4 2 1 a n a ly s i s Storskalig encellig RNA-sekvensering (scRNA-seq) datauppsättningar som produceras i olika laboratorier och vid olika tidpunkter innehåller batcheffekter som kan äventyra integration och tolkning av data. Befintliga scRNA-seq analysmetoder felaktigt antar att sammansättningen av cellpopulationer är antingen känd eller identisk över partier. Vi presenterar en strategi för satskorrigering baserad på upptäckt av ömsesidiga närmaste grannar (MNN) i det högdimensionella uttrycksområdet. Vårt tillvägagångssätt är inte beroende av fördefinierade eller lika populationssammansättningar över omgångar, utan det kräver bara att en delmängd av befolkningen delas mellan omgångar. Vi visar överlägsenheten av vår strategi jämfört med befintliga metoder genom att använda både simulerade och verkliga scRNA-seq dataset. Med hjälp av flera droplet-baserade scRNA-seq dataset, visar vi att vår MNN batch-effect-korrigering metod kan skalas till ett stort antal celler. Den minskande kostnaden för scRNA-seq experiment [1] [2] [3] [4] har uppmuntrat inrättandet av storskaliga projekt som Human Cell Atlas, som profilerar transkriptomer av tusentals till miljontals celler. För sådana stora studier kräver de logistiska begränsningarna oundvikligen att data genereras separat, dvs. vid olika tidpunkter och med olika operatörer. Data kan också genereras i flera laboratorier med hjälp av olika celldelnings- och hanteringsprotokoll, biblioteksprepareringsteknik och/eller sekvenseringsplattformar. Alla dessa faktorer resulterar i satseffekter 5, 6, där uttrycket av gener i ett parti skiljer sig systematiskt från det i ett annat parti. Sådana skillnader kan dölja underliggande biologi eller införa falska struktur i uppgifterna; därför, för att undvika vilseledande slutsatser, måste de korrigeras innan ytterligare analys. De flesta befintliga metoder för satskorrigering baseras på linjär regression. Limma paketet ger bort BatchEffect funktion 7, som passar en linjär modell som innehåller en blockerande term för satsstrukturen till uttrycksvärdena för varje gen. Därefter är koefficienten för varje blockerande term inställd till noll, och uttrycksvärdena beräknas från de återstående termerna och resterna, vilket ger en ny uttrycksmatris utan batcheffekter. ComBat metod 8 använder en liknande strategi men utför ett ytterligare steg som involverar empiriska Bayes krympning av den blockerande koefficienten uppskattningar. Detta förfarande stabiliserar skattningarna i närvaro av begränsade replikat genom att dela information mellan gener. Andra metoder, såsom RUVseq 9 och svaseq 10, används också ofta för satskorrigering, men deras fokus är främst på att identifiera okända faktorer för variation, till exempel de på grund av oregistrerade experimentella skillnader i cellbearbetning. Efter att dessa faktorer identifierats, kan deras effekter regresseras ut som beskrivits tidigare. Befintliga satskorrigeringsmetoder var speciellt utformade för bulk RNA-seq. Således, deras tillämpning på scRNA-seq data är baserad på antagandet att sammansättningen av cellpopulationen inom varje parti är identisk. Alla systematiska skillnader i genomsnittliga genuttryck mellan partier tillskrivs tekniska skillnader som kan regresseras ut. I praktiken är dock populationssammansättningen vanligtvis inte identisk i satser i scRNA-seq-studier. Även om samma celltyper är närvarande i varje parti, överflöd av varje celltyp i datamängden kan ändras beroende på subtila skillnader i förfaranden såsom cellkultur eller vävnadsextraktion, dissociation och sortering. De uppskattade koefficienterna för batchblockeringsfaktorerna är därför inte enbart tekniska utan innehåller en icke-noll biologisk komponent på grund av skillnader i sammansättning. Partikorrigering baserad på dessa koefficienter skulle således ge felaktiga representationer av cellulära uttryck profiler, och resultaten kan potentiellt vara värre än om ingen korrigering utförs. En alternativ metod för datasammanslagning och jämförelse i närvaro av satseffekter använder en uppsättning landmärken från en referensdatauppsättning för att projicera nya data på referens 11, 12. Skälet till detta tillvägagångssätt är att en viss celltyp i referenspartiet kommer att vara mest lik celler av sin egen typ i det nya partiet. Sådana projektionsstrategier kan tillämpas genom att använda flera dimensionalitetsreducerande metoder, såsom huvudkomponentanalys (PCA) eller spridningskartor, eller genom att använda kraftbaserade metoder såsom t-distribuerade stokastiska granne inbäddning (t-SNE). Denna strategi beror på valet av landmärken i högdimensionellt utrymme plockat från referensdatamängden, som täcker alla celltyper som kan visas i de senare satser. Om de nya partierna inkluderar celltyper som faller utanför det transkriptionella utrymme som utforskas i referenspartiet, kommer dessa celltyper inte att projiceras till en lämplig position i det utrymme som definieras av landmärkena (kompletterande anmärkning 1). 4 2 2 VOLYM 36 ANTAL 5 MAJ 2018 naturbioteknik a n a ly s i s Här föreslår vi en ny metod för att avlägsna avvikelser mellan biologiskt besläktade satser beroende på förekomsten av MNN mellan satser, som anses definiera de mest likartade cellerna av samma typ över satser. Skillnaden i uttrycksvärden mellan celler i ett MNN-par ger en uppskattning av batcheffekten, som görs mer exakt genom medelvärden för många sådana par. En korrigeringsvektor erhålls från den uppskattade satseffekten och appliceras på uttrycksvärdena för att utföra satskorrigering. Vår strategi identifierar automatiskt överlappningar i populationssammansättningen mellan partier och använder endast överlappande undergrupper för korrigering, vilket undviker antagandet av lika sammansättning som krävs av andra metoder. Vi visar att vårt tillvägagångssätt överträffar befintliga metoder på en rad simulerade och verkliga scRNA-seq datamängder som involverar olika biologiska system och teknologier. RESULTAT Vårt tillvägagångssätt identifierar celler som har ömsesidigt likartade uttryck profiler mellan olika experimentella partier eller replikat. Vi drar slutsatsen att eventuella skillnader mellan dessa celler i den högdimensionella genuttrycksrymden drivs av batcheffekter (dvs tekniska skillnader som induceras av operatören eller andra experimentella artefakter) och inte representerar den underliggande biologin av intresse. Vi noterar att vår definition av en satseffekt också kan innehålla vissa signaler som drivs av biologiska egenskaper som inte är av intresse (till exempel, interprovskillnader på grund av genotyp). Efter korrigering kan flera partier "sammanfogas" till en enda datauppsättning (Fig. 1).................................................................. Det första steget i vår metod innebär global skala av data genom en cosinus normalisering. Mer exakt, om Y x är uttrycket vektor för cell x, definierar vi cosinus normalisering som: Därefter beräknar vi Euclidean avstånd mellan cosinonormalized uttryck profiler av par av celler. Beräkna Euclidean avstånd på dessa normaliserade data är likvärdigt med att använda cosinus avstånd på de ursprungliga uttrycken värden (kompletterande anmärkning 2). Cosinusavstånd har i stor utsträckning använts för att mäta celllika likheter enligt uttrycksprofiler 11, [13] [14] [15] och är tilltalande eftersom de är skaloberoende 15 och därmed robusta till tekniska skillnader i sekvensering djup och fånga effektivitet mellan satser. Nästa steg är att identifiera varandras närmaste grannar. Överväg ett scRNA-seq-experiment bestående av två satser 1 och 2. För varje cell i 1 i batch 1, vi hittar k celler i batch 2 med de minsta avstånden till i 1, dvs, dess k närmaste grannar i batch 2. Vi gör samma sak för varje cell i batch 2 för att hitta sina k närmaste grannar i batch 1. Om ett par celler från varje parti finns i varandras uppsättning av närmaste grannar, dessa celler anses vara ömsesidigt närmaste grannar (Fig. 1).................................................................. Vi tolkar dessa par som innehållande celler som tillhör samma celltyp eller tillstånd trots att de genereras i olika partier. Därför bör alla systematiska skillnader i uttrycksnivå mellan celler i MNN-par representera batcheffekten. Vår användning av MNN par innebär tre antaganden: (i) det finns minst en cell population som finns i båda satser, (ii) batch effekten är nästan ortogonal till den biologiska subrymden, och (iii) batch-effekt variation är mycket mindre än den biologiska-effekt variationen mellan olika celltyper (mer detaljerad diskussion av dessa antaganden i kompletterande anmärkning 3). Den biologiska subrymden avser en uppsättning grundvektorer som representerar biologiska processer; längden på varje vektor är lika med antalet gener. Till exempel kan några av dessa vektorer representera cellcykeln; vissa vektorer kan (1) (1) definiera uttryck profiler som är specifika för varje celltyp; och andra vektorer kan representera differentiering eller aktiveringstillstånd. Den sanna uttrycksprofilen för varje cell kan uttryckas som den linjära summan av dessa vektorer. Samtidigt representeras batcheffekten av en vektor av längd som är lika med antalet gener, som läggs till uttrycksprofilen för varje cell i samma batch. Enligt våra antaganden är det enkelt att visa att celler från samma population i olika partier kommer att bilda MNN par (kompletterande not 4). Detta antagande kan mer intuitivt förstås genom att celler från samma population i olika omgångar bildar parallella hyperplan med avseende på varandra ( Bild. 1).................................................................. Vi noterar också att ortogonalitet antagande är svag för en slumpmässig endimensionell batch-effect vektor i högdimensionella data, särskilt med tanke på att lokala biologiska subrymder vanligtvis har mycket lägre inneboende dimensionalitet än det totala antalet gener i datamängden. För varje MNN-par beräknas ett parspecifikt partikorrigeringsvektor som vektorskillnaden mellan uttrycksprofilerna för de parade cellerna. Även om en uppsättning biologiskt relevanta gener (t.ex. mycket varierande gener) kan underlätta identifieringen av MNN, behöver beräkningen av batchvektorer inte utföras i samma utrymme. Därför kan vi beräkna batchvektorerna för en annan uppsättning undersökningsgener (kompletterande not 5). En cellspecifik © 2018 Nature America, Inc., en del av Springer Nature. Alla rättigheter förbehållna. natur bioteknik Volume 36 ANTAL 5 MAJ 2018 4 2 3 a n a ly s batch-korrigering vektor beräknas sedan som ett vägt genomsnitt av dessa par-specifika vektorer, som beräknas med en Gaussian kärna. Detta tillvägagångssätt stabiliserar korrigeringen för varje cell och säkerställer att den förändras smidigt mellan angränsande celler i det högdimensionella uttrycksutrymmet. Denna Gaussian utjämning av batch vektorer möjliggör en lokalt linjär sats korrigering; d.v.s. varje MNN-par batch vektor bidrar till batch effekten för celler i närheten av motsvarande par inom varje batch. En sådan lokalt linjär korrigering av batcheffekterna resulterar i en övergripande korrigering som kan tolerera icke-konstanta batcheffekter (kompletterande bild. 1 )............................................................................................................... Vi betonar att denna korrigering utförs för alla celler, oavsett om de deltar i ett MNN-par. Således kan korrigering utföras på alla celler i varje parti, även om de inte har en motsvarande celltyp i de andra partierna. Vi genererade simulerade data för ett enkelt scenario med två satser av celler, var och en bestående av varierande proportioner av tre celltyper (Online Methods). Vi tillämpade var och en av tre batch-korrigeringsmetoder-vår MNN-baserad korrigeringsmetod, limma och ComBat-till simulerade data, sedan utvärderade resultaten genom att inspektera t-SNE tomter 16 (Online Metoder). Korrekt avlägsnande av batcheffekten bör resultera i bildandet av tre kluster, en för varje celltyp, så att varje kluster innehåller en blandning av celler från båda tillverkningssatserna. Men vi observerade detta ideala resultat först efter MNN korrigering (Fig. 2).................................................................. Uttrycksdata som inte korrigerats eller korrigerats med de andra metoderna visade minst en kluster innehållande celler från endast ett parti, vilket tyder på att batcheffekten inte helt avlägsnades. Detta resultat beror helt och hållet på skillnaderna i befolkningssammansättning, som diskuterats tidigare. Upprepa simuleringen med identiska proportioner av alla celltyper i varje parti gav likvärdiga prestanda för alla metoder (kompletterande bild. 2 )............................................................................................................... För att visa tillämpligheten av vår metod på verkliga data, vi övervägde två hematopoetiska datamängder som genereras i olika laboratorier genom två olika scRNA-seq protokoll. I den första datauppsättningen 12 använde författarna SMART-seq2-protokollet 17 för att profilera enskilda celler från hematopoetiska stam- och stamcellspopulationer i 12 veckor gamla honmöss. Med hjälp av marköruttrycksprofiler från fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) tilldelade vi retroaktivt kända celltypers etiketter till celler (Online Methods). Dessa etiketter inkluderade multipotenta stamceller, lymfoida, multipotenta stamceller, hematopoetiska stamceller och stamceller, hematopoietiska stamceller, vanliga myeloida stamceller (CMP), granulocyt-monocyter (GMP) och megakaryocyt-erytrocyter (MEPs). I den andra datauppsättningen 18 använde författarna det massivt parallella protokollet för encellig RNA-sekvensering (MARS-seq) för att bedöma encells heterogenitet i myeloida stamceller från 6-8 veckor gamla honmöss. Igen, indexerade FACS användes för att tilldela en cell-typ etikett (MEP, GMP eller CMP) till varje cell. För att bedöma prestanda, utförde vi t-SNE dimensionalitetsreduktion på uttrycksdata för de mycket varierande generna, före och efter korrigering med var och en av de tre metoderna (MNN, limma och ComBat) (Fig. 3a-d och online-metoder). Endast MNN-korrigering sammansmälte korrekt de celltyper som delades mellan partier, dvs. CMP, EP och GMP, samtidigt som den underliggande differentieringshierarkin 12, 18 (Fig. 3e)........................................................................................................... De delade celltyperna däremot fortfarande grupperade efter batch efter korrigering med limma eller ComBat, vilket tyder på att batcheffekten inte helt hade avlägsnats (färgning efter batch i Kompletterande bild. Denna förordning träder i kraft den tjugonde dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning. Detta resultat kan hänföras till skillnaderna i celltypsammansättning mellan satser och överensstämmer med simuleringsresultaten. För att säkerställa att dessa resultat inte berodde på en idiosynkronisering av t-SNE-metoden upprepade vi vår analys med en alternativ dimensionsreduktionsmetod (PCA) där endast celltyperna används gemensamt mellan de två satserna (bild. 3f-i).......................................................................................................... Bland metoderna var MNN-korrigeringen fortfarande den mest effektiva när det gäller att avlägsna batcheffekten. Som en motivering till den ortogonala effekten av batcheffekten på det biologiska hyperplanet presenterar vi ett histogram av vinkeln mellan de batchvektorer som beräknats av MNN och de två första enskilda värdedekompositionskomponenterna i det referensparti som används i MNN (dvs. datamängden SMART-seq2). De flesta vinklar är nära 90°, vilket stöder nästan-ortogonalitet antagande ( Kompletterande bild. 3e)........................................................................................................... En spridningskarta 19 av de MNN-korrigerade uppgifterna (Supplementary Bild. 3f-h) visar samma differentiering hierarki av celltyper som i figur 3e. Upprepar samma analys på en subgrupp av slumpmässigt provtagna gener (1.500 av totalt 3904 högvariabla gener) gav liknande resultat, vilket visar robustheten i vår analys med avseende på den ingående genuppsättningen (kompletterande bild). Fyra )............................................................................................................ Vi testade vidare vår metods förmåga att kombinera mer komplexa datamängder som genererats genom en mängd olika metoder. Här fokuserade vi på bukspottkörteln eftersom det är en mycket heterogen vävnad med flera väldefinierade celltyper. Vi kombinerade scRNA-seq data på humana pankreasceller från fyra olika offentligt tillgängliga datauppsättningar 20-23 genererade genom två olika scRNA-seq protokoll (SMART-seq2 och scRNA-seq av multiplexed linjär förstärkning (CEL-seq) / CELseq2). Celltypsetiketter togs från de medföljande metadata eller härleddes enligt den metod som beskrivs i den ursprungliga publikationen (ytterligare uppgifter om förbehandling av data i onlinemetoder). © 2018 Nature America, Inc., en del av Springer Nature. Alla rättigheter förbehållna. 4 2 4 VOLYM 36 ANTAL 5 MAJ 2018 nature biotechnology a n a ly s Vi tillämpade MNN, limma och ComBat på den kombinerade datamängden och undersökte de korrigerade uppgifterna. Alla tre tillverkningssats-korrigeringsmetoder förbättrade grupperingen av celler genom deras cell-typ etiketter (Fig. 4a,b, Online metoder och kompletterande bild. 5a-d).............................................................. Detta resultat är inte förvånande, eftersom skillnaden mellan celltyp sammansättning i de fyra satser var blygsam (kompletterande tabell 1). Men även en liten skillnad i sammansättning var tillräcklig för att orsaka ductal och acinar celler felaktigt separeras efter korrigering med limma eller ComBat. Som en jämförelse grupperades båda celltyperna konsekvent över satser efter MNN-korrigering, i överensstämmelse med simuleringsresultaten. För att bestämma effekten av korrigering på kvaliteten på celltypbaserad klusterbildning bedömde vi klusterseparation genom att beräkna den genomsnittliga siluettbredden för varje celltyp (Supplementary Fig. 5 och online-metoder). Den genomsnittliga siluettkoefficienten efter MNN-korrigeringen var betydligt större än den i okorrigerade och limma- och ComBat-korrigerade data (P < 0:05, tvåsidiga Welchs t-test). MNN-korrigering kan således minska variansen mellan partierna inom varje celltyp samtidigt som skillnaderna mellan celltyper bevaras. Vi beräknade också entropi av blandning (Online Methods) för att kvantifiera omfattningen av sammansmältning av celler från olika satser. De data som korrigerades i batch med MNN visade högre blandningsentropi än de okorrigerade uppgifterna och uppgifterna korrigerades med limma eller ComBat (Supplementary Fig. Denna förordning träder i kraft den tjugonde dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning. Förbättringen av blandningen av tillverkningssatser observerades i det reducerade utrymme som erhölls genom antingen t-SNE eller PCA (kompletterande bild. 5e-l)........................................................................................................... Vi stödde återigen vårt antagande att batcheffekterna är tillräckligt avlägsnade när de ligger ortogonalt till den biologiska subrymden (Supplementary Fig. 5m-o).......................................................................................................... Den observerade strukturen i bukspottkörtelns data var robust i förhållande till storleken på den ingående genuppsättningen, vilket visas genom slumpmässig subsampling av den totala mycket varierande genuppsättningen (kompletterande bild. 6 ) och 6 )............................................................................................................... Efter partikorrigering utförs kan de korrigerade uttrycksvärdena användas i rutinmässiga nedströmsanalyser såsom klusterering före differentialgenuttrycksidentifiering. För att ge en demonstration, använde vi MNN-korrigerad uttryck matris till samtidigt klusterceller från alla fyra pankreas datamängder. Våra nya klusteretiketter stämde överens med de tidigare celltypsuppdragen baserade på de enskilda serierna, med ett justerat Rand-index på 0,94 (ett Rand-index på 0 motsvarar en slumpmässig tilldelning, medan ett Rand-index på 1 betecknar en perfekt matchning mellan tidigare och nya uppdrag). Viktigt nog fick vi kluster för alla partier i ett enda klustersteg. Detta förfarande garanterade att klusteretiketterna var direkt jämförbara mellan celler i olika partier. Om klusterbildning däremot hade utförts separat i varje parti, skulle det inte ha funnits någon garanti för att en (svagt separerad) kluster som upptäckts i ett parti skulle ha haft en direkt motsvarighet i ett annat parti. © 2018 Nature America, Inc., en del av Springer Nature. Alla rättigheter förbehållna. nature biotechnology VOLUME 36 ANTAL 5 MAJ 2018 4 2 5 a n a ly s i s Vi använde våra nya kluster för att utföra en differential expressionsanalys mellan deltaholmsklustret och gammaholmsklustret. Med hjälp av celler från alla partier upptäckte vi 76 differentialt uttryckta (DE) gener med en falsk upptäcktsfrekvens (FDR) på 5% (Fig. 4c)................................................................................................ Denna uppsättning inkluderade markörgener för cellerna som ingår i analysen (PPY och SST), gener som är involverade i utvecklingen av pankreasisletsceller (PAX6) och gener som nyligen inblandats i deltaisletfunktionen och utvecklingen av typ 2-diabetes (CD9 och HADH) 22. Som jämförelse upprepade vi differentialuttrycksanalysen genom att endast använda celler från varje parti där båda celltyperna var närvarande [20] [21] [22]. Resultaten gav endast 12, 49 respektive 51 gener vid en FDR på 5%, vilket omfattade 14, 5-57,9% av de som upptäcktes när alla celler användes (Fig. 4d)................................................................. Sammanfogning av datamängder är fördelaktigt eftersom det ökar antalet celler utan att kräva ytterligare experimentellt arbete, förbättrar statistisk kraft för nedströmsanalyser såsom differentialgenuttryck och ger därmed ytterligare biologiska insikter. I detta syfte är vår MNN-strategi av avgörande betydelse eftersom den säkerställer att sammanslagningen genomförs på ett enhetligt sätt. Tillkomsten av droplet-baserade cellfångning, lys, RNA omvänd transkription och efterföljande uttryck profilering av sekvensering har gjort det möjligt att skala upp till tiotals och hundratusentals celler 2, 3, 24. Dessa tekniker är idealiska för att testa skalbarheten och tillämpligheten av vår korrigeringsmetod för stora scRNA-seq dataset. Vi tillämpade specifikt vår MNN tillvägagångssätt till två stora datauppsättningar av droplet-baserad scRNA-seq härledd från den kommersiella 10X Genomics krom plattform 24. Vi valde datauppsättningar bestående av en blandning av cellidentiteter och komplexiteter, nämligen 68 000 perifera mononukleära blodceller (PBMC) och 4 000 T-celler från olika donatorer. PBMC innehåller en miljö av perifera adaptiva och medfödda immunvita blodkroppar som cirkulerar genom den humana vaskulaturen, medan perifera T-celler innehåller en blandning av naiva och antigenexponerade lymfocyter involverade i aktiv immunövervakning. En naiv sammanslagning av dessa två datamängder utan redovisning av batcheffekter illustrerade separationen av T-cellerna från deras motsvarigheter i PBMC-data (Fig. 5a b)................................................................................................ Kombinationen av dessa två datamängder med hjälp av MNN visade att de separata perifera T-celler som kartlagts till undergrupperna av T-celler i PBMC-blandningen (Fig. 5c,d)................................................................................................ Viktigt är att andra perifera lymfocytrelationer inte förvanskades genom den korrigering som tillämpades, trots frånvaron av MNN i T-cellsdatamängden (Fig. 5c)........................................................................................................... Särskilt 4, 44/44,459 (99,7%) av de enskilda T-celler som kartlagts på deras lämpliga motsvarigheter i PBMC-datamängden (Fig. 5).................................................................. Resterande 13/4.459 (0,3%) kartlades främst till en liten klunga av okänd onogeni och till kanterna på en stor klunga av monocyter. Däremot kartlade 14 icke-T-celler (0,3%; specifikt monocyter) till T-cellkluster felaktigt. Eftersom storleken på encelliga uttrycksdatamängder ökar kommer det att finnas ett växande behov av beräkningsmetoder som kan skalas upp för att uppfylla dessa krav. För att visa skalbarheten av vår metod provade vi olika proportioner av celler från 68K PBMC-datauppsättningen, och korrigerade sedan batcheffekten mellan varje delprov och 4K T-cellsdata. Inom intervallet 7.000 till 70.000 celler, observerade vi Y-axeln representerar -log 10 BenjaminiHochberg-justerat P-värde (-log 10 P värden >100 censureras på 100 för jämförbara skalor), och x-axeln är log 2 faldig förändring av uttryck i gammaceller över deltaceller. Individuella gensymboler är märkta när "log 2 faldig förändring" > 3. Fler gener uttrycks konsekvent olika vid en FDR på 5 % i de kombinerade datamängderna. (d) Venndiagram som representerar skärningspunkten mellan DE-gener genom att använda celltypetiketterna efter satskorrigering (blå cirklar) och med hjälp av de ursprungliga celltypetiketterna från varje enskild studie (orange cirklar). Siffrorna i varje segment är det totala antalet DE-gener mellan delta och gamma-isletceller i varje parti. Varje Venn diagram motsvarar ett parti där båda celltyper finns. © 2018 Nature America, Inc., en del av Springer Nature. Alla rättigheter förbehållna. 4 2 6 VOLYM 36 ANTAL 5 MAJ 2018 naturbioteknik a n a ly s i s en ungefärlig linjär tidsförhöjning (Fig. 5e)............................................................................................................ Således är vår metod kompatibel med både karaktären av droplet-teknik-härledda encelliga uttrycksdata och omfattningen av nuvarande och framtida datamängder. Korrekt avlägsnande av satseffekter är avgörande för giltig dataanalys och tolkning av resultat. Detta avlägsnande är särskilt relevant som skalan och omfattningen av scRNA-seq experiment ökar, överskridande kapaciteten av datagenerering inom en enda sats. För att besvara relevanta biologiska frågor krävs sammanslagning av data från olika partier som genereras av olika protokoll, operatörer och/eller plattformar. Men för biologiska system som är mycket heterogena, sammansättningen av celltyper och tillstånd kommer sannolikt att skilja sig mellan partier, på grund av stokastisk och okontrollerbar biologisk variabilitet. Befintliga batchkorrigeringsmetoder svarar inte för skillnader i cellsammansättning mellan tillverkningssatser och lyckas inte helt ta bort batcheffekten i sådana fall. Detta misslyckande kan leda till vilseledande slutsatser där satsspecifika kluster felaktigt tolkas som skilda celltyper. Genom att använda både simulerade data och verkliga scRNA-seq dataset, visade vi att vår MNN metod kan framgångsrikt ta bort batcheffekten i närvaro av skillnader i sammansättning. Dessutom visade vi MNN-metodens skalbarhet på stora dropletbaserade datamängder. En förutsättning för vår MNN-metod är att varje parti måste innehålla minst en delad cellpopulation med ett annat parti. Detta krav är nödvändigt för en korrekt identifiering av MNN-par mellan partier. Batcher utan någon delad struktur är till sin natur svåra att korrigera, eftersom batcheffekterna är helt förbryllade av biologiska skillnader. Sådana fall ger en motivation för att använda en "cellkontroll", dvs. en lätt reproducerbar cellpopulation av känd sammansättning (från en cellinje, till exempel) som spikas in i varje prov i syfte att ta bort batcheffekter över prover. En anmärkningsvärd egenskap hos vår MNN korrigeringsmetod är att den justerar för lokala variationer i batcheffekter med hjälp av en Gaussian kärna. Vår metod kan därför tillgodose skillnader i storlek eller riktning av batcheffekten mellan olika cellsubpopulationer i högdimensionellt utrymme. Sådana skillnader hanteras inte lätt med metoder baserade på linjära modeller (eftersom de skulle kräva explicit modellering av fördefinierade grupperingar av celler, vilket skulle besegra syftet med att använda scRNA-seq för att studera population heterogenitet i första hand). Våra resultat för bukspottkörtelns datauppsättning tyder på att med tanke på celltypspecifika batcheffekter (standardinställningen av MNN) snarare än en globalt konstant batcheffekt för alla celler förbättrar batch-removal resultat (kompletterande bild. 7 ) och 7 )............................................................................................................... En viktig konsekvens är att en enda kontrollpopulation kanske inte räcker för en korrekt uppskattning av lokala satseffekter. I stället kan det vara nödvändigt att använda en lämpligt blandad population av celler för att korrekt redogöra för lokala variationer. Vi demonstrerade i simuleringar och verkliga dataset att MNN framgångsrikt kombinerar celler med samma cell-typ etikett, genom att föra celler från olika partier till ett gemensamt koordinatsystem som definieras av den första (referens) sats, så att alla partier kan analyseras tillsammans. MNN eliminerar därför avvikelser mellan besläktade satser utan analys eller tolkning av ursprunget och orsakerna till satsens effekter (mellan varje par satser). Det kan också vara intressant att studera de tekniska och biologiska orsakerna till dessa skillnader. Ett parti kan till exempel innehålla celler från ett geneknockout-experiment, och det andra partiet kan innehålla celler från en organism av vildtyp. I sådana fall skulle korrigeringsvektorerna (som tillhandahålls som en utgång av MNN-algoritmen) kunna undersökas för att förstå skillnaderna mellan satser. Batch korrigering spelar en kritisk roll i tolkningen av scRNAseq data från båda små studier, där logistiska begränsningar utesluter generering av data i ett enda parti, och stora studier som involverar internationella konsortier såsom Human Cell Atlas, där scRNA-seq data genereras för en mängd olika relaterade vävnader vid olika tidpunkter och av flera laboratorier. Vår MNN-metod är ett överlägset alternativ till befintliga metoder för satskorrigering i närvaro av kompositionsskillnader mellan satser. Vi förväntar oss att denna metod kommer att förbättra rigor av scRNA-seq dataanalys och därmed kvaliteten på de biologiska slutsatserna.
Slutligen, i biomedicinsk dataanalys, fokuserar ömsesidiga närmaste grannar (MNN) satskorrigering REF på familjer med många olika deformationer som ofta förekommer i biomedicinska data.
Batch effects in single-cell RNA-sequencing data are corrected by matching mutual nearest neighbors
{'venue': 'Nature Biotechnology', 'journal': 'Nature Biotechnology', 'mag_field_of_study': ['Biology', 'Medicine']}