Som ett resultat av ovanstående begränsningar har referensfria metoder, som inte är beroende av externa referensuppgifter, föreslagits 2, 5. Vi visar att ingen av de nuvarande metoderna tillräckligt kontrollerar falska positiva, och vi presenterar en ny metod, referensfri justering för celltyp sammansättning (ReFACTor), för att ta itu med bristerna i nuvarande metoder. ReFACTor baseras på en variant av PCA och kan appliceras på vilken vävnad som helst. PCA är en naturlig kandidat för korrigering av celltyp heterogenitet, eftersom de första flera huvudkomponenterna (PCs) korreleras med celltyp sammansättning 6. Endast ett litet antal platser (så kallade differentierade metylerade regioner, eller DMR) skiljer sig dock avsevärt mellan celltyper, och därför minskar alla platser i PCA eventuellt korrelationen. Motiverade av denna observation utformade vi ReFactor för att utföra en PCA på en delmängd av de platser som är differentierat metylerade över de olika celltyperna snarare än på hela uppsättningen CpG-metyleringsplatser. Speciellt väljer ReFACTor de platser som kan rekonstrueras med låg fel med hjälp av en låg-rank approximation av den ursprungliga metyleringsmatrisen. I motsats till andra metoder där oövervakad platsval utförs baserat på korrelationen mellan platsen och fenotypen, använder ReFACTor inte fenotypen i urvalsprocessen, vilket gör ReFACTor användbar som en del av en kvalitetskontroll steg i EWAS. Vi utvärderade ReFACTors förmåga att fånga celltypsammansättning med hjälp av simuleringar och verkliga data. Vi simulerade först blandningen av celltyper och mätte korrelationen av PCs av ReFACTor (ReFACTor komponenter) med cell proportionerna. Vi observerade att korrelationen mellan var och en av celltyperna och den linjära prediktorn av celltypen med hjälp av de första flera ReFACTor komponenterna avsevärt förbättrades jämfört med korrelationen med hjälp av de första flera PCs av en standard PCA. Dessa resultat var robusta mot simuleringsparametrarna (se Online Methods och Supplementary Figs. 1–3............................................................................................... Därefter mätte vi ReFACTors prestanda på verkliga data från GALA II-datauppsättningen 7 (n = 489). GALA II-kohorten innehåller helblodsmetyleringsdata samt cellantalsmätningar för 78 av proverna, och därför kunde vi utvärdera korrelationen mellan de uppmätta celltypernas proportioner och de infererade ReFactor-komponenterna. Vi jämförde resultaten från ReFACTor med PCA och med den tillgängliga referensbaserade metoden 3 (Fig. 1).................................................................. Sammantaget är ReFACTor korrelation med celltyp proportioner högre än PCA: s, och ReFACTor överträffar referens-baserad metod med sex komponenter-sex är antalet celltyper den uppskattar-även om den referensbaserade metoden utnyttjar externa data som inte är tillgängliga för ReFACTor. Även cellantal kan potentiellt användas för att justera för vävnad i epigenom-omfattande associationsstudier (eWas), olika metyleringsprofiler av olika celltyper kan leda till falska upptäckter. Vi introducerar refaktor, en metod baserad på huvudkomponentanalys (Pca) och utformad för korrigering av celltyp heterogenitet i eWas. refaktor inte kräver kunskap om cellantal, och det ger förbättrade uppskattningar av celltyp sammansättning, vilket resulterar i förbättrad kraft och kontroll för falska positiva i eWas. Motsvarande programvara finns tillgänglig på http://www.cs.tau.ac.il/~heran/ cozygene/software/refactor.html. Nyligen genomförda arbete med EWAS tyder på en viktig roll för DNA-metylering som en mekanism som är involverad i sjukdom. I en standard EWAS av primärvävnad, såsom helblod, metyleringsdata representerar epigenetiska tillstånd av en heterogen blandning av celltyper. Eftersom epigenomet är mycket varierande mellan olika celltyper, korrelationer mellan fenotyp av intresse och celltyp sammansättning leder till ett stort antal falska upptäckter 1,2. I den statistiska standardanalys som används i EWAS används ett univariattest för korrelation mellan fenotypen och var och en av de sonderade CpG-platserna. Falska upptäckter på grund av celltypen heterogenitet kan därför åtgärdas genom att cellens proportioner läggs till som kovariater. Celltypsammansättningar mäts dock inte normalt, och därför har en beräkningsmetod föreslagits för skattning av celltypsammansättning med hjälp av en referensdatauppsättning som inkluderar metyleringsmätningar för sorterade celler 3. Tyvärr finns referensdata för helgenommetyleringsnivåer från sorterade celler endast tillgängliga för en liten undergrupp av olika blodkroppar och inte för någon annan vävnad. Dessutom är de befintliga datamängderna små 3, 4, och individerna i referensdata inte matchas för metylering-förändrande faktorer såsom ålder och kön, vilket kan leda till felaktigheter i celltyp uppskattningar.
En annan ny referensfri metod för att uppskatta cellsammansättningen i metyleringsdata, ReFACTor REF, utför en oövervakad funktionsval steg följt av en huvudkomponentanalys (PCA).