STRUKTURE är den mest använda kluster programvara för att upptäcka befolkningens genetiska struktur. Den senaste versionen av denna programvara (STRUKTURE 2.1) har förbättrats nyligen för att ta hänsyn till förekomsten av koppling disequilibrium (LD) orsakas av en blandning mellan populationer. Denna senaste version, dock fortfarande inte beaktar effekterna av stark bakgrund LD orsakas av genetisk drift, och som kan orsaka falska resultat. STRUKTURE författare har därför föreslagit ett grovt tröskelvärde för avståndet (1,0 cM) mellan två loci under vilken paret loci inte bör användas. På grund av LD:s känslighet för demografiska händelser är avståndet mellan loci inte alltid en bra indikator på styrkan hos LD. I denna studie undersöker vi sambandet mellan genomiskt avstånd och styrkan i korrelationen mellan loci (r LD ) i en fri-omfattande population av mouflon (Ovis aries), och vi presenterar ett empiriskt test av effekten av r LD på de klusterresultat som tillhandahålls av länkmodellen i STRUKTURE. Vi visade att ett högt r LD-värde ökar sannolikheten för att upptäcka falska kluster. Vi föreslår att r LD används som ett index för att basera ett beslut på om man ska använda ett par loci i en klusteranalys eller inte. Nyckelord: STRUKTURE-programvara; länkdisequilibrium; populationsstruktur; klustering Inledning STRUKTURE (Pritchard et al., 2000) är den mest använda klusterprogramvaran som används för att upptäcka populationsgenetisk struktur, med mer än 1000 citeringar för sin första version (Pritchard et al., 2000) och mer än 170 citeringar för dess nyligen förbättrade version (Falush et al., 2003) (källa: ISI Web of Science database). STRUKTURE genererar kluster baserade på både transient HardyWeinberg disequilibrium (HWD) och kopplingsdisequilibrium (LD) som orsakas av en blandning mellan populationer. Programmet fungerar genom att gruppera individer i grupper, där både koppling och HWD minimeras, och därför, närvaron av LD i data förbättrar klusterresultat (Falush et al., 2003). Å andra sidan kan "stark" LD eller avvikelse från Hardy-Weinberg jämvikt leda till en överskattning av antalet upptäckta kluster (Falush et al., 2003). STRUKTURE handlar om två typer av LD: den första är blandning LD, som förekommer över loci även om de är obundna på grund av korrelationen av allelfrekvenser "eftersom individer med en stor del av anor i befolkningen k har ett överskott av alleler som är vanliga i k" (Falush et al., 2003). Den andra är en blandning LD, som är "den korrelation som uppstår mellan länkade markörer i nyligen blandade populationer " (Pritchard och Wen, 2004). Denna LD inträffar eftersom markörer är på samma "chunk" av kromosom som härrör från en anortal population. Den "blandningsmodell" som implementerats i den senaste versionen av STRUKTURE (STRUKTURE 2.1; Falush et al., 2003) kombinerar LD med kartavstånd mellan markörer för att förbättra klusterresultat. Falush m.fl. (2003) definierade en tredje typ av LD: bakgrunds-LD mätt mellan syntenous loci separerad med få cM. Bakgrund LD genereras av genetisk drift, förväntas vara stark på kort avstånd, och kan generera falska kluster (Falush et al., 2003). Författarna har dock inte genomfört ett sätt att ta hänsyn till LD vid klusterbildning ännu, och de råder användarna att undvika alltför nära kopplade markörer som kan vara i bakgrunden LD (Falush et al., 2003). Pritchard och Wen (2004) föreslog att avståndet mellan markörerna inte skulle vara under 1 cM för människor, även om de inte tillhandahöll empiriska bevis till stöd för detta råd. För många arter leder dock avsaknaden av en genomisk karta till en oförmåga att skilja bakgrund LD från andra typer av LD. Dessutom, andra händelser än en blandning, såsom befolkningsflaskhalsar (Lynch och Walsh, 1998) (Hill och Robertson, 1968 ) kan därför vara mer informativ än genomic karta för att avgöra vilka par av loci kan användas. Även om STRUKTURE är det mest använda programmet för att identifiera kluster, har endast ett fåtal studier testat dess känslighet för ekologiska eller genetiska begränsningar. Till exempel Berry et al. (2004) och Rosenberg m.fl. (2001) testade effekten av antalet loci på klusterresultat, medan Evanno et al. (2005) och Waples och Gaggiotti (2006) testade effekterna av variationen i spridningsfrekvensen bland populationerna på tillförlitligheten hos antalet upptäckta kluster. Dessutom har ingen studie testat effekten av LD:s styrka på klusterresultat. I detta dokument använder vi kunskap om både mouflonpopulationens (Ovis aries) fullständiga historia och genomisk information om arten för att studera de potentiella fördomar som orsakas av stark LD om klusterbildning med STRUKTURE 2.1. Den Kerguelen mouflon befolkningen grundades 1957 av två individer från Vincennes Zoo (Paris). År 1958 började mouflonet fortplanta sig, och befolkningen nådde 100 personer i början av 1970-talet. Befolkningen växte sedan exponentiellt och uppgick 1977 till omkring 700 individer, vilket motsvarar en täthet på omkring 100 individer per hektar. Sedan dess har befolkningen präglats av cyklisk dynamik, fluktuerande mellan 250 och 650 individer, med vinterkrascher som inträffar var 3-5 år (Chapuis et al., 1994). Med tanke på de höga densiteter som uppnås under toppar, den låga genetiska mångfald som observerats (max 4 alleler per loci Kaeuffer et al., 2007), den lilla storleken på ön och den unga åldern av befolkningen, vi förväntar oss inte att upptäcka någon genetisk struktur. Dessutom har den starka grundareffekten i denna population potentiellt genererat stark bakgrund LD. Denna situation gynnar möjligheten att empiriskt testa effekten av bakgrundslänkning på klusterbildning. Slutligen kunde vi beräkna avståndet mellan syntenous loci baserat på en genomic karta över Ovis aries (Maddox et al., 2001) och koppla detta avstånd till korrelationen mellan loci. 1993 provade vi 106 personer som dog under vinterkraschen och för vilka vi kände till deras exakta geografiska position. Dessa individer var genotypade vid 22 mikrosatellitloci: 18 från fem länkgrupper och sju som var okopplade. Vi använde STRUC-TUR 2.1 för att uppskatta befolkningens genetiska struktur. Med hjälp av olika kombinationer av loci med variabel r LD fick vi olika klusterresultat och jämförde dem med geografiska positioner. Vi utvärderade sedan förhållandet mellan kartavståndet mellan loci och styrkan i LD (det vill säga r LD, en korrelationskoefficient uppskattas mellan par loci, Hill och Robertson, 1968), och testade effekterna av distans och r LD på klusterresultaten. Vi antar att ett högt r LD-värde mellan loci kan indikera en potential för paret loci att generera falska kluster med STRUKTURE. Material och metoder Befolkningen ligger på Haute Island, en liten ö (6,5 km 2 ) i Kerguelen skärgård. Kerguelen är en mycket avlägsen Subantarctisk skärgård belägen i södra Indiska oceanen (49120 0 S, 70120 0 E). Klimatet är Subantarctic, med hög nederbörd, starka vindar och medeltemperatur från 11C under vintern till 81C på sommaren. Steniga landskap dominerar Haute Island, med gles vegetationstäcke (ca 40%) bestående av få endemiska arter (som är Azorella selago och Agrostis magellanica) och introducerade foderarter (som är Poa sp. och Festuca sp.) (Chapuis m.fl., 1994)........................................................................................................ Den centrala delen av ön består av steniga berg, som är 321 m höga. Moufloner är begränsade till stränder och låghöjd prärier skyddade från de dominerande vindarna. 1993 samlades vävnadsprover in från 106 lammkroppar från båda könen som hittades på marken. Positioner spelades in med hjälp av en 125 m 2 rutnät karta över Haute Island. Proverna förvarades i 95 % etanol. DNA extraherades med hjälp av QIAamps minisats för vävnadsextraktion (Qiagen Inc., Mississauga, Ontario, Kanada). PCR förstärkning utfördes på följande 22 ungulatelite loci: ARO28, HEL10, MCM64, MCM152, BM3413, HUJ177, MAF64, MCM527, TGLA13, Ilsts059, TGLA176, RT1, AGLA226, Il2ra, MCM218, NRAMP, OarCP49, TEXAN4, DRBps, INRA26, omHC1 och TGLA387 (se för detaljer Maddox et al., 2001). Reaktionsförhållanden (se http://www.thearkdb.org/) optimerades med hjälp av temperatur och MgCl 2-gradienten PCR. PCR-produkter analyserades med en automatisk sekvenserare (ABI 3730; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) och lästes med hjälp av GENEMAPPER 3.5-programvara (Aapplied Biosystems). Vi karakteriserade variation på varje lokus, och testade även för avgångar Hardy-Weinberg jämvikt, med hjälp av Genepop (Raymond och Rousset, 1995) finns på http://www.wbiomed.curtin.edu.au/genepop/genepop_op1.html. Avstånden mellan loci uppskattades med hjälp av SM3 BestPositions, kön i genomsnitt i Arkdb-databasen (http://www.thearkdb.org/) och Maddox et al. (2001).................................................................. Vi uppskattade LD mellan 22 loci med hjälp av korrelationskoefficienten r LD (Hill och Robertson, 1968). LD-korrelationskoefficienten mellan alla loci-par beräknades med hjälp av Linkdos-programvara (Garniere och Dillmann, 1992) (http://www.wbiomed.curtin.edu.au/ genepop/linkdos.html). Sedan använde vi Fishers exakta test i Genepop (Raymond och Rousset, 1995) (http://wbiomed.curtin.edu.au/genepop/genepop_op2. html) för att testa om genotyper på ett ställe är oberoende av genotyper på andra ställen. Grundare händelser (Lynch och Walsh, 1998) och populationsdynamik (Slatkin, 1994) kan påverka LD. Vi undersökte arten av förhållandet mellan r LD och avståndet i cM mellan två loci i mouflon befolkningen.  Ärftlighet attributet en sannolikhet Pr (X) med tanke på data (X), och loggen Pr (X) används för att bestämma det mer sannolika antalet kluster (Pritchard et al., 2000). Men Pr(X-K) är beräknings svårt att uppskatta, och Pritchard et al. (2000, s 948, 958) har föreslagit ett ad hoc- sätt att uppskatta sannolikheten för K med tanke på genotypade data. Pritchard m.fl. (2000, p 950 ) varnade användarna för att de uppskattade sannolikheterna bör betraktas som "en guide till vilken modeller är konsekvent snarare än korrekta uppskattningar av de bakre sannolikheterna" av K. STRUKTURE programvara ger också tilldelning sannolikheter för varje individ för varje kluster. Vi använde dessa sannolikheter för att dra slutsatser om varje individs medlemskap i deras mest troliga grupper. Vi hänvisade till fårgenomiska kartan (Maddox et al., 2001) för avstånd mellan loci för användning i länkmodellen. Befolkningen var ung (mindre än 50 år sedan introduktionen), och vi förväntade oss att hitta ingen befolkningsstruktur eller en svag struktur. Allelfrekvenser bör troligen korreleras mellan grupper, och därför använde vi alternativet "korrelerade allelfrekvenser" i kopplingsmodellen. K-värdet som gav den maximala sannolikheten för körningarna behölls som det mest sannolika antalet kluster (Pritchard och Wen, 2004). Vi körde först en serie modeller med K från 1 till 10, med hjälp av alla loci. Vi fastställde inbränningsperioden till 500 000 och löplängden till 1 000 000 för att ge konsekventa resultat under drift. För att verifiera konsekvensen i resultaten utförde vi 10 oberoende körningar för varje K. Att köra denna första serie tog oss mer än 100 timmar, och vi begränsade följande modeller till tre körningar och till en K från 1 till 5. Vi körde dessa analyser med hjälp av tre olika kombinationer av utvalda loci: (1) syntenous loci, (2) non-syntenous loci och (3) syntenous loci separerade med stora avstånd (43 cM). Vi körde slutligen STRUKTURE med alla olika möjliga par av syntenous loci och uppskattade antalet kluster för vart och ett av dessa par. Vi analyserade förhållandet mellan avståndet mellan två syntenous loci och deras r LD. Med tanke på den icke-linjära länken mellan de två variablerna, monterade vi en icke-linjär regressionsmodell av formen y 1⁄4 b 0  och b 1 *e (Àx/th), med hjälp av selfStart förfarande i paketet MASS i R (Venables och Ripley, 2002), där y är r LD och x är avståndet mellan två loci. Vi använde en generaliserad linjär modell (logit link funktion och binomial distribution) för att analysera effekten av r LD på sannolikheten för att upptäcka mer än ett kluster med STRUKTURE. Antalet alleler kan påverka klusterresultat (Rosenberg et al., 2001), och ingick därmed i modellen. Två grupper av par av syntenous loci (det vill säga med en r LD o0.3 och med en r LD 40.5, respektive) gav helt separerat antal uppskattade kluster (det vill säga 1 eller 41 kluster, respektive). För att redogöra för den skevhet som orsakas av den fullständiga separationen mellan dessa två grupper, körde vi en sned-robust logistisk regression som använder en maximal bestraffad sannolikhet uppskattning (Firth, 1993; Heinze och Schemper, 2002). Vi använde paketet logistf i R (Ploner et al., 2005). Resultat Det genomsnittliga antalet alleler per locus var 2,5 och varierade mellan 2 och 4. Den genomsnittliga heterozygositeten som observerats är 0,4770,012 s.e. Ingen av de 22 loci visade någon avvikelse från Hardy-Weinberg jämvikt (exakt test P 1⁄4 0,05). LD och länken med avstånd på kromosomen Trettiosex av de 231 loci paren visade signifikant LD (Po0.05). Den genomsnittliga r LD för hela uppsättningen loci var 0,112 (intervall: 0.0005-0,878). Av dessa 36 par, åtta var från syntenous loci och visade en r LD i genomsnitt 0,64, ( Tabell 1). De 28 andra paren i LD var på olika kromosomer och kännetecknades av en genomsnittlig r LD på 0,09. Endast 10 par loci, inklusive de åtta paren från syntenous loci var fortfarande i betydande LD efter korrigering för flera tester (Benjamini och Hochberg, 1995). Det genomsnittliga r LD för de två icke-syntena paren i signifikant LD efter korrigering för multipeltestning var tabell 1 Länkgrupper, avstånd mellan loci (i cM) och korrelationer (r LD ) mellan syntenous loci och deras associerade P-värde (i djärva signifikanta P-värden)
I REF studerades effekten av kopplingsdisequilibrium på återhämtningen av populationsstrukturen med hjälp av simulerade data.
Detecting population structure using STRUCTURE software: effect of background linkage disequilibrium
{'venue': 'Heredity', 'journal': 'Heredity', 'mag_field_of_study': ['Biology', 'Medicine']}