Massivt parallell cDNA-sekvensering (RNA-Seq) ger ett opartiskt sätt att studera en transkriptom, inklusive både kodnings- och icke-kodande gener. Hittills har de flesta RNA-Seq-studier varit avgörande beroende av existerande annoteringar och därmed fokuserat på uttrycksnivåer och variation i kända transkript. Här presenterar vi Skriften, en metod för att rekonstruera transkriptomen av en däggdjurscell med hjälp av endast RNA-Seq läser och genomsekvensen. Vi applicerade den på musembryonala stamceller, neuronala prekursorceller och lungfibroblaster för att korrekt rekonstruera genstrukturerna för de flesta kända uttryckta generna. Vi identifierade betydande variation i proteinkodningsgener, inklusive tusentals nya 5′ startplatser, 3′ ändar och interna kodning exons. Vi bestämde sedan genstrukturerna av mer än tusen stora intergena icke-kodande RNA (lincRNA) och antisense loci. Våra resultat öppnar vägen för att styra experimentell manipulation av tusentals icke-kodande RNA och visa kraften i ab initio rekonstruktion för att göra en omfattande bild av däggdjur transkriptomer. A r t i c l es celler (NPC) och mus lungfibroblaster (MLF) och korrekt identifierat den fullständiga kommenterade fulllånga genstrukturer för de flesta uttryckta, kända, proteinkodande gener. Rekonstruktionen av de tre transkriptomerna avslöjade betydande variation i proteinkodningsgener mellan celltyper, inklusive tusentals nya 5′ startplatser, 3′ ändar eller ytterligare kodning exons. Många av dessa varianter stöds av oberoende data. Vi upptäckte också genstrukturen och uttrycksnivån av över 2.000 icke-kodande transkript, inklusive hundratals transkript från tidigare identifierade lincRNA loci, över tusen fler lincRNAs med liknande egenskaper och hundratals multi-exoniska antisense ncRNAs. Vi visar att lincRNAs inte har någon betydande kodningspotential och att de är evolutionära bevarade. Våra resultat öppnar vägen för att styra experimentell manipulation av denna nya grupp av gener och belysa kraften i RNA-Seq tillsammans med en ab initio rekonstruktion för att ge en omfattande bild av cellspecifika transkriptomer. RESULTAT Vi använde massivt parallell (Illumina) sekvensering till sekvens cDNA bibliotek från poly(A) + mRNA från ESC, NPC och MLF celler, med 76-bas parad-end avläsningar. För ESC-biblioteket genererade vi totalt 152 miljoner paradläsningar. Med hjälp av en gapad anpassning 13, 93 miljoner av dessa var anpassningsbar (497 Mb anpassade baser, 262-faldigt genomsnittlig täckning av kända proteinkodande gener uttryckt i ESC). Vi fick liknande nummer för NPC- och MLF-biblioteken (Online Methods). I ESC, 76% av dessa läser kartlagt inom exonic regioner av kända proteinkodande gener, 9% var i introns av kända proteinkodande gener, och 15% kartlagt i intergenic regioner. Vi fann en stark korrelation mellan uttrycksnivåer av proteinkodningsgener mätt med RNA-Seq och Affymetrix-uttrycksmatriser (r = 0,88 för alla gener; Kompletterande bild. 2 )............................................................................................................... Därefter utvecklade vi Skriften, en genomstyrd metod för att rekonstruera transkriptomen med hjälp av endast en RNA-Seq datauppsättning och en (oannoterad) referensgenomsekvens. Skriften består av fem steg (Fig. 1 A r t i c e s korsningar inom utskriften, och ~30% av 76- bas avläsningar förväntas i genomsnitt spänna över en exon- exon korsning. Från de indelade avläsningarna konstruerar vi en "konnektivitetsgraf" (Fig. 1d), Där två baser i genomet är anslutna om de är omedelbara grannar antingen i genomic sekvensen själv eller inom en skarvat läsa. Vi använder avtal med skarvningsmotiv vid varje putativ korsning för att orientera anslutningen (kanten) i konnektivitetsgraf 9.13 (Fig. 1d) och i enlighet med förordning (EG) nr 1069/2009 (nedan kallad förordning (EG) nr 1069/2009). (ii) För att härleda utskrifter använder vi en statistisk segmenteringsmetod 4 och både skarvade och oskarpade avläsningar för att identifiera sökvägar i konnektivitetsgrafen med kartlagd läsberikning jämfört med genomisk bakgrund (Fig. 1e)............................................................................................................ Detta görs genom att göra ett skjutfönster med hjälp av en teststatistik för varje region, beräkna en tröskel för genom-bred betydelse, och använda betydande fönster för att definiera intervall. (iii) Från sökvägarna konstruerar vi en "ranskriptiv graf" som förbinder varje exon i utskriften (Fig. 1f)............................................................................................................ Varje väg genom grafen är riktad och representerar en orienterad (strand-specifik) isoform av genen. Alternativa skarvade isoformer identifieras genom att beakta alla möjliga vägar i utskriftsgrafen. (iv) Vi utökar utskriftsgrafen med anslutningar baserade på paradedend-avläsningar och deras avståndsbegränsningar, så att vi kan gå med i utskrifter eller ta bort osannolika isoformer (Fig. 1g, nedan). (v) Vi skapar en katalog över utskrifter som definieras av sökvägarna genom utskriftsgrafen. Parad-end information, bestående av avläsningar som kom från de två ändarna av den sekvenserade RNA-fragment, ger värdefull ytterligare information i återuppbyggnaden. För det första visar närvaron av parade ändar som förbinder två regioner att de visas i samma utskrift; en sådan anslutning kanske inte annars är uppenbar eftersom låga uttrycksnivåer eller ojusterbar sekvens kan förhindra en kontinuerlig kedja av överlappande sekvensavläsningar (replicerad eller oreplicerad) över utskriften. Vi ökar således utskriftsgraferna med parad-end information, där tillgänglig, till (indirekt) länk noder i grafen. Vi använder dessa indirekta länkar (Fig. 1g) för att lägga till kanter mellan bortkopplade grafer, lägga till interna noder (exons) som kan ha missats inom en sökväg (transcript) och lägga till extra stöd för befintliga kanter. Detta förfinar strukturen på våra utskrifter och ökar vårt förtroende för dem, särskilt i svagt uttryckta utskrifter, som är mer benägna att ha täckning luckor. För det andra begränsar distributionen av bibliotekets insatsstorlekar avståndet mellan de parade avläsningarna; dessa avståndsbegränsningar kan användas för att dra den relativa sannolikheten för vissa potentiella utskrifter (t.ex. de där de parade ändarna skulle vara mycket närmare eller mycket längre än förväntat). Vi härleder fördelningen av insatsstorlekar för ett givet bibliotek från positionen av läspar på transkript från de gener för vilka det bara finns en enda transkriptmodell (det vill säga, ingen detekterbar alternativ sclicing; Online Methods). I ESC-biblioteket stämmer till exempel denna distribution väl överens med de experimentellt bestämda storlekarna. Med hjälp av denna distribution, tilldelar vi sannolikheten för varje anslutning, filtrera osannolika (Online Methods). Vi tillämpade Skriften på vår mus ESC RNA-Seq data set och jämförde våra rekonstruktioner med proteinkodande genanteckningar 15. Skriften identifierade 16 389 icke-överlappande, multi-exoniska utskrift grafer som motsvarar 15,352 kända multi-exoniska gener (Online Metoder). Av rekonstruerade gener täcks 88,4% av en enda graf (ingen fragmentering av den rekonstruerade utskriften) och 8,0% av två utskriftsgrafer (fragmentering av utskriften till två separata bitar i rekonstruktionen). Fokusera på de 13,362 generna med betydande uttryck (P < 0,05 jämfört med © 2010 Nature America, Inc. Alla rättigheter reserverade. 5 0 6 VOLYM 28 ANTAL 5 MAJ 2010 naturbioteknik A r t i c l es bakgrundstäckning; se Online Metoder), Skriften rekonstruerade den längsta kända splitter isoform (från 5 till 3′ ände, inklusive alla exoner och splitter korsningar; Bild. 2a ) för 10,355 av dem (~78%). Alla våra rekonstruerade transkript för kända multiexoniska transkript hade också rätt orientering (strand), så att vi kan rekonstruera gener som överlappar varandra på motsatta trådar (Fig. 2a)................................................................................................ Fullständiga utskriftsstrukturer återfanns över ett mycket brett spektrum av uttrycksnivåer (Fig. 2b,c) för både enstaka och multiexoniska gener. Till exempel rekonstruerade Skriften noggrant utskriften av ~73% av de kända proteinkodande generna vid den andra kvintilen av uttryck, och ~94% av generna från den översta kvintilen. Dessutom var den genomsnittliga andelen av baserna som rekonstruerades för varje utskrift hög (Fig. 2c)........................................................................................................... Även för botten 5% av uttryckta gener, vi återhämtade oss i genomsnitt 62% av varje av dessa transkript "baser (Fig. 2c)........................................................................................................... För singelexongener återhämtade vi oss i genomsnitt 80% av transkriberade baser. Vi fick liknande resultat i de andra två celltyperna (19 835 och 20 407 utskriftsgrafer för 14,212 respektive 13,351 kända gener i NPC respektive MLF). De flesta av de gener som inte var helt rekonstruerade är de med lågt uttryck; det bör vara möjligt att rekonstruera de flesta av dessa genom att generera mer RNA-Seq data. De få starkt uttryckta gener som inte var helt rekonstruerade är antingen resultatet av anpassning artefakter orsakas av nyligen bearbetade pseudogener eller härrör från nya transkriptom variationer, saknas från den nuvarande annotation (utforskas i detalj nedan). Med tanke på att de flesta av skrifternas rekonstruktioner av proteinkodande gener var korrekta, undersökte vi därefter skillnaderna mellan den rekonstruerade transkriptomen och de kända genannoteringarna (kompletterande tabell 1). Vi fokuserade på transkript med (i) roman 5′ start platser; (ii) roman 3′ slutar; och (iii) tidigare oidentifierade exons inom transkriptionella enheter av kända proteinkodande gener. I varje kategori diskuterar vi först nedan de rekonstruerade utskrifterna i ESC och sedan resultaten för NPC och MLF. 1. Vad är det för fel på dig? Alternativa 5′ startplatser stöds av H3K4me3-märken. Vi hittade 1 804 transkript i ESC som matchar den kommenterade 3′ ände men har en alternativ 5′ startplats, härledd från en extra exon inte överlappande den kommenterade första exon. Vi skiljer mellan interna alternativa 5′ startplatser (1 397 fall; Bild. 3a), som inträffar nedströms från den kommenterade start, och externa alternativ 5′ startplatser (407 fall; Bild. 3b ), som inträffar uppströms av den kommenterade starten. Nittio procent av de interna 5′ start platser och 75% av de externa 5′ start platser innehöll en H3K4me3 modifiering, ett tecken på promotor regionen av gener 16 (kompletterande bild. Denna förordning träder i kraft den tjugonde dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning. Dessa alternativa startplatser ligger i genomsnitt 21 kb uppströms den kommenterade platsen, vilket innebär en omfattande översyn av de kommenterade initiativtagarna. I synnerhet hade ~60% av utskrifterna med en alternativ startplats (inre eller yttre) ingen rekonstruerad isoform med början vid den kommenterade 5′ startplatsen. Vi fick liknande resultat från NPC och MLF (Fig. 3a, A r t i c l es 5′ startplatser (2 302 stöds av H3K4me3 i deras respektive vävnader) och 807 externa 5′ startplatser i minst en celltyp. I synnerhet är 33 % av dessa nya 5′ ändar sannolikt aktiva i ESC men inte i NPC eller MLF. 2. Utgångspunkten är följande: Alternativa 3′ oöversatta regioner stöds av polyadenyleringsmotiv. Det finns 551 (~4%) ESC-rekonstruerade utskrifter med en alternativ 3′ änd nedströms av den kommenterade 3′ ände (genomsnittligt avstånd 30 kb nedströms, Bild. Denna förordning träder i kraft den tjugonde dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning. Av dessa visade 275 (~50%) tecken på ett polyadenylationsmotiv inom romanen 3′ exon, som bara är något lägre än för kommenterade 3′ toppar (60%) och mycket högre än för slumpmässigt utvalda storleksmatchade exons (6%). Frekvensen av polyadenyleringsmotivet stöder exaktheten i rekonstruktionen. För att konservativt skilja mellan uppströms (tidigt) avslutande och ofullständig rekonstruktion, vi betecknade roman 3′ slutar endast i de fall som inte överlappar någon av de kända exons i den kommenterade utskriften och som innehöll kompletta 5′ start platser. Vi identifierade 759 transkript med uppströms 3′ slutar i ESC (Fig. 3d) ; 44 % av dem innehöll ett polyadenyleringsmotiv som stödde deras biologiska relevans. För de flesta (90%) av dessa utskrifter rekonstruerade Skriften också en isoform som innehöll den kommenterade 3′ slutet. Vi fick liknande resultat för NPC och MLF (Fig. 3c,d, höger; Kompletterande tabell 1). Sammantaget identifierade vi 940 nedströms 3′ ändar och 1 850 uppströms 3′ slutar i minst en celltyp. 3. Vad är det som händer? Ytterligare kodning exons är mycket bevarade och bevara ORF. Vi hittade 534 transkript i ESC med minst en extra, tidigare oannoterade interna kodning exon skarvat till kommenterade proteinkodning transkript (Fig. 3e)........................................................................................................... Dessa utskrifter innehöll 588 nya interna exons, som varierade i längd från 6 bp till 3,5 kb (median, 111 bp; 20-80% quantiles, 60-224 bp). Av dessa extra exons fanns 322 (54,5 %) i alla versioner av den rekonstruerade utskriften i ESC. De flesta (83 %) av dessa nya exoner behåller läsramen i utskriften och är lika välbevarade som kända kodning exons (kompletterande bild. 4), i överensstämmelse med deras kodningskapacitet. Vi validerade förekomsten av de nya exons inom fem testade transkriptioner, med omvänd transkription följt av PCR (RT-PCR) följt av Sanger sekvensering (Online Methods). Vi fick liknande resultat i MLF (124 transkript, 144 exons) och NPC (325 transkript, 363 exons) (Fig. 3e, höger). En majoritet av exons (~70%) var närvarande i alla versioner av den rekonstruerade transkript inom en celltyp. Sammantaget identifierade vi 960 nya interna exons i minst en celltyp (Fig. 3e, höger). Vi vände oss därefter till att identifiera genstrukturerna av utskrifter uttryckta från kända lincRNAs loci. Vi hade tidigare identifierat 317 lincRNA loci på basis av K4-K36 domäner i ESC celler 4. Vid tillämpning på ESC RNA-Seq data rekonstruerade Skriften multiexoniska genstrukturer för 250 (78,8%) av dem (Fig. 4)................................................................. Detta är jämförbart med andelen (78,5 %) rekonstruerad för proteinkodande gener med K4-K36-domäner i ESC. Skriften rekonstruerade 87% (160 av 183) av ESC lincRNAs för vilka vi tidigare identifierat en RNA hybridization signal från tiling microarrays. Vi diskuterar möjliga orsaker till de få återstående avvikelserna i kompletterande anmärkning 2. De rekonstruerade lincRNA transkripten i ESC har i genomsnitt 3,7 exons, en genomsnittlig exonstorlek på 350 bp och en genomsnittlig mogen skalperad storlek på 3,2 kb (jämfört har proteinkodande gener i genomsnitt 9,7 exons, exonlängd på 291 bp och längd på 2,9 kb). Den skriften-identifierade strandinformationen för varje lincRNA är förenlig med den som härleds från platsen för H3K4me3-modifieringen och med orienteringen bestämd från ett strandspecifikt RNA-Seq-bibliotek som vi genererade självständigt (Online Methods). De flesta lincRNAs representerar sannolikt 5′ fullständiga transkript baserade på överlappning med H3K4me3 (82%) och 3′ fullständiga transkript baserade på närvaro av ett polyadenylation motiv (~50%, jämförbar med 60% för proteinkodande gener och långt över bakgrunden av 6%). Likaså rekonstruerade Skriften framgångsrikt lincRNA genstrukturer för K4-K36 lincRNA loci i MLF och NPC (232 av 289 i MLF och 224 av 270 i NPC). De flesta är sannolikt 5′ komplett (69% i MLF och 81% i NPC baserat på överlappning med H3K4me3) och många kan vara 3′ komplett baserat på detekterbara 3′ polyadenylatering platser (18% i MLF och 37% i NPC). Dessutom rekonstruerade vi framgångsrikt ytterligare 116 lincRNAs tidigare identifierade endast i mus embryonal fibroblasts men som nu rekonstruerades i minst en av de andra tre celltyperna. Sammantaget identifierade vi genstrukturer för 609 tidigare definierade lincRNA loci i minst en av de tre celltyperna. Förutom de tidigare identifierade lincRNAs, hittade vi ytterligare 1140 multi-exoniska transkript som karta till intergenic regioner (591 i ESC, 318 i MLF, och 528 i NPC; Bild. Denna förordning träder i kraft den tjugonde dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning. De flesta av dessa transkript verkar inte koda proteiner, och betecknas som icke-kodning, på grundval av deras codon substitutionsfrekvens (CSF) poäng 17, 18 (Online Metoder) över mogna (replicerade) RNA transkript (88%; Bild. 5a ) och om avsaknaden av en öppen läsram (ORF) större än 100 aminosyror (80%; Bild. Denna förordning träder i kraft den tjugonde dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning. Noggrann granskning av © 2010 Nature America, Inc. Alla rättigheter förbehållna. 5 0 8 VOLYM 28 ANTAL 5 MAJ 2010 naturbioteknik A r t i c l es resterande ~12% avslöjade 66 loci som sannolikt kommer att vara nya proteinkodande gener (hög CSF score, ORF >200 aminosyror och mycket hög evolutionär bevarande; Suplementary Fig. 5).................................................................. De flesta av de nya lincRNA loci identifierades inte i vår tidigare studie på grund av de stränga kriterier som vi införde när vi använde kromatinkartor för att identifiera lincRNAs. Specifikt, Vi krävde att en K4-K36 domän sträcker sig över minst 5 kb och vara väl separerade från närmaste kända gen locus 4. De flesta nya intergena transkript (76 %) berikades för en K4-K36-domän (en jämförbar andel som den för uttryckta proteinkodande gener) men uppfyllde inte storleks- och avståndskriterierna eller kunde inte identifieras på en genomomfattande signifikansnivå (utan att känna till deras locus a priori). I genomsnitt, genomic loci av den nya lincRNAs är närmare angränsande gener och har mindre storlekar (~3.5 kb genomsnitt), och utskrifterna är kortare (859 bp). Av lincRNAs som inte hade en kromatinsignatur som nådde genombred signifikans visade ~40% kromatinmodifikationer anrikade på en nominell signifikansnivå (jämfört med 57% för proteinkodande gener). I genomsnitt, lincRNAs uttrycks på nivåer som är lätt detekterbara, om än något lägre än de av proteinkodande gener. Medianuttrycksnivån för de rekonstruerade lincRNAs, beräknad genom avläsningar per kilobas av exonisk sekvens per miljon inpassade avläsningar (RPKM; se Online Methods) var ungefär en tredjedel av uttrycket för proteinkodande gener (Fig. 5d), med ~25% av lincRNAs med uttrycksnivåer högre än mediannivån för proteinkodande gener (Fig. 5d)........................................................................................................... De nya lincRNA som identifierats i denna studie uttrycks på något lägre nivåer än de från kromatinidentifierad loci, vilket överensstämmer med det faktum att kromatin anrikning är positivt korrelerad med uttrycksnivåer (Fig. 5d)........................................................................................................... Vi jämförde den nya lincRNA gener till en samling av ~35,000 mus cDNA och fann bevis för att ~43% av våra lincRNAs var närvarande i denna samling 1. Detta är jämförbart med den rapporterade fraktionen (40%) av kända transkript som omfattas av samma cDNA katalog 1. De återstående lincRNAs finns i vår studie men inte i jämförelsekatalogen. Dessa missades sannolikt tidigare på grund av de olika celltyperna och begränsad täckning av den tidigare studien 1. De rekonstruerade genstrukturerna av lincRNA låter oss noggrant bedöma deras evolutionära sekvensbevarande i varje exon och i små fönster. I detta syfte identifierade vi de ortologa sekvenserna för varje lincRNA över 29 däggdjur och uppskattad bevarande av en metrisk (en online-metod) som återspeglar den totala sammandragningen av grenlängden av det evolutionära trädet som förbinder dem 19. Vi beräknade över hela lincRNA transkript, liksom över enskilda exons. På grundval av våra högupplösta genstrukturer visar lincRNA-sekvenserna större bevarande än slumpmässiga genomiska regioner eller introner (Fig. 5c), jämförbart med åtta kända funktionella lincRNAs [20] [21], och lägre än proteinkodning exoner. Resultaten är förenliga med våra tidigare uppskattningar av bevarande 4. Intressant nog är bevarandenivåerna oskiljaktiga mellan de kromatindefinierade lincRNAs 4 och de nya som endast identifierats i denna studie (Fig. 5c), i överensstämmelse med medlemskap i samma klass av funktionella stora ncRNA gener. Dessa bevarandenivåer är betydligt högre än de som rapporterats för en tidigare katalog av stora icke-kodande RNAs 1. Vi bestämde också de specifika regioner inom varje lincRNA som är under renande urval och därmed sannolikt att vara funktionell, genom att datora inom korta fönster (Online Methods). I genomsnitt, 22% av baserna inom lincRNAs ligger inom bevarade fläckar (jämförbart med värdet av 25% för de åtta kända funktionella lincRNAs, mycket högre än 7% för introniska baser och lägre än 77% för proteinkodning baser, Kompletterande bild. 6 ) och 6 )............................................................................................................... Dessa bevarade fläckar ger en kritisk utgångspunkt för funktionella studier 23. En betydande fraktion (~41%) av de nya lincRNAs rekonstrueras i minst en celltyp visar bevis för uttryck i minst två av A r t i c l es tre celltyper. Detta är jämförbart med de 45% av de tidigare identifierade lincRNAs som finns i minst två av de tre celltyperna. Däremot uttrycks 80% av de uttryckta proteinkodande generna över två av de tre celltyperna. Detta är inte bara ett resultat av det lägre övergripande uttrycket av lincRNAs, eftersom fraktionen av celltypspecifika lincRNAs är högre än den av vävnadsspecifika proteinkodningsgener i varje uttryck kvantil (Supplementary Fig. 7)................................................................. Således är lincRNAs sannolikt att vara mer vävnadsspecifik än proteinkodande gener. En väsentlig del av lincRNA loci producerar också alternativa skarvade isoformer. Inom ESC identifierade vi t.ex. två eller flera alternativa formade isoformer för 25% av lincRNA-gener, jämförbara med 30% för proteinkodande gener (15% av lincRNAs i MLF har alternativa formade isoformer och 14,7% i NPC). Sammanlagt hade 28,8% av den 1 749 lincRNA loci bevis för alternativa isoformer i någon av de tre celltyperna. Skriften rekonstruerade hundratals transkript som överlappar kända proteinkodande genloci men transkriberas i motsatt riktning och representerar sannolikt antisense transkript. För att bestämma orientering, vi krävde att alla identifierade antisense transkript vara multi-exonic (Online Metoder). Med hjälp av dessa kriterier identifierade vi 201 antisense multi-exonic transkript i ESC (Fig. 4b) ; dessa transkript hade i genomsnitt fem exons per transkript och en genomsnittlig transkriptstorlek på 1,7 kb. I genomsnitt överlappade de antisense transkripten genomiska locusen av den sense protein kodande genen med 1 023 bp (83% av locusen), och de flesta (64%) överlappade åtminstone en sense exon, men denna överlappning var betydligt lägre (766 bp, 48% av transkript exons). Några av dessa antisense transkript (79, ~40%) identifierades genom en tidigare cDNA-sekvensstudie 1, 24, men de flesta (122, ~60%) var tidigare oidentifierade. De flesta (~85%) antisense transkript var icke-protein kodning av båda ORF analys (Fig. 5b) och CSF-poäng (Fig. 5a).............................................................................................. Fyra av de nyligen identifierade antisense transkripten hade en stor, bevarad öppen läsram och är sannolikt nya, tidigare oannoterade proteinkodande gener. Vi validerade de rekonstruerade ESC antisense transkript av tre oberoende uppsättningar av experimentella data. (i) De flesta av antisense loci bar ett H3K4me3 märke i deras 5′ ände (Fig. 4b), överensstämmer med deras oberoende och antisense transkription (till exempel, 64% av 164 transkript där det var möjligt att upptäcka en oberoende H3K4me3 märke eftersom 5′ slutet av antisense transkript inte överlappar 5′ ändar av sense genen). (ii) Vi genererade och sekvenserade ett strandspecifikt bibliotek i ESC (17,5 miljoner Illumina läser; Online Methods), och fann ett betydande (P < 0,05) antal avläsningar på antisense strand i > 90% av fallen (resterna missas sannolikt i denna begränsade sekvensering på grund av lägre uttryck). (iii) Vi bekräftade fem av fem testade antisense transkript med RT-PCR till unika exons av antisense transkript (Online Methods) följt av Sanger sekvensering. Vi fick liknande resultat för antisense transkript i MLF och NPC (112 och 202 multi-exon antisense transkript, respektive). Sammantaget identifierade vi 469 antisense transkripter uttryckta i minst en celltyp, varav endast 125% tidigare identifierades i storskalig sekvensering av mus cDNAs 24. De återstående 344 (73%) var oidentifierade av den tidigare studien, sannolikt återspeglar de distinkta celltyper som användes i den studien och den begränsade täckningen av tidigare kataloger. De 469 antisense transkripten uttrycks på nivåer jämförbara med de av de nya lincRNAs (Fig. 5d) men visar betydligt lägre sekvens bevarande. I själva verket, antisens ncRNAs visade mycket lite evolutionärt bevarande som uppskattas av den metrisk för de portioner som inte överlappar proteinkodning exons på sense strand, vilket tyder på att antisense ncRNAs är en distinkt klass från lincRNAs (Fig. 5c)........................................................................................................... Trots att många däggdjur har tillgång till genomsekvensen har en omfattande förståelse av transkriptomen varit ett svårfångat mål. I synnerhet saknades i stor utsträckning de beräkningsverktyg som behövdes för att rekonstruera alla fulllånga utskrifter från rikedomen av kortlästa data. En färsk studie föreslog att övervinna denna begränsning experimentellt genom att använda mycket långa avläsningar (till exempel 454 sekvensering) som en byggnadsställning för kortläst rekonstruktion 25. Detta är tillämpligt, om än till en betydande kostnad, för starkt uttryckta gener men skulle kräva extra djup för att täcka mer svagt uttryckta. Här presenterar vi Skriften, en ny beräkningsmetod för att rekonstruera en transkriptom från däggdjur utan förkunskaper om genannoteringar. Skriften bygger på längre läsningar som spänner splitter korsningar för att ansluta diskontikuösa (replikerade) segment och lösa flera splitter isoformer, och använder parad-end information för att förfina dessa utskrifter. Skriften kan identifiera korta men starkt uttryckta avskrifter samt avskrifter med mycket lägre uttryck för vilka det finns aggregerade bevis längs hela utskriftslängden. Även om Skriften är beroende av en referensgenomsekvens, kan många av dess komponenter också användas i utvecklingen av metoder för sammanställning av utskrifter från endast läsdata. Vi tillämpade Skriften på RNA-Seq data från pluripotent ESC och differentierade linjer och visade att vi exakt kan rekonstruera de flesta uttryckta, kommenterade proteinkodande gener, på ett brett spektrum av uttrycksnivåer, samt avslöja många nya isoformer i proteinkodning transkriptom. Denna variation kan ha viktiga regleringsroller, definiera nya celltypspecifika promotors, oöversatta regioner och proteinkodning exons. Vi använde Skriftens känslighet och upplösning för att rekonstruera genstrukturerna och trådinformationen av hundratals lincRNAs och multiexoniska antisense transkript, av vilka många endast är måttligt uttryckta. Skriften identifierade över tusen lincRNAs över de tre celltyper studeras. De flesta av de lincRNA identifierade hittades inte tidigare av klassisk storskalig cDNA sekvensering 1. Många av dessa lincRNAs kunde inte tillförlitligt identifieras enbart på basis av chromatin struktur på grund av deras närhet till proteinkodande gener eller deras korta genomiska längder. Sammantaget fann vi att förhållandet mellan uttryckt proteinkodning till icke-kodande gener i dessa celltyper var ~10:1 men att det totala antalet RNA-molekyler var mer kraftigt partiska mot proteinkodningsfraktionen (~30:1), resultat liknande tidigare observationer 26. Skriften identifierar exakta genstrukturer för de flesta tidigare funna lincRNA loci (samt för de nyupptäckta), en förutsättning för ytterligare studier. Till exempel använde vi dessa för att identifiera de specifika regionerna inom varje lincRNA som är under renande urval (konservering), en utgångspunkt för experimentell och beräkningsundersökning. Tillsammans belyser våra resultat kraften i ab initio rekonstruktioner för att kommentera ett genom, för att upptäcka transkriptionell variation inom kända proteinkodande gener och för att ge en rik katalog av exakta genstrukturer för icke-kodande RNA. Nästa steg är helt klart att tillämpa detta tillvägagångssätt på ett brett spektrum av däggdjurscelltyper, för att få en heltäckande bild av däggdjurs transkriptom. Metoder och eventuella tillhörande referenser finns i pappersversionen på http://www.nature.com/naturebiotechnology/.
Skriften REF konstruerar ett splitterdiagram från de kartlagda läsarna och rekonstruerar utskrifter som motsvarar alla möjliga sökvägar i den här grafen.
Ab initio reconstruction of cell type–specific transcriptomes in mouse reveals the conserved multi-exonic structure of lincRNAs
{'venue': 'Nature Biotechnology', 'journal': 'Nature Biotechnology', 'mag_field_of_study': ['Biology', 'Medicine']}