Gener underliggande mutant fenotyper kan isoleras genom att kombinera markör upptäckt, genetisk kartläggning och omsekvensering, men en mer enkel strategi för att kartlägga mutationer skulle vara en direkt jämförelse av mutant och wild-typ genom. Att tillämpa ett sådant tillvägagångssätt hindras emellertid av behovet av referenssekvenser och av mutationsbelastningar som förbryllar den otvetydiga identifieringen av kausala mutationer. Här introducerar vi NIKS (needle in the k-stack), en referensfri algoritm baserad på att jämföra k-mers i helgenomsekvensering data för exakt upptäckt av homozygota mutationer. Vi applicerade NIKS på åtta mutanter inducerade i icke-referensrissorter och på två mutanter av den icke-modellarten Arabis alpina. För båda arterna visade jämförelse av sammanslagna F2-individer utvalda för mutanta fenotyper små uppsättningar av mutationer inklusive de kausala förändringarna. Dessutom identifierades kausalgenen entydigt genom att man jämförde M 3-plantor av två alleliska mutanter. För alla arter som är mottagliga för mutagenes, NIKS möjliggör framåt genetik utan att kräva segregerande populationer, genetiska kartor och referenssekvenser. Framåtriktade genetiska skärmar har varit av grundläggande betydelse för att klargöra biologiska mekanismer i modellart 1. Deras framgång har emellertid förlitat sig på genomförbarheten av muterad genisolering. Identifiering av kausala mutationer börjar vanligtvis med genetisk kartläggning, följt av kandidatgensekvensering och kompletterande studier med hjälp av transformation. Framsteg i DNA-sekvensering teknik har oerhört påskyndad genetisk kartläggning genom att kombinera bulk segregant analys, det vill säga pooling rekombinanta genom, med hela genom sekvensering, vanligtvis kallas kartläggning genom sekvensering 2,3. Detta tillvägagångssätt håller nu på att bli standard för mutationskartläggning och identifiering i många modellarter 3-12 och har även tillämpats för att dechiffrera kvantitativa egenskaper med komplexa genetiska arkitekturer 13, 14. Nyligen har mutagen-inducerade förändringar använts som nya markörer, vilket gör det möjligt att kartlägga mutationer med hjälp av isogena kartpopulationer 10, 15. Trots detta, alla kartläggning-för-sekvensering metoder förlitar sig på omsekvensering, en metod för helgenome rekonstruktion baserad på att anpassa sekvenser till en referenssekvens. Detta krav begränsar därför tillämpningen av tekniken på arter för vilka en sådan referensgenomsekvens finns tillgänglig. Många projekt för sammanställning av referenssekvenser pågår för närvarande, bland annat sådana som gäller de flesta av de viktigaste arterna av grödor och avelsdjur. Även med en befintlig referenssekvens har det visat sig vara tekniskt svårt att utvidga metoderna för kartläggning för sekvensering utöver de sekvenserade referensanslutningarna. Mutant alleler av gener som inte finns i referenssekvensen kan inte identifieras enbart inom omsekvenseringsdata. I synnerhet, snabb-evolverande gener, såsom de som är involverade i sjukdomsresistens, kanske inte alltid representeras i referenssekvens 16, 17. Alternativa lösningar för kartläggning-för-sekvensering i arter utan referenssekvenser har föreslagits, såsom kartläggningby-sekvensering baserad på referenssekvenser av relaterade arter eller uttryckt sekvens taggsamlingar 11, 18. Alla dessa metoder är dock i hög grad beroende av låg sekvensskillnad och höga nivåer av synteni mellan mutantgenomet och anpassningsmålet. Nyligen infördes metoder för direkt genomjämförelse av flera prover utan en referenssekvens, men ingen har visat sig vara korrekt och tillräckligt exakt för identifiering av mutationer [19] [20] [21]. NIKS är en metod för referensfri genomjämförelse baserad enbart på frekvensen av korta subsekvenser inom hela genomsekvensdata. Den är inriktad på att identifiera mutagen-inducerad, småskalig, homozygota skillnader mellan två högt besläktade genom, oberoende av deras inavlade eller utavlade bakgrund, och ger en väg till identifiering av mutationer utan att kräva någon tidigare information om referenssekvenser eller genetiska kartor. Principer och prestanda för NIKS NIKS bygger på analys av k-mers, som definieras som undersekvenser av längd k av en sekvensavläsning. NIKS börjar med att bedöma frekvensen av varje k-mer inom sekvensering data för varje prov med hjälp av k-mer-räkna programvara Jellyfish 22. K-mers som överlappar med sekvensfel kommer att vara av låg frekvens, eftersom dessa fel inte förekommer i alla avläsningar från motsvarande region, och det är därför möjligt att skilja dem från avläsningar som är felfria (Fig. 1)..................................................................
NIKS REF är utformad för helgenomsekvenseringsprotokoll.
Mutation identification by direct comparison of whole-genome sequencing data from mutant and wild-type individuals using k-mers
{'venue': 'Nature Biotechnology', 'journal': 'Nature Biotechnology', 'mag_field_of_study': ['Medicine', 'Biology']}