Registrering av ljusmikroskopibilder av stora, icke genomskinliga exemplar, t.ex. utveckling av flercelliga organismer, kompliceras av minskad kontrast till följd av ljusspridning. Tidig utveckling av zebrafisk kan fångas med hjälp av vanlig mikroskopi av ljusblad, men nya avbildningsstrategier krävs för att erhålla högkvalitativa data om sen utveckling eller mindre transparenta organismer. Vi kombinerade digital skannad laserlampa fluorescensmikroskopi med osammanhängande strukturerad belysningsmikroskopi (dslm-si) och skapade strukturerade belysningsmönster med kontinuerligt justerbara frekvenser. vår metod diskriminerar den provrelaterade spridda bakgrunden från signalfluorescens, vilket tar bort ut-of-focus ljus och optimerar kontrasten mellan i-fokus strukturer. dslm-si ger snabb kontroll över belysningsmönstret, exceptionell bildkvalitet och höga bildhastigheter. Vi utförde långsiktig avbildning av zebrafish utveckling för 58 h och snabb multi-view av tidigt Drosophila melanogaster utveckling. Vi rekonstruerade cellpositioner över tiden från Drosophila dslm-si data och skapade ett flygande digitalt embryo. Kraftfulla nya kvantitativa metoder för utvecklingsbiologi har dykt upp som syftar till att förstå morfogenes, utveckla mental genetik och deras relation systemwide 1-9. Det är nu möjligt att utförligt följa cellbeteende under den första dagen av zebrafish utveckling 6 eller att utföra storskalig kartläggning av genuttryck profiler i nematoder 9. Sådana storskaliga och höggenomströmningsstudier bygger på avancerad fluorescensmikroskopi och automatiserade metoder för bildbehandling och dataanalys. Dessa metoders robusthet beror emellertid i hög grad på ljusmikroskopets prestanda. Nyligen utvecklade vi digitalskannade laserljusfluores cencemicroscopy (DSLM), där ett enda plan i ett prov snabbt skannas med en tunn laserstråle medan en kamerabaserad detektionsarm registrerar en fluorescensbild i rätt vinkel mot belysningsaxeln. Detta tillvägagångssätt ger en kombination av viktiga egenskaper: bildhastighet och signaltonoise förhållandet är hög, och energibelastningen på provet, och därmed fotoblekning och fototoxicitet, hålls på ett minimum 6,7. Tidiga zebrafiskembryon kan registreras för upp till 24 timmar och ge bilddata, från vilka cellrörelser kan rekonstrueras med hög trohet. Liknande analyser vid senare stadier av embryogenes eller för mindre transmorala exemplar, såsom Drosophila melanogasterembryon, hämmas dock av väsentligt ökad ljusspridning. Bildkvalité och kontrast lider vid avbildning av mycket komplexa multicel lular prover med många cellmembran som fungerar som refraktiva gränssnitt eller i embryon, där somatiska celler är uppslukade av en lipidrik äggula (till exempel, tidiga Drosophila embryon). För att ta itu med denna begränsning införde vi tidigare incoher ents strukturerade belysningsmikroskopi 10 till ljusark-baserad avbildning 11 genom att placera en mekanisk härskning i ett konjugerat bildplan i belysningsarmen i ett selektivt plan belysningsmikroskop 12 (en metod som kallas selektiv plan belysningsmikroskopi med strukturerad belysning; SPIMSI) för att illuminera provet med ett fast mönster av ränder snarare än en homogen ljusark. Genom att förvärva en skiftserie av bilder vid olika rumsliga faser av detta mönster kunde vi diskriminera det spridda bakgrundsljuset mot signalfluorescens med hjälp av en enkel processalgoritm. Tyvärr måste hela domen flyttas för att ändra fasen av profilen, och olika regler krävdes för olika frekvenser. SPIMSI drabbades därför av låg bildkvalitet, låg bildhastighet och brist på flexibilitet när det gäller formen och frekvensen av belysningsmönstret 12. Här presenterar vi ett DSLM genomförande av strukturerad illumi nation (DSLMSI) som behandlar alla tre frågor. I DSLMSI moduleras intensiteten hos den lysande laserstrålen elektroniskt i synkronisering med skanningsprocessen. Detta gjorde det möjligt för oss att skapa högkvalitativa sinusoidala intensitetsprofiler. Harmonic komponenter, fas och frekvens av den strukturerade belysningen mönster är flexibla och kan snabbt justeras för att adressera spatiotemporal
Digitalt skannade laserljusblad fluorescensmikroskopi kombineras sedan med osammanhängande strukturerad belysningsmikroskopi för att producera 3D platser av färgade kärnor i Drosophila embryon REF.
Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet–based structured-illumination microscopy
{'venue': 'Nature Methods', 'journal': 'Nature Methods', 'mag_field_of_study': ['Biology', 'Medicine']}