Konnektivitetsarkitekturen hos de neuronala kretsarna är viktig för att förstå hur hjärnor fungerar, men vår kunskap om de neuronala ledningsdiagrammen är fortfarande begränsad och partiell. Tekniska genombrott inom märkning och avbildningsmetoder som startade för mer än hundra år sedan har avancerad kunskap inom området. Men volymen av data i samband med avbildning av en hel hjärna eller en betydande del därav, med elektron eller ljusmikroskopi, har först nyligen blivit tillgänglig för digital lagring och analys. En mushjärna avbildad vid ljusmikroskopisk upplösning handlar om en terabyte av data, och 1 mm 3 av hjärnan vid EM-upplösning är ungefär en halv petabyte. Detta har gett upphov till ett nytt forskningsområde, beräkningsanalys av storskaliga neuroanatomiska datauppsättningar, med mål som inkluderar rekonstruktioner av morfologin hos enskilda neuroner såväl som hela kretsar. Problemen omfattar stor datahantering, segmentering och 3D-rekonstruktion, beräkningsgeometri och arbetsflödeshantering som möjliggör hybrida tillvägagångssätt som kombinerar manuell och algoritmisk bearbetning. Här går vi igenom detta växande fält av neuronal dataanalys med tonvikt på att rekonstruera neuroner från EM data kuber. DOI 10.1016DOI 10. /j.conb.2011 Introduktion Neuroatomisk forskning har varit beroende av stora volymer av bilddata från starten. Ramó n y Cajal, som arbetade i början av 1900-talet, producerade mer än tusen manuella ritningar av nervceller [1] [2] [3] [4] baserade på ljusmikroskopi (LM) av Golgi-fläckade neuroner, medan den första fullständiga rekonstruktionen av Caenorhabditis elegans neuronal krets [5 ], initierad på 1970-talet, involverade redan 10 000 elektronmikroskopiska (EM) bilder. Samtida initiativ för att kartlägga lokala kretsar med hjälp av EM [6,7-9,10,11,12,13], eller för att kartlägga projektionsmönster på en hel hjärna nivå [14,15 ] med hjälp av LM, har höga dataöverföringshastigheter som kan vara i intervallet av gigabyte per minut och är jämförbara med de datahastigheter som är bekanta i moderna partikelacceleratorer. Vid LM upplösning en mus hjärna producerar $ 1 TB data och en mänsklig hjärna $ 1 petabyte (PB), medan bara 1 mm 3 vävnad i EM producerar upp till en petabyte data. Stora volymer av bilddata som måste hanteras och analyseras utgör betydande hård-, programvaru- och algoritmiska utmaningar. Liknande utmaningar påträffas även inom den kommersiella domänen, som exemplifieras av Google Earth eller Youtube databaser; utan tvekan de neuroanatomiska datamängder är mindre, men måste hanteras och analyseras med en mindre ekonomisk fotavtryck, vilket ger upphov till särskilda utmaningar. Bilddata annotation och kvantifiering i neuroanatomi har nästan uteslutande manuellt fram till nyligen [6,10,11,12 ], med en ökande användning av beräkningsverktyg och visningsgränssnitt för att underlätta mänskligt arbete. Även om effektiv maskin-mänsklig interaktion avsevärt kan förbättra analysgenomströmningen, är detta dock inte en godtyckligt skalbar framtida lösning på de dataanalysutmaningar som orsakas av neuroanatomi med hög genomströmning, vilket kommer att krävas för storskalig kretskartläggning. Att återskapa en enda neuron på ljusmikroskopnivå tar dussintals timmar, samtidigt som det tar 100 gånger längre tid att göra samma sak för EM-data [13]. Trots det starka behovet av automatisering har algoritmer ännu inte lyckats ta över rekonstruktionsuppgiften (även om utmaningen är erkänd och arbetas på [16], jfr. DIADEM-utmaningen för ljusmikroskopisk rekonstruktion [17] [18] [18] [19]. Kvantifiering av cellkroppar har klarat sig något bättre, vilket exemplifieras av Allen Gene Expression Atlas i mushjärnan [20, 21] som kondenserar hundratals terabyte råa bilddata till ett gemensamt registrerat, voxellerat antal märkta celler. Denna automatiserade analys saknar dock fortfarande klassiska stereotypa förfaranden för histologisk kvantifiering (t.ex. Den nuvarande avsaknaden av effektiva helautomatiska verktyg för neuroanatomi med hög genomströmning indikerar behovet av två linjer av algoritm och mjukvaruutveckling. För det första innebär en pragmatisk hybridmetod en arbetsfördelning mellan maskin och människa, som utnyttjar förstärkningen av människans förmågor med hjälp av effektiva programvaruverktyg. I detta tillvägagångssätt, som exemplifieras av programvara som nu används till en navigerings- och kommentarsvolymer som inte begränsas av RAM utan av disklagring; för V3D är RAM-begränsningen undantagen från kartvyinsticksprogrammet. b Många ursprungliga studier använde detta verktyg; se den citerade referensen för en översyn. c Alla förtecknade rekonstruktionsverktyg syftar till att tillhandahålla 3D-objekt. Skillnaden som görs här mellan 2D och 3D är dock baserad på sättet att annotera, och beror på anisotropin av de använda datamängderna (s. Text och figur 1 rekonstruera neuroner från EM data kuber [24 ], algoritmer används för låg nivå bildbehandling (sömnad, anpassning, kontrast anpassning), och människor bidrar sin unika förmåga att upptäcka och spåra neurala processer i bullriga data. Ett andra, mer fullständigt automatiserat tillvägagångssätt som kräver minimal mänsklig intervention eftersträvas också (till exempel för att räkna cellkroppar i en volym av neuronal vävnad, Mitra, opublicerad). I detta tillvägagångssätt finns det en tidsmässig separation av mänsklig och maskinansträngning: det inledande, mänskliga arbetsintensiva skedet innebär prototyper av nödvändiga algoritmer, potentiellt försöker replikera mänsklig prestanda, medan det senare skedet automatiseras med minimal mänsklig intervention i form av kvalitetskontroll förfaranden på produktionen. Denna översyn syftar till att sammanfatta den tillgängliga programvaran för analys av storskaliga neuroanatomiska datamängder med särskilt fokus på rekonstruktion av neuroner från EM-data (tabell 1, figur 2 ), med uppmärksamhet på de detaljerade tekniska frågor som uppstår i specifika metoder för insamling av data. Vi tar kort upp de metoder som ingår i LM-dataanalys för att ge vissa kontraster till EM-relaterade datautmaningar. Vi fokuserar på de verktyg som har varit produktiva i en konkret neurobiologisk miljö. De flesta studier som framgångsrikt har använt elektronmikroskopisk avbildning för analys av neuronal konnektivitet [5,10,25-27] skära vävnaden av intresse i hundratals eller tusentals mycket tunna skivor, vid en tjocklek av typiskt 40-90 nm. Därefter avbildas dessa skivor med hjälp av transmissionselektronmikroskop (TEMs), som ger en upplösning i planet på vanligtvis 4-8 nm, eftersom elektroner med mycket hög energi kan användas för att ge provkontrast. En automatiserad serieindelning av EM utvecklades för några år sedan [8]. Detta tillvägagångssätt (AT(L)UM) fäster en bandsamlingsmekanism till en konventionell ultramikrotom, som ger en mer tillförlitlig metod för att plocka upp de många ultratunn skivor som produceras i ssEM, och minskar tjockleken på skivorna till upp till 30 nm eller mindre. Eftersom bandtransportören inte är elektrontransparent avbildas skivorna med hjälp av skanningselektronmikroskopi (SEM). Denna metod ger en voxelstorlek på normalt 5-10 nm Â 25-30 nm. När man använder ssEM är därför datamängderna vanligtvis mycket anisotropa i upplösning: mycket hög upplösning i planet, men upp till en faktor på 10 mindre upplösning över plan. Denna metod och dess tillhörande anisotropi har flera konsekvenser för dataanalys: (1) Sekventiella bilder måste anpassas till varandra, eftersom de tas oberoende av många fysiska sektioner, och för närvarande kräver detta vanligtvis manuell interaktion med data. (2) Förvrängningar på grund av vikning, stretching och klippning måste korrigeras, vanligtvis genom förvrängning algoritmer som innebär icke-affin registrering. (3) Datasurfing har två lägen: den ena är i sidled panorering över en stor en-slice bild med behovet av att zooma in och ut från en upplösning av några nanometer till flera mikrometer; den andra vänder genom efterföljande bilder. (4) Uppgiftsinteckningen är nästan uteslutande i planet, eller tvådimensionell, eftersom upplösningen är mycket högre i planet. Vanligtvis, neuriter beskrivs som konturer i en bild, och sedan identifieras igen i den efterföljande korrekt i linje skiva. Denna slutsats från en bit till nästa förvandlar rekonstruktionen till vad man kan kalla 21⁄2-dimensionell data annotation (figur 1a ). Schematisk av rekonstruktionslägen för storskaliga EM- eller LM-data, beroende på graden av anisotropi av bilddata. (a) När upplösningen i planet är betydligt högre än den för plan, görs rekonstruktion i planet och strukturer följs in i de angränsande sektionerna. Detta är det typiska återuppbyggnadsläget för sSTEM (s. Text) och uppgår till en '21⁄2D-' återuppbyggnad. (b) När voxelstorlekarna är nära isotropa kan neuriter rekonstrueras i 3D. Detta är det typiska rekonstruktionsläget för SBEM, FIB-SEM, och vissa LM datamängder (s. Text). Den mest använda programvaran för båda typerna av återuppbyggnad listas i figur 2. Den banbrytande Reconstruct programvara av Fiala et al. [28] användes för många EM studier som behandlar synaps och ryggrad geometri [10,29,30], och rekonstruktion av neuritfragment [31]. Det ger anpassning och ytrekonstruktion rutiner, men begränsas av mängden data som kan laddas in i huvuddatorminnet. Ett framgångsrikt programpaket som övervinner dessa minnesbegränsningar är programvaran TrakEM2 av Cardona et al. [12 ], som också innehåller bra anpassning och sömmer rutiner [32]. Det har använts i flera nyligen genomförda studier som behandlar neuronal konnektivitet i fluglarver [12,33-35] och mus cortex [11]. Metoder som försöker automatisera neuritrekonstruktion från anisotropa data eller under antagande av anisotropa neuriter (löper i en föredragen riktning) genom att imitera konturdetektering-och-förökningsprocessen är under utveckling [36] [37] [38], och börjar tillämpas på neurobiologiska studier [10 ]. Metoder för automatisk avbildning av block av nervvävnad i elektronmikroskopet har också utvecklats under de senaste åren (jfr. Även Briggman och Bocks granskning i denna fråga). Dessa metoder kräver en-bloc färgning av vävnaden, som sedan överförs till elektronmikroskopet, där ytan av vävnadsblocket avbildas av en skanning elektronstråle. Därefter slipas vävnadsblockets topp med hjälp av antingen en diamantkniv (SBEM [6,7]) eller en fokuserad jonstråle (FIB-SEM [9]), och den nyligen exponerade ytan avbildas igen. Dessa avbildningsmetoder ger en mycket mer isotropisk voxelstorlek: upplösningen i z begränsas mestadels av skärtjockleken, som för närvarande är 25 nm för SBEM [6 ] och typiskt 5-8 nm för FIB-SEM [9]. Resolutionen i planet är för närvarande 12 nm för SBEM och upp till 4 nm för FIB-SEM. Eftersom bilderna tas från ytan av vävnadsblocket innan ytan skärs av, är bilderna oftast mycket väl i linje, och kräver mycket mindre efterbehandling, om någon. Men eftersom synfältet för skannande elektronstråle är begränsat, är bild förvärv vanligtvis kaklad, kräver post-hoc sömning av bilder i varje bildplan. Som en följd av detta kräver analysen av sådana data: (1) Lateral anpassning, oftast endast översättning, och sömmar; båda kan vanligtvis göras automatiskt utan användarinteraktion. (2) Fullt 3D-datanavigering, antingen genom att visa data som är praktiskt taget provtagna i tre ortogonala plan, eller genom att tillhandahålla ett snedt bildplan. (3) 3D data annotation (s. Figur 1b). Data annotation kan göras genom att konturera neuritväggarna; detta liknar analysen av ssEM data. Men det är inte trivialt, som var utformad för hela hjärnan LM data. (c) Snapshot och rekonstruktion (infälld) med KNOSSOS [24], som anpassades till 3D EM-data från SBEM- eller FIB/SEM-experiment. Se tabell 1 för en översikt över tillgängliga återuppbyggnadsverktyg och deras mångsidighet. Bilder med tillstånd av A. Cardona (a) och H. Peng (b). (Tabell 1)............................................................................................... Av dessa är KNOSSOS och Ssecret helt oberoende av datamängdens storlek, eftersom de endast laddar det segment av data som för närvarande visas i huvudminnet, vilket möjliggör användning på bärbara datorer (åtminstone när det gäller KNOSSOS). KNOSSOS är tillägnad skelett rekonstruktioner, men ger inte en volym annotering alternativ. ITK-SNAP tillåter endast volymmärkning och innehåller ormalgoritmen för semiautomated rekonstruktion. V3D ger alternativ för både volym och skelett annotation, och Ilastik har en semi-automatiserad märkningsmetod för volym annotation baserat på den asymmetriska watershed algoritm. Kretsrekonstruktion från blockface EM-data har nyligen framgångsrikt applicerats på riktning-selektivitetskretsen i mus näthinnan [6 ], med KNOSSOS för neuronrekonstruktion, och ITK-snap för synaps märkning. Ilastik har applicerats på synapsdetektion i mus neokortikal neuropil [44]. Oberoende av de metoder som används för avbildning och rekonstruktion måste tillförlitligheten hos de erhållna resultaten bedömas kritiskt. Hittills har experter mestadels antas kunna korrekt analysera anatomiska data, om bara tillräckligt med tid spenderades på ett givet prov. Även om detta antagande sannolikt är sant för glest färgade neuroner, fel som görs även av experter blir kritiska i täta storskaliga manuella rekonstruktioner. Detta har först nyligen erkänts fullt ut, och håller på att lösas genom antingen korrekturläsning [10,38,45,46], eller upprepande rekonstruera samma neuroner av olika användare, följt av en statistiskt motiverad konsensus förfarande [24 ]. Kompletterande till den högupplösta men hittills begränsade volymen EM-baserade återuppbyggnadsinsatser, initiativ för att kartlägga långdistans neuronal konnektivitet med hjälp av ljusmikroskopisk märkning av enstaka neuroner eller små populationer av neuroner avbildade i hela hjärnor är också fullföljas [14,47,48]. Strikt taget kartlägger nuvarande LM-baserade metoder (såvida de inte baseras på transsynaptiska virus eller kombineras med andra metoder) neuroners morfologiska egenskaper, från vilka konnektivitetsinformation kan härledas. Metodiken och datautmaningarna beror på hjärnans storlek. För den lilla Drosophila hjärnan, enskilda neuroner som spänner över en rumslig omfattning jämförbar med hela hjärnan kan skannas med konfokal mikroskopi eller två-foton mikroskopi efter att göra hjärnan transparent. En publicerad LM-baserad atlas av en samling neuroner från Drosophila hjärnan är nu tillgänglig [49 ], och algoritmisk utveckling för samregistrering av enskilda flyga hjärnor till digitala atlaser är på god väg [15 ]. Kartläggning av anslutningsmöjligheter i större hjärnor (t.ex. mus) innebär avsevärt ökade utmaningar [14,50 ]. Fysisk sektionning krävs för närvarande för att visualisera hela hjärnan, även om avbildningsmetoder där hjärnan görs transparent också för närvarande utvecklas [51]. Ljusmikroskopi utförs på en serie optiska sektioner, och paralleller kan hittas till den seriella delen EM och seriella blockface EM-metoder. Den analoga av seriella snittmetoden är bekant från klassiska neuroanatomiska arbete, och i denna metod tunna vävnadssektioner skärs med en kryomikrotom ($5-50 mm) och placeras på glasglas. En teknik för överföring av band har också utvecklats [52] och används för bearbetning med hög genomströmning, även om full automatisering fortfarande är ett framtida mål. Neuronerna kan bära fluorescerande etikett (framställd med hjälp av injektioner av fluorescerande spårämnen eller virus, eller lämpliga genetiska konstruktioner) eller är lämpliga för ljusfältsavbildning (när det gäller spårämnen som utsätts för immunhistokemisk bearbetning). Bilderna är avbildade med hjälp av bildscanning mikroskop, som varierar i scanning förmåga. I detta tillvägagångssätt är upplösningen anisotropisk (x-y upplösning är 0,5-1 mm i bildplanet, medan zrelösningen i praktiken är inställd på sektionen tjocklek ($5-50 mm, med en tjocklek på 20-25 mm används i hög-genomströmning projekt). Det är möjligt att samla flera z-stacks inom en fysisk sektion för att förbättra zrelösning, men det är opraktiskt att göra detta för närvarande för hela hjärnor. Det är också möjligt att göra konfokal mikroskopi på diabilder men detta är svårt att rutinmässigt göra i stor skala. Anisotropin i bildvoxlarna är således jämförbar med den för ssEM-data (s. ovan). En andra metod parallellt med SBEM har också utvecklats för hela hjärnan optisk avbildning, genom att ta bort vävnadssektioner från ett block med hjälp av en vibratom, medan utför avbildning på ytan av blocket (P. Osten, pers. Meddelande, http://www.tissuevision.com/). Med hjälp av två-foton mikroskopi, leder detta till en mer isotropisk voxellation av hjärnan (t.ex. 2 mm Â 2 mm Â 2 mm voxels); men detta kommer med en betydande tid straff. I praktiken är de datamängder som samlas in med hjälp av denna metod också mycket anisotropa, med en upplösning som är jämförbar med den seriella sektionsmetoden www.sciencedirect.com som beskrivs ovan. Blockfacesektionsmetoden minskar snedvridningen mellan efterföljande sektioner och eliminerar därmed i stor utsträckning det problem med registrering och morfering som behöver åtgärdas för seriell sektionsmetod (även om den senare i viss mån förbättras med hjälp av bandöverföringsmetoden för seriell sektionning). Ett annat framväxande område är den direkta kvantifieringen av cellers antal och densitet på hela hjärnans nivå. Även om detta traditionellt har varit inom området stereologisk kvantifiering med hjälp av datorstödd manuell teknik, har den nuvarande driven för att samla hela hjärndatauppsättningar lett till behovet av rent algoritmiska metoder. Analysrörledningen för hela hjärnan LM-baserade neuroanatomiprojekt har helst en uppsättning steg som inkluderar: (1) Förbehandling för kvalitetskontroll. (2) Registrering av optiska sektioner till var och en för att montera en hel hjärna. (3) Registrering av hela hjärnor till varandra eller till en gemensam referensatlas. (4) Segmentering och kvantifiering av cellkroppar, fragment av neurala processer eller, i särskilda fall, rekonstruktion av hela neuroner. (5) Presentation av behandlade data och råa bilder på webben genom multi-resolution tittare, på databas-understödda webbportaler som tjänar experimentella metadata. (6) Integration med andra relaterade onlineresurser, inklusive neuroanatomiska databaser och publicerad litteratur. I motsats till genomiska datamängder är datavolymerna för stora för att laddas ner över Internet för lokal behandling så vi kan också se tillkomsten av molnbaserad samarbetsbehandling av dessa datamängder. Med publiceringen av storskaliga EM-rekonstruktioner och större LM-baserade kretskartläggningsprojekt på gång har neuroanatomin gått in i en ny, beräkningsdriven och förbättrad fas. I EM-fallet har nästan all den analys som hittills publicerats varit manuell, kanske till $ 10 4 arbetstimmar. Det är tydligt att automatiserad analys fortfarande kräver ytterligare framsteg för att avsevärt minska mängden manuellt arbete inblandade. Dataanalysutmaningarna i beräkningsneuroanatomin är inte av den art att ett enda algoritmiskt genombrott kommer att lösa alla större problem; de underliggande uppgifterna är komplexa och mångfacetterade, och vi förväntar oss gradvisa prestandaökningar. Effektiv data annotation genom optimerad interaktion mellan maskiner och människor kan förväntas spela en betydande roll i en nära framtid.
En fullständig översikt över de olika verktygen och deras styrka och begränsningar finns i REF.
Computational methods and challenges for large-scale circuit mapping
{'venue': 'Current opinion in neurobiology', 'journal': 'Current opinion in neurobiology', 'mag_field_of_study': ['Biology', 'Medicine']}