Matematisk modell av IRMA syntetiskt nätverk IRMA utvecklades som ett testbädd syntetiskt nätverk i jäst för utformning och validering av omvänd teknik och modellering [1]. IRMA består av ve-gener, CBF1, ASH1, SWI5, GAL4 och GAL80 och dess topologi omfattar både transkriptions- och proteinproteinregleringsmekanismer ( [1]). Figur 2 i huvudtexten visar ett schematiskt diagram över de regulatoriska interaktionerna mellan de ve generna. Nätverkstopologin omfattar en positiv återkopplingsslinga från CBF1 tillbaka till sig själv via GAL4 och SWI5, och en negativ återkopplingsslinga från CBF1 tillbaka till sig själv via ASH1. Ytterligare en förordning finns mellan SWI5 och GAL80 via GAL10-promotorn som är bunden av GAL4. Transkription av nätverksgener kan kontrolleras av närvaron av Galactose (GAL) i tillväxtmediet, vars närvaro hämmar transkription av SWI5 från GAL10 promotorn. För att fånga dynamiken i nätverket har en hybridmodell (kompletterande figur S1 ) som approximerar dynamiken i Glukos (F 1 ) och Galaktos (F 2 ), anpassats från [1]. Både vektoräldarna F 1 och F 2 delar samma modellstruktur samt de flesta av parametrarna (v 3,k 4 ochγ behöver en specific argumentation) som redovisas nedan: var är systemet tillstånd. Vi använde Hill-funktioner för att modellera transkriptionshastigheter från promotors; flera regler på CBF1 modelleras av produkten av två Hill-funktioner (AND-reglering). En tidsfördröjning τ är närvarande i ekvationen för x 1 modellering transkription av CBF1, som är acekted av en 100 minuters lång tidsfördröjning på grund av den sekventiella rekryteringen av kromatin-modifierande komplex till HO promotorn (som följer bindning av SWI5 och andra transkriptionsfaktorer) [2]. En förteckning över alla modellparametrar finns i kompletterande tabell S1 i [1]. Observera att modellen är hybrid som parametrarv 3,k 4 ochγ växla mellan två olika uppsättningar av värden beroende på kolkällan (Galaktos eller Glukos). Kontrollalgoritm: utformning och genomförande I detta system driver GAL1-promotorn uttrycket för fusionsproteinet Gal1-Gfp. Således kan det beskrivas som ett enda in-single output (SISO) dynamiskt system. Inmatningen u(t) beskriver förekomsten av galaktos eller glukos i tillväxtmediet. Utmatningen y(t) är den uppmätta genomsnittliga uorescensnivån för Gal1-Gfp-proteinet i cellpopulationen. Kontrollmålet är en set-point reglering, där cellpopulationen är skyldig att under flera generationer uttrycka en xed mängd urinescence (kontrollreferens r(t)). För detta ändamål har vi utformat en enkel kontrollalgoritm baserad på en proportional-integral regulator (PI) vars utdataû(t) är en funktion av kontrollfelet e(t) (obalansen mellan den önskade och nuvarande uteffekten av systemet e(t) = r(t) − y(t) dened som:û Eftersom celler kan konsumera antingen galaktos eller glukos på ett ömsesidigt uteslutande sätt, måste den kontinuerliga signalû(t) avkodas till en diskret signal som anger antingen galaktos (u(t) = 2) eller glukos (u(t) = 0). Ovanstående begränsning möjliggör en analogi med de problem som uppstår vid utformningen av återkoppling kontrollstrategier för kraft elektroniska kretsar [3]. Här kan växlar och SCR (kiselstyrda rektiers) endast slås på eller o, viss produktion mäts eller uppskattas normalt och, särskilt i industriella tillämpningar, kompenserande buller och yttre störningar är av yttersta vikt. Den enklaste och mest använda kontrolltekniken i detta sammanhang är att använda PI regulator kopplad till en PWM (Pulse Width Modulation) kontroll strategi med en klassisk begränsad integral anti-windup [4]. Detta är också den strategi vi har antagit för att kontrollera cellpopulationen. Vid den enklaste återkopplingen av PI-PWM jämförs en sågtandsignal medû(t) för att modulera bredden på ett rektangulärt pulståg, som sedan används som styringång (se [5] för ytterligare detaljer). Nämligen, låt vara sågtooth signalen; sedan För att styra GAL1 promotorn valde vi sågtooth wave parametrar enligt följande: α = 0, β = 2 och T = 5min. Vinsterna för PI-regulatorn, nämligen K p = 6 och K i = 0,3, justerades enligt Cohen-Coon-strategin ( [6]) med hjälp av en linjär överföringsfunktion som beskriver den GAL1-promotor som tidigare härletts i [7]: med parametrar μ = 0,28, d = 68 och  till = 134. IRMA kan modelleras som ett input-output system där input u modellerar närvaron/saknaden av Galactose och utdata y är koncentrationen av en av dess gener, nämligen Cbf1 (x 1 ). Observera att inmatningen fungerar nonlinearly på dynamiken i nätverket som närvaron av Galactose ändrar värdena för alla Galactose-beroende parametrar (namelyv 3,k 4 ochγ). Dessutom, så snart Glukos administreras till cellerna, dessa slutar svara på Galactos, även om det fortfarande finns i mediet. Därför är kontrollingången (tolkad som Galaktoskoncentration på 2 w/v% i den totala volymen av uid som når jäst) begränsad till antingen ON (u = 1) eller OFF (u = 0). Systemutgången y = x 1 kan inte mätas direkt som en koncentration. Istället konstruerades cellerna så att CBF1p blandas med ett GFP, det gröna urindrivande proteinet [1]. På så sätt är högre koncentrationer av Cbf1p förknippade med högre urinnivåer. Dessutom, som beskrivs i [8], mängden uppskattad urinmängd kan vara direkt relaterad till det faktiska antalet molekyler. Ur ett kontrollperspektiv är gennätverksmodellen därför ett mycket ickelinjärt, hybrid, tidsfördröjningsdynamiskt system av formen: T, μ är vektorn för parametervärden i Glucose (u = 0) ochμ är vektorn för parametervärden i Galactose (u = 1). Hybridsystem används ofta för att modellera gennätverk (t.ex. Se [911]), där det är ganska vanligt att observera tröskelberoende och bytesliknande aktiverings- eller hämningsfunktioner som styr dynamiken i protein-protein- eller protein-gen-interaktioner. Ur ett kontrollperspektiv är uppgiften att reglera uttrycket av CBF1 till något önskat värde, säger r(t) genom att modulera kontrollinmatningen u(t) (kolkällan som administreras till cellen). I vad som följer, kommer vi att ignorera fenomen som Zeno beteenden (vilket skulle innebära gennätverket att slå på och o ett obundet antal gånger i en nite och begränsad tid). För att lösa detta problem är utmaningen att utforma en eektiv men ändå enkel kontrollstrategi som kan hantera de många oundvikliga 3 begränsningar som kännetecknar biologiska system (dvs. höga bullernivåer, ofullständig kunskap och omodellerad dynamik). Cellerna är levande organismer och de motstår yttre åtgärder mycket eektivt. Dessutom är det viktigt att minimera behovet av att i detalj känna till den biologiska process som ska styras, för att göra kontrollstrategin så allmän som möjligt och tillämplig på alla processer av intresse. Den huvudsakliga konstruktionsbegränsningen som måste beaktas när man syntetiserar en regulator för ett biologiskt system som IRMA är att cellerna tenderar att konsumera Glukos som sin primära kolkälla, även när galaktos finns, eftersom de får energi från det till en lägre energikostnad [12]. Dessutom förtränger GLU-genes GAL-gener som beskrivs i [13]; därför är vår kontrollingång binär: antingen galaktos eller glukos, men inte båda. Precis som i fallet med GAL1-promotorn använde vi PI-PWM-kontrollstrategin för den set-point-kontrolluppgiften. Segtooth-vågparametrarna för PWM var inställda på α = 0, β = 10E − 5 och T = 5 min. På så sätt är signalens amplitud 10% av Cbf1-nivån vid steady state i Glukos och perioden är dubbelt så lång som avvecklingstiden för Cbf1. Med detta val, är begränsningen mättas av kontrollingången som binär. I fallet med signalspårning kontroll uppgift, för att kompensera för den beräknade fördröjningen av 100min i CBF1 gen transkription, en strategi infördes, som inspireras av den klassiska Smith Predictor system i [14], som visas i kompletterande figur S2. Den delay-free versionen av IRMA modell (block M i kompletterande figur S2 ) används för att producera en numerisk uppskattning av den förväntade systemutgången. Detta fördröjs sedan och subtraheras från den kvantierade uorescenceutgången, y, av nätverket för att producera en signal som letteras via en linjär lter F och läggs tillbaka till y. Ltern var utformad empiriskt för att undertrycka högfrekventa buller som går in i kontrollslingan och kännetecknas y: Utgången y s av fördröjningsersättningsschemat jämförs sedan med önskad utgång (y ref ) för att erhålla felsignalen e. En Proportionell-Integral styrenhet tar e i ingång och beräknar kontrollsignalû(t) med vinsterna K p = 175.6 och K I = 2.11. Dessa vinster upptäcktes med Cohen-Coon-metoden, som tidigare beskrivits för Gal1-promotorn; i fallet IRMA parametrarna för överföringsfunktionen i ekv. (8) befanns vara μ = 0,0467, d = 146,85 och  ska = 667,62. En jämförelse mellan den linjära approximationens stegrespons och den icke linjära modellen visas i kompletterande figur S3. Den beräknade analoga kontrollsignalenû omvandlas sedan till binära värden med hjälp av PWM-modulatorn som beskrivs ovan och som matar både den fysiska anläggningen och den modell som används för fördröjningskompensation med samma binära ingång u, vilket stänger återkopplingsslingan. Den kontrollstrategi som beskrivs i föregående avsnitt har genomförts som en Finite State Automaton i MATLAB (Mathworks Inc.) för att reglera både GAL1-promotorn och IRMA-nätverket. Den Finite State Automaton genomföra PI-PWM kontrollalgoritm är mycket enkel: vid varje steg (k) en bild förvärvas av mikroskopet, och den normaliserade uorescence signal beräknas tack vare en bild segmentering algoritm beskrivs i nästa avsnitt. Urescenssignalen y s (k) jämförs mot referenssignalen y ref (k) för att erhålla felet e(k). Kontrollingången u(k) beräknas sedan med hjälp av diskret-tid implementation av PI-regulatorn diskuteras i [4]. Kontrollingången u(k) används för att bestämma varaktigheten av pulsen av Glukos eller Galactose med hjälp av PWM-strategin. Varaktigheten av varje puls motsvarar det tidsintervall under vilket sprutan laddad med Galactos förblir högre än den som innehåller Glukos (eller vice versa). I nästa ögonblick (k + 1) förvärvas en ny bild och återkopplingsberäkningen sker. Felet e(k + 1) är tillgängligt för en ny kontroll iteration och varje steg upprepas igen. När det gäller signalspårningsuppgiften för IRMA-nätverket är Finite State Automatons genomförande av kontrollalgoritmen mer komplext, eftersom det i detta fall finns ett behov av att simulera IRMA-modellen M i prediktorblocket, vilket är nödvändigt för förseningskompensationen. Som representeras i kompletterande figur S4, i k-th steg, e(k) är känd, därför är det möjligt att beräkna den kontrollinmatning u(k) som ska tillämpas på både anläggningen och IRMA modell M via PI-regulatorn [4]. Kontrollingången används sedan för att beräkna varaktigheten av pulsen hos Glukos eller Galactos med hjälp av PWM-strategin. In-silico analys av kontrollalgoritmen för IRMA-nätverket Med tanke på komplexiteten i IRMA-modellen, innan det experimentella genomförandet av kontrollstrategin i -vivo, beslutade vi att testa och validera resultatet av kontrollsystemet i -silico. I det numeriska genomförandet utvärderades flera alternativa designalternativ. Det konstaterades till exempel att användning av en icke-linjär modell för förseningskompensation (i blocket märkt som "M" i kompletterande figur S2 ) ger en jämförbar prestanda med den som erhålls när man använder en linjäriserad (som föreslås i [14] ). Dessutom utförde vi numeriska simuleringar av kontrollsystemet mot osäkerheter i tidsuppskattningen genom att beakta scenariot där fördröjningen τ är inställd på noll. Resultaten presenteras i kompletterande figur S5 och kompletterande figur S6 som visar kontrollsystemets förmåga att garantera en rimlig prestanda även i detta fall. Slutligen undersökte vi eekterna av att förenkla kontrollstrategin ytterligare genom att ta bort det förutsägelsesystem som används för att kompensera förseningen. Även om en enklare kontrollstrategi kan minska den övergripande prestanda, anledningen till att ta detta steg är att vi föredrar att sakrice precision till förmån för en kontrollstrategi som lätt kan användas för att kontrollera andra gennätverk och proteiner, utan att kräva en dynamisk modell av systemet för att kontrolleras. In-silico resultat rapporterade i Kompletterande Figur S7 och Kompletterande Figur S8 visar prestandan av en sådan enkel PI/PWM kontroll strategi när den genomförs för att kontrollera genuttryck nivåer i IRMA. Insilico-försöken bekräftar att denna strategi på ett eektivt sätt tvingar Cbf1-koncentrationen att följa den önskade referenssignalen när fördröjningen τ = 0. Den slutna styrplattformen beskrivs ovan, använder en inverterad epiuorescens Nikon-TI Eclipse mikroskop. Mikroskopet är programmerat att förvärva två typer av bilder: a) en faskontrastbild (faskontrast) och b) två urinescensbilder (en för det gröna spektrumet för GFP och en i det röda spektrumet för Sulforhodamine B). Det röda färgämnet Sulforhodamin B tillsätts till galaktosmediet och används för att kontrollera korrekt administrering av kontrollingången. När cellerna har avbildats kan bildanalysmetoder användas för att uppskatta deras urescens [15]. I detta syfte har vi utvecklat en anpassad bildbehandlingsalgoritm för att fullt ut utnyttja vår plattforms egenheter. [16] Vårt mål var att utföra både cellsegmentering och cellspårning, maximera känslighet som primärt mål, och sedan rening resultaten genom att förbättra specificitet. Vi baserade vår segmenteringsmetod på globalt kantlänkningssystem. Jästceller i fas kontrast bilder förekommer i kluster, låg intensitet, konvex och ofta kvasi-cirkulära former omgiven av en vit halo (kompletterande figur S9 C). Kontrasten mellan de pixlar som hör till cellerna och de pixlar som hör till halos är vanligtvis så hög att kantpunkter kan upptäckas genom utvärderingen av omfattningen av lutningen beräknas i varje punkt av bilden (kompletterande figur S9). På grund av formen av jästcell kan kantpunkter anslutas till Circular Hough Transform (CHT) [17]. CHT kan upptäcka nästan alla celler i bilden, även när celler kanter överlappar; tyvärr 5 CHT algoritmen är beräknings dyrt (både i minne och tid) och visar begränsad specificitet kapacitet. Därför, för att begränsa beräkningskostnaden i samband med algoritmen, introducerar vi ett förbehandlingssteg av bilden för att välja de regioner i bilden där celler finns ( Kompletterande figur S9 B ). Dessa regioner identifieras med hjälp av en mask som erhålls genom morfologisk verksamhet (bländning, stängning och lling) och tröskel (se kompletterande figur S9 A). Falska upptäckter minskar till följd av segmenteringen av dessa regioner. Eftersom området för de regioner i bilden som innehåller celler dessutom är mindre än området för bakgrunden, minskas beräkningstiden avsevärt. När celler har lokaliserats i faskontrastbilden används en binär lter för att upptäcka endast pixlar av GFP-uriescensen eld i celler. Låt oss peka ut uorescence eld image I som:
Mot bakgrund av ovanstående kommer vi att betrakta installationen dokumenterad i REF som referensplattformen för in vivo-genomförandet av vår modellurvalsmetod.
In-Vivo Real-Time Control of Protein Expression from Endogenous and Synthetic Gene Networks
{'venue': 'PLoS Computational Biology', 'journal': 'PLoS Computational Biology', 'mag_field_of_study': ['Biology', 'Computer Science', 'Medicine']}