En statistisk modellering tillvägagångssätt föreslås för användning i att söka stora microarray datauppsättningar för gener som har en transkriptionell svar på en stimulans. Metoden är obegränsad med avseende på tidpunkten, omfattningen eller varaktigheten av svaret, eller det totala överflödet av utskriften. Den statistiska modellen gör en anpassning till systematisk heterogenitet i uttrycksnivåer. Motsvarande dataanalyser ger genspecifik information, och metoden ger ett sätt att utvärdera den statistiska betydelsen av sådan information. För att illustrera denna strategi har vi härlett en modell för att avbilda den profil som förväntas för en periodiskt transkriberad gen och använt den för att leta efter budding jäst transkript som följer denna profil. Med hjälp av objektiva kriterier identifierar denna metod 81% av de kända periodiska transkript och 1 088 gener, som visar signifikant periodicitet i minst en av de tre analyserade datamängderna. Endast en fjärdedel av dessa gener uppvisar dock signifikanta svängningar i minst två datamängder och kan klassificeras som periodiska med hög konfidensgrad. Metoden ger uppskattningar av de genomsnittliga aktiverings- och deaktiveringstiderna, inducerade och basala uttrycksnivåer, och statistiska mått på precisionen av dessa skattningar för varje periodiskt transkript. En dvances i microarray teknologier (1-5) har gjort det möjligt för utredare att utforska dynamiken av transkription i en genombred skala. Den nuvarande utmaningen är att ta fram användbar och tillförlitlig information ur dessa stora datamängder. En gemensam, första metod är klusteranalys. Det primära syftet med klusteranalys är att gruppera gener som har jämförbara variationsmönster. Denna metod är värdefull för att minska komplexiteten hos stora datamängder och för att identifiera dominerande mönster i data (6). Det behövs dock ytterligare metoder för att extrahera information om enskilda gener från dessa stora datamängder. Mot dessa mål överväger vi en statistisk metod för att identifiera gener vars utskriftsprofiler reagerar på en stimulans. I allmänna termer innebär detta tillvägagångssätt att modellera associationen av ett generiskt svar med en specifik experimentell variabel, till exempel timing, celltyp, temperatur, eller läkemedelsdosering, med hjälp av en uppsättning tolkningsbara parametrar. Ett mål är att uppskatta relevanta parametrar för enskilda transkript, med målet att testa specifika hypoteser om transkript svar på stimulans. Om den statistiska modellen ger en adekvat representation av uttrycksdata för en specifik gen, då motsvarande modellparameteruppskattningar kan ge vissa responsegenskaper för den genen. Modellparametrar kan till exempel beskriva storleken, varaktigheten eller tidpunkten för svaret. Denna modelling strategi kan användas för två gruppjämförelser, där målet kan vara att identifiera gener som är olika uttryckta mellan normala och onormala vävnader, eller i studier av läkemedelsupptäckt, där målet kan vara att identifiera transkript som påverkas av läkemedelsdosering. För att visa nyttan av detta tillvägagångssätt, formulerade vi en modell för att identifiera periodiskt transkriberade gener av den spirande jästen Saccharomyces cerevisiae. I detta fall är stimulansen synkront återupptagande av cellcykeln genom att frigöra cellerna från en fast stopppunkt. Svaret är en puls av transkription, och den viktigaste experimentella variabeln är cellcykel timing (7-9). Fyra synkroniserade cellcykeldatauppsättningar har genererats och gjorts tillgängliga för allmän prospektering (8, 9). Dessa stora datamängder har analyserats genom visuell inspektion (8), Fourier transform och hierarkisk klusterbildning (9), k-means (10) och QT-klustring (11), självorganiserande kartor (12) och singular value decomposition (13, 14). Fourier transform analys av tre datauppsättningar, där tröskeln för periodicitet baserades på beteendet hos kända periodiska gener, ledde till en rapport att det finns 800 periodiskt transkriberade gener (9). Senare användes k-medelkluster för en datauppsättning, och fem periodiska kluster med 524 medlemmar identifierades (10). Endast 330 gener identifierades dock genom båda tillvägagångssätten. För jämförelse har vi använt statistisk modellering för att söka efter regelbundet oscillerande profiler i dessa stora datamängder. Detta tillvägagångssätt kompletterar klustermetoder i det snarare än att försöka gruppera gener med liknande uttrycksmönster det syftar till att direkt identifiera transkript som påverkas av en given stimulans och att ge specifik information om individuella svarsmönster. Som förstärks nedan möjliggör metoden också heterogenitet i responsmönster bland prover, med förväntad robusthet av slutsatser om responsparametrar för vissa typer av experimentella variationer. Metodram. Låt Y jk betecknar uttrycksnivån för jth-genen i kth-provet i ett stimulansexperiment. Antalet, J, av gener som studeras ofta kommer att vara av hög dimension, typiskt i tusentals, medan antalet prover, K, kan vara jämförelsevis få. En standard statistisk metod skulle relatera medelvärdet av vektorsvaret, Y och k (Y 1k,. .., Y Jk ) för kth provet till en motsvarande vektor av p kovariater x k  till (x 1k,. .., x pk ) som kodar stimulanskategorier och eventuella andra egenskaper hos kth provet med hjälp av en regressionsfunktion, säger J ) kan inkludera genspecifika och andra parametrar och ska beräknas. Under en sådan regression modell elementen i vektorn för skillnader Y k  på k (x k, ) har medel noll, men kan förväntas korreleras till exempel på grund av variationer i mRNA extraktion, förstärkning, och bedömning bland prover. Sådana variationer kan erkännas genom att införa ytterligare parametrar, som vi hänvisar till som heterogenitetsparametrar i modellen för medelvärdet av Y k. I själva verket, för prov k, kan man införa både en additiv heterogenitet parameter  på k och en multiplikativ heterogenitet parameter k som ger en modell, för förväntan av Y jk. Genomsnittet för ks och ks är begränsat till noll respektive ett för att undvika eventuella identifiabilitetsproblem i förhållande till regressionsparametrarna av primärt intresse. Den höga dimensionen av Y k kommer att göra det möjligt att exakt uppskatta dessa heterogenitetsparametrar i många tillämpningar. Inbegripet dessa parametrar kan förkortas: SPM, enpulsmodell. † Till vem återtrycksförfrågningar bör adresseras. E-post: lbreeden@fhcrc.org eller lzhao@fhcrc.org. Kostnaden för publiceringen av denna artikel täcktes delvis av avgifter på sidan. Denna artikel måste därför märkas med "reklam" i enlighet med 18 U.S.C. §1734 endast för att ange detta faktum. Uppskattningar av vektorn av genomsnittliga parametrar kan nu uppskattas som  på  på { på 1,. .., K, 1,.. .., K, }, en lösning till uppskattningsekvationen, där D k är matrisen av partiella derivat av medelvärdet av Y k med avseende på parametern, V k betecknar V k med varje v j 2 ersatt av en konsekvent uppskattning v j 2, och 1 betecknar en kolumn vektor av en av längd J. Enligt ovanstående modellering antaganden, kommer att vara ungefär gemensamt normalt distribueras förutsatt att både J och K är stora, och variansen av kan konsekvent uppskattas (som J och K blir stora) av en standard smörgås formel (15, 16). Den genomsnittliga parameteruppskattningsförfarandet just beskrivs förväntas vara användbar i olika typer av mikroarray dataset. Det kommer att göra det möjligt att uppskatta meningsfulla genspecifika parametrar för att karakterisera uttrycksnivåer som svar på en stimulans, och i den meningen, kompletterar klusteranalys som syftar till att gruppera gener med liknande uttrycksmönster, med mindre betoning på mönsteregenskaper. Till exempel, i samband med att jämföra uttrycksmönster mellan sjukdomsdrabbade och icke-sjukdomsdrabbade vävnader, kan man definiera en binär indikator x k som tar värdet noll för icke-sjukdomsfria vävnadsprover och en för sjukdomsbehandlade vävnadsprover, och ange en regressionsfunktion,  på jk (x k, ) j0 j1 x k, under vilken jth genen skulle vara differentialt uttryckt mellan normala och onormala vävnader, när j1 0. Regressionsvariabeln x k kunde också utökas så att regressionsfunktionen kunde vara beroende av andra uppmätta egenskaper hos kth-provet (eller kth-studieobjektet). På liknande sätt, i en studie av variationer i uttryck över tiden skulle man definiera x k  på k, tidpunkten för kth provet som ska samlas in, och man kan välja en linjär eller annan funktionell form för att modellera regressionsfunktionen  på jk (x k, ). I resten av detta papper fokuserar vi på den specifika inställningen av transkriptsvarsmönster när celler frigörs från cellcykelstillestånd. Vårt särskilda intresse kommer att vara identifiering av gener som har periodiska uttrycksnivå förändringar över flera cellcykler. En viktig dataanalys utmaning avser möjligheten av en enda icke-oscillerande puls av transkription för vissa gener, efter återupptagandet av cellcykling. Modellera periodisk transkription. Överväg ett synkroniserat experiment för att identifiera mRNAs som transkriberas en gång per cellcykel. Antag att när den aktiveras, den jth mRNA når ett förhöjd värde ( på j  och j) och när den avaktiveras faller den till en basal uttrycksnivå ( på j ) (Fig. 1).................................................................. Naturligtvis tolkas j som skillnaden mellan genomsnittliga topp- och daluttrycksnivåer. Med tanke på flera kopior av jth mRNA, transkriberad och dissipated vid på varandra följande tidpunkter i flera celler med ofullständig synkronisering, den genomsnittliga uttrycksnivån av jth transkript vid tiden t k kan modelleras som: där j  med 1, 2,.., J och k med ofullständig synkronisering,.., K för alla J transkript vid alla K tidpunkter, där j, j är aktiveringen och deaktiveringstiderna för jth genen, respektive, t* k k  och k.., Där betecknar skillnaden i faktisk cellcykel timing och observerad timing och är typiskt känd som fas, är cellcykeln spännvidden, och summan är över flera cellcykler, c, 1, 2,.......... Standardavvikelsen, k, skildrar variationen av ''sann'' cellspecifika tidpunkter runt t k, som vi antar att följa en normal fördelning med medelvärdet t k, vilket resulterar i den kumulativa normala fördelningsfunktionen (.) i den genomsnittliga modellen. Också, K, k är additiv och multiplicativ heterogenitet parametrar för kth provet som beskrivs ovan, och här x k  och t k. Ovanstående singel-puls modell (SPM) anger en modell för det genomsnittliga uttrycket för varje gen som cellcykeln fortskrider. Gene-specifika Uttrycket värden som erhålls (punkter) är föremål för både additiv och multiplikativ heterogenitet samt ytterligare variabilitet utöver vad som har modellerats, och skillnaderna av vilka är kända som restprodukter. Med hjälp av dessa rester uppskattar vi deras standardavvikelse och utvärderar betydelsen av pulshöjden i förhållande till denna standardavvikelse via Z-poängen. 5632 __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ aktiverings- och deaktiveringstider samt bakgrunds- och förhöjda uttrycksnivåer beräknas för varje gen. SPM möjliggör också variation mellan proverna, för att synkronin är ofullständigt och, som beskrivs nedan, för att synkronin ska försämras med tiden ( Bild. 1 )............................................................................................................... Ytterligare detaljer om utvecklingen av SPM finns i bilagan, som publiceras som kompletterande material på PNAS webbplats, www.pnas.org. Den resulterande medeluttrycksmodellen har visats visuellt för att reproducera de profiler som observerats för periodiska transkriptioner mätt med konventionella metoder (17). SPM som beskrivs ovan kan tillämpas med hjälp av den genomsnittliga modelluppskattning som beskrivs ovan. För att förenkla numeriska aspekter har vi använt en flerstegsprocedur: (i) heterogenitetsparametrar, ( ska k, k ), k 1..., K, uppskattas genom att använda alla gener när pulshöjderna är inställda på noll, (ii) cellcykeln spänna,  och, uppskattas genom att använda en grupp av kända cellcykelgener under en pulsmodell, (iii) synkronisering variabilitet, k, k  på 1,...., K, uppskattas genom att använda samma grupp av kända gener, och (iv) genspecifika parametrar ( ska j, j, j, j ), j  och 1,.., J, uppskattas medan andra uppskattade parametrar behandlas som fasta till sina uppskattade värden. Även om en samtidig uppskattningsmetod med hjälp av den uppskattade ekv. 1 skulle vara att föredra, inverkan på uppskattningen av de genspecifika parametrarna för deras variansuppskattningar är sannolikt att vara minimal eftersom genspecifika parametrar är svagt korrelerade med andra parametrar. Fastställande av cellcykelns spännvidd och provspecifika parametrar möjliggör en separat enkel beräkning av den genspecifika parameteruppskattningen och deras variansuppskattningar för var och en av J-generna. Närmare uppgifter om dessa beräkningar finns i bilagan. För att testa SPM:s passform införde vi ytterligare polynomfunktioner i medelmodellen och testade hypotesen att polynomkoefficienterna var identiska noll. I synnerhet har SPM utökats och skrivits för att möjliggöra en avvikelse från SPM. En score-typ teststatistik för (eng. j1, en j2, en j3 )  och sedan konstrueras med hjälp av den asymptotiska normalteorin som beskrivs ovan. Denna poängstatistik, j 2, kommer att ha en ungefärlig chi-kvadratfördelning med tre frihetsgrader under SPM-modellen, för tillräckligt stor J och K. Vi väljer 11.3, den 1% övre andelen av denna chi-kvadratfördelning för att identifiera gener med mönster som avviker avsevärt från SPM. För cdc28-datamängden är det till exempel bara 262 gener som ger teststatistik som överskrider det kritiska värdet. Observera att andra avvikelser än de polynomiska termerna kan anges men inte tillämpas här. För de gener för vilka uttrycksmönstret inte avviker nämnvärt från SPM, uppskattar vi aktiveringstiden ( j ), deaktiveringstiden ( j ), basaluttrycksnivån ( till j ) och höjningen av uttrycksnivån under intervallet ( till j ), tillsammans med deras uppskattade standardavvikelser. Enligt SPM regleras uttrycksnivåer i cellcykeln om och endast om  på j 0. Vi väljer ett kritiskt värde på 5 för det absoluta värdet av varje Z j, förhållandet mellan uppskattningen av  på j till dess uppskattade standardavvikelse, för att förkasta nollhypotesen. Detta värde, långt i svansen av normal distribution, förväntas bevara en genombred signifikansnivå på cirka 0,3 % (tvåsidig) även med så många som 6000 gener under undersökning. Vissa gener som visade tecken på avvikelse från SPM kan också ha uttrycksmönster som varierar med cellcykeln. Man kunde testa j 0 även för dessa gener i samband med den förstärkta medelmodellen, j (t k ), som beskrivs ovan, även om tolkningen av ett sådant test skulle vara villkorad av lämpligheten av den förstärkta modellen. Datans natur. Tre datauppsättningar användes i denna analys. Datamängden cdc28 genererades av Cho et al. (8) och synkronin fastställdes genom att använda en temperaturkänslig CDC28-mutation för att reversibelt stoppa celler i G 1. Oligonukleotid matriser (Affymetrix, Santa Clara, CA) hybridiserades till fluorescerande märkta cDNAs gjorda från varje prov, och de absoluta fluorescence intensitet värden antas vara proportionella mot mängden av varje transkript i varje målprov (7). Dessa uppgifter har laddats ner från http:enomics.stanford.edu. De två andra uppsättningarna data (alfafaktor och cdc15) genererades av Spellman et al. (9) Använda ett alfafaktormedierat G1-stopp och en temperaturkänslig CDC15-mutation för att inducera ett reversibelt M-fasstopp. I detta fall tillverkades fluorescerande märkta cDNA från RNA från varje tidpunkt och ett andra fluorescerande färgämne användes för att märka cDNA tillverkat av en asynkron kontrollkultur. Kontroll och test cDNAs blandades och hybridiserades till matriser av PCR-amplified jäst ORFs. Fluorescensintensitetsvärden för båda färgämnen mättes och logaritmiska förhållanden för test- och kontrollvärden skapades. Uppnådda förhållanden antas approxima motsvarande verkliga förhållanden för test kontra kontroll mRNA-nivåer (9). Dessa data och cdc28-data, som omskalats för att härma kvoten data, var tillgängliga från public domain webbplats http: encellcycle-www.stanford.edu. Våra resultat är baserade på analys av dessa datamängder och kommer som sådan att påverkas av alla variationskällor som är involverade i beredningen och bearbetningen av dessa grupperade prover. De primära antagandena för SPM är att cellcykelreglerade transkript kommer att nå sitt maximum endast en gång per cykel och att dessa pulser uppstår vid invarianta tider i på varandra följande cykler. SPM innehåller termer som gör det möjligt att ta emot additiv och multiplikativ heterogenitet mellan olika prover. Bilda. 2 visar additiv heterogenitetsuppskattningar för varje datamängd. Tillsatsen heterogenitet är minimal när logaritmiska förhållanden används. När den absoluta intensiteten beaktas för cdc28-datamängden är additiv heterogenitet tydligast vid 90-min-tidpunkten. Detta bekräftar oron över denna särskilda tidpunkt (8) och utgör ett sätt att korrigera för dess heterogenitet. Vi uppskattade cellcykelspann för varje datamängd genom att använda en uppsättning av 104 kända cellcykelreglerade gener och profilering över en rad möjliga cellcykelspann (se bilaga). Som förväntat skiljer sig cykelns spännvidd för varje synkroniseringsmetod. Cykelintervall för datamängderna alfafaktor och cdc15 visar bimodala fördelningar (Fig. 2).................................................................. Dessa kan bero på återvinning artefakter som olika påverkar den första cykeln och ändra tidpunkten för en delmängd av utskrifterna. Vi har använt den uppskattade cellcykeln spänn som minimerar en viss viktad summa av kvadrater, vilket ger ett värde på 58 min för alfafaktor synkronin, 115 för CDC15 celler, och 85 för CDC28 kultur. Bilda. 2 visar också de uppskattade standardavvikelserna i samband med förlust av synkronisering över tiden. När dessa värden har erhållits beräknas j2-värdena för j-genen för j  på 1,.., J, och genspecifika parametrar uppskattas för alla gener som har transkriptionsmönster som överensstämmer med SPM (dvs j 2 värden mindre än 11,3). Genspecifika parametrar inkluderar de genomsnittliga aktiverings- och deaktiveringstiderna och de basala och förhöjda nivåerna. Bilda. 3 visar mikroarraydata (fasta linjer) för fem periodiska gener och den monterade SPM på dessa profiler (doterade linjer). Det är tydligt att modellen nära motsvarar dataprofilen och ger genomsnittliga aktiverings- och deaktiveringstider (inom parenteser) som överensstämmer med de observerade mönstren. Z-värdena för dessa svängningar varierar från ca 18 för RFA1 i cdc15-datamängden till ca 3,5 för MCM3 i alfafaktordatamängden. Det faktum att det periodiska beteendet hos MCM3 fortfarande är uppenbart ger oss förtroende för att vi har satt en tillräckligt konservativ tröskel för varje Z j. De tre översta transkripten har klassificerats som G 1-specifika, MCB-reglerade gener (9). PDS1-pulsen är dock försenad jämfört med de andra två. RFA1 och CLB6 aktiveras ungefär samtidigt, men CLB6 mRNA:s puls är kortare. Dessa skillnader återspeglas i de aktiverings- och deaktiveringstider som SPM beräknar för varje gen och kan användas för att identifiera koordinatreglerade transkript. Identifiering av Cell Cycle-reglerade Transkript Använda SPM på cdc28 Data Set. Totalt uppfyllde 607 gener SPM:s tröskelvärden för periodicitet (dvs. värdet 5 eller högre) med hjälp av absoluta fluorescensintensitetsmätningar direkt från cdc28-data (8). Vi fick ungefär samma antal gener genom att använda antingen logaritmen av intensiteten eller logaritmiska proportioner av intensiteter som genereras av Spellman et al. (1, 2, 9 ). Endast omkring 500 gener identifierades dock i alla tre analyserna. Således kan varje enskild datatransformation missa cirka 20% av de potentiella positiva, på grund av Z-värden som är nära vår tröskel. I all efterföljande analys har vi använt logaritmiska nyckeltal för cdc28-data för att överensstämma med alfafaktorn och cdc15-data. Förteckningar över cellcykelreglerade gener i cdc28-datamängden har sammanställts genom visuell inspektion (8) och k-medelskluster (10). SPM-analys bekräftar en majoritet av dessa uppdrag och identifierar många fler oscillerande transkript. Tillämpningen av den k-means-metod som tillhandahålls av Tavezoie et al. (10) Använde en inledande filtreringsstrategi för att välja ut de 3000 jästgener som visade den högsta variationskoefficienten under kursens gång. Sedan användes den iterativa k-means-proceduren för att dela upp alla 3000 profiler i 30 kluster. Kravet att alla 3.000 profiler skulle passa in i en av 30 kluster gjorde det nödvändigt att samla stora kluster med löst korrelerade uttrycksmönster. Fem av dessa kluster hade genomsnittliga tidsprofiler som var klart periodiska under två cellcykler. Endast omkring hälften av profilerna hos de 524 klustermedlemmarna överskred dock tröskelvärdena för periodicitet i SPM. För att se om SPM kunde identifiera ett tätt kluster av periodiska gener beräknade vi 2 och Z-värdena för ett kluster av G 1-specifika transkript som monterades på tre olika trösklar av Heyer et al. (11) med hjälp av QTClust-algoritmen. I detta fall finner vi att alla tightaste klustermedlemmar antingen överskrider eller kommer mycket nära tröskeln för periodicitet i SPM (Fig. 4 Överst). Kontrollen av gränsfallen tyder på att de sannolikt kommer att vara återkommande och att vår Z-värdetröskel därför är försiktig. När klustertröskeln är lägre är medlemskapet dubbelt så stort som och återigen ligger nästan alla profiler på SPM-tröskeln eller långt över den (Fig. 4 I mitten). Men, som noterats av Heyer et al. (11) En ytterligare uppmjukning av klustret för att inkludera 272 profiler leder till att många dåligt matchade mönster som även har låga Z-värden av SPM (Fig. 4 Längst ner). Detta visar hur effektivt båda metoderna är när det gäller att identifiera de mest periodiska avskrifterna. Det är också bild. 2............................................................... Parametrar som uppskattas för datamängderna från synkronisering med alfafaktor (A), cdc15 (B) och cdc28 (C för kvotdata och D för absolut intensitet) datamängder. Den vänstra kolumnen återspeglar den uppskattade additiva heterogeniteten för varje tidpunkt. Den mittersta kolumnen anger den uppskattade cellcykelns spännvidd för varje synkroni som profilerad, viktad minst kvadrat på en sannolikhetsskala. För att underlätta visuell inspektion, omvandlade vi denna summa av kvadrater till en sannolikhetsskala med hjälp av exp[-L(-)]exp[-L(-)]. Detta skulle vara en bakre sannolikhet, om uttrycksvärden följde den normala fördelningen. Högerkolumnen visar uppskattade standardavvikelser i samband med försämrad synkronisering. Bilda. 3............................................................... SPM (doterade linjer) passar till mikroarraydata (fasta linjer) från tre olika synkroniserade cellcykler för fem periodiskt transkriberade gener. Den logaritmiska kvoten data kontra tid ritas för alfafaktorn (höger), cdc15 (Center) och cdc28 (vänster) synkronier. Under varje diagram visas tidpunkterna för aktivering och deaktivering för varje utskrift inom parentes, följt av Z-poäng och 2 statistik beräknad enligt SPM, som anger betydelsen av pulshöjd respektive avvikelse från SPM. 5634 ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ illustrerar värdet av att ha två helt olika metoder för att analysera data för att fastställa meningsfulla tröskelvärden och karakterisera de mindre robusta responsmönstren. En annan egenskap hos SPM är dess uppskattning av genspecifika parametrar. Bilda. 4 visar också hur fördelningen av aktiverings- och deaktiveringstider breddas i takt med att klustermedlemskapet ökar. Denna breddning indikerar att förutom att den innehåller icke-periodiska profiler, innehåller denna grupp gener med olika uttryckskinetik. SPM gör det således möjligt att ytterligare dela upp dessa kluster av liknande uttrycksmönster beroende på frågan om intresse. En begränsning av dessa cellcykeldatauppsättningar är det lilla antalet prover och bristen på flera mätningar när som helst, vilket gör identifieringen av falska positiva och falska negativa problem. För att lindra detta problem har vi använt SPM för att identifiera periodiska utskrifter från cdc28-, cdc15- och alfafaktorerna separat och sedan jämföra resultaten. SPM identifierar ungefär dubbelt så många periodiska gener i cdc28-datauppsättningen som i någon av de andra två synkronierna (Fig. 5) Och totalt finns det 1 088 gener som visar signifikanta svängningar i minst en datauppsättning. Bland de 1 088 periodiska gener som identifierats av SPM finns 81% av de 104 kända periodiska generna. Totalt 254 gener oscillerar signifikant i minst två databaser, som representerar 4% av alla gener, men omfattar 46% av de kända periodiska generna. SPM identifierar därför de kända periodiska transkripten långt över den nivå som kan förväntas av en slump. Endast en fjärdedel av de kända periodiska generna är bland de 71 gener som poängsätts som periodiska i alla tre datamängderna. Totalt 834 gener visas periodiskt i endast en datauppsättning och som sådan kommer ytterligare datainsamling att krävas innan denna stora grupp av gener kan klassificeras otvetydigt. Fullständiga listor över de periodiska utskrifter som identifierats av SPM finns tillgängliga på vår webbplats (www.fhcrc.org och labs på engelska). Spellman m.fl. (9) Använde Fourier analys av de kombinerade data från samma tre datauppsättningar för att identifiera periodiska transkript. Med hjälp av de kända periodiska generna som vägledning för att sätta sin tröskel, uppskattade de att 799 gener är periodiska. Endast 65 % av dessa gener tas också upp av SPM som periodiska i minst en datauppsättning. Denna skillnad kan delvis förklaras av vår konservativa tröskel för Z eftersom en sänkning av tröskelvärdet för Z till 4,0 gör det möjligt att klassificera 79 procent av dessa gener som periodiska i minst en datauppsättning. Nästan alla gener som överstiger tröskeln för periodicitet av SPM i minst två datamängder är också igenkända enligt metoden med Spellman et al. (9). Detta beslut träder i kraft den tjugonde dagen efter det att det har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning. Här igen, som med kluster, de mest robusta periodiska mönster identifieras med båda metoderna. Det finns dock 571 gener som verkar vara periodiska enligt SPM-kriterier i minst en datauppsättning men som inte klassificeras som sådana av Spellman et al. (9). Detta beslut träder i kraft den tjugonde dagen efter det att det har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning. Som nämnts ovan kan dessa inte entydigt klassificeras som periodiska utan ytterligare bekräftande uppgifter. De är antingen falska negativa i två datauppsättningar eller falska positiva i en. Experimentell variation är mycket mer sannolikt att resultera i ett icke-periodiskt mönster än det är att producera en smidigt svängande profil. Med SPM måste topparna också uppstå samtidigt i på varandra följande cellcykler och toppar och dalar är inte igenkännbara om de representeras av en enda punkt i profilen (se bilaga). Dessa begränsningar bör minska bullret och leda till en lägre falsk positiv felfrekvens. Vi kan dock inte eliminera inverkan av buller i data och med så få datapunkter att basera dessa uppdrag på, många förblir Bild. 4........................................... Periodiska transkript som topp i G1-fasen av cellcykeln identifierades av Heyer et al. (11) Använda QTClust-algoritmen och variera klusterdiametertröskeln från  på 0, 3 (högst 41 gener), till 0, 5 (83 gener), till 1, 2 (272 gener). Avskriftsprofilerna för medlemmar i dessa på varandra följande större G 1-kluster analyserades av SPM och deras Z- och 2-värden ritades upp (vänster). Z-poängen och 2-trösklarna för SPM läggs över på dessa tomter för att visa att andelen av dessa profiler skulle klassificeras som periodisk (lägre högerkvadrant för varje tomt). (Rätt) fördelningen av genomsnittliga aktiverings- och deaktiveringstider ritas upp för varje grupp. Dessa parameteruppskattningar beräknades av SPM endast för de profiler som överskrider SPM-trösklarna. Bilda. 5................................................................ Periodiska transkriptioner som identifierats av SPM med trösklar på 5 och 11,3 är avbildade för att visa graden av överenskommelse mellan de tre datamängderna. Logaritmiska kvotdata från Spellman et al. (9) För var och en av de tre datamängderna analyserades av SPM. Det totala antalet periodiska gener som identifieras i varje datamängd visas och representeras av en cirkel. Överenskommelse mellan datamängderna framgår av cirklarnas skärningspunkter. Totalt 71 gener uppfyller SPM-tröskeln för periodicitet i alla tre datamängderna; 254 poäng som periodiska i minst två databaser; 834 visas periodiskt i endast en datauppsättning; och 1 088 uppfyller SPM-tröskeln i endast en databas. Om vi använder ytterligare ett kriterium på R 2  på 0,6 för att identifiera profilerna bland dessa 1,088 för vilka modellen ger en förklaring till 60% eller mer av uttrycksdatavariationen, hittar vi 473 profiler. Denna lista finns på vår hemsida (www. Fhcrc.org-labs-reeden-SPM). Zhao m.fl. PNAS tvetydiga. De 254 gener som poängsätts som periodiska i två datauppsättningar kan anses periodiska med någorlunda hög konfidensgrad, men de omfattar endast omkring hälften av de kända periodiska generna och som sådana klart underskatta antalet. Om inte mer data genereras kommer klassificeringen av de andra utskrifterna att förbli tvetydig. Med andra ord, trots ackumuleringen av nästan en halv miljon datapunkter, kan vi identifiera endast omkring hälften av de periodiska transkripten av knoppande jäst med stort förtroende. Dessa tvetydigheter, i kombination med det faktum att statistiska metoder är mest tillförlitliga när det finns ett stort antal oberoende prover, leder oss att dra slutsatsen att en annan datauppsättning, traversing två full cell cykler och med närmare tidpunkter kommer att krävas för att mer fullständigt identifiera och beställa periodiska transkript av denna viktiga modell organism. Om hälften av dessa 1 088 gener faktiskt är periodiska (se bild.  5 ) skulle de bestå av cirka 10 % av alla spirande jästgener, vilket skulle kunna ses som en enorm regelbörda för cellerna, särskilt om det finns många olika sätt på vilka denna förordning genomförs. Å andra sidan, om det bara finns 20 olika kretsar som uppnår denna reglering och genprodukter har utvecklats till dessa begränsade uttrycksmönster baserat på cellens behov för dem, kan man se det som en mycket parsimonisk strategi för att begränsa den biosyntetiska belastningen på cellen. I denna rapport använder vi en statistisk modell (SPM) för att identifiera och karakterisera enstaka pulser av transkription som förekommer vid invarianta tider i på varandra följande cellcykler. SPM är en specifik tillämpning av statistisk modellering, men den grundläggande strategin kan tillämpas på alla stora datauppsättningar för att identifiera gener som genomgår en transkriptionell respons på en stimulans. På grund av dess relativa enkelhet kan statistisk modellering användas för att förhöra stora datamängder utan att använda ytterligare filter för att minska antalet gener som ska analyseras. Den innehåller också heterogena parametrar som tenderar att minska bullerpåverkan i datamängderna. SPM identifierar regelbundet oscillerande transkript utan hänsyn till mängden transkript eller höjden eller tidpunkten för topp och ger uppskattningar av medeltiden för aktivering och deaktivering. Dessa värden är bara uppskattningar, men de är opartiska enligt den antagna SPM och kan betraktas som att definiera egenskaper hos enskilda gener. SPM tillhandahåller också statistiska mått på precisionen i parameteruppskattningarna så att optimala grupperingar kan göras och genomgå ytterligare analys. Dessa egenskaper hos statistisk modellering kompletterar och förstärker de andra metoder som används för att analysera mikroarray data. Vi tackar Drs. M. Campbell, J. Cooper och J. Sidorova för hjälpsamma diskussioner om data. Vi tackar också utredarna som bidrog med sina jästuttrycksdata till den offentliga domänen, och L. Heyer, S. Kruglyak och G. Church för att ha tillhandahållit klusterinformation för jämförelse. Denna forskning stöds av bidrag från National Institutes of Health (GM41073 till L.B. och PO1 CA53996 till L.P.Z. och R.P.). SPM kan utvecklas i flera steg. Det första steget modellerar en enda transkription i en enda cell över cellcykler som en binär process: där Y (t) betecknar uttrycksnivå vid tiden t, (en, en) med (0 ≤  på <  till ≤ ) betecknar aktivering och deaktiveringstider, är cellcykeln spännvidd, c = 0,1,2,... betecknar 1: a, 2: a, 3: e,..., cellcykeln. Alternativt kan ovanstående display skrivas som med summeringen över 1:a, 2:a, 3:e,..., cykel, och I{•} är en identitetsfunktion. I det andra steget behandlas flera transkriptioner i en enda cell, vilket ger en uttryckspuls för cellen med bakgrund och förhöjda uttrycksnivåer (t.ex. -α,-α +-β ) och aktiverings- och deaktiveringstider (-,-) (-) (---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Medeluttrycket för synkronin uppstår sedan från summering över N-cellerna och tar förväntan över slumpmässig timing (T i ). Efter några enkla algebra, kan vi visa att medeluttrycksnivån vid tiden t k kan sedan skrivas som: där.(x) är den Gaussiska kumulativa fördelning funktion och α = N. Ett fjärde steg erkänner att synkroniseringen försämras med tiden, en inneboende begränsning med alla synkroniseringsprotokoll. Vi modellerar denna försämring genom att tillåta σ att monotont öka med tid t. Specifikt antar vi att standardavvikelsen för tidpunkten för celler i ta prov k följer en exponentiell form modell: där (γ 0,γ 1 ) är parametrar som ska uppskattas. Ett femte steg innehåller multiplikativa (λ k ) och additiva (δ k ) heterogenitetsfaktorer mellan proverna. Variationer i mRNA extraktion, förstärkning och bedömning kan resultera i 3 heterogenitet mellan prover. Som tidigare nämnts leder önskan att rymma sådana heterogeniteter till följande modell för den genomsnittliga uttrycksnivån, där δ k och λ k är specifika för kth-provet och δ k-s och λ k-s-medelvärdet till noll respektive 1, över K-proven. Som skrivet är modellen tillämplig på mätningar av mängden utskrifter direkt. För att analysera förhållandet mellan transkriptnivåerna väljer vi att eliminera de multiplikativa heterogenitetsfaktorerna (λ k  och 1). Varje gen tillåts ha sin egen aktiverings- och deaktiveringstid samt sin egen bakgrund och förhöjda uttrycksnivå, vilket ger SPM-modellen för det genomsnittliga uttrycket för
I Zhao et al REF är en statistisk modell lämplig för alla gener för att hitta de som är cellcykelreglerade.
Statistical modeling of large microarray data sets to identify stimulus-response profiles.
{'venue': 'Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America', 'journal': 'Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America', 'mag_field_of_study': ['Biology', 'Medicine']}