Abstrakt. Vi har undersökt cortex av Caenorhabditis elegans ägg under pseudocleavage (PC), en period av den första cellcykeln som är viktig för generering av asymmetri vid första klyvning (Strome, S. 1989. Int. Vad är det? Upp. Det är Cytol. 114: 81-123). Vi har funnit att riktat, aktin beroende, cytoplasma, och kortikal flöde inträffar under denna period sammanfaller med en omorganisation av den kortikala aktin cytoskelon (Strome, S. 1986. Detta beslut träder i kraft den tjugonde dagen efter det att det har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning. Det är cellbiol. Detta anslag är avsett att täcka utgifter för tjänstemän och tillfälligt anställda som arbetar inom politikområdet Migration och inrikes frågor samt administrativa utgifter för tjänstemän och tillfälligt anställda som arbetar inom politikområdet Migration och inrikes frågor. Flödeshastigheten (4-7 #m/min) liknar tidigare fastställda partikelrörelser som drivs av kortikala aktinflöden i motila celler. Vi visar att riktade flöden förekommer i en av döttrarna till den första divisionen som själv delar sig asymmetriskt, men inte i sin syster som delar sig symmetriskt. De kortikala och cytoplasma händelser av PC kan härma i andra celler under cytokinesis genom att ersätta mitotiska apparaten med mikrotubule polymerization inhibitor nocodazol. I samtliga fall korrelerar polariteten för de resulterande kortikala och cytoplasmiska flödena med positionen för den försvagade mitotiska spindeln som bildas. Dessa kortikala flöden åtföljs också av en förändring i distributionen av det kortikala aktinnätet. polariteten i denna omfördelning är på liknande sätt korrelerad med placeringen av den försvagade spindeln. Dessa observationer tyder på en mekanism för att generera polariserade flöden av cytoplasmatiskt och kortikalt material under embryonala klyvningar. Vi presenterar en modell för händelserna i PC och föreslår hur polerna av mitotic spindle mediera bildandet av kontraktil ringen under cytokinesis i C. elegans. T rIE fenomen kortikal flöde har beskrivits i många system inklusive lamellipodia av motila celler (Abercrombie et al., 1970; Heath, 1983; Fisher et al., 1988), tillväxtkottar av neuroner (Forscher och Smith, 1990), under amoeboid locomotion (Grebecki, 1984), och under cytokinesis (Dan, 1954). I dessa fall strömmar material som gränsar till plasmamembranet på ett kontinuerligt och riktat sätt bort från en region till en avlägsen region. Till exempel, i fallet med motila celler, fläckar av aggregerade membranproteiner (Taylor et al., 1971; Holifield och Jacobson, 1991) eller partiklar (Abercrombie et al., 1970; Fisher et al., 1988) appliceras på den dorsal ytan av lamellipodia, flöda bort från den främre kanten av cellen. Det finns nu betydande bevis, som härrör från ett antal observationer, för att det underliggande kortikala aktinnätverket (Heath, 1983; Wang, 1985; Forscher och Smith, 1988) ständigt rör sig i motilceller. Membranproteiner kan vara associerade med sådana rörliga kortikala nätverk och så kan sopas längs i samma riktning (Holifield et al., 1990), och de kan i sin tur bära längs extracellulära partiklar. Alternativa hypoteser förutspår att de kortikala flöden drivs av flöden av membran lipid (Bretscher, 1976 (Bretscher,, 1984. AI Vänligen ställ all korrespondens till S. N. Hird, Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology, Hills Road, Cambridge, CB2 2QH, England. Även om det har föreslagits att denna typ av flöde inte enbart är ansvarig för kortikal flöde under capping (Sheetz et al., 1989; Lee et al., 1990; Kucik et al., 1990) är det fortfarande möjligt att det kan bidra till kortikala rörelser. Det finns en period i den första cellcykeln av Caenorhabditis elegans embryo under vilken ett antal cytoskeletal och cytoplasma omgrupperingar inträffar som har vissa likheter med de kortikala flöden som ses i andra organismer. Under intervallet kallas pseudocleavage (PC) ~ den främre cortex av det befruktade ägget genomgår en serie sammandragningar; cytoplasma flyter mot den bakre änden av ägget och en övergående klyvning fåra ( pseudocleavage fåra) former och sedan regresserar (Nigon, 1960). Man tror att åtminstone några av dessa händelser är avgörande för den korrekta uppdelningen av utvecklingsfaktorer i ägget Strome, 1988, 1990; Strome, 1989; Kirby m.fl., 1990). I synnerhet kan det cytoplasmaiska flödet medföra bestämningsfaktorer till äggets bakre ände på ett icke-specifikt sätt där de sedan kan förankras före den första determinativa klyvningen. Germ-line specifika granulat (P granulat), kan lokaliseras till den bakre periferin av ägget på detta sätt (Strom och trä, 1982). Det finns en slående omorganisation av kortikal aktin nätverket samtidigt med händelserna i PC (Strome, 1986). Inledningsvis är aktinfibrer och foci jämnt fördelade i hela ägg cortex, men foci blir gradvis koncentrerad i den främre cortex. Det finns också immunocytologiska bevis för att kortikal myosin omfördelas på liknande sätt vid denna tid (Strome, S., personlig kommunikation). Det har därför föreslagits att under PC, kortikal aktin och, möjligen, myosin bildar ett kontraktilt nätverk som blir lokaliserad till den främre cortex displaceing cytoplasma (och bestämningsfaktorer) posteriort (Strome, 1989). Vi är intresserade av att förstå hur denna grundläggande omorganisation av ägget cortex uppstår, eftersom det kan avslöja hur polariteten i en asymmetrisk klyvning bestäms. I detta papper visar vi att det finns ett riktat flöde av kortikal material under PC i C. elegans genom att använda en tidsfördröjning mikroskopi system som registrerar flera fokala nivåer. Vi visar att det finns ett liknande kortikalt flöde innan klyvning i en annan blastomer som partitionerar cytoplasmakomponenter innan division men inget riktat flöde i sin syster som därefter delar symmetriskt. Dessutom kan cytoplasma- och kortikala flöden av PC, bildningen av den övergående fåran och anhopningen av kortikal aktin härmas i andra blastomerer under cytokines genom behandling med mikrotubulepolymerisationshämmaren nocodazol. Detta läkemedel minskar storleken på mitotic spindle och ofta orsakar det att ligga nära cell cortex. I samtliga fall är orienteringen av flödena och platsen för ansamling av kortikal aktin korrelerad med platsen för den mitotiska spindeln. Detta tyder på en allmän mekanism för att generera riktade flöden av cytoplasma. Material och metoder Wild type (N2) Caenorhabditis elegans stam Bristol odlades på agar tallrikar vid 20 °C med Escherichia coli stam OP50 som livsmedelskälla (Brenner, 1974). Embryon erhölls från unga vuxna gravider genom dissektion till äggsalter (118 mM NaC1, 40 mM KCI, 3,4 mM MgCI2, 3,4 mM CaC12, 5 mM Hepes, pH 7.4; Edgar och McGhee, 1986). Tidiga embryon identifierades med hjälp av ett dissekerande mikroskop, och grupperades sedan tillsammans med hjälp av spetsen på ett skalpellblad. De flyttades för observation med hjälp av ett utdraget kapillärrör. Embryos som hade avslutat den andra meiotiska uppdelningen innan dissektion överlevde denna procedur; de isolerade innan slutförandet av meios vanligtvis arresterades. Embryos deponerades på ett glastäcke belagt med en lösning på 0,1 % polylysin (Sigma Chem. Detta beslut träder i kraft den tjugonde dagen efter det att det har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning. Skyddslipsen vändes sedan upp och ned över en depressionsbild som innehöll äggsalter. Embryona observerades med hjälp av ett Zeiss Axioplan mikroskop utrustat med Nomarskl differential interferensoptik och en Hamamatsu C2400 videokamera med analog svart nivå subtraktion. Ett tidsförloppsmikroskopisystem användes för att registrera händelser som ägde rum på ytan och i cytoplasman samtidigt (se nedan). Ett system utvecklades som gör det möjligt för en användare att göra tidsförskjutningsinspelningar av flera fokalplan, vilket gör det möjligt att följa tredimensionella händelser i tiden. Systemet använder ett Sony LVR-LVS/6000 optiskt disksystem som styrs via en seriell länk från en lap-top dator. Datorn används också för att styra en motoriserad fokusenhet (som används i ett BioRad MRC 500/600 konfokalmikroskop) med hjälp av en andra seriell port. Programvaran systemet gör det möjligt för användaren att ange antalet fokalplan per skanning, separationen mellan plan, tidsintervall mellan fokus skanningar, det totala antalet fokus skanningar och ett filnamn för hänvisning av data vid uppspelning. Alla parametrar för en inspelning kör lagras på ett särskilt digitalt område på videodisken, och en katalog kan erhållas från alla video "filer ~ befintliga på den för närvarande monterade diskpatronen. Vid inspelning, en enda videoram fångas och spelas in på varje fokal nivå i en skanning; skanningar upprepas med de angivna intervallen. Vid uppspelning kan en användare spela upp inspelningen framåt och bakåt i tiden på en angiven fokalnivå eller gå upp och ner genom fokalnivåerna vid en given tidpunkt. På så sätt är det möjligt att spåra föremål i tre dimensioner under den period då inspelningen gjordes. Programmen är skrivna av Mike Thomson vid Laboratoriet för molekylärbiologi Elektronik Workshop. Eftersom embryon i ett tidigt pronukleärt stadium är permeabla för nokodazol, genomfördes behandlingen av dessa embryon med detta läkemedel genom att använda lämplig koncentration av nokodazol (från 5 mg/ml i DMSO stamlösning) i äggsalter. Äldre embryon behandlades genom laserpermeabilisering av det chitinösa äggskalet i närvaro av äggsalter som innehåller nokodazol. Embryos var också permeabilized till cytochalasin D (från en 1 mg/ml i DMSO stamlösning) med hjälp av laser. Laser microbeam permeabilization utfördes som beskrivits tidigare. Granuler spårades direkt från videomonitorn på acetatark med lämpliga tidsintervall. Delvis synkroniserade unga vuxna tvättades från NGM plattor till M9 buffert (Brenner, 1974). Maskarna behandlades med 3% hypoklorit, 0,8 M NaOH i M9 vilket får dem att bryta upp och släppa sina embryon. Embryona samlades genom centrifugering i en bänkskiva (1 500 rpm, 30 s). Embryona tvättades två gånger i M9 med centrifugering och omsuspenderades sedan i 10/~g/ml nokodazol i äggsalter. De resuspenderade embryona var sedan permeabiliserade genom att tvingas med måttligt tryck genom en 30 g nål för att ta bort äggskalen. De permeabiliserade embryona inkuberades i,o5-10 min vid rumstemperatur i nokodazollösningen. Mikrofilament fixering och färgning utfördes som beskrivs i Hill och Strome (1988). För att fixa en lika stor volym nyberedd 3,0% paraformaldehyd, 0,2% glutaraldehye i äggsalter tillsattes och blandades snabbt. Endast permeabiliserade embryon fastställdes genom detta förfarande; sådana embryon skulle därför ha varit permeabla för nokodazol. Fixation tilläts fortsätta i 3 timmar vid 16"C med skakning. Efter fixering samlades embryona in genom centrifugering, omsuspenderades i en lösning på 0,5 % Triton X-100 i äggsalter och extraherades under 1 timme vid rumstemperatur. Embryona samlades genom centrifugering och återsuspenderades i 6,6 nM Bodipy-falsyrain (Molecular Probes Inc., Eugene, OR) i PBS innehållande 0,25 % Triton X-100. De blev sedan fläckade över natten vid 16°C med agitation. De fläckade embryona samlades in genom centrifugering, återsuspenderades i en liten volym PBS innehållande 1 ~g/ml DAPI för att färga nukleinet, och placerades på en polylysinbelagd rutschkana. Ett täckglas med två smörjda kanter lades över embryona, och PBS var elakt undertill för att tvätta. Slutligen monterades embryona i DABCO/glycerol och undersöktes med hjälp av ett BioRad MRC-600 laserscannande konfokalmikroskop.
Till exempel, i de mycket tidiga stadierna av pronukleär migration i C. Elegans embryo, den kvinnliga pronucleus flyttar från den främre sidan mot den manliga pronucleus, förmodligen på grund av strömmande flöden längs cellperiferin REF som produceras av rörelser aktin-myosin cortex.
Cortical and cytoplasmic flow polarity in early embryonic cells of Caenorhabditis elegans
{'venue': 'The Journal of Cell Biology', 'journal': 'The Journal of Cell Biology', 'mag_field_of_study': ['Medicine', 'Biology']}