Vi bedömer tillämpningen av andra generationens miljöprovberedare (ESP) för upptäckt av skadliga algblomningsarter (HAB) i fält- och laboratoriemiljöer med hjälp av två molekylära sondtekniker: en smörgåshybridiseringsanalys (SHA) och fluorescerande in situ-hybridisering (FISH). Under våren 2006, första gången detta nya instrument användes, den framgångsrika automatiserade tillämpningen av DNA-sond arrayer för olika HAB arter och andra planktonic taxa, men icke-specifik bakgrundsbindning på SHA-sond array stöd gjorde resultat tolkning problematiskt. Efter 2006 ersattes DNA-systemets stödmembran som vi använde med ett annat membran, och SHA-kemin justerades. Känsligheten och det dynamiska intervallet för dessa ändringar bedömdes med hjälp av 96-brunnars platta och ESP-matris SHA-format för flera HAB-arter som vanligen förekommer i Monterey Bay i ett intervall av koncentrationer; svaren var signifikant korrelerade (p < 0,01). Modifierade matriser utplacerades 2007. Jämfört med 2006 visade sondmatriser förbättrad signal: Buller, och fjärrdetektering av olika HAB-arter visades. Vi bekräftade att ESP och tillhörande analyser kan detektera HAB-populationer på nivåer under de som utgör folkhälsoproblem, och resultaten kan relateras till rådande miljöförhållanden i nära realtid. *Korresponderande författare: E-post: dgreenfield@belle.baruch.sc.edu Vi tackar teknikerna och maskinisterna på MBARI för deras ovärderliga hjälp och engagemang för instrumentutveckling. Vi uppskattar också hårt arbete och engagemang från besättningen på R/V Zephyr och Moss Landing Marine Laboratory, Small Boat Operations, och hjälp från Drs. W. Jones och C. Preston. Författarna erkänner tacksamt dr. Z. Wang och T. Roth för extraktion och analys av domoinsyra i diskreta vattenprover. Detta projekt finansierades delvis av Monterey Bay Aquarium Research Institute från medel som tilldelats av David och Lucille Packard Foundation, National Science Foundation, och National Aeronautics and Space Administration (OCE-0314222, CCF424599, och NNG06GB34G till CAS, och OCE-0314089 till GJD). Ansvarsfriskrivning: Alla åsikter, resultat och slutsatser eller rekommendationer som uttrycks i detta material är författarnas och återspeglar inte nödvändigtvis den nationella vetenskapsstiftelsens åsikter. Denna publikation utgör inte ett godkännande av någon kommersiell produkt eller avser att vara ett yttrande utöver de vetenskapliga eller andra resultat som erhållits av National Oceanic and Atmospheric Administration (NOAA). Ingen hänvisning får göras till NOAA, eller till denna publikation som tillhandahålls av NOAA, till reklam eller säljfrämjande åtgärder som skulle kunna tyda på eller antyda att NOAA rekommenderar eller stöder någon av de produkter som anges här, eller som har som syfte att få den annonserade produkten att användas eller köpas på grund av denna publikation. Det är Limnol. Det är Oceanogr.: Metoder 6, 2008, 667-679 © 2008, av American Society of Limnology and Oceanography, Inc. LIMNOLOGY och 1998; Olson och Sosik 2007), den optiska plankton discriminatorn (Kirkpatrick et al. 2000; Robbins m.fl. 2006), Autonom Microbial Genosensor, och Laser In Situ Scattering och Transmissometer (Rienecker et al. 2008)............................................................... Dessa och relaterade instrument kan användas oberoende av varandra eller integreras med större observationssystem (t.ex. Ryan et al. 2005; Paul m.fl. 2007; Babin m.fl. 2008)............................................................... I det ljuset överväger vi här hur miljöprovberedaren (ESP) kan användas för att upptäcka skadliga alger på plats (Scholin et al. , 2008............................................................... ESP är en anordning som gör det möjligt för användare att samla diskreta vattenprover från havet under ytan, koncentrera partiklar, och tillämpa molekylära sond-baserade analyser på distans (Roman et al. 2007)................................................................................................... Provmanipuleringar utförs i reaktionskammare som kallas puckar, som lastas in i och tas bort från olika stationer med hjälp av robotiska mekanismer. ESP använder för närvarande DNA-sonder i ett smörgåshybridiseringstest (SHA) format och antikroppssonder i ett kompetitivt ELISA-format. ESP har också möjlighet att arkivera prover för olika laboratorieanalyser, inklusive fluorescerande in situ hybridization (FISH; t.ex., Goffredi et al. 2006; Greenfield m.fl. 2006; Jones m.fl. 2008)............................................................... Den "första generationen" (1G) ESP genomgick fältförsök under flera år från [2001][2002][2003][2004][2005] i Monterey Bay och Mainebukten. Dessa experiment fokuserade på validering av grundläggande instrumentdesign och molekylära analyser (Goffredi et al. 2006; Scholin m.fl. 2008)............................................................... Resultaten från dessa försök vägledde iterationer för "andra generationens" (2G) ESP, som genomgick fältutplaceringar under våren 2006. I samverkan med teknisk förfining var ett av våra mål med 2G ESP att uppnå en mer kvantitativ ram. Därför genomförde vi laboratoriestudier med hjälp av diatomen Pseudo-nitzschia australis, där både SHA- och FISH-teknik användes för att bedöma instrumentets prestanda (Greenfield et al. 2006).................................................................. Det arbete som presenteras här bygger på dessa laboratorietester, med fokus på de första fältutplaceringarna av det nya instrumentet. Våra specifika mål var trefaldiga: för det första att dokumentera en övergång från den tidigare DNA-sonden membranstöd (Predator, Pall Corp.) till förstärkt nitrocellulosa (Optitran; Schleicher & Schuell); för det andra att utvärdera denna övergång genom att jämföra känslighet och dynamiskt intervall 96-well platta och ESP matris SHA-format; och för det tredje att utvärdera prestanda ESP och anslutna analyser för detektion av HABs i en fältinställning under våren 2006 och 2007. Vi visade att ESP kan upptäcka riktade HAB-arter in situ, och vi visar att trender i ESP-resultat bekräftas kvalitativt av trender i fytoplankton överflöd klarare genom periodisk vattenprovtagning. (klon CAWR04; Tyrrell et al.) 2001 ) odlades vid 18 °C, alla andra villkor var som ovan. Denna förordning träder i kraft den tjugonde dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning. Uppräkning beskrivs i Greenfield et al. (2006). A. katanella räknades genom provtagning av fem replikat 1,8 ml alikvot av logfasodling, färgning av alikvoter med 1 droppe syra Lugols jodlösning och uppräkning av celler med hjälp av ljusmikroskopi med hjälp av en Sedgewick Rafter kammare. H. akashiwo räknades upp enligt M. Adachi (unpubl. uppgifter) enligt följande: Hundra mikroliter logfasodling tillsattes i tre exemplar 3,9 ml 0,2 μm filtrerat havsvatten (FSW) för en utspädning på 1:40. För att döda celler utan att bryta sina cellmembran, utspädd kultur värmdes till 45°C i ett vattenbad i ~3 min för att stoppa cellmotilitet sedan placeras omedelbart på is i ~2 min. Aliquots (n = 3, 1 ml vardera) från vart och ett av de tre rören räknades därefter under ett ljusmikroskop med hjälp av en Sedgewick Rafter kammare för totalt 9 diskreta räkningar. För att samla in prover för SHA-analys koncentrerades logfaskulturen till 25 mm, 0,65 μm porstorlek hydrofilt Durapore (Millipore) filter med hjälp av skonsam vakuum (5 mm Hg). Membranerna rullades och placerades i kryovials (Nalge Company), provsidan vänd in, och kapslade injektionsflaskor förvarades i flytande kväve tills det behövdes. Beredning och bearbetning av DNA-sondmatriser för fjärrdetektering av HABs-A detaljerad beskrivning av SHA i DNA-sondmatrisformat, samt metoder för matristryck och bearbetning beskrivs på annat håll (Greenfield et al. 2006 )................................................................................................................. I den aktuella studien omfattade fångstsonder som användes för 2006 års utplaceringar Pseudo-nitzschia australis (auD1; tabell 1), Heterosigma akashiwo (Het1), P. multiseries/pseudodelicatissima (muD2) och Alexandrium tamarense/katenella (NA1). För arbete som utfördes under 2006 späddes kontrollsonden (AlexComp) på matriserna 1:1000, 1:2000, 1:4000 och 1:8000 (Greenfield et al. 2006).................................................................. Under 2007 inkluderades laboratoriestudier och fältutplaceringar, ytterligare en fångstsond för P. multiseries (muD1), och endast en 1:1000 utspädning av AlexComp-kontrollen användes. Normalisering av konjugataktivitet-Vi upptäckte att aktiviteten hos antikropps-HRP-konjugatet som användes i SHA (nedan kallat "konjugat") inte alltid var konsekvent mellan satser, inte ens när det bereds och späds med hjälp av ett konsekvent protokoll (data visas inte; efter Greenfield et al. 2006).................................................................. Konjugatkatalyserar kolorimetriska och kemiluminescerande reaktioner som motsvarar överflöd av målmolekyler. Eftersom ett av våra mål är att uppnå en mer kvantitativ ram är det viktigt att se till att reaktiviteten hos denna reagenslösning är konsekvent bland syntespartierna. Därför utvecklade vi ett kvalitetskontrollförfarande för att justera konjugatreaktiviteten baserat på en känd koncentration av en syntetisk målsekvens kallad "länk". En länkare är en oligonukleotid som är kostnadsfri för både fångande och signalsonder (se även Goffredi et al. 2006; Greenfield m.fl. Användningsområden för ESP: 2006 -2007 668 Greenfield m.fl. 2006).................................................................. För att förbereda länkaren späddes ett lager (1 ng μL -1 i 1xTE) av NA1S/ALXS alt L, hädanefter NA1-L (tabell 1), ut till 25 pg ml -1 i 0,2 μm-filtrerad 3 M GuSCN-lysbuffert inom 1 timme från användning för att ge en 96-well platta SHA mål A 450 av ~0,7 (Greenfield et al. 2006).................................................................. För ESP-matrisen SHA-format, ett lager (1 ng μL -1 i 1xTE) av auD1/PSDS L, hädanefter auD1-L (komplementet av avskiljnings- och signalsonder för P. australis; Tabell 1 ), förbereddes enligt ovan för att ge ett mål A 450 ~0,3. När alla andra reaktionstillstånd rapporteras tidigare styrs SHA:s totala reaktivitet mot en länkare av konjugatets aktivitet. För att bereda konjugatet återsuspenderades lyofiliserat ImmunoPure Peroxidas konjugerat IgG Fraction Mouse Anti-Digoxin (Pierce Bioteknik) till en teoretisk 0,8 mg ml -1 med destillerat vatten (Sigma) och späddes sedan 1:500 med GuardianTM Peroxidas Conjugate Stabilizer/Diluent/Blocker (S/D/B). Aliquots av detta 1:500 reagensparti jämfördes mot ett referensparti av samma reagens som man vet har önskad reaktivitet med hjälp av 96-brunnsplattan SHA. Den nya 1:500 parti konjugat späddes sedan i enlighet med detta med S/D/B för att matcha referensstandarden (detta motsvarar i allmänhet ~1:700-1:800 för 96-brunn plattan och ~1:1300-1:2000 för ESP array SHA. ESP-matrisens konjugataktivitet används vid en svagare koncentration än 96-hålsplattans format eftersom preliminära experiment har visat att arraybakgrunden (region där ingen sondfläck uppstod) ökar när konjugatnivåerna är högre (data visas inte). För ESP-utplaceringen våren 2007 och laboratorietesterna var de specifika konjugataktiviteterna för SHA i 96-hålsplattan och ESP-matrisformaten 1:750 respektive 1:1776. Övergång till nya ESP matris membran stöd och standard kurvor-Generation av standard kurvor med hjälp av både 96-well plattan och ESP matris SHA format följde metoder som beskrivs tidigare (Greenfield et al. 2006).................................................................. Den tidigare ESP-matrisen membranstöd, Predator (Pall Corporation), avbröts dock som en kommersiell produkt i slutet av 2006 så ett nytt matrisstöd krävdes. En övergång till Optitran BA-S 83 Förstärkt Nitrocellulose Membran (Whatman, Schleicher & Schuell), nedan kallad Optitran, genomfördes. Metoden för att trycka DNA-sonder på Optitran var identisk med Predator. Användning av Optitran-baserade matriser i ESP skiljde sig dock något från Predator genom att membranet klämdes tätt i pucken, inget bakfilter användes, och matrisen behandlades initialt med Western Blocking Solution (Sigma) innan lysat lades till (1 ml, 8 min) och ersattes sedan med tvätt under matrisbehandling (Goffredi et al. 2006; Greenfield m.fl. 2006).................................................................. Konjugataktiviteten bestämdes enligt ovan. För att generera standardkurvor för 96-brunnsplattan SHA-formatet tinades frysta filter (n = 5) som innehöll kända cellantal av målarter upp till rumstemperatur och sedan omedelbart lyserades och analyserades (Greenfield et al. 2006).................................................................. P. australis lysater späddes serievis i lysbuffert för att ge ~8 × 10 För att generera standardkurvor med ESP, var provfilter (n = 3) homogeniserade, lysater späddes efter behov, sedan lysaten delades så att en alikvot analyserades med hjälp av 96-well plattan SHA och den andra aliquot av samma lysat analyserades med hjälp av ESP-matrisen. MuD2 och muD1 fångar sonderna reagerar båda med P. multiseries (Miller och Scholin 1998; Scholin et al. 1999 ) så standardkurvor för båda utfördes samtidigt med samma odlade prover. För alla standardkurvor användes resultaten av 96-hålsplattan SHA för att uppskatta koncentrationen av målarter som levererades till ESP-matrisen. Array spot intensitet bestämdes genom att subtrahera genomsnittet av fyra lika stora bakgrundsområden som omger individuella fångst- och kontrollsond fläckar, då medelvärde (± SE) punkt intensitet per sond rapporterades för bilder vid en 60 s exponering vid 1 × 1 CCD-kamera binning. Fält provtagningsschema-Under våren 2006 och 2007 var ESP utplacerad för ~2-3 veckor perioder i Monterey Bay, Kalifornien, bredvid CIMT förtöjning M0 (36.83N, 121.90W, djup ~70 m) så att ESP provtagningsintaget förblev mellan 5 och 7 m under ytan. Under 2006 var utplacering 1 16-27 mars och Utplacering 2 var 10-23 april medan vår 2007 utplacering skedde 17 maj-11 juni. För alla distributioner, ESP fjärr automatiserad provtagning och bearbetning av DNA-matriser, en DNA-matris per dag, för antingen HABs, invertebrate larver, eller bakterier. Konkurrent ELISA (ceLISA) matriser för domoinsyra (DA) bearbetades på samma dagar som HAB matriser. Utvecklingen och tillämpningen av cELISA-matriserna kommer att beskrivas separat (Doucette et al. Jag är klar. Konkurrenta miljödata erhölls från två källor: en ledningsförmåga, temperatur, djupprofilering (CTD; Seabird Electronics Inc.) anbringad på ESP och data från M0-förtöjningen. Data från ESP CTD användes under Deployment 1 medan M0-data presenteras för 27 mars-23 april. Parametrar som användes för denna studie inkluderade ytvattentemperatur (°C) och salthalt (.). In situ ESP provtagning och prov arkiv-Den process genom vilken ESP samlar in och bearbetar prover in situ beskrivs på annat håll (Goffredi et al. 2006; Roman m.fl. 2007; Jones m.fl. 2008 )............................................................................................................................ För vår studie har hela vattenprover (400 till 1000 ml för HAB-matriser) bearbetats och avbildats enligt Greenfield et al. (2006) med följande ändringar: konjugatet späddes 1:5000 med S/D/B under 2006 men under 2007 normaliserades konjugatet till en referensaktivitet enligt ovan och tvättbufferten ersattes med Western Blocking Solution. Kort efter insamling av ett vattenprov för HAB-matrisen samlade och bevarade ESP ytterligare 50 ml alikvot. Vid hämtning av ESP, arkiverade prover quartered och bearbetas för FISH efter Greenfield et al. (2006). Arkiverade prover kan lagras för upp till ~1 mo utan förlust av signal i en FISH analys (Miller och Scholin 2000). Fluorescein-märkta oligonukleotider som används i denna studie listas i tabell 1. Mark threaking ESP genererade data-Resultat av HAB array och FISH analyser från ESP-arkiverade prover jämfördes mot laboratorieversioner av samma typer av analyser med hjälp av vattenprover som samlats in manuellt nära ESP och, om möjligt, sammanfaller med instrumentprovtagning. För att samla in prover manuellt, satte vi en davit med en handmanövrerad vinsch på en Boston valfångare; detta gjorde det möjligt att distribuera en profilering CTD och två 5 L Niskin flaskor på cirka 5 m och 7 m djup. Vattenprover återfördes till laboratoriet inom 1 timme och kombinerades sedan till en djupintegrerad total volym på 10 liter. Eftersom våra distributioner omfattade tre typer av DNA-sondsystem (bakterier, invertebrate larver, HABs), en DNA-matris per dag, sammanföll inte alltid provtagningsdatum med datum då ESP-bearbetade HAB-matriser. Den manuella provbearbetningen skedde enligt följande. Vid återkomsten till laboratoriet koncentrerades vatten (upp till 1000 ml, provvolymen matchade ESP-provvolymen när så var möjligt) på ett hydrofilt filter av porstorleken 0,65 μm i replikat av 4 eller fler. Triplicerade filter bearbetades omedelbart med hjälp av 96-hålsplattan SHA (Greenfield et al. 2006 ; tabell 1 ). Upprepade filtrerade prover lagrades i flytande kväve tills det behövdes. Prover har samlats in för FISH i 10 ml alikvoter (n = 9–12), sedan filtrerats och bearbetats med ett 13 mm filtreringsrör enligt Scholin (1998, 2000). För DA samlades två prover på 400 ml vardera på en porstorlek på 0,65 μm hydrofila Duraporemembran och lagrades i flytande kväve tills det extraherades och analyserades. DA var ) blandades 9:1 (v/v) med en kaninpolyklonal anti-DA antikropp utspädd i HBS-EP buffert (1:300, v/v; GE HealthcareBiacore). Varje prov/antikroppsblandning injicerades (150 μL vid 25 μL min -1) på ett CM5-sensorchip (GE Healthcare-Biacore) innehållande immobiliserad DA. Antikropp som inte var bunden av DA i lösning var bunden till chip ytan orsakar en förändring i refraktionsindex. Kvantifieringen baserades på en kalibreringskurva beredd med hjälp av DA-certifierat referensmaterial (Inst. för marin biovetenskap) och från 1 × 10 -3 till 1 × 10 4 ng DA ml -1. DA koncentrationer i varje prov beräknades med hjälp av Biacore Q och GraphPad Prism (v. 4) programvara. Fjärrdetektering av HAB-arter med hjälp av ESP: 2006-Baserat på laboratorieförsök som använde stöd för Predatormatrisen före 2006 års fältsäsong, var P. australis känt för att uppvisa ett förutsägbart samband mellan cellkoncentration och sondmatrissvar mellan 2 × 10 3 till 6,4 × 10 4 celler ml -1 lysat (Greenfield et al. 2006).................................................................. Det var också känt att HAB-matriserna kunde användas för att upptäcka P. multiseries/pseudodelicatissima, A. catenella och H. akashiwo (t.ex. Scholin et al. 2008), men förhållandet mellan sondens reaktivitet och organismens överflöd var inte väl karakteriserat innan fältoperationer inleddes. Råpoängen för att tolka artnärvaro och relativ förekomst baserat på HAB-matriserna togs som signal för en given fångstsond minus bakgrund, mätt med CCD-antal. Signaler från fångstsonder som inte var signifikant högre än bakgrunden (ANOVA, singelfaktor, α = 0,05) eller som var mindre än bakgrunden registrerades som icke-detekterbara. Av alla DNA-sonder på HAB-matrisen ansågs endast P. australis-testet potentiellt kvantitativt med tanke på den etablerade standardkurvan (Greenfield et al. 2006).................................................................. Under 2006 års fältförsök uppvisade ytvattnets temperatur en allmän uppvärmningstrend 16 mars till 23 april, men låg mellan 11 °C och 14.6 °C (Fig. 1a).............................................................................................. Salinitet varierade mellan 22.90. och 33.15, men var typiskt ~33. med undantag för en regn händelse under den första veckan i april (Fig.  1b)................................................................................................ Resultat av HAB matriser med hjälp av Predator array stödmembran under Deployment 1 visade att signal intensi- band för alla fyra fånga sonder var under bakgrundsnivåer för båda HAB array datum (Fig. 2a)................................................................................................ Under utplacering 2 uppvisade HAB-matriserna en svag positiv signal för Het1 (H. akashiwo) den 10 april, men negativa signaler för alla andra infångningssonder. Den 18 april och den 21 april upptäcktes positiva signaler för Het1, auD1 (P. australis) och muD2 (P. multiseries/pseudodelicatissima). NA1-sonden (A. catenella) gav ingen positiv signal vid något provtagningsdatum. Trender för detektion av HAB med 96-hålsplattan SHA följde vanligtvis trender som registrerats av ESP (Figs. 2a, b).............................................................................................. Dessa resultat baserades på en konservativ lägre detektionsgräns (LLD) på 0,094 vid A 450 endast för lysbuffert (studieintervall 0,052-0,094). Till exempel, 96-well plattan SHA gav negativa resultat för början av Deployment 1, sammanfaller med negativa HAB matriser. Under utplacering 2 observerades en liten positiv reaktion för Het1 (0,155 OD ± 0,011) den 10 april och den 18 april observerades positiva signaler för auD1, muD2 och Het1, liknande matrisformatet. Uppskattningar av P. australis-nivåer kan dras från 96-hålsplattan SHA-värden med hjälp av tidigare rapporterade standardkurvor (Greenfield et al. 2006).................................................................. Mängderna varierade från under detektionsgränsen (10, 13 april) till högst ~1,3 × 10 4 celler L -1 den 21 april vilket motsvarar ett SHA-värde på 96 brunnsplattan på 0,167 OD ± 0,032 SE. Trender i cellmängd med hjälp av FISH för prover arkiverade med hjälp av både ESP, och fältprover som samlats in manuellt och bearbetats med hjälp av filtreringsgrenröret metoder var liknande under båda installationerna (Fig. Denna förordning träder i kraft den tjugonde dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning. Även om de totala uppskattningarna varierade mellan de två FISH-metoderna med upp till en faktor på 2, kunde denna diskrepans förklaras av att skattningarna av celltätheten låg under den fastställda, tillförlitliga lägre detektionsgränsen vid alla provtagningsdatum (Miller och Scholin 1998; Greenfield et al. 2006).................................................................. Vissa skillnader uppstod dock mellan ESP-genererade resultat och data från rutinmässig vattenprovtagning. Till exempel, en positiv signal detekterades för sonden NA1 den 18 och 21 April med hjälp av 96-well plattan, men HAB array resultat var negativa. Sådana observationer var inte helt oväntade eftersom var och en innebär ett i grunden olika sätt att få prov. ESP drar i vatten genom ett enda intag på ett fast djup under en period av upp tõ 1 h, och provet intag djup kan variera på grund av tidvatten och ström. Dessutom samlas prov som arkiverats för FISH med hjälp av ESP ~1 h efter att ha förberett det föregående provet för en motsvarande uppsättning. Däremot gjordes manuella provsamlingar i allmänhet medan ESP samlade in ett prov för SHA. De 5 L Niskin flaskorna trippades ungefär 5 m och 7 m från ytan, och dessa vattenprover kombinerades vid återkomsten till laboratoriet. Provet 10 L representerar således en integrerad vattenvolym från en diskret tidsram på två djup. Som en följd av detta är prov som samlas in av ESP och de som samlas in manuellt aldrig direkt "matchade;" skillnader i fytoplankton gemenskap struktur mellan de två provtagningsmetoderna är därför möjliga. Detta problem förstods, men det enda sättet att få riktigt matchade prover var för dykare att samla in en motsvarande volym vatten från nära ESP intag under samma tidsperiod som instrumentet var provtagning. Detta var inte möjligt under denna studie så vi var tvungna att förlita oss på fartygsbaserade samlingar; därför var potentiella skillnader mellan ESP och manuellt insamlade prover oundvikliga. Icke desto mindre kan de allmänna trender som observerats med instrumentet bekräftas kvalitativt genom att diskreta prover returneras till laboratoriet. Domosyra (DA) upptäcktes från manuella samlingar på alla HAB provtagningsdatum för Deployment 2, men var lägst (4,7 ng ml -1 ) den 13 april, samtidigt med negativa resultat på 96-brunnsplattan SHA för Pseudo-nitzchia spp. (Fig. 2b,e).......................................................................................................... DA var högst mot slutet av utplaceringen, och detta sammanföll med HAB array detektion av Pseudo-nitzschia spp. (Fig. 2a,e).......................................................................................................... Analysprestanda efter övergången till nya membranstöd och analyskemi-Pall Corporation avbröt produktionen av Predatormembranet 2006, så ytterligare fält- och laboratoriestudier med hjälp av detta stöd avslutades. För att bedöma tillämpligheten av ersättningsmembranet, Optitran BA-S 83, genererades standardkurvor för både 96-brunnsplattan och ESP-matrisen SHA-format med hjälp av odlade representanter för målarten HAB (Fig. 3)............................................................... De använda cellkoncentrationerna återspeglade intervall som antingen ligger på eller under nivåer som vanligen anses hotfulla vid en vattenprovvolym på 400 ml och lysatvolym på 2 ml. Till exempel utgör DA produktion av P. australis och P. multiseries i allmänhet inte hälsorelaterade eller ekologiska hot i överflöd < 2,5 × 10 4 celler L -1: 2006-2007 673 Bild. 3............................................................... SHA-standardkurvor med användning av både 96-brunnars bänkprov (n = 5 replikerade brunnar ± SE) och HAB-matrisens punktintensitet (n = 8 matrisfläckar ± SE) för A. catenellasond NA-1 (A), P. australis sond auD1 (B), P. multiseries/pseudodelicatissima sond muD2 (C), P. multiseries sond muD1 (D) och H. akashiwo sond Het1 (E). Observera skillnaden i dynamiskt intervall (y-axes) mellan mål. (Tyrrell m.fl.) År 2002).................................................................................................. Förhållandena mellan cellkoncentrationerna med användning av båda SHA-formaten var statistiskt signifikanta och i hög grad korrelerade (ANOVA, en faktor, α = 0,05; Bild. Denna förordning träder i kraft den tjugonde dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning. Båda analysformat gav ett linjärt svar på ett ökande antal målceller som räknas upp med hjälp av mikroskopi, så direkt jämförelse mellan 96-well plattan och ESP SHA array format kan göras för matchade prover. Även om känsligheten och det dynamiska intervallet skilde sig avsevärt mellan DNA-sonder, har de flesta sonder gjort det möjligt att upptäcka celldensiteter som, inom en laboratoriemiljö, ligger inom de områden som är relevanta för människors hälsa och viltvård. Förvånansvärt nog visade P. multiseriesond muD1 en lägre detektionsnivå i HAB-matrisen än 96-hålsplattan SHA (Fig. 3d)................................................................................................. Historiskt anses muD1 vara en svagt reagerande sond i både SHA- och FISH-format i förhållande till muD2, som riktar sig både till P. multiseries och P. pseudodelicatissima (Scholin et al. 1999; Miller och Scholin 2000).............................................................. I vår studie, skillnaden mellan muD1 och muD2 var särskilt tydlig eftersom alla experiment använde samma P. multiserie lysat och båda fånga sonder. Till exempel, P. multiserie (5 × 10 6 celler väl -1 ) muD2 var ovanför den linjära delen av kurvan, här operativt definieras som OD ~0.1 till 3,0, men att samma lysat var inom det linjära intervallet av muD1 (Figs. Denna förordning träder i kraft den tjugonde dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning. Vid ≤ 6,25 × 10 3 celler brunn -1, P. multiserie upptäcktes inte av muD1 med hjälp av 96-well plattan, men var detekterbara i HAB array. Däremot upptäcktes sådana låga koncentrationer i båda SHA-formaten genom muD2. Dessa observationer tyder på att den bästa användningen för muD1 kan vara att avgöra om muD2 är inriktad P. multiseries eller P. pseudodelicatissima i HAB-matrisen när målarten förekommer i lågt antal. MuD1 är sannolikt endast effektiv kvantitativt i 96-well plattan SHA när P. multiseries rRNA innehåll i cellulära homogenater överstiger den linjära delen av kurvan för muD2, såsom under blomningar. Array-to-array variabilitet och reproducerbarhet av SHA bedömdes med hjälp av A. catenella som en representativ art. Mål lysat koncentrationer representerade höga, medelstora och låga nivåer som 500, 125, och 31 celler väl -1, respektive (Fig. 4)................................................................. Vissa array-till-array variabilitet hittades, och 96-well plattan format verkade något känsligare för små förändringar i A. katanella densiteter än gjorde HAB array. Icke desto mindre fann man en stark korrelation mellan HAB-matrisens spotintensitet och cellulär lysatkoncentration (R 2 = 0,9686; Bild. 4 ), och denna korrelation var mycket signifikant (ANOVA, en faktor, α = 0, 05, P < 0, 001). En del av sondens korsreaktivitet observerades i DNA-matrisen SHA-format när proverna hade höga koncentrationer av Pseudonitzschia spp. (Tabell 2 ).............................................................................................................. Som jämförelse observerades ingen korsreaktivitet hos HAB när matriser presenterades med prover som innehöll höga koncentrationer av A. catenella eller H. akashiwo. I 96-hålsplattan SHA-format observerades ingen korsreaktivitet för någon sond när icke-målarter var närvarande vid den högsta koncentration som användes på motsvarande standardkurva. Dessa resultat indikerar att falskt positiva signaler för vissa Pseudo-nitzschia spp. kan returneras av ESP under blandade Pseudo-nitzschia spp. blommar och tyder på att ytterligare analysförfining kan vara nödvändig. Detta förstärker också behovet av att karakterisera ESP empiriskt och fastställa hur detektionsmetoden fungerar i en. Cirklarna representerar replikat (n = 3) matriser, och fel barer representerar SE av CCD antal per matris. Tabell 2............................................................................................... Matrix för korsreaktivitet som observeras medan man genererar standardkurvor med hjälp av ESP-matriser Capture-sond på ESP-matrisen avser sond som uppvisade korsreaktivitet och lysatmål avser fångstsond som motsvarar art homogenat. +++ = korsreaktivitet som observerats vid de tre översta cellulära lysatkoncentrationerna, ingen korsreaktivitet som observerats vid lägre koncentrationer; ++ = korsreaktivitet som endast observerats vid de högsta två cellulära lysatkoncentrationerna; + = korsreaktivitet som endast observerats vid de högsta cellulära lysatkoncentrationerna; -= ingen korsreaktivitet för någon cellulär lysatkoncentration; N/A = ej tillämpligt.
Greenfield m.fl. har utvecklat en robotplattform för att utföra laboratorie-typ mätningar av alger i fältet REF.
Field applications of the second-generation Environmental Sample Processor (ESP) for remote detection of harmful algae: 2006-2007
{'venue': None, 'journal': 'Limnology and Oceanography-methods', 'mag_field_of_study': ['Chemistry']}