Volume 30 ANTAL 2 FEBRUARI 2012 naturbioteknik l e t t t e r s Beräkningsenzym design håller löfte för produktion av förnybara bränslen, läkemedel och kemikalier. De novo enzym design har genererat katalysatorer för flera reaktioner, men med lägre katalytisk effektivitet än naturligt förekommande enzymer [1] [2] [3] [4]. Här rapporterar vi användningen av speldrivna crowdsourcing för att öka aktiviteten hos ett datoriserat enzym genom en funktionell ombyggnad av dess struktur. Spelare i online-spelet Foldit 5, 6 utmanades att bygga om ryggraden i en beräkningsdesignad bimolecular DielsAlderase 3 för att möjliggöra ytterligare interaktioner med substrat. Flera iterationer av design och karakterisering genererade en 24-restue helix-turn-helix motiv, inklusive en 13-restue insättning, som ökade enzymaktiviteten >18-faldigt. Röntgenkristallografi visade att den stora insättningen antar en helix-sväng-helix struktur placerad som i Foldit modellen. Dessa resultat visar att mänsklig kreativitet kan sträcka sig bortom de makroskopiska utmaningar som möter i vardagen till molekylära designproblem. Tidigare beräkningsmetoder för enzymdesign har hållit ryggraden oförändrad, men det är tydligt från naturlig utveckling att optimeringen av nya funktioner i allmänhet innebär vissa ryggrad omgrupperingar 7. De novo designmetoder har använts för att skapa nya slingor och proteinstrukturer 8, och motiv-riktade designmetoder kan införa nya funktionella slingor när specifika interaktioner används för att styra modellering 9,10. Oriktad ombyggnad av proteinstommen för att förbättra funktionen har dock ännu inte uppnåtts. En primär utmaning är att antalet möjligheter till oriktad ombyggnad, när stora insättningar och sekvensvariationer är tillåtna, är för stort för att systematiskt sökas genom automatiserade metoder. Det senaste arbetet har visat att crowdsourcing protein modellering problem till en online community genom spelet Foldit, som utvecklar spelarnas struktur förutsägelse färdigheter, är ett effektivt sätt att lösa svåra protein struktur modellering problem 5, 6. Det var dock oklart om spelarnas modelleringsexpertis, som bygger på mänsklig kreativitet och rumslig intuition för att direkt söka genom alternativa proteinstrukturer, kunde utvidgas till proteindesign, vilket innebär en mycket mer öppen sökning genom proteinsekvens och strukturutrymme. För att undersöka om mänsklig kreativitet kan vägleda sökandet i detta betydligt större utrymme, införlivade vi nya verktyg som tillåter insättningar, raderingar och sekvenssubstitutioner i Foldit för att komplettera befintliga verktyg för att manipulera proteinkonformation. För att integrera spelarna i den experimentella designprocessen presenterade vi dem med en rad pussel. För att ansluta Foldit spelare iterativ prospektering med experimentell testning, etablerade vi en avancerad Foldit spelare som en mellanhand mellan Foldit community och det experimentella laboratoriet, som presenterade spelare med pussel i varje skede av designprocessen. Med hjälp av Foldit, den avancerade spelaren analyserade topranking gemenskap design och byggt sekvens bibliotek runt strukturerna för att stabilisera gynnsamma interaktioner. Mönstren testades sedan experimentellt, och de bästa användes som indata för nästa pussel som postades till online-communityn (kompletterande bild. 1 )............................................................................................................... Vi utmanade Foldit spelare att bygga om den aktiva platsen loopar av ett datoriserat enzym, DA_20_10 (ref. 3), som katalyserar Diels-Alder reaktionen. Denna reaktion, en hörnsten i organisk syntes, skapar två nya kol-kolbindningar och upp till fyra stereocenter i ett steg. DA_20_10 katalyserar den välstuderade reaktionen mellan 4-karboxibenzyl trans-1,3-butadien-1-karbamat (dien) och N,N-dimetylakrylamid (dienofil, Kompletterande bild. 2 )............................................................................................................... Trots betydande katalytisk aktivitet är det aktiva området DA_20_10 öppet på ena sidan, vilket gör substraten ganska exponerade för lösningsmedel (Fig. 1a).............................................................................................. Vi resonerade som så att omformning av aktiva slingor för att få ytterligare kontakter med substraten skulle kunna förbättra katalytisk aktivitet och specificitet. Den tidigare utvecklade masspektrometri-baserade analysen för att upptäcka Diels-Alderase aktivitet möjliggör dock screening av endast ~200 varianter på en gång, och därmed screening stora bibliotek 11 är inte möjlig. Istället valde vi att anlita Foldit spelare för att vägleda sökandet efter ombyggda slingor som producerar högre aktiviteter. Eftersom det inte var klart vilken loop till ingenjör, den första Foldit pussel, "Cover Ligand," bad spelarna att bygga om någon av fyra aktiva plats loopar i DA_20_10 för att göra ytterligare molekylära kontakter till ligand. Spelare tilläts lägga till eller ta bort upp till fem aminosyror utöver muterande rester på den aktiva platsen (Supplementary Fig. 1a och kompletterande uppgifter). Efter en veckas spel rangordnades de 69 773 designerna av spelarna av energi, de lägsta 50 var visuellt bedömda, och fyra designs som gjorde särskilt gynnsam natur bioteknik Volume 30 ANTAL 2 FEBRUARI 2012 1 9 1 l e t t rs interaktioner med ligander valdes för att genomgå ytterligare omgångar av förfining ( Kompletterande figurer. 1b och 3). Med utgångspunkt från dessa fyra slingor utformade den avancerade spelaren ett bibliotek med 36 sekvenser som förutspåddes interagera gynnsamt med substraten och/eller stabilisera den designade strukturen (Supplementary Library 1 och Supplementary Fig. Denna förordning är till alla delar bindande och direkt tillämplig i alla medlemsstater. Medan de flesta varianter inte uppvisade några signifikanta aktivitetsnivåer, hade en (CE0) en katalytisk verkningsgrad på 0,5 s −1 M −1 M −1, ungefär en tiofaldig minskning i förhållande till DA_20_10, som har en katalytisk verkningsgrad på 4,7 s −1 M −1 M −1 (tabell 1). Vi antog att den planerade insättningen kan ha önskad struktur, men de nuvarande aminosyrorna interagerade med substraten eller övergångstillståndet var suboptimala. Vi utforskade denna design ytterligare genom att göra och testa ytterligare 500 sekvensvarianter förutspådde att göra gynnsamma interaktioner med de modellerade ligands (Supplementary Library 2). Den mest aktiva av dessa konstruktioner, CE4, bestod av en helix buttressing ligands, följt av en ostrukturerad loop, och är niofaldigt mer aktiv än DA_20_10 med en katalytisk verkningsgrad på 42,4 s −1 M −1 M −1 (tabell 1). Ett andra pussel, "Back Me Up," sedan postades till Foldit gemenskapen ber spelarna att stabilisera den ursprungligen utformade helix genom att omvandla en ostrukturerad loop till en ytterligare angränsande strukturerad helix (kompletterande data). De tilläts att ändra struktur, sekvens och längd som tidigare, men endast för den ostrukturerade slingan. Efter ytterligare en vecka och 109 421 mönster hade de översta motiven konvergerat på ett helix-sväng-helix-motiv, som begärts (kompletterande bild. 1d)........................................................................................................... Återigen byggde den avancerade spelaren två bibliotek baserade på det gemenskapsdesignade helix-svänghelixmotivet, var och en bestående av ungefär 200 sekvenser (kompletterande bibliotek 3). Den mest aktiva designen från dessa bibliotek identifierades som CE6, med en katalytisk verkningsgrad på 87,3 s −1 M −1 M −1 (tabell 1). Detta motsvarar en > 150-faldig ökning av aktiviteten i förhållande till den ursprungliga spelardesignade modellen (CE0) och en > 18-faldig förbättring i förhållande till det ursprungliga enzymet, DA_20_10. Det tredje och sista pusslet utmanade spelarna att förutsäga strukturen för den stora insättningen i CE6 från och med den ursprungliga konstruktionens kristallstruktur (kompletterande bild. 1e)............................................................................................................ Efter en vecka genererade spelarna 335,697 lösningar, och den lägsta energin av dessa valdes som den spelare predikterade strukturen för CE6 (Fig. 1b och kompletterande bild 1f)............................................................................................................ För att validera noggrannheten hos den toppklassade CE6-modellen bestämde vi CE6:s struktur genom röntgenkristallografi (kompletterande tabell 1). De konstruerade helikorna är väl lösta i elektrontätheten (Fig. 1d), och den spelare utformade helix-turn-helix modellen är anmärkningsvärt nära den faktiska strukturen ( Bild. 1c och kompletterande bild 1 g............................................................................................................ Helix 1 har rätt sekundär struktur, register, placering och orientering, vilket resulterar i en Cα-r.m.s. avvikelse på 1,21 Å över längden på det konstruerade spiralelementet (spannrester 36–44 i konstruktionen). Alla tre konstruerade rester i gränssnittet mellan helix 1 och det modellerade övergångstillståndet (Ser 39, Leu 42 och Thr 43) är i samma rotameriska konformation som förutsägs i den slutliga designade modellen (Fig. 1e)............................................................................................................ Dessutom är serine 36, som var utformad för att kapa N-terminus av Helix 1, också modellerad korrekt (Fig. 1e)............................................................................................................ Helix 2 (som var utformad för att interagera med Helix 1, och motsvarar resterna 48 till 56 i det designade enzymet) är välbeställd i kristallstrukturen och har samma övergripande placering som i Foldit modellen, men dess förpackningsvinkel och orientering i förhållande till Helix 1 skiljer sig något från modellen. Helix 2 förutspåddes ha en förpackningsvinkel på 30 grader i förhållande till Helix 1, medan de två helikorna i kristallstrukturen är parallella. Skillnaden i läget för den designade Helix kontra kristallstrukturen är ett resultat av en liten rotation runt mitten av Helix 2 (nära alanin 51). Ryggraden r.m. avvikelsen över helix-turn-helix-motivet är 3,13 Å, men större delen av detta ökade r.m.s. avvikelse är ett resultat av den ändrade orienteringen för Helix 2. Några av skillnaderna mellan den slutliga designen och den experimentellt bestämda kristallstrukturen är belägna nära kristallkontakter med C-terminus av en andra molekyl av CE6 i den asymmetriska enheten (Supplementary Fig. 4)................................................................. För att utvärdera om de observerade kristallkontakterna förekommer i lösningen muterade vi de mest begravda resterna i kristallgränssnittet (F324R, I326G och F327K). Aktiviteten hos denna mutant var oskiljaktig från CE6, vilket tyder på att gränssnittet inte bildar i lösning (kompletterande bild. 5).................................................................. Michaelis konstanter, K M-dien och K M-dienofil (tabell 1 och bild). 2), av CE6 förbättras sexfaldigt respektive trefaldigt, jämfört med start design, men omsättningen antal (k katt ) är oförändrad. c Figur 1 Kristallstruktur av Foldit design liknar spelarmodellen. (a) Kristallstruktur för startdesign Diels Alderase. Strukturen av DA_20_10 har inte lösts; visas är strukturen av en prekursor (3I1C, gul) som skiljer sig med endast tre aminosyrasubstitutioner. Det modellerade övergångstillståndet för Diels-Alder-reaktionen avbildas i cyan. (b) Struktur för start Diels Alderase (gul) överlagd på CE6 spelare förutsagd struktur (lila). CE6 har en 24-amino-syra-loop ombyggnad, inklusive en 13-rest-insättning, som omvandlar en ostrukturerad ögla till ett helix-sväng-helix-motiv. (c) Kristallstruktur av CE6 (3U0S, ljusblå) överlagd med spelare förutsagd struktur av CE6 (lila). Helix-turnhelix-motivet är tydligt närvarande och har en position nära den i den förutsagda strukturen. d) Korrelation mellan CE6-modellerade helices och motsvarande experimentell elektrontäthet. Elektrontäthetskartan är konturerad till 1,0 σ. Sidokedjealanin 45 är nära mitten av bilden till vänster, med helix 1 ovan och helix 2 nedan. (e) De spelardesignade sidokedjorna i CE6 som bildar gränssnittet mellan helix 1 (lila) och övergångsstatsmodellen (cyan) finns i samma rotameriska konformation som i CE6 (3U0S, ljusblå). Figur 1d genererad i Coot 13. Alla andra siffror genererade i PyMol 14. Tabell 1 Kinetiska konstanter härledda från den ickelinjära regressionen passar i Figur 2 Protein 1 9 2 VOLYM 30 ANTAL 2 FEBRUARI 2012 naturbioteknik l e t t t e rs Förbättringen i K M men avsaknaden av förändring i k katt överensstämmer med designmodellen och kristallstrukturen. Den designade loopen interagerar med och sannolikt ökar affiniteten för båda substraten i linje med minskningen i K M. De katalytiska resterna som stabiliserar övergångstillståndet är på motsatt sida av den aktiva platsen, och dessa rester har nästan identiska platser i CE6 och den ursprungliga designen ( Kompletterande bild. 6 ) trots den storskaliga ombyggnaden av slingan. Med tanke på denna likhet, och det faktum att konformationen av substrat och övergångstillstånd är mycket lik i regionen för den utformade slingan, är det inte förvånande att, som föreslås av bristen på förändring i k katt, slingan inte selektivt stabilisera övergångstillståndet. Förutom ökad aktivitet, antog vi att den ökade begravda ytan och hydrofobi i bindningsfickan skulle öka dienofil specificitet för andra hydrofobiska substrat. Vi testade denna hypotes genom att testa enzymaktivitet av CE6 med en serie modifierade dienofiler som tidigare beskrivits 3. I förhållande till DA_20_10 uppvisade den spelande CE6 en trefaldig ökning av bindningsspecificiteten för den hydrofoba dienofilen 2A över den hydrofila dienofilen 2E (kompletterande bild). 7), överensstämmer med vår förutsägelse. CE6 visar dock ingen signifikant preferens för 2A jämfört med de liknande stora hydrofoba 2B- och 2C-substraten. Den ökade specificiteten för hydrofila substrat och förlusten av specificitet för hydrofobiska substrat tyder på att även om den önskade hydrofobiska fickan bildas, ytterligare förbättringar av formkomplementet mellan substratet och det konstruerade enzymet förblir möjliga. Med tanke på den nya ryggraden struktur den aktiva platsen, framtida studier kommer att undersöka ytterligare ryggrad ombyggnad för att modulera substrat specificitet. Insättning av helix-sväng-helix motiv kan vara till stor nytta vid beräkning av proteindesign. En fördel med spiralhårnålar är att de i stor utsträckning är självstabiliserande och inte kräver ytterligare tertiära interaktioner för att bilda 12. Detta gör att de flesta av de experimentella provtagningarna kan fokuseras på att introducera nya funktionella interaktioner med ligander. Det högt beställda och förutsägbara spiralregistret gör det möjligt att fokusera provtagningen på en liten del av positionerna som förväntas peka direkt mot ligand av intresse. Vi har visat att crowdsourcing komplexa computational protein-design problem med en gemenskap av spel-utvecklade experter kan vara ett effektivt sätt att kreativt ta prov på den potentiella sekvensutrymme för utformningen av aktiva plats loopar som modulerar enzymaktivitet. Enligt vår kunskap är detta den mest omfattande ombyggnad genom design av en funktionell proteinstruktur hittills, och utfördes genom screening mindre än 1.000 sekvenser. Folbit communitys förmåga att framgångsrikt styra storskaliga proteindesign problem visar att biofysik expertis som utvecklats genom spelspel överföringar effektivt från struktur förutsägelse till mer öppen design utmaningar. Metoder och eventuella tillhörande referenser finns i pappersversionen på http://www.nature.com/naturebiotechnology/. Anslutningskod. Röntgenkristallografiska koordinater har deponerats i Protein Data Bank med anslutning ID 3U0S. Obs: Kompletterande information finns på Nature Biotechnology webbplats. Vi skulle vilja erkänna medlemmarna i Foldit laget för deras hjälp att utforma och utveckla spelet och alla Foldit spelare som frivilligt att göra detta arbete möjligt. Vi vill också tacka J. Thompson för användbara manus, liksom B. Siegel och M. Eiben för användbara kommentarer om manuskriptet.
I ett helt annat fält är Foldit ett online-spel där spelare tävlar om att manipulera proteiner REF.
Increased Diels-Alderase activity through backbone remodeling guided by Foldit players