Vi beskriver ett system som tillåter automatiserad analys av reportergenuttryck i Caenorhabditis elegans med cellulär upplösning kontinuerligt under embryogenes. Vi visar dess nytta genom att definiera uttrycksmönster för reportrar för flera embryonalt uttryckta transkriptionsfaktorer. Den invarianta celllinjen tillåter automatisk anpassning av flera uttryck profiler, vilket gör det möjligt att direkt jämföra uttrycket av olika gener' reportrar. Vi använde också detta system för att övervaka perturbationer till normal utveckling som involverar förändringar både i cell-division timing och i cell öde. Systematisk tillämpning av detta system kan avslöja genaktiviteten hos varje cell under hela utvecklingen. Ett viktigt mål med aktuell biologisk forskning är att förstå hur genomet styr processen med vilken en encellig zygot ger upphov till komplexiteten hos en multicellulär organism och i sin tur en ny zygot. Att helt enkelt veta det fullständiga komplementet av transkriptionellt aktiva gener för varje cell genom hela utvecklingen skulle vara ett stort framsteg och skulle ge det molekylära ramverket för att förstå det nätverk av interaktioner med vilka utvecklingen fortskrider. Till exempel, beskrivningen av uttrycket mönster av par-regel gener såsom även hoppat över i Drosophila melanogaster med hög rumslig och temporal upplösning hade varit avgörande för att förstå hur dessa gener kan orsaka att uttrycka celler att anta ett öde som skiljer sig från angränsande icke-reporter-uttryckande celler 1. Flera olika metoder har försökt fånga uttrycksinformation med hög temporal och rumslig upplösning i bred skala. Microarray experiment har gett värdefull information såsom temporal uttryck i hela embryon eller enstaka tidpunkt-punkt uttryck för specifika celltyper 2-7. Mikroarraybaserad analys är dock otymplig och tekniskt utmanande när man försöker uppnå både cellulär och hög tidsupplösning. Imaging en organism mer lätt ger singel-cell upplösning av uttryck genom att använda en transgen reporter med en visualizable output, eller genom att direkt märka transkripts eller proteiner. Vanligtvis analyseras dock endast en eller några få gener på en gång, ofta endast vid specifika tidpunkter. Att integrera sådana dataset över flera gener och flera prover genom hela utvecklingen kräver i allmänhet experter anatomister, och uttryck profiler av enskilda celler ofta förloras. Nematoden C. elegans presenterar möjligheten av nya tillvägagångssätt till den omfattande beskrivningen av uttrycksmönster. Eftersom den är genomskinlig från zygot till vuxen och har bara 959 somatiska celler som vuxen, kan varje cell visualiseras under hela livscykeln i levande maskar. Eftersom en mask utvecklas genom en invariant cell härstamning, kan kunskap om en avbildad mask härstamning entydig tilldelning av identiteten för varje cell 8. Detta gör det möjligt att anpassa uttrycksmönster från enskilda maskar till en referenslinje, vilket ger en integrerad bild av genuttryck för varje cell. För att systematiskt utnyttja dessa möjligheter hade vi tidigare utvecklat metoder som möjliggör automatiserad beräkningsspårning av C. elegans lineage 9-11. Dessa metoder använder anpassade programvara för att identifiera nuclei och spåra dem över tid, i tredimensionell (3D) filmer av mask embryon allmänt uttryckt kärnlokaliserade histon-GFP fusionsproteiner. Detta system genererar mycket exakta linjer genom 350-cellsstadiet, som omfattar alla utom den sista omgången av embryonal celldelning. Här utökar vi systemet för att ge detaljerad spatiotemporal karakterisering av reporter genuttryck i både vildtyp och genetiskt perturbed embryon. RESULTAT För att övervaka genuttryck skapade vi promotor-histone genfluorescent proteingen reporter konstruerar, med hjälp av en gens 5 ¢ intergenic sekvens för att driva uttryck av en mCherry 12,13 eller en DsRed reporter (Tabell 1). Att samla reportern till en C. Elegans histonkodningssekvens leder reportern till kärnan för att underlätta kvantifiering och tilldelning av signalen till specifika celler. Dessa konstruktioner, även om de saknar post-transkriptionella styrsignaler och kanske även vissa transkriptionella kontroller, bör driva spatiotemporala uttryck av reportern och ge ett test av vår förmåga att beskriva uttrycksmönster över tiden i enstaka celler. Vi använde mikropartiklar bombardment för att generera stabilt integrerade transgener, för att undvika höga kopior nummer, mosaik,
Murray och Al. REF har utvecklat ett system för att automatiskt spåra celllinje under embryogenes av C. elegans.
Automated analysis of embryonic gene expression with cellular resolution in C. elegans
{'venue': 'Nature Methods', 'journal': 'Nature Methods', 'mag_field_of_study': ['Biology', 'Medicine']}