Tetrahydrofolate is a necessary co - factor in the production of 1-carbon units, which are critical for the synthesis of thymidylate and purine nucleotides needed for DNA and RNA synthesis.
MTX còn cạnh tranh với emzym Thymidylate synthetase trong vòng 24 giờ sau uống làm giảm folat và thymidylat cần thiết cho sự tổng hợp RNA và DNA trong pha S của chu kỳ tế bào sinh tổng hợp DNA bị ức chế và gián phân bị ngừng lại.