Högt genomflöde sekvensering teknik är nu i allmänt bruk i biologi. Dessa teknologier producerar miljontals korta sekvensavläsningar och tillämpas rutinmässigt på genom, epigenomer och transkriptomer. Sequencing steady-state RNA i ett prov, känt som RNA-seq, är fritt från många av begränsningarna av tidigare teknologier, såsom beroendet av tidigare kunskap om organismen, som krävs för microarrays och PCR (se ruta 1: Jämförelser av microarrays och sekvensering för genuttryck analys). Dessutom lovar RNA-seq att reda ut tidigare otillgängliga komplexiteter i transkriptomen, såsom allelspecifika uttryck och nya promotors och isoformer [1] [2] [3] [4]. De dataset som produceras är dock stora och komplexa och interpretation är inte rakt fram. Liksom med all teknologi med hög genomströmning är analysmetodiken kritisk för att tolka data, och RNA-seq-analysprocedurer fortsätter att utvecklas. Därför är det lämpligt att se över för närvarande tillgängliga metoder för analys av data och kommentera framtida forskningsinriktningar. Att förstå RNA-seq-data beror på den vetenskapliga frågan av intresse. Till exempel kräver bestämning av skillnader i allelspecifika uttryck korrekt bestämning av prevalensen av transkriberade singelnukleotidpolymorfismer (SNP) [5]. Alternativt kan fusionsgener eller avvikelser i cancerprover detekteras genom att hitta nya transkript i RNA-seq data [6, 7]. Under det senaste året har det dykt upp flera metoder som använder RNA-seq-data för estimering av mängden [8, 9], detektion av alternativ skarvning [10] [11] [12], RNA-redigering [13] och nya transkript [11, 14]. Det primära målet för många biologiska studier är dock genuttrycksprofilering mellan prover. vi, i denna översyn fokuserar vi på de metoder som finns tillgängliga för att upptäcka skillnader i gennivå uttryck mellan prover. är typ av analyt sis är särskilt relevant för kontrollerade experiment som jämför uttryck i vildtyp och mutant stammar av samma vävnad, jämföra behandlade kontra obehandlade celler, cancer kontra normalt, och så vidare. Till exempel, jämförelse av uttryck förändringar mellan den odlade patogenen Acinetobacter baumannii och den patogen som odlas i närvaro av etanol - som är känd för att öka virulens - avsöndrade 49 differentierat uttryckta gener som hör till en rad funktionella kategorier [15]. Här beskriver vi den processledning som används för att upptäcka differentialuttryck (DE) i RNAseq och undersöker tillgängliga metoder och programvaruverktyg med öppen källkod för att utföra analysen. Vi lyfter också fram flera områden som kräver ytterligare forskning. De flesta RNA- seq experiment tar ett prov av renat RNA, klippa det, konvertera det till cDNA och sekvens på en höggenomströmningsplattform, såsom Illumina GA / HiSeq, SOLiD eller Roche 454 [16]. process genererar miljontals korta (25 till 300 bp) avläsningar tagna från ena änden av cDNA-fragmenten. En vanlig variant på denna process är att generera korta avläsningar från båda ändarna av varje cDNA-fragment, så kallade "parade-end" avläsningar. Plattformarna skiljer sig avsevärt åt i fråga om kemi och bearbetning, men oavsett de exakta detaljerna består rådata av en lång lista över korta sekvenser med tillhörande kvalitetsresultat. Dessa utgör ingångspunkten för denna översyn. En översikt över den typiska RNA-seq pipeline för DE-analys beskrivs i figur 1. Först kartläggs avläsningar till genomet eller transkriptomen. För det andra, karterade avläsningar för varje prov är sammansatta till gen-nivå, exon-nivå eller transkript-nivå uttryck sammanfattningar, beroende på syftet med experimentet. Därefter normaliseras de summerade data i samverkan med den statistiska testningen av DE, vilket leder till en rangordnad lista av gener med tillhörande P-värden och vik förändringar. Slutligen, biologisk insikt från dessa listor kan uppnås genom att utföra systembiologi metoder, liknande dem som utförs på microarray För att använda RNA-seq data för att jämföra uttryck mellan prover, är det nödvändigt att vända miljontals korta avläsningar till en kvantifiering av uttryck. Det första steget i detta förfarande är avläsningskartläggningen eller justeringen. Det enklaste är att hitta den unika platsen där en kortläsning är identisk med referensen. Men i verkligheten är referensen aldrig en perfekt representation av den faktiska biologiska källan till RNA som sekvenseras. Förutom provspecifika attribut som SNPs och indels (insättningar eller raderingar), finns det också ett övervägande om att avläsningarna uppstår från en skarvat transkriptom snarare än ett genom. Dessutom kan korta avläsningar ibland anpassas perfekt till flera platser och kan innehålla sekvenseringsfel som måste redovisas. Därför är den verkliga uppgiften att hitta den plats där varje kortläsning bäst matchar referensen, samtidigt som man tillåter fel och strukturella variationer. Även om forskning om hur man bäst anpassar avläsningar till en referens pågår, innebär alla lösningar av nödvändighet en viss kompromiss mellan algoritmens beräkningskrav och den fuzziness som tillåts för att matcha med referensen. Nästan alla korta läsjusterare använder en strategi för en första pass "heuristisk" match, som snabbt hittar en reducerad lista över möjliga platser, följt av en grundlig utvärdering av alla kandidatanpassningar med en komplex "lokal anpassning" algoritm. Utan denna inledande heuristiska sökning för att minska antalet potentiella justering platser, utföra lokal anpassning av miljontals korta avläsningar skulle vara beräkningslöst omöjligt på nuvarande hårdvara. Nuvarande konfigurerare möjliggör snabb heuristisk matchning genom att använda antingen hashtabeller [19] [20] [21] [22] eller Burrows Wheelertransform (BWT) [23] [24] [25]. Hash-table-konfigurerare har fördelen av att vara lätt att förlänga för att upptäcka komplicerade skillnader mellan läsning och referens, till priset av ständigt ökande beräkningskrav. Alternativt kan BWT-baserade konfigurerare kartlägga avläsningar som nära matchar referensen mycket effektivt men är oöverkomligt långsamma när mer komplexa avvikelser beaktas. En detaljerad förklaring av dessa metoder ligger utanför tillämpningsområdet för denna översyn, men finns i [23, [26] [27] [28] [29] [30]. Aligners skiljer sig också åt i hur de hanterar'multikartor' (läser den kartan lika bra till flera platser). De flesta likriktare antingen kasta multikartor [25], fördela dem slumpmässigt [29] eller fördela dem på grundval av en uppskattning av lokal täckning [31, 32], Även om en statistisk metod som innehåller anpassning poäng har också föreslagits [33]. Parad-end avläsningar minskar problemet med multimapping, eftersom båda ändarna av cDNA fragmentet som de korta avläsningar genererades bör kartlägga i närheten på transkriptomen, vilket gör att tvetydigheten av multikartor kan lösas under de flesta omständigheter. När man överväger avläsningar från genomiskt DNA, kartläggning till en relevant referensgenom är allt som behövs. RNA-seq är dock sekvenserande fragment av transkriptomen. Denna skillnad hanteras på flera sätt. Mot bakgrund av tabell 1. Först avbildas avläsningar till referensgenomet eller transkriptomen (med hjälp av korsningsbibliotek för att kartlägga läser att korsa exon gränser); karterade avläsningar samlas till uttryck sammanfattningar (tabeller av räkningar, visar hur kan läsas i kodning region, exon, gen eller korsning); data normaliseras; statistisk testning av differentialuttryck (DE) utförs, producerar och en lista över gener med tillhörande P-värden och veck förändringar. Systembiologin kan sedan användas för att få biologiska insikter från dessa listor.
Emellertid Poisson distribution antagande om antalet avläsningar kan inte fånga variabiliteten i RNA-Seq data väl, vilket leder till hög-false positiva hastigheter i upptäckten av DEGs REF.
From RNA-seq reads to differential expression results
{'venue': 'Genome Biology', 'journal': 'Genome Biology', 'mag_field_of_study': ['Biology', 'Medicine']}