Högt genomflöde av DNA-sekvenseringsteknik har förändrat den genetiska forskningen och börjar påverka klinisk praxis. Att analysera data med hög genomströmning i följd är dock fortfarande en utmaning, särskilt i kliniska miljöer där noggrannhet och vändningstider är kritiska. Vi presenterar en ny strategi för detta problem, implementerad i ett programpaket som heter Platypus. Platypus uppnår hög känslighet och specificitet för SNPs, indels och komplexa polymorphisms genom att använda lokal de novo sammansättning för att generera kandidatvarianter, följt av lokal justering och probabilistic haplotype uppskattning. Det är en storleksordning snabbare än befintliga verktyg och genererar samtal från rå anpassad läsdata utan förbehandling. Vi demonstrerar prestandan av Platypus i kliniskt relevant experimentell design genom att jämföra med SAMtools och GATK på helgenom- och exomfångsdata, genom att identifiera de novo variation i 15 moder-avkomma trios med hög känslighet och specificitet, och genom att uppskatta humana leukocytgenotyper direkt från variantanrop. Tekniker för höggenomströmning av DNA-sekvensering gör det nu möjligt att generera stora mängder högkvalitativa sekvensdata till en blygsam kostnad. Men trots betydande framsteg i algoritmutveckling [1] [2] [3] [4] [5] [6], behandlingen av dessa data till högkvalitativa variantsamtal förblir utmanande 7. Kvalitetskraven är särskilt stränga för kliniska tillämpningar. Här identifierar vi fyra sådana krav. För det första bör algoritmer ha hög kapacitet för att upptäcka ett brett spektrum av variationer, inklusive en- och flera nukleotidvarianter (SNV:er och MNV:er) och strukturella variationer inklusive indelningar, sekvensbyten och mobila elementinsättningar. Även om relativt sällsynt, strukturell variation är berikad bland varianter med fenotypiska effekter 8. Dessutom kan förmågan att kvantifiera bevis för frånvaron av variation vara avgörande i ett kliniskt sammanhang. För det andra måste pipelines ha låg falsk upptäcktsfrekvens (FDR), till exempel när man identifierar de novo-mutationer som ligger till grund för mendeliska störningar i moder-avkomma trios, för att minimera kostsamma valideringsförsök. För det tredje bör pipelines kunna hantera utmanande loci, inklusive mycket repetitiv sekvens och referensfel, och vara robusta till höga nivåer av lokal mångfald för att få tillgång till kliniskt intressanta regioner som humant leukocytantigen (HLA) loci 9. För det fjärde bör pipelines ha låga resursbehov och drivas på råvaruhårdvara samtidigt som snabba vändningstider uppnås. Med dessa krav i åtanke har vi utvecklat en ny metod som integrerar flera strategier för detta problem i ett enda, mycket optimerat genomförande. Den vanligaste metoden är att kartlägga läser till en referensgenom 6,10-13 och antingen skanna för systematiska skillnader med referensen eller identifiera haplotyper som stöds väl av data 14. Styrkan i detta tillvägagångssätt inkluderar hög känslighet 1, 11; tillgång till de flesta av den mänskliga genom, inklusive repetitiva regioner, genom att utnyttja parad-end läsinformation 10; och relativt låga resurskrav från bearbetning läser på ett strömmande sätt 12. Kartläggningsmetoder har dock flera svagheter. För det första fokuserar kartbaserade samtal ofta på en enda variant typ 1-4, vilket leder till fel runt indels och större varianter 2,15. För det andra kan detta tillvägagångssätt misslyckas i mycket olika regioner där systematiska avvikelser ger felaktigt stöd för SNV och andra varianter 16. För det tredje, kartläggning-baserade anropare tenderar att förlita sig på den nucleotide-nivå noggrannhet läsuppriktningar 3, 4, 15, och, även om dessa kan förbättras genom att justera runt kända indels 1, Denna process är kostsam, bygger på en ordbok av kända polymorphic indels och förbättrar inte anpassningarna runt andra varianter typer. En kompletterande metod som undviker dessa begränsningar är referensfri sekvensmontering 5, [17] [18] [19] [20]. Montering algoritmer bygga en de Bruijn 5,20,21 eller överlappa 22,23 graf och söka denna datastruktur för bevis på polymorphisms. Genom att inte förlita sig på ett referensgenom, är detta tillvägagångssätt variant agnostic, klarar väl med mycket olika regioner, naturligt arbetar på den lokala haplotype nivån snarare än på nivån av enskilda varianter och undviker behovet av en inledande kartläggning och anpassning steg. Men, monteringsalgoritmer har vanligtvis höga beräkningskrav 21 Nature GeNetics VolumeME 46  och number 8  på AUGUST 2014 9 1 3 kartläggningsbaserade tillvägagångssätt 5 och begränsas av repetitiva sekvens, som contiguity information går förlorad när avläsningarna bryts upp i sina på varandra följande k-mers under grafkonstruktion. Förutom att direkt utnyttja avläsningar från urvalet av intresse, vissa algoritmer lånar information över relaterade prover [1] [2] [3] 5. Genom att separera processerna för att identifiera och genotypa varianter, även en svagt stödd variant i ett prov kan säkert kallas om det starkt stöds av ett annat prov eller prover. Detta tillvägagångssätt minskar frekvensen av falska negativa samtal på grund av nedåtgående variationer i lästäckning, en funktion som är viktig i jämförelser av tumörer och metastaser 24, populationsbaserade studier 25 och stamtavla inklusive förälder-avkomma trios i de novo upptäckt mönster. Även om var och en av dessa metoder har förtjänster, ingen algoritm hittills kombinerar alla av dem. Här beskriver vi Platypus, en algoritm som kombinerar en haplotypbaserad, multi-prov variant anropare med lokal sekvens montering i en Bayesian statistisk ram. Vi visar att integrering av de tre tillvägagångssätten resulterar i hög känslighet och specificitet i flera kliniskt relevanta experimentella mönster, över en rad olika mutationstyper, inklusive komplexa variationer och indelser upp till ~1 kb i storlek, i både låg- och högdivergens regioner av genomet. Förutom variantsamtal tillhandahåller Platypus även referenssamtal och lokal länkinformation mellan så kallade varianter, och vi använder dessa för att uppskatta HLA-genotyper direkt från dessa data. Genomförandet har låga resursbehov och ger en process i ett steg som undviker behovet av mellanfiler, vilket möjliggör snabb behandling av stora volymer data med hög genomströmning i sekvens på standardhårdvara. RESULTAT Algoritmen börjar med att generera en uppsättning kandidatvarianter att beakta i efterföljande steg (Fig. 1a).............................................................................................. Tre källor till kandidater kan övervägas: varianter som stöds direkt av läsuppställningar, varianter som identifieras genom montering och varianter från externa källor, såsom databaser över kända polymorfismer. Monteraren anser att små (standard av 1,5 kb) fönster i taget, bearbetning läser den kartan in i fönstret, samt deras partner, oavsett kartstatus och plats. En färgad de Bruijn graf 5 genereras från läs- och referenssekvenser. Eftersom läsorienteringen är känd, som minst en läst från varje par kartläggs, bygger vi bara grafen på den främre tråden. Därefter, en uttömmande djup-första traversal algoritm extraherar alla unika vägar som börjar och slutar på referenssekvensen; var och en av dessa vägar representerar en alternativ allel kandidat. Algoritmen, som alltid returnerar icke-självskärande banor, påverkas inte av repetitiva element som orsakar komplexa slingor och trassel eller av förekomsten av flera banor som delar undergrupper av grafen. Detta tillvägagångssätt skiljer sig från det som används av de flesta globala montörer, som vanligtvis identifierar relativt enkla alternativa vägar ('bubbles') för att uppnå hög specificitet; däremot är Platypus kandidatgenerationsstadium utformat för att uppnå hög känslighet. Vi samlar sedan kandidatvarianter i väl åtskilda fönster som vardera innehåller ett begränsat antal kandidater. Dessa kandidater kombineras sedan till en uttömmande lista över haplotyper. Om ett fönster innehåller många kandidater använder vi en ungefärlig sannolikhetsberäkning för att endast beakta de mest lovande haplotyperna (upp till 256 som standard). Efter listan över haplotyper genereras, deras frekvens uppskattas under en diploid segregation modell (Fig. 1b)................................................................................................ För det första, matrisen av sannolikheten för varje avläsning ges varje kandidat haplotypes beräknas. Denna beräkning innebär sekvensjustering enligt en felmodell som inkluderar positionsberoende sannolikheter specifika för tekniken och en bas missmatchning sannolikheter från läskvalitetspoäng. En förväntan-maximization (EM) algoritm uppskattar population haplotyp frekvens från dessa sannolikheter. Den uppskattade populationen haplotyp frekvenser används som tidigare för att ringa haplotyper i varje prov (Fig. 1c)........................................................................................................... Vi bryter upp kallade haplotyper i deras ingående varianter och beräknar variantspecifika genotypanrop och sannolikheter genom att marginalisera över de andra varianterna i regionen. På så sätt bidrar lokal länkinformation som kodas i avläsningar till att informera genotypen av länkad variation i ett fönster. Vi rapporterar uttryckligen en del länkinformation i ansökningsomgångarna, som kan användas i efterföljande fas- och imputeringsledningar. Vi tillämpar slutligen en uppsättning filter för att ta bort falska samtal på grund av data artefakter som inte är modellerade explicit. Dessa inkluderar filter för allel och tråd bias, kartläggning kvalitet, baskvalitet, insats storlek, sekvens sammanhang och bakre sannolikhet för varianten; vi använde standardtrösklar i hela. En fullständig beskrivning av algoritmen ges i den kompletterande anmärkningen. För att bedöma prestandan hos Platypus på hela genomdata analyserade vi offentligt tillgängliga data (75-86 × 100-bp parade Illumina HiSeq 2000 läser) från en välstuderad moder-avkomma trio (NA 12878, NA 12891 och NA 12892; CEU kohort av prover från Utah av norra och västra europeiska anor). Vi använde SNP chip och hög kvalitet haploid fosmid data som tidigare genererats för NA12878 (ref. 26) för att uppskatta känslighet och FDR. Vi jämförde Platypus med två allmänt använda variantuppringare, Genome Analysis Toolkit (GATK) 1 och 9 1 4 VolumeME 46 _BAR_NUMMER 8 August 2014 Nature GeNetics t e c h n i c a l r e p o rt s SAMtools 3. För GATK använde vi den allmänt tillgängliga "bästa praxis" GATK anrop som gjordes med den senaste UnifiedGenotyper och en anrop som gjordes med HaplotypeCaller, med hjälp av standardargument. Samtools anropsset gjordes med hjälp av det publicerade protokollet (se den kompletterande anmärkningen för närmare information). Kvalitetsmått visade att Platypus uppnådde hög specificitet för både SNP och indels (tabell 1). Förhållandet mellan övergång och omvandling (ti/tv) på 2.136 är jämförbart med tidigare uppskattningar 25, vilket tyder på god specificitet för SNP:er. Detta stöddes av en låg icke-referens samtalsfrekvens (0,024%) på platser som kallas homozygot referens av Axiom SNP chip. Manuell kontroll och jämförelse med andra anropsuppsättningar tyder på att den stora majoriteten av dessa diskrepanser var Axiom genotypningsfel (kompletterande tabell 1 och kompletterande anmärkning). Det faktum att SNP-chips är partiska, inklusive det faktum att webbplatser som är tillgängliga för SNP-chips tenderar att vara lätta att ringa från kortlästa data, innebär att denna siffra sannolikt underskattar den verkliga FDR. Fosmid data gör att vi kan placera en övre gräns på FDR, med hjälp av platser som kallas homozygot variant men där fosmid data stöder referenssekvensen 5. För Platypus hittade vi 8 sådana platser, vilket resulterade i en FDR övre gräns på 0,4% (8/1,891). Alla disharmoniska varianter var i dbSNP137, och de flesta (6/8) hade en låg genotypkvalitetspoäng (<45), med båda måtten indikerar att dessa varianter kan representera genotypningsfel av verkliga heterozygota varianter snarare än falska positiva variantanrop. Utifrån dessa data uppskattade vi Platypus känslighet för SNP-samtal till 94,1 % respektive 90,1 % med hjälp av Axiom-data och fosmidsekvenser. Dessa uppskattningar liknar dem för GATK UnifiedGenotypier (94,8 % och 83,6 %) och GATK HaplotypeCaller (95,5 och 84,2 %) och är något lägre än för SAMtools (96,8 % och 92,4 %). Majoriteten av Axiom SNP som inte kallades av Platypus missades på grund av lågt lässtöd (52%; 476/916 stöddes av 2 eller färre avläsningar), sannolikt på grund av variation i cellinjesubkloner, eller kallades men markerades som osäkra (33%; 301/916). Platypus identifierade också regioner där sekvensdata gav positivt stöd för frånvaron av variation. Axiom data indikerade att Platypus hade över 98% känslighet för att ringa referenssekvens (referenssamtal gjordes på 254.066/258.914 av Axiom homozygot referens platser). Indels är mer utmanande att ringa exakt från kortlästa data än SNPs eftersom deras genomic mutationsfrekvens är mycket kontextberoende 8 och korrelerar med sekvensering felhastigheter 2. Dessutom är indelserna ungefär tiofaldigt mindre rikliga än SNP:er, så att en given falsk positiv samtalsfrekvens översätts till en tiofaldig högre FDR bland indels än SNP:er. Från fosmiddata uppskattade vi den övre FDR-gränsen för indels till 4,6 % (12/250), ungefär hälften av FDR-skattningarna för SAMtools och GATK-algoritmerna. De flesta disharmoniska varianter (7/12) hade exakta matchningar med dbSNP137, vilket tyder på att den verkliga FDR kan vara lägre. Manuell kontroll av de kortlästa och fosmida data visade att 5 av 12 disharmoniska varianter kallades korrekt men rapporterades över flera samtalsposter, medan resten sannolikt är falska positiva samtal i repetitiva eller tandem repetitiva regioner. Vi uppskattade därför FDR för indels till 2,8 % (7/250). Med hjälp av fosmiddata uppskattade vi Platypus känslighet för indels till 53,0 %. Denna låga känslighet drivs till stor del av indels i homopolymeric och tandem repetitive indel hotspots som filtreras ut för att ta itu med vanliga sekvens artefakter i dessa regioner. Ta bort ~1% av mycket repetitiva genomiska regioner med höga förutsagda indelfrekvenser (25,4 Mb; se ref. 8) ökad känslighet för 76, 0% (GATK UnifiedGenotype, 78, 3%; GATK HaplotypeCaller, 81, 0%; SAMtools, 75, 5%). Platypus identifierade också ett stort antal MNPs (definierat som par av SNPs på högst 5 bp isär) och komplexa ersättningshändelser, som varierar i storlek från 2 till 66 bp. En betydande del av basförändringarna i dessa händelser matchade tidigare sett SNP (37,5%; 51,834/138,036). Vissa av dessa kan motsvara två eller flera oberoende SNP, men majoriteten sannolikt har uppstått från enstaka mutationshändelser som påverkar multipla nukleotider 27. Lokal montering gör det möjligt för Platypus att ringa varianter betydligt större (upp till ~1 kb) än de som kan identifieras inom en enda avläsning. Platypus kunde identifiera 27.608 raderingar mellan 50 och 2.288 bp i längd och 481 tillägg mellan 50 (Fig. 2).................................................................. Den strategi för kartläggning som följs av lokal församling kräver avläsningar som bidrar till en stor insättning för att förankras av sina partner, vilket begränsar den maximala längden av insättningar som kan kallas. Vi fann verkligen att känsligheten för att kalla på tillägg minskade i förhållande till raderingar. Platypus kunde dock fortfarande identifiera åtta hellånga heterozygota Alu-insättningar, som alla tidigare hade validerats 25. I kliniska tillämpningar väljs ofta hel-exom sekvensering över helgenom protokoll på grund av den lägre kostnaden och eftersom den mest kliniskt tolkningsbara variationen sker i kodsekvens. Tekniskt sett skiljer sig exome fångstdata tillräckligt mycket från helgenomedata för att motivera en separat bedömning på grund av specifika fördomar i tekniken (variabel avskiljningseffektivitet vid polymorfa platser, strandfördomar vid fångstgränser och stora variationer i täckningen) och specifika egenskaper hos målet (högt GC-innehåll och förekomsten av paralog sekvens på grund av pseudogener). Vi utvärderade prestandan hos Platypus med hjälp av allmänt tillgängliga exome data från NA12878 trio 25 (100-bp parade-end avläsningar, genomsnittlig täckning på 210×), och vi använde SNP chip data för att uppskatta noggrannheten av variant anrop och genotyping. Resultaten rekapitulerar för det mesta de för hela genomet data. Platypus förmåga att ringa MNPs och komplex variation är särskilt användbar i exome data, eftersom rapportering av enskilda singel-nukleotid förändringar kan komplicera tolkningen av aminosyraförändringar. Frekvensen av disharmoniska samtal på platser genotypade som homozygot referens av Axiom SNP chip var 0,046% (86/186,956; tabell 1). En stor del av disharmoniska varianter kallades komplexa varianter av MNP (40%; 35/86); dessutom ökade disharmonisfrekvensen trefaldigt (till 0,132%) var än två Axiom platser var inom 2 bp av varandra och minskade till 0,037% för isolerade Axiom platser. Denna observation tyder på att en stor del av disharmoniska samtal representerar falska negativa chip samtal, sannolikt eftersom närliggande variation resulterar i sonder misslyckas med att hybridisera korrekt. Samma felläge observerades vid helgenomsamtal (kompletterande anmärkning). Andra algoritmer brukar kalla MNP:er för flera SNP:er och tenderar att filtrera bort högklustrad variation, förklara den till synes bättre prestanda av dessa algoritmer på denna statistik; till exempel, när MNP:er uteslöts, Platypus genotypkonkordans ökade till 98,9%. Flera nyligen genomförda studier har framgångsrikt identifierat sjukdomsframkallande de novo-mutationer med hjälp av sekvensdata från moder-avkomma trios, i både exomes [29] [30] [31] och hela genom 32, 33. Att identifiera 1 kausalvariant bland cirka 70 de novo-mutationer 34 i ett genom som spänner över 3 × 10 9 bp kräver falskt positiva frekvenser under 1 × 10 −8. Befintliga studier uppnå detta genom sträng filtrering med hjälp av kompletterande data, inklusive databaser över kända polymorfismer 29, [31] [32] [33] [34] eller varianter direkt observerade i andra prover 29, 31, 34; sekvensdata från morföräldrar, syskon eller monozygotiska tvillingar 7, 32, 33; funktionella annoteringar 33; kända segmentella dubbleringar 33; eller validering av kandidat de novo mutationer genom Sanger sekvensering 29, 32, 33. Dessutom, vissa studier utelämnade indels på grund av tekniska utmaningar 31, 32, 34, Trots den relativt starka inverkan av indels på fenotyp 8. Istället kallade vi de novo-mutationer av alla typer från enbart triosekvensdata och för filtrering använde vi en Bayesiansk modell som kvantifierar bevisen för en de novo-mutation jämfört med normal mendelisk segregation. Detta tillvägagångssätt gjorde det möjligt för oss att införliva en låg tidigare tro på en de novo mutation på en viss plats och att redogöra för förlust av föräldra heterozygota samtal till följd av fluktuationer i slumpmässig täckning. Specifikt använder vi Bayes' regel för att beräkna den bakre sannolikheten för en de novo-mutation händelse N med tanke på läsdata d som där p(N) är den tidigare sannolikheten för en de novo-mutation (inställd till 2 × 10 −8 mutationer per plats per generation) och p(d) är den marginella sannolikheten för data, beräknad som p (d]N) Här betecknar M och R förekomsten av en variant som följer normala mendeliska segregeringsmönster respektive en icke-variant locus, p(M) = 1 × 10 -3 och p(R) = 1 − p(N) − p(M). Vi accepterar en putativ de novo-mutation om den bakre sannolikheten överstiger 0,5 (se den kompletterande anmärkningen för fullständig information). Detta filter applicerades på alla varianter av anropare. För att bedöma Platypus känslighet analyserade vi återigen data från NA12878 trio som erhållits från förevigade cellinjer och använde sig av en studie av Conrad et al. som identifierade 49 bacterline och 952 cellinje de novo mutationer med hjälp av en uttömmande anropsstrategi följt av omfattande validering 35. Innan det Bayesianska filtret applicerades identifierade Platypus alla groddar och 97 % (924/952) av cellinjemutationerna (tabell 2); av de 28 mutationerna som inte kallas, hade 24 ett mycket lågt lässtöd, sannolikt på grund av icke-klonaliteten hos cellinjeprovet, 9 1 6 Volume 46  med ANM.8 AUGUST 2014 Nature GeNetics t e c h n e c a l e p o r s 2 överlappade raderingsanrop som sannolikt misstolkades som SNP:er i Conrads datauppsättning 35, 1 locus var svårt att tolka och 1 representerade ett verkligt falskt negativt resultat från Platypus konservativa standardfilter (kompletterande tabell 2 och kompletterande anmärkning). Efter applicering av Bayesian filtret, 94% (46/49) och 95% (909/952) av dessa platser hade tillräcklig sekvenstäckning för att övervinna den tidigare sannolikheten för 2 × 10 −8 mutationer per baspar, vilket motsvarar en tidigare förväntan på ~70 de novo mutationer per generation. För att bedöma specificitet analyserade vi avancerade sekvensdata (46-58× täckning, 100-bp parade-end Illumina HiSeq 2000 läser) för en moderavkomma trio som utgjorde en del av en större klinisk omsekvensering studie (H.C. Martin, J.C. Taylor, C. Allan, M. Attar & C. Babbs et al., opublicerade data). Efter Bayesian filtrering, Platypus kallade 94 de novo mutationer i avkomman: 88 SNVs, 1 MNV och 5 indels. Icke-specifik förstärkning och primer design problem resulterade i otolkbara data för 26 av dessa. Av de återstående 68 samtalen (inklusive 5 indels) validerades 63 som sanna de novo-mutationer (60 SNV och 3 indels; kompletterande anmärkning), vilket indikerar en kombinerad FDR på 7,4 % för SNV och indel de novo-mutationssamtal (5/68; 95 % trovärdigt intervall (CI) = 3-16%; online-metoder). Det är möjligt att, bland uppmaningar som valideringsförsöket inte fungerade för, FDR är högre, men det är svårt att på ett meningsfullt sätt uppskatta denna hastighet. Två av de validerade de novo-mutationerna var grupperade SNVs (genomiskt avstånd på 341 bp), vilket tyder på att dessa två mutationer orsakades av en enda mutationshändelse 36. Av de fem samtal som inte validerade, en berodde på en missad föräldra variant på att läsa filtrering på grundval av kartläggning kvalitet. Kartläggning artefakter var också den sannolika orsaken till de fyra andra falska samtal, eftersom de stöds av avläsningar av låg kartkvalitet och ligger i repetitiva sekvenser som LINE och SVA-C repeater. Platypus höga specificitet tar bort behovet av att filtrera genom polymorf status, vilket gör att vi kan identifiera de novo mutationer som förekommer på kända polymorfa platser (homoplasier). Av de 92 novo-mutationer som kallades i den kliniska omsekvenseringsstudien identifierades 3 tidigare som polymorfismer av 1000 Genomes Project 25; 2 av dessa validerades som sanna de novo-mutationer, medan valideringen av den tredje anropet var ofullständig. Denna höga frekvens av homoplasier beror sannolikt på kombinationen av ett stort antal kända polymorfismer och förekomsten av mutationella hotspots, särskilt vid CpG dinucleotides. Beräkning tyder på att i varje generation 3% av de novo mutationer-eller 2.1 av en förväntad 70 mutationer-inträffar på en polymorf bakgrund. Denna förklaring förutsäger att CpG-associerade mutationer är berikade bland homoplastiska de novo-mutationer (kompletterande anmärkning). För att testa denna hypotes, gjorde vi de novo mutation kallar på ytterligare 14 moder-barn trios från samma kliniska omsekvenseringsstudie. Vi korsade de resulterande 1,007 de novo mutation samtal (26-94 per prov, genomsnitt 67,1) med 1000 Genomes Project data, identifiera 52 putativa homoplasier (1-5 per prov, genomsnitt 3,5, alla SNVs; Tabell 3 ). Vi fann, som förväntat, en signifikant anrikning av CpG-associerade mutationer i jämförelse med icke-homoplastiska de novo-mutationer (26/52 mot 245/871; P = 0,001). Den lokala haplotypen kring putativa homoplastiska de novo-mutationer stödde antingen direkt anropet (34/52) eller var ofullständig (9/52), medan ett falskt positivt var indikerat i 9 av 52 fall (kompletterande tabell 3 och kompletterande anmärkning). Nature GeNetics VolumeME 46 NUMMER 8 August 2014 9 1 7 t e c h n i c a l r e p o r ts Application 4: genotyping HLA loci Variation i HLA generna är en viktig faktor för känslighet för smittsamma och autoimmuna sjukdomar, vilket gör HLA genotyping av intresse för medicinsk genetik. Den höga sekvensmångfald och omfattande paralogi av dessa gener utgör en utmaning för HLA genotypning, som vanligtvis utförs av PCR förstärkning och sond hybridization 37. Genom-wide high-throughput sekvensering data är också informativa om HLA genotyp, men, även om användningen av global montering har visat lovande, kartläggning-baserade metoder är för närvarande begränsade av den höga densiteten och komplexiteten av variation i regionen 38. För att bedöma Platypus förmåga att genotyp HLA loci, utnyttjade vi dess förmåga att tillhandahålla explicita referenssamtal närhelst den fann positiva bevis för frånvaron av variation, samt lokal länkinformation. Genom att kombinera dessa data konstruerade vi små genotypkontiger i storlek från 15 till 192 bp över de klassiska HLA klass I generna. Därefter anpassade vi dessa contigs till de 2.186 kända HLA-A, 2.796 HLA-B och 1.746 HLA-C haplotyper som var och en identifierades med en hierarkisk identifierare (till exempel HLA-B*56:01:01) och beräknade genotypsannolikhet för alla HLA genotyper från anpassningspoäng. Slutligen tog vi fram uppskattningar av maxlikelihood för de tre klass I HLA loci (kompletterande bild. 1 )............................................................................................................... Detta förfarande resulterade i unika och korrekta HLA-B- och HLA-C-genotyper med fyrsiffrig upplösning i NA12878 (bild. 3 och Tilläggsbild 2).................................................................. Tre av de fyra allelerna kunde unikt skrivas på sexsiffrig upplösning (kompletterande tabell 4), bättre än vad som uppnåddes genom tidigare laboratorietyp 39. Den uppskattade genotypen för HLA-A var unik och korrekt på tvåsiffrig nivå, med den korrekta fyrsiffriga genotypen (HLA-A*11:01/HLA-A*01:01) i resultaten. De återstående tvetydigheterna orsakas av en kluster av saknade varianter på grund av låg kvalitet avläsningar och skillnader utanför exonic sekvens som för närvarande inte beaktas av rörledningen; till exempel allelerna HLA-A*01:01 och HLA-A*01:04N är identiska med undantag för en 1-bp-längd skillnad på grund av en korrekt kallas splitting variant 5′ till exon 4 orsakar en frameshift i kodon sekvens ( Kompletterande figurer. 3 och 4 och kompletterande anmärkning), som dock ignorerades i genotypning pipeline. Vi introducerar ett nytt tillvägagångssätt till variant kallar från high-throughput sequencing data som integrerar idéer från kartläggning-, montering-och befolkning-baserade samtal. Genom att separera anropsprocessen till ett kandidatgenerationsstadium, utformat för att optimera känsligheten, och ett haplotypbaserat anropssteg, utformat för specificitet, presterar algoritmen bra på båda mätvärdena. Den resulterande hög specificitet eliminerar behovet av aggressiv filtrering när man kallar de novo-mutationer i en moder-avkomma design, förenklar sådana konstruktioner och utökar deras tillämplighet. Med hjälp av denna pipeline, hittar vi bevis för ett genomsnitt av ~2 homoplastic de novo mutationer per generation. För att uppnå den höga känslighet och specificitet som krävs för att upptäcka de novo-mutationer i ett kliniskt sammanhang är det nödvändigt att kontrollera både frekvensen av falska positiva samtal hos barnet och falska negativa samtal hos föräldern. För att uppnå detta krävs tillräcklig sekvenstäckning hos både föräldrar och barn. Med hjälp av probabilistisk skalning av empiriska täckningsdata, finner vi att Platypus uppnår 95% känslighet för de novo mutationer med sekvensdata vid en genomsnittlig täckning på 35×, med specificitet jämförbar med de data som presenteras i denna rapport (Online Methods). Algoritmen har flera funktioner som är viktiga i klinisk design. Genom att använda färgade de Bruijn grafer för att lokalt montera kandidat alleler, algoritmen kan hantera både stora varianter upp till 1 kb i storlek och mycket olika regioner i genomet. I kombination med förmågan att göra referenssamtal och att rapportera lokal länkinformation möjliggör detta högupplösande genotypning av klass I HLA-gener från högflödessekvenseringsdata. Förmågan att göra referenssamtal kommer att vara användbar även i andra kliniska sammanhang, inklusive i skärmar för genetiska anlag för sjukdom, där förmågan att tryggt utesluta vissa varianter kan vara kliniskt relevant. Platypus utförs väl på både helgenom- och exome-kaptur data, och, särskilt för exonic varianter, dess förmåga att kalla multinukleotid polymorphisms kommer att bidra till att korrekt kommentera inverkan på protein-kodande gener av dessa varianter. Platypus är en snabb och effektiv implementering av denna algoritm, kräver varken en komplex bioinformatik pipeline eller omfattande beräkningsresurser. Platypus använder inga mellanliggande filer, minimerar tillgång till BAM-filer och har låga minne och CPU-krav, vilket resulterar i 5-90× snabbare bearbetningstider än med jämförbara algoritmer (tabell 1). Ytterligare funktioner, inklusive sammanslagning, demultiplexering och deduplikation av BAM-filer, förenklar ytterligare behandlingen och minskar I/O-kraven. Flera utökningar av algoritmen kan övervägas. Dessa skulle ge ytterligare bevis som ytterligare skulle förbättra algoritmens förmåga att upptäcka stora (>1-kb) strukturella variationer. Även om algoritmen har framgångsrikt använts för att upptäcka somatiska mutationer i cancervävnad 40, 41, det för närvarande inte specifikt hantera sådana icke-diploida prover, och skräddarsydda modeller kommer att ytterligare förbättra prestanda för dessa applikationer. Det nuvarande genomförandet ger dock högkvalitativa varianter i en rad praktiska kliniska miljöer, och vi hoppas att det kommer att bidra till ett ökat utnyttjande av avancerad sekvenseringsteknik på kliniken. Webbadresser. I-Silico PCR,
Platypus REF fokuserar i allmänhet på mindre indels, men, genom att använda sig av lokal montering, kan också genotyp större.
Integrating mapping-, assembly- and haplotype-based approaches for calling variants in clinical sequencing applications
{'venue': 'Nature Genetics', 'journal': 'Nature Genetics', 'mag_field_of_study': ['Medicine', 'Biology']}