Paciente: VIH/sida ingresado en el Hospital del Instituto de Medicina Tropical  ̈Pedro Kourí ̈ por presentar síntomas respiratorios bajos con interposición líquida.

Muestra y condiciones de cultivo: el líquido pleural se inoculó en medio agar sangre (Biocen, Cuba) enriquecido con sangre de carnero 5 %, agar MacConkey (Biocen). Los medios inoculados se incubaron a 35 oC durante 24-48 h. Posteriormente, el medio agar sangre fue incubado a temperatura ambiente (TA) por 5 d adicionales. Una vez concluida la incubación, se realizó la lectura y a continuación la tinción de Gram, observación microscópica y pruebas bioquímicas.

Pruebas bioquímicas: se realizó la hidrólisis de la esculina, citocromo oxidasa, catalasa, ureasa y factor equi según lo descrito por Prescott en 1991.

Extracción de ADN: una azada del cultivo del líquido pleural proveniente del paciente se introdujo en un vial estéril de 1,5 mL, al cual se le adicionó 400 mL de agua destilada estéril. Posteriormente, el contenido se incubó a 80 oC por 15 min en un baño termostatado.8 El homogenizado obtenido de la ruptura celular fue utilizado para la PCR.

PCR: se amplificó un fragmento de 439 pares de base (pb) del gen que codifica para la proteína de choque térmico de 65 kDa (HSP) del género Mycobacterium conservada en microorganismos del orden Actinomycetales.8 Se tomaron 5 μL del homogenizado previamente obtenido y se le adicionaron 45 μL de volumen de reacción de amplificación que contenía: Tris/HCl (pH 8,3) 10 mM, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, desoxirribonucleótidos (dNTP) 200 μM, cebadores TB11(5 ́-ACCAACGATGGTGTGTCCAT-3 ́) y TB12 (5 ́-CTTGTCGAACCGCATACCCT-3 ́) 0,4 μM, 2 unidades de Taq ADN polimerasa (Bioline, Londres, Reino Unido). El perfil de amplificación se llevó a cabo según lo descrito por Steingrube y otros.

Para la detección de los productos amplificados se analizaron 12 μL de cada mezcla resultante mediante electroforesis en gel de agarosa 1,2 % con solución reguladora de Tris-Borato-EDTA (89 mM Tris, 89 mM Borato, 2mM EDTA). La electroforesis se realizó a 80 V por 1 h. Los resultados se visualizaron en un transiluminador ultravioleta (Macrovue 2011, LKB, Suecia) y luego se fotografiaron con una cámara digital Power Shot G6 (Cannon, Japón).

En las reacciones de amplificación se empleó como control positivo ADN extraído del cultivo de una cepa de M. tuberculosis (H37Rv) y agua destilada estéril como control negativo.

PCR-RFLP: los productos de la PCR se dividieron en 2 alícuotas, que fueron utilizadas para el análisis de los patrones de restricción con las enzimas BstE II (New England Biolabs, Reino Unido) y Hinf I (New England Biolabs, Reino Unido). Las condiciones del análisis de restricción y del resto del protocolo se llevó a cabo según lo descrito por Steingrube y otros.

Después de 24 h de inocular el líquido pleural del paciente en el medio agar MacConkey no se obtuvo ningún crecimiento bacteriano. En el medio agar sangre se observó un crecimiento de colonias de 1-2 mm de diámetro, las cuales fueron indistinguibles. A las 48 h de incubación de la muestra, se observaron colonias redondas, con apariencia irregular, lisas, semitransparentes, brillantes, mucoides, y unidas. Luego de 5 d de incubación a temperatura ambiente, las colonias variaron de tamaño (2-4 mm de diámetro) y mostraron un pigmento color salmón. Cuando se realizó la tinción de Gram, esta mostró cocobacilos, grampositivos y pleomórficos.

Los resultados de las pruebas bioquímicas realizadas al cultivo del líquido pleural se muestran en la tabla. El análisis en su conjunto, sugiere una posible infección por R. equi en el paciente analizado. Sin embargo, un elemento esencial y confirmatorio para demostrar la infección por este microorganismo es la presencia del factor equi, el cual resultó negativo en la muestra analizada. Para demostrar la presencia de R. equi en el material estudiado, se requirió de un proceder adicional, la utilización de métodos moleculares.

La PCR del fragmento de 439 pb del gen que codifica para la proteína HSP fue exitosamente amplificada a partir del cultivo del líquido pleural del paciente. Este resultado no es concluyente de infección por R. equi, porque solo brinda información de que el microorganismo pertenece al orden Actinomycetales. Sin embargo, los resultados obtenidos demostraron la presencia de R. equi cuando se realizó la restricción enzimática empleando las enzimas BstE II y Hinf I al producto de PCR. En la muestra analizada se obtuvo 1 banda amplificada de 439 pb al emplear BstE II y 2 bandas 310/70 pb para Hinf I; los patrones de restricción coincidieron con el algoritmo descrito por Steingrube y otros.
Paciente : VIH / sida ingresado en el Hospital del Instituto de Medicina Tropical ̈Pedro Kourí ̈ por presentar síntomas respiratorios bajos con interposición líquida . Muestra y condiciones de cultivo : el líquido pleural se inoculó en medio agar sangre ( Biocen , Cuba ) enriquecido con sangre de carnero 5 % , agar MacConkey ( Biocen ) . Los medios inoculados se incubaron a 35 oC durante 24-48 h. Posteriormente , el medio agar sangre fue incubado a temperatura ambiente ( TA ) por 5 d adicionales . Una vez concluida la incubación , se realizó la lectura y a continuación la tinción de Gram , observación microscópica y pruebas bioquímicas . Pruebas bioquímicas : se realizó la hidrólisis de la esculina , citocromo oxidasa , catalasa , ureasa y factor equi según lo descrito por Prescott en 1991 . Extracción de ADN : una azada del cultivo del líquido pleural proveniente del paciente se introdujo en un vial estéril de 1,5 mL , al cual se le adicionó 400 mL de agua destilada estéril . Posteriormente , el contenido se incubó a 80 oC por 15 min en un baño termostatado.8 El homogenizado obtenido de la ruptura celular fue utilizado para la PCR . PCR : se amplificó un fragmento de 439 pares de base ( pb ) del gen que codifica para la proteína de choque térmico de 65 kDa ( HSP ) del género Mycobacterium conservada en microorganismos del orden Actinomycetales.8 Se tomaron 5 μL del homogenizado previamente obtenido y se le adicionaron 45 μL de volumen de reacción de amplificación que contenía : Tris / HCl ( pH 8,3 ) 10 mM , KCl 50 mM , MgCl2 1,5 mM , desoxirribonucleótidos ( dNTP ) 200 μM , cebadores TB11(5 ́-ACCAACGATGGTGTGTCCAT-3 ́ ) y TB12 ( 5 ́-CTTGTCGAACCGCATACCCT-3 ́ ) 0,4 μM , 2 unidades de Taq ADN polimerasa ( Bioline , Londres , Reino Unido ) . El perfil de amplificación se llevó a cabo según lo descrito por Steingrube y otros . Para la detección de los productos amplificados se analizaron 12 μL de cada mezcla resultante mediante electroforesis en gel de agarosa 1,2 % con solución reguladora de Tris-Borato-EDTA ( 89 mM Tris , 89 mM Borato , 2mM EDTA ) . La electroforesis se realizó a 80 V por 1 h. Los resultados se visualizaron en un transiluminador ultravioleta ( Macrovue 2011 , LKB , Suecia ) y luego se fotografiaron con una cámara digital Power Shot G6 ( Cannon , Japón ) . En las reacciones de amplificación se empleó como control positivo ADN extraído del cultivo de una cepa de M. tuberculosis ( H37Rv ) y agua destilada estéril como control negativo . PCR-RFLP : los productos de la PCR se dividieron en 2 alícuotas , que fueron utilizadas para el análisis de los patrones de restricción con las enzimas BstE II ( New England Biolabs , Reino Unido ) y Hinf I ( New England Biolabs , Reino Unido ) . Las condiciones del análisis de restricción y del resto del protocolo se llevó a cabo según lo descrito por Steingrube y otros . Después de 24 h de inocular el líquido pleural del paciente en el medio agar MacConkey no se obtuvo ningún crecimiento bacteriano . En el medio agar sangre se observó un crecimiento de colonias de 1-2 mm de diámetro , las cuales fueron indistinguibles . A las 48 h de incubación de la muestra , se observaron colonias redondas , con apariencia irregular , lisas , semitransparentes , brillantes , mucoides , y unidas . Luego de 5 d de incubación a temperatura ambiente , las colonias variaron de tamaño ( 2-4 mm de diámetro ) y mostraron un pigmento color salmón . Cuando se realizó la tinción de Gram , esta mostró cocobacilos , grampositivos y pleomórficos . Los resultados de las pruebas bioquímicas realizadas al cultivo del líquido pleural se muestran en la tabla . El análisis en su conjunto , sugiere una posible infección por R. equi en el paciente analizado . Sin embargo , un elemento esencial y confirmatorio para demostrar la infección por este microorganismo es la presencia del factor equi , el cual resultó negativo en la muestra analizada . Para demostrar la presencia de R. equi en el material estudiado , se requirió de un proceder adicional , la utilización de métodos moleculares . La PCR del fragmento de 439 pb del gen que codifica para la proteína HSP fue exitosamente amplificada a partir del cultivo del líquido pleural del paciente . Este resultado no es concluyente de infección por R. equi , porque solo brinda información de que el microorganismo pertenece al orden Actinomycetales . Sin embargo , los resultados obtenidos demostraron la presencia de R. equi cuando se realizó la restricción enzimática empleando las enzimas BstE II y Hinf I al producto de PCR . En la muestra analizada se obtuvo 1 banda amplificada de 439 pb al emplear BstE II y 2 bandas 310/70 pb para Hinf I ; los patrones de restricción coincidieron con el algoritmo descrito por Steingrube y otros .