Genuttryck förhållande som härrör från spott-glas microarray experiment har blivit ovärderligt för forskare genom att tillhandahålla känsliga och omfattande indikatorer för molekylära baser av cellbeteenden och tillstånd. Flera nackdelar med denna form av data har dock noterats, inklusive oförmågan att relatera nyckeltal till absoluta uttrycksnivåer eller att jämföra experimentella förhållanden som inte mäts med samma kontroll. I denna studie visar vi en metod för att övervinna dessa hinder. Först, istället för att kohybridisera märkta experiment- och kontrollprover, hybridiserar vi varje prov mot märkta oligos som kompletterar varje mikroarray-funktion. Förhållanden mellan provintensiteterna och intensiteten av oligoreferensmätningsprov RNA-nivåerna på en skala som relaterar till deras absoluta förekomst, i stället för till de variabla och okända förekomsterna av en cDNA-referens. Vi visar att resultaten från denna typ av hybridisering är korrekta och behåller absolut överflöd information mycket bättre än konventionella mikroarray förhållande. Därefter, för att säkerställa korrekt mätning av prov och oligo referensintensiteter, som kan skilja sig åt genom flera storleksordningar, använder vi en linjär regressionsalgoritm, implementerad i ett fritt tillgängligt PERL-skript, för att kombinera linjära intervall av flera skanningar tagna på olika scanner känslighetsinställningar på en utökad linjär skala. Vi diskuterar framtida tillämpningar av vår metod för att mäta RNA uttryck på den absoluta skalan av antalet transkript per cell från någon organism för vilken oligo-baserade fläckglas mikroarrays finns tillgängliga. O ne av de mest framgångsrika genomik teknologier som utvecklats hittills är DNA microarray (1-4), som tillåter samtidig upptäckt av uttrycksnivåer för varje gen i en organism. För närvarande, spott-glas microarray experiment utförs genom att använda sonder syntetiserade från två RNA prover (en referens och ett experimentellt prov) som är märkta med olika färgfluor och kohybridiseras till en matris. Skillnader i genuttrycksnivåer rapporteras som förhållandet mellan experimentella och referensintensiteter (konventionella mikroarrayförhållanden). Emellertid, denna teknik, som har producerat stora databaser av helgenome uttrycksdata på individer som sträcker sig från bakteriemetabolism till cancer hos människa, är ännu inte fullt mogen. Användningen av nyckeltal i två färger hybridisering experiment kontroller för flera källor till experimentell variation inneboende i fläckglas mikroarray-teknik, inklusive variation över ORF i märkta nukleotid frekvens, mängd och kvalitet av DNA fläckig på matrisen, ojämn hybridisering, och fläckstorlek och morfologi (2, 5). Men konventionella mikroarray förhållande har flera egenskaper som begränsar efterföljande beräkningsanalys, och därmed mängden information som kan extraheras från dessa stora datamängder. För det första resulterar rapportering av uttrycksdata som förhållande mellan cDNA-referens och experimentella prover i förlust av den absoluta transkriptmängdsinformation som överförs av den enskilda punktfluorescensintensiteten, vilket döljer viktiga skillnader i nivåer av genuttryck mellan ORF. Användningen av cDNA-referensprover, som till stor del är okaraktäriserade och inte lätt reproducerade, hämmar också jämförelser mellan datamängder som använder olika cDNA-referenser. Ett exempel är oförmågan att samla liknande förhållanden mellan tid-kurs experiment som använder initiala tidpunkter som referensprover (kompletterande material att ref. 6 ) och 6 ).................................................................................................. I denna studie utvecklar vi en kombination av experimentella och beräkningsmetoder som förbättrar noggrannheten och jämförbarheten hos DNA-mikroarraydata genom att (i) mäta punktintensiteten i förhållande till ett kalibrerat referensprov och (ii) extrapolera data från flera skanningar för att öka antalet rapporterade intensiteter. I detta system, märkt cDNA från ett prov av intresse hybridiseras tillsammans med en uppsättning differentialt märkta oligonukleotider av känt överflöd (kalibrerad oligo referens) som innehåller sekvenser som kompletterar varje plats på matrisen. Efter hybridisering mäts punktintensiteten genom skanning vid flera känslighetsinställningar för detektion, och resultaten kombineras till en vanlig linjär skala genom att använda en linjär regressionsalgoritm som implementeras i ett PERL-skript som kallas masliner (MicroArray Spot LINEar Regression). Slutligen, RNA överflöd uttrycks som ett förhållande till den kalibrerade oligo referensen, ett prov som lätt reproduceras och ger betydande signal för varje egenskap på arrayen. Strains och Media. Den stam av Saccharomyces cerevisiae som används i denna studie är FY4, en MATA-prototrop isogen till ett GAL2-derivat av S288C (7). Medierna förbereddes enligt beskrivningen (8). Glukoskulturer (Glu) odlades i jästextrakt och peptone dextros (YPD; 2% glukos), raffinoskulturer (Raff) odlades i SDRAf (2% raffinos), och etanolkulturer (EtOH) odlades i SDEtoH (2% etanol). Galaktoskulturer (Gal) odlades i YPRaf (2% raffinos) och inducerades i 20 minuter genom tillägg av galaktos till 2%. Alla kulturer odlades vid 30°C och skördades vid densiteter på 1-2  på 10 7 celler per ml.
En annan metod som kombinerar flera skanningar är masliner (Microarray Spot LINEar Regression) algoritm REF.
Measuring absolute expression with microarrays with a calibrated reference sample and an extended signal intensity range.
{'venue': 'Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America', 'journal': 'Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America', 'mag_field_of_study': ['Medicine', 'Biology']}