tabique nasal, descubriéndose perforación de 1cm aproximadamente. El análisis de la biopsia tomada de la lesión reportó tejido necrosado e inflamación crónica. El cultivo realizado de la muestra evidenció abundancia de Staphylococcus aureus. Durante el período 1998–2008, el paciente manifiesta haber sufrido constantes recaídas del cuadro clínico con frecuente reactivación de los bordes de la perforación, formación de costras y sangrado nasal. Durante 2011, fue detectada necrosis y es nuevamente intervenido para eliminar costra, evidenciándose incremento de la perforación.

La biopsia indica nuevamente inflamación crónica y el cultivo arroja S. aureus. Despistajes para tuberculosis y citomegalovirus indicados por el parte médico arrojan resultados negativos. Posteriormente se indica toma de nueva biopsia para despistaje de leishmaniasis, sugiriendo resultados no conclusivos o negativos. Seguidamente en ambiente hospitalario se indica aplicación de leishmanina revelando resultados poco conclusivos o negativos. La repetición de prueba de IDR arroja resultado negativo. En enero 2012 llega a nuestro laboratorio portando láminas producto de extendidos realizados en la sección de otorrino del Hospital Universitario de los Andes luego de una toma demuestra de la lesión activa en la región del tabique nasal. Las láminas conteniendo material del área afectada fueron procesadas por diferentes metodologías. Asimismo, al paciente le fue extraída por punción venosa periférica una muestra de sangre para realizar ensayos de PCR y estudios serológicos por diferentes métodos.

Consideraciones éticas Previo al muestreo el paciente fue informado de todo el procesamiento de la muestra, firmando el consentimiento previa información (CPI) y autorizando su ejecución.

RESULTADOS

Examen parasitológico

Formas amastigotes de Leishmania sp. fueron detectadas en extendidos de láminas portaobjetos, coloreadas con Giemsa al 10% en buffer fosfato pH 7,2, conteniendo material tomado de la lesión del tabique nasal. En general, el número de parásitos observados fue escaso, pudiéndose en ocasiones, detectar hasta 2 amastigotes por campo microscópico de 1000X. La observación fue realizada en microscopio Axioskop-Zeiss-Germany acoplado a cámara digital Noticam 480 en interfase con Laptop HP, haciéndose el registro de cada campo microscópico positivo. La morfología de amastigotes detectados.

Identificación de la especie de Leishmania por ensayos de PCR

Con la finalidad de identificar la especie a la que pertenecen los amastigotes de Leishmania detectados en el examen parasitológico antes descrito, fue realizado un aislamiento de ADN a partir del material obtenido de la lesión del tabique nasal. La muestra examinada llegó al laboratorio extendido en láminas portaobjetos. La extracción de ADN fue realizado utilizando el método clásico fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1). El ADN obtenido fue procesado por ensayos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando la metodología multiplex previamente desarrollada para especies de Leishmania neotropicales. El ensayo de PCR multiplex arrojó resultados positivos a Leishmania braziliensis demostrado por la amplificación de una fuerte banda de 148 pb de la muestra de la lesión del tabique nasalcomo se describió anteriormente. Asimismo, señales similares, aunque de banda más tenue fue detectada en muestra de sangre periférica del paciente, procesada con el mismo ensayo de PCR multiplex. Resultados del ensayo de PCR en material del tabique nasal y de sangre periférica del paciente.



Examen serológico

Una alícuota de suero del paciente fue tomada para realizar exámenes serológicos convencionales que detectan anticuerpos (Ac) anti-Leishmania, utilizando antígeno de L. braziliensis. Los mismos incluyeron un test de aglutinación directa (TAD) y una prueba de Inmunofluorescencia indirecta (IFI) siguiendo procedimientos previamente estandarizados y adaptados en nuestro laboratorio para tal fin. Todas las pruebas realizadas resultaron negativas.

Aplicación de prueba diagnóstica alternativa para corroborar infección por Leishmania braziliensis

Para llevar a cabo la confirmación de L. braziliensis como agente causal de la lesión del caso registrado, fue aplicada una prueba serológica alternativa en formato Western Blot, utilizando como antígeno proteínas ancladas por GPI (Glycosil-Phosphatydil-Inositol) a la membrana de promastigotes de L. braziliensis. Estas proteínas han sido exitosamente ensayadas en nuestro laboratorio como marcadores bioquímicos específicos para identificar y diferenciar leishmaniasis causada por L. (V.) braziliensis, siguiendo metodología previamente descrita. La aplicación del test reveló una banda de aproximadamente 50kDa específica para L. braziliensis, la cual no es detectada en sueros de individuos infectados por L. (L.) mexicana o L. (L.) amazonensis, confirmando la identidad revelada con el ensayo de PCR. Asimismo, esta reacción permite aseverar que la lesión que presenta el caso estudiado es parasitológica e inmunológicamente activa, ya que en casos tratados o curados la reacción es negativa.
Se presenta un caso de lesión mucosa en un paciente masculino de 48 años de edad , casado , de profesión ingeniero forestal , venezolano , con residencia en la ciudad de Mérida al occidente de Venezuela . Por su ocupación refiere frecuentes visitas a bosques de localidades del piedemonte andino de los estados Mérida , Trujillo , Táchira y Barinas , además de localidades llaneras del estado Apure y otras del estado Bolívar , al sur de Venezuela , incluyendo la Gran Sabana , Imataca y el Dorado . El paciente afirma haber pernoctado largos períodos en localidades donde la leishmaniasis es considerada endémica y manifiesta reconocer los insectos incriminados como transmisores de Leishmania . Asimismo , refiere no haber presentado lesiones cutáneas primarias atribuidas a esta parasitosis . El historial clínico del paciente se remonta a 1996 , manifestando haber sufrido molestias con sangrado por fosas nasales y formación de costras en el tabique nasal . Al año siguiente mediante examen realizado por un médico otorrinolaringólogo le fue detectada lesión en el tabique nasal . Referido a un dermatólogo le fue aplicada prueba de intradermorreacción ( IDR ) con aplicación de leishmanina para despistaje de leishmaniasis , arrojando resultado negativo . Posteriormente le fue aplicado un curetaje quirúrgico para eliminar una costra del tabique nasal , descubriéndose perforación de 1 cm aproximadamente . El análisis de la biopsia tomada de la lesión reportó tejido necrosado e inflamación crónica . El cultivo realizado de la muestra evidenció abundancia de Staphylococcus aureus . Durante el período 1998–2008 , el paciente manifiesta haber sufrido constantes recaídas del cuadro clínico con frecuente reactivación de los bordes de la perforación , formación de costras y sangrado nasal . Durante 2011 , fue detectada necrosis y es nuevamente intervenido para eliminar costra , evidenciándose incremento de la perforación . La biopsia indica nuevamente inflamación crónica y el cultivo arroja S. aureus . Despistajes para tuberculosis y citomegalovirus indicados por el parte médico arrojan resultados negativos . Posteriormente se indica toma de nueva biopsia para despistaje de leishmaniasis , sugiriendo resultados no conclusivos o negativos . Seguidamente en ambiente hospitalario se indica aplicación de leishmanina revelando resultados poco conclusivos o negativos . La repetición de prueba de IDR arroja resultado negativo . En enero 2012 llega a nuestro laboratorio portando láminas producto de extendidos realizados en la sección de otorrino del Hospital Universitario de los Andes luego de una toma demuestra de la lesión activa en la región del tabique nasal . Las láminas conteniendo material del área afectada fueron procesadas por diferentes metodologías . Asimismo , al paciente le fue extraída por punción venosa periférica una muestra de sangre para realizar ensayos de PCR y estudios serológicos por diferentes métodos . Consideraciones éticas Previo al muestreo el paciente fue informado de todo el procesamiento de la muestra , firmando el consentimiento previa información ( CPI ) y autorizando su ejecución . RESULTADOS Examen parasitológico Formas amastigotes de Leishmania sp . fueron detectadas en extendidos de láminas portaobjetos , coloreadas con Giemsa al 10% en buffer fosfato pH 7,2 , conteniendo material tomado de la lesión del tabique nasal . En general , el número de parásitos observados fue escaso , pudiéndose en ocasiones , detectar hasta 2 amastigotes por campo microscópico de 1000X. La observación fue realizada en microscopio Axioskop-Zeiss-Germany acoplado a cámara digital Noticam 480 en interfase con Laptop HP , haciéndose el registro de cada campo microscópico positivo . La morfología de amastigotes detectados . Identificación de la especie de Leishmania por ensayos de PCR Con la finalidad de identificar la especie a la que pertenecen los amastigotes de Leishmania detectados en el examen parasitológico antes descrito , fue realizado un aislamiento de ADN a partir del material obtenido de la lesión del tabique nasal . La muestra examinada llegó al laboratorio extendido en láminas portaobjetos . La extracción de ADN fue realizado utilizando el método clásico fenol : cloroformo : alcohol isoamílico ( 25:24:1 ) . El ADN obtenido fue procesado por ensayos de reacción en cadena de la polimerasa ( PCR ) utilizando la metodología multiplex previamente desarrollada para especies de Leishmania neotropicales . El ensayo de PCR multiplex arrojó resultados positivos a Leishmania braziliensis demostrado por la amplificación de una fuerte banda de 148 pb de la muestra de la lesión del tabique nasalcomo se describió anteriormente . Asimismo , señales similares , aunque de banda más tenue fue detectada en muestra de sangre periférica del paciente , procesada con el mismo ensayo de PCR multiplex . Resultados del ensayo de PCR en material del tabique nasal y de sangre periférica del paciente . Examen serológico Una alícuota de suero del paciente fue tomada para realizar exámenes serológicos convencionales que detectan anticuerpos ( Ac ) anti-Leishmania , utilizando antígeno de L. braziliensis . Los mismos incluyeron un test de aglutinación directa ( TAD ) y una prueba de Inmunofluorescencia indirecta ( IFI ) siguiendo procedimientos previamente estandarizados y adaptados en nuestro laboratorio para tal fin . Todas las pruebas realizadas resultaron negativas . Aplicación de prueba diagnóstica alternativa para corroborar infección por Leishmania braziliensis Para llevar a cabo la confirmación de L. braziliensis como agente causal de la lesión del caso registrado , fue aplicada una prueba serológica alternativa en formato Western Blot , utilizando como antígeno proteínas ancladas por GPI ( Glycosil-Phosphatydil-Inositol ) a la membrana de promastigotes de L. braziliensis . Estas proteínas han sido exitosamente ensayadas en nuestro laboratorio como marcadores bioquímicos específicos para identificar y diferenciar leishmaniasis causada por L. ( V. ) braziliensis , siguiendo metodología previamente descrita . La aplicación del test reveló una banda de aproximadamente 50kDa específica para L. braziliensis , la cual no es detectada en sueros de individuos infectados por L. ( L. ) mexicana o L. ( L. ) amazonensis , confirmando la identidad revelada con el ensayo de PCR . Asimismo , esta reacción permite aseverar que la lesión que presenta el caso estudiado es parasitológica e inmunológicamente activa , ya que en casos tratados o curados la reacción es negativa .